Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất

Sắc kí cột là phương pháp dùng để tách các chất (cấu tử) ra khỏi hỗn hợp dựa vào
tính
phân
cực
của
từng
chất.
Dụng
cụ:
cột sắc kí (giống giống như cái buret, gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng
không cần vạch chia độ, đôi khi bạn cũng không cần cái khóa này nữa, kích thước
cột có lớn, có nhỏ, từ bự tổ chảng như cái cột đình đến bé tí tẹo như cái ống tiêm)
chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là
silicagel pha thuận và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm
Si có đính các nhóm OH, silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài
ra còn dùng alumin) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí của bạn. Nếu dùng
pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân cực của bạn
hơn, các chất không phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các
chất phân cực hơn sẽ ra sau. Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu của bạn có mà bạn
sẽ dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ đó bạn sẽ chọn kích cỡ cột sắc kí của bạn như
thế nào. Một yếu tố nữa cũng quyết định đến lượng silicagel là bản mỏng của bạn,
tùy thuộc chất bạn tách gần nhau hay xa nhau mà bạn dùng lượng silicagel gấp 20,
30 hay 50 lần lượng mẫu. Chú ý lượng silicagel phải đổ đến khoảng gấp 10 lần
đường kính cột thì quá trình tách sẽ diễn ra tốt. Nếu trên bản mỏng lượng chất của
bạn gần nhau thì lượng silicagel dùng phải gấp 50 lần lượng mẫu, còn xa nhau thì
chỉ
cần
gấp
20
lần
là

đủ.
Dung môi: thông thường bạn chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột. Nếu
dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến
phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung
môi, cách chọn dung môi như thế nào là do bạn đã quyết định dựa vào thông tin
trên bản mỏng. Chú ý dung môi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với
dung môi chạy bản mỏng vì hạt silicagel dùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản
mỏng
nên
khả
năng
tách
sẽ
kém
hơn
một
chút.
(sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả thông tin trên bản
mỏng, TLC, thin layer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để "mò mẫm"
thông tin về hỗn hợp của mình cũng như biện pháp tách chất cần lấy).
Sau khi có tất cả thông tin rồi thì bạn tiến hành chạy cột.
Thực
hiện
Bước 1 là nhồi cột. Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha
dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó trong một erlen chẳng
hạn. Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồi dưới đáy cột để chặn silicagel lại, nếu cột


quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn xuống, chú ý dùng ít bông gòn thôi. Với
những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel rồi thì không cần

làm việc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau khi chạy cột xong ta phải
rửa lại nhiều lần cho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi bông gòn, khi chạy cột
xong
chỉ
cần
vứt
bông
gòn
đi
là
xong.
Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không
phân cực) đã pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột. Trong lúc rót thì nên mở khóa để
silicagel lắng đều, nhớ để 1 erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như
vậy đến khi cho hết lượng silicagel vào, tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên
dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi hệ ổn định, cột không bị nứt
hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn thành. Khóa cột lại.
Bước 2: nạp mẫu chất vào. Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Nạp
mẫu ướt là hỗn hợp của bạn cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu
vào là được. Còn nếu mẫu của bạn không tan trong dung môi chạy cột thì bạn phải
hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp trong 1 erlen chẳng hạn. Sau đó dùng lượng ít
silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó cho hết vào bình cô quay để cô quay
đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa mẫu. Lúc này nạp hết silicagel đó
vào cột và cho dung môi chạy cột vào. Cái này gọi là nạp mẫu khô. Khi cô quay thì
nhớ lót miếng bông gòn ở miệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên. Cô quay
gọi nôm na là chưng cất trong áp suất kém (chân không).
Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu
chất để ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của
hệ, chú ý không được thay đổi đột ngột cũng như chuyển từ không phân cực sang
phân cực rồi lại quay lại không phân cực, làm như vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại

từ
đầu,
mất
hết
chất.
Bước 4: mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có
kém theo chất đã tách được bằng hũ bi, mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ (mỗi hủ bi
chứa được khoảng 50-200mL tùy kích thước lớn nhỏ). Sau đó đem chấm bản các
hủ bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như
vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn.
Ghi
chú
Mỗi lần tách cần khoảng 50-200 hủ bi, thời gian tách từ 2 đến 7 ngày.
Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, ra chậm hay nhanh, việc này
quyết định quá trình tách của bạn có tốt hay không. Nếu thận trọng quá cho chạy
chậm thì bạn phải chờ lâu, nếu nôn nóng quá cho chảy nhanh thì silicagel của bạn


chưa kịp tách đã phải cho ra chất, như vậy cũng không tách được.
Có những hệ phải tách rất lâu, cho dù đã mở khóa hết cỡ vẫn không chảy xuống
nhanh thì bạn dùng máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá). Nó sẽ sục không khí
vào để tăng tốc quá trình đẩy dung môi xuống (chỉ dùng khi tốc độ dòng dưới
khoảng 3 giọt/phút). Chú ý chất của bạn không dễ bị oxi hóa thì mới dùng phương
pháp này được. Nếu không oxi không khí sẽ oxi hóa hết chất của bạn.
Nếu dùng silicagel pha đảo thì cột không cần khóa vì pha đảo chạy rất chậm,
nhưng nhược điểm là bạn phải ngồi canh nó liên tục, tức là nếu tách 3 ngày thì bạn
phải thức trắng 2 đêm để canh cột! CHú ý khi đã chạy pha đảo thì không được
dùng máy đẩy, vì bản chất pha đảo là chậm (giống như chạy ngược chiều sợ công
an thổi thì ai cũng phải chạy chậm, sợ bị tông nữa). Nếu dùng máy đẩy thì như đã
nói ở trên, silicagel không tách được, quá trình tách của bạn hoài công.

Khi chạy cột thì điều tối kị là khóa cột lại quá lâu. Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày thì
bạn phải khóa cột lại ở cuối ngày để đi về, nhưng hôm sau phải lên làm ngay, nếu
để quá lâu thì chất bị giữ lại trong cột lâu sẽ khó tách ra hơn.
Kiến thức còn hạn hẹp, nói hơi khó hiểu nhưng hy vọng đóng góp được chút ít.
Thân!

Shadow
09-22-2008, 09:23 AM
Hi ! Cám ơn tie.pok rất nhiều, đúng là mình làm cũng 3, 4 đề tài rồi nhưng chưa
trích cao bao giờ :24h_104: nhưng bạn không hiểu câu hỏi của mình rồi ! Khi có
một mẫu cao trên tay, làm sao biết được đó là những chất không phân cực hay là
phân cực ? ( những phân đoạn đang cô lập làm sao biết những chất trên đó ! ). Còn
vấn đề thang chia độ phân cực, thực ra nó chỉ biết cái nào lớn hơn, cái nào nhỏ hơn
thôi, ví dụ như nhóm flavone gọi là phân cực hơn nhóm triterpen, nhưng flavon là
phân cực hay không phân cực, hay gọi là phân cực trung bình ? Không có thang
chia
nào
rõ
ràng
cả
:24h_093:
Còn về quá trình trích cao, quy trình của bạn đưa ra rất chi tiết nhưng không biết
bạn có làm chưa hay chỉ nghe nói :hutthuoc( vì có một số điểm lạ lắm !


1. Mỗi lần ngâm cao không ai ngâm 10,20 g cả ! làm như vậy chừng nào mới
xong :24h_125: và cũng không ai sắc ký lớp mỏng cao MeOH hết -> vì trong cao
MeOH có rất nhiều chất trong đó -> 100% không thể thấy tách gì được !!!
2. Vì không thể tách ra được nên người ta mới từ cao MeOH đó chia thành nhiều
phân đoạn có độ phân cực khác nhau, bằng cách trích lỏng-lỏng với từng loại dung

môi có độ phân cực khác nhau, hay dùng cách trích rắn lỏng như bạn nói cũng
được ( cách này có nghe nói nhưng chưa thấy bao giờ ) -> sau đó mới thực hiện sắc
ký lớp mỏng với các phân đoạn thu được -> thường thì chúng ta hay lựa loại cao
nào tách đẹp, dễ để làm trước ( đúng ra là không phải lựa chọn như vậy, phải thử
hoạt tính từng phân đoạn đó rồi lựa chọn loại cao có hoạt tính cao khảo sát )
3- Cơ chế tách trên cột HPLC và sắc ký cột thông thường là giống nhau, bạn thấy
khác nhau vì bạn chưa chạy sắc ký cột pha đảo bằng C18 thôi. HPLC tách tốt hơn
vì hạt nhồi trong cột nhỏ hơn hạt nhồi trong sắc ký cột rất nhiều ( nếu bạn dùng
loại hạt nhỏ này nhồi trong sắc ký cột thì cũng được nhưng dung môi không thể
chảy qua ! Điển hình cho trường hợp này là sắc ký lớp mỏng thường tách tốt hơn
sắc ký cột, tại sao nó tách tốt hơn :24h_125: -> đơn giản vì hạt của sắc ký lớp
mỏng
nhỏ
hơn
hạt
của
sắc
ký
cột
thôi.
Mình biết chỉ có vậy :018: có gì đóng góp nha :24h_057:
tie.pok
09-23-2008, 09:20 PM
Hello
shadow
Cảm ơn bạn đã trao đổi. Mình có một số ý kiến như thế này:
1. Các flavonoid thì ai cũng biết là chúng thuộc lớp chất phân cực (bản chất do sự
chuyển dịch điện tử trong vòng thơm và nhóm C=O cũng có đóng góp cho sự phân
cực của flavonoid). Cũng chính vì nó phân cực nên gần đây cả làng mới khảo sát
các flavonoid trong HCTN (các chất kém phân cực đã được các tiền bối khảo sát

hết rồi và cho biết rằng chúng chẳng có hoạt tính j hay ho), mà khi làm loại này,
người ta hay vứt ngay đi cái phần chiết ban đầu từ nHexan. Theo kinh nghiệm thì
flavonoids thường xuất hiện ở phần chiết Etyl acetat và Metanol.


Làm thao tác chiết lỏng lỏng về bản chất ý nghĩa và mục đích cũng chỉ là để cô lập
các lớp chất không phân cực, phân cực trung bình và phân cực.
2. Trong bài viết trên của mình, ngâm 10 - 20g mẫu trong MeOH là bước khảo sát
ban đầu (để chấm bản mỏng tìm hệ dung môi, sơ bộ đánh giá tương quan hàm
lượng giữa chất trong mẫu, và để đưa đi thử hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn của
mẫu tổng). Chứ không phải chỉ ngâm từng ấy để làm hầm bà lằng các bước sau đó
rồi đưa llên cột. Muốn làm để đưa lên cột, ít nhất cũng fải có 200g đến... rất nhiều
g
mẫu
khô.
Mà như bạn nói, có rất nhiều chất trong mẫu chiết MeOH nên người ta mới phải
thử với SKBM với cả chục hệ dm khác nhau. Khi SKBM dùng hệ dm không phân
cực thì các chất không phân cực sẽ chạy lên còn các chất phân cực vẫn nằm
nguyên ở vết gốc, sau đó SKBM với các hệ dm phân cực tăng dần cho đến khi trên
bản mỏng thể hiện các chất không phân cực và phân cực vừa nằm hết ở tiền tuyến
dm còn các chất phân cực được tách bên dưới với các Rf khác nhau còn ở vết gốc
chỉ
còn
mờ
mờ
là
ok.
Tất nhiên đây chỉ là bước khảo sát cơ bản ban đầu nên việc tách rõ ràng các chất ra
khỏi
nhau

là
1
điều
không
tưởng.
3. Đúng như bạn nói việc tách trên CỘT của SK cột (trừ cột Sephadex) và tách trên
CỘT của HPLC là hoàn toàn giống nhau về nguyên tắc và cơ chế tách. Mình biết
là bạn làm nhiều về HPLC nên bạn hiểu. Nhưng điều mình muốn nói là cơ chế hoạt
động của HPLC lại khác nhiều vì có được các điều kiện tuyệt vời như áp suất,
gradient
nồng
độ,...
4. Bạn nhắc đến loại cột C18, có phải cái mà thiên hạ lâu nay vẫn gọi là cột pha
đảo không? Vật liệu nhồi trong cột là silica gel có đính với gốc Hydrocacbon no R
(chuỗi 18 C) chính thằng R này làm cho loại silica gel này trở nên rất không phân
cực. Khi chạy cột C18 người ta chạy bằng H2O, H2O:MeOH, MeOH. Mà loại này
có cái hay rất hợp với tính tiết kiệm của người Việt là khi dùng xong có thể rửa đi
và lần sau làm thì nhồi cột dùng lại. Uh, nếu đúng là nó thì mình cũng có may mắn
dùng hết 1 thùng của Meck rồi.
thuhanoi2304
11-06-2008, 11:26 PM


anh Tie.pok mới dùng hết 1 thùng thôi ah?thần tượng của tớ đấy.cái này tớ đú
không nổi
TungPham1986
03-18-2009, 02:55 PM
Thấy mọi người bàn về HCTN mình cũng xin góp một số ý kiến thế này. Việc
chọn hệ dung môi để chạy sắc kí cột dựa vào kết quả sắc kí lớp mỏng. Sau khi đã
có được các cặn chiết từ dịch cồn ( Cặn n-hexan, Điclometan, Etyl Axetat,

Metanol), sắc kí lớp mỏng được tiến hành với các hệ dung môi với độ phân cực
tăng dần, mình thường làm với N-hexan ( ete dầu hỏa)->Điclometan->etylaxetat>metanol. Các hệ dung môi được khảo sát với tỉ lệ tăng dần chất phân cực hơn.
Còn để chọn được hệ dung môi phù hợp thì tùy vào kinh nghiệm của từng người và
tùy vào mụch đích phân tích. Trong quá trình SKLM thì có dùng thêm thuốc thử
như FeCl3 hay Vanidin/H2SO4 để thử định tính một số chất có trong cặn chiết.
Còn việc chạy SKLM sau khi thu được các phân đoạn chủ yếu là để gom các phân
đoạn giống nhau lại ( có thể là đơn chất hay hỗn hợp) nếu là đơn chất thì kết tinh
và chụp phổ là OK. Còn nếu là hỗn hợp thì tiến hành sắc kí cột lần hai( mình
thường làm trong công tơ hút) sẽ thu được chất tinh khiết.
TungPham1986
03-18-2009, 02:59 PM
anh Tie.pok mới dùng hết 1 thùng thôi ah?thần tượng của tớ đấy.cái này tớ đú
không
nổi
HUyền phải ko? Anh kia thật là đại gia chơi hẳn một thùng hóa chất Merck. Chắc
là làm trong viện nào có đề tài lớn, hay là làm ở nước ngoài. Chứ ở VN thì hóa
chất chai Tàu đã là đại gia lắm rồi. Dân HCTN toàn mua dung môi công nghiệp về
cất lại chứ chưa thấy ai mua hóa chất Merck bao giờ.