Tóm tắt luận án Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận poly γ glutamic axit và hướng ứng dụng trong thực phẩm

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Khoa học công nghệ và ứng dụng của nó đời sống ngày càng được
quan tâm của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Những
ứng dụng của khoa học và công nghệ vào cuộc sống ngày càng thể
hiện sự quan trọng của lĩnh vực này. Các hợp chất có nguồn gốc
thiên nhiên dần thay thế các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Sự
phát triển của công nghệ sinh học đã giúp xã hội phát triển theo
hướng thích ứng với tự nhiên, quá trình tổng hợp các hợp chất tự
nhiên từ vi sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu. Các
hợp chất có nguồn gốc tự nhiên được thu nhận từ vi sinh vật nhờ
việc tổng hợp từ chu trình sống của chúng. So với các hợp chất
được tổng hợp bằng con đường hóa học, tổng hợp bằng phương
pháp sinh học có những ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức
khỏe con người, thân thiện với môi trường và có tính chất bền
vững.
Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất của một polyme, nó có
thể được tạo ra bằng cách sử dụng axit glutamic thông qua phương
thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai là sử dụng vi sinh
vật có khả năng tổng hợp polyme từ quá trình sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật đó. Bản chất là một polyme có khả năng phân
hủy, không độc với con người, tự nhiên nên γ-PGA đang được
nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực.Trong ngành
công nghiệp xử lý môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết
tụ, hỗ trợ quá trình lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc
hóa học. Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử
dụng như một dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, trong y
dược γ-PGA được dùng như các chất mang, chất giữ ẩm...
Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả
năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ có trong các sản phẩm nước
ngoài mà có thể phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm truyền

thống của Việt Nam như Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước
Mắm, Chao…[5].Từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản
xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những
nghiên cứu rộng hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus
cũng như các sản phẩm và vi khuẩn này tạo. Hơn nữa việc tạo ra


những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là
một xu hướng phát triển, bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao,
ít ảnh hưởng đến môi trường sống. Để đáp ứng nhu cầu đó đề tài
“Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và
hướng ứng dụng trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những
những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus và tạo ra những sản phẩm
mới đáp ứng những nhu cầu bức thiết của xã hội hiện nay.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi sinh
vật.
Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào trong các sản phẩm
thực phẩm
Nội dung nghiên cứu gồm
Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật có hoạt
tính sinh tổng hợp γ PGA từ các sản phẩm thực phẩm.
Khảo sát và tối ưu các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp
axit poly γ glutamic.
Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm của axit poly γ
glutamic.
Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào một số
sản phẩm thực phẩm.
Những đóng góp mới của đề tài
Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu

nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng
giống vi sinh vật, tối ưu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng
hợp γ PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc,
đặc tính của γ PGA.
Bước đầu ứng dụng có hiệu quả γ PGA trong việc ổn định trạng
thái, màu sắc, hương vị của nước cam trong chế biến và bảo quản,
cũng như cải thiện độ giòn, dai, màu sắc trong sản xuất giò.
Bố cục của luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số liệu 53
hình ảnh và 130 tài liệu tham khảo trong đó: Mở đầu (2 trang);
Chương 1 Tổng quan (37 trang), Chương 2 Vật liệu và phương
pháp nghiên cứu (11 trang), Chương 3 Kết quả và thảo luận (58
trang), Chương 4 Kết luận (1 trang), Danh mục các công trình
nghiên cứu đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang)
2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và
ngoài nước đề cập đến các vấn đề
Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA trên thế giới
Tình hình nghiên cứu và ứng dụng γ-PGA ở Việt Nam
Cấu trúc và phân loại γ-PGA.
Tính chất của γ-PGA, các hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA và cơ
chế sinh tổng hợp γ-PGA.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA
Các Phương pháp định lượng và tinh sạch γ-PGA.
Các phương pháp xác định cấu trúc và khối lượng phân tử của γ
PGA Ứng dụng γ-PGA trong các lĩnh vực công nghệ thực phẩm,
môi trường, mỹ phẩm, y tế, nông nghiệp và các ngành công
nghiệp khác.

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu, dụng cụ và thiết bị
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong luận án gồm
Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp PGA
Phương pháp hóa lý và hóa sinh:
Xác định hàm lượng PGA.
Xác định hàm lượng protein, xác định hàm lượng carbohydrate.
Kiểm tra độ tinh sạch trên điện di bằng trên gel polyacrylamide
(SDS PAGE)
Kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký lỏng cao áp - HPLC
Xác định khối lượng phân tử bằng sắc ký thấm gel
Xác định tỷ lệ đồng phân L và D – Glutamic trong thành phần
γ-PGA bằng đo độ phân cực
Phương pháp tinh sạch dựa trên 3 phương pháp đã được sử dụng
trên thế giới
Phương pháp toán học: tối ưu đa yếu tố theo quy hoạch thực
nghiệm
Phương pháp nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γPGA đến chất lượng nước cam ép đóng chai.
3


Phương pháp nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γPGA đến chất lượng giò lụa
Phương pháp đánh giá cảm quan dựa theo TCVN 3215-79
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Poly γ
glutamic.
3.1.1Tuyển chọn các chủng sinh γ PGA axit trong môi trường đặc
hiệu.

Kết quả cho thấy từ 27 chủng phân lập được 7 chủng có khả năng
phát triển mạnh trên môi trường đặc hiệu sau 72 h nuôi cấy; 20
chủng vi khuẩn phát triển chậm sau 72 h và một số không phát
triển

Hình 3.1. Sự tạo màng của các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu

Từ 7 chủng thu được thông qua nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu
E, cho thấy các chủng có khả năng tạo màng nhầy lớn nhất sau 96
h là bốn chủng B5; ND1; N2; T1 tiến hành kiểm tra khả năng tạo
nhớt của các chủng này để đánh giá khả năng tạo γ PGA của từng
chủng.
3.1.2 Tuyển chọn chủng dựa trên đặc tính tạo nhớt trên môi
trường đặc hiệu
Kết quả nghiên cứu cho thấy độ nhớt canh trường nuôi cấy tăng
mạnh trong thời gian từ 72h đến 96h, và độ nhớt lớn nhất đạt được
của các chủng tại thời điểm 96h. Hai chủng B5 và T1 là hai chủng
tạo ra độ nhớt lớn nhất từ 5,2 – 5,3cp, các chủng ND1 và ND6 là
các chủng tạo độ nhớt thấp nhất trong 7 chủng. Phương pháp sử
dụng độ nhớt để đánh giá hiệu suất sinh tổng hợp của các chủng
chỉ đưa ra giá trị tương đối khả năng tạo γ-PGA
3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γPGA bằng phương pháp đo quang UV-VIS
4


Kết quả cho thấy khả năng sinh γ-PGA mạnh nhất là thời điểm
96h của các chủng phân lập được. Theo một số nghiên cứu đi
trước về γ-PGA tại 96h giá trị γ-PGA được tạo ra là cực đại, đây
cũng là thời điểm được lựa chọn để dừng quá trình lên men nhằm
tăng hiệu quả của quá trình sản xuất.

Dựa trên các kết quả đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA bằng
phương pháp phổ tử ngoại và các đặc điểm hình thấy hai chủng vi
khuẩn có mã hiệu B5 và T1 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA lớn
nhất trong số 7 chủng vi khuẩn phân lập được. Trên cơ sở đó lựa
chọn hai chủng vi khuẩn B5 và T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γPGA.
3.2. Định tên chủng vi khuẩn sinh γ PGA
3.2.1. Định tên bằng phương pháp sinh hóa
Dựa vào kết quả phân loại ở bảng 3.5 đối chiếu với phần mềm
nhận dạng API PLUS, đặc điểm sinh lý, sinh hóacho thấy chủng
vi khuẩn B5 có độ tương đồng với B. subtilis là 98% và độ tương
đồng của vi khuẩn T1 với loài B. subtilis là 73%.
3.2.2. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử:
Trình tự đoạn gel được giải trình tự trên hệ thống máy ABI
3103XL xác định được đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 có
1250 bp và của T1 là 1516bp. Phân tích kết quả bằng phần mềm
sequecing analysis 5.3, và so với kết quả trên ngân hàng gen bằng
kỹ thuật BLAST cho thấy chủng B5 có quan hệ gần nhất, 99% với
loài B. subtilis strain wn39 mã số 161621764|gb|EU294413.1 và
chủng T1 có quan hệ gần nhất, 97% với B. subtilis strain y10
Kết quả định danh bằng hai phương pháp hóa sinh và phương
pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 là chủng vi
khuẩn có độ tương đồng 99% đối với chủng vi khuẩn B. subtilis.
Dựa vào những kết quả định danh vi khuẩnB. subtilis mã hiệu B5
có thể đề xuất tên gọi cho chủng vi khuẩn này là Bacillus subtilis
B5. Đối với chủng T1 do quá trình định danh bằng hai phương
pháp hóa sinh và phương pháp sinh học phân tử cho kết quả có độ
tương đồng với B. subtilis là 97% và phương pháp hóa sinh là
73% cho thấy chủng T1 không thuộc loài B. subtilis, vì vậy chủng
B. Subtilis B5 được lựa chọn sử dụng là chủng giống cho các quá
trình nghiên cứu tiếp theo.

5


3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
γ PGA
3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ PGA
Những nghiên cứu về sinh tổng hợp γ PGA cho thấy tiền chất để
tạo thành γ PGA chủ yếu là hợp chất glutamic hoặc glutamat.
Nghiên cứu trên nguồn tiền chất là đậu tương, glutamic và natri
glutamat, tiến hành sinh tổng hợp γ PGA cho thấy có thể sử dụng
natri glutamat làm nguồn tiền chất cho quá trình tạo γ PGA thay
thế cho axit glutamic.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
B. subtilis là loài vi khuẩn ưa ấm có khả năng sinh trưởng và phát
triển tốt ở dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC. Chủng B. subtilis B5 là
một chủng được phân lập từ Tương bần, một sản phẩm được sản
xuất trong điều kiện có sử dụng nhiệt độ môi trường cao cho quá
trình lên men (37-40oC). Để có thể tìm ra một chế độ nhiệt thích
hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi trường
nghiên cứu có Natri glutamat, trong điều kiện nuôi tĩnh, lên men
tại các nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC và 45oC và 50oC để nuôi cấy,
thu nhận kết quả 24h một lần, kết thúc quá trình lên men sau thời
gian 120h. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua đồ thị hình 3.9.

10

Thời
gian

8

24

6

48

γ PGA (g/l)

(h)

72

4

96

2

120

0
30°C

35°C

40°C

45°C

50°C

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA

3.3.3.Ảnh hưởng của tốc độ lắc.
6


Tốc độ lắc của quá trình lên men được khảo sát ở tốc đô từ 0 – 200
v/p, tốc độ lắc là thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho môi
trường lên men. Khi tốc độ lắc lên đến 200 v/p sự hình thành các
dòng chảy xoáy trong canh trường, sự cung cấp oxy hòa tan cho
quá trình lên men tăng, sự hình thành γ-PGA có cải thiện hơn so
với tốc độ lắc từ 100-150 v/p. Đối với mẫu nuôi tĩnh do không có
sự tác động lên lớp vỏ tế bào, nên sự hình thành γ-PGA không bị
ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men chỉ
phản ánh trên góc độ nghiên cứu trên phòng thí nghiệm. Do vậy
lựa chọn phương án tốc độ lắc = 0 v/p ( nuôi tĩnh) làm thông số
cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo, đây cũng là phương án
được đề cập trong nhiều công trình nghiên cứu về γ-PGA sản sinh
từ B. subtilis của các nhà khoa học trên thế giới.
3.3.4. Ảnh hưởng của pH.
Sự ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và sinh trưởng của vi
khuẩn B. subtilis B5 thể hiện rất rõ tại các giá trị pH = 5 môi
trường axit yếu và pH =9 môi trường kiềm, khả năng sinh tổng
hợp γ-PGA hầu là không thấy. Sự hình thành γ-PGA tăng mạnh
trong khoảng pH từ 6 đến 8 trong thời gian 96h. Giá trị γ-PGA cao
nhất (13,03 g/l) tại thời điểm 96h trong môi trường có pH ban đầu
là 8, hàm lượng γ-PGA tại các giá trị pH = 7 và pH = 6 đạt cực đại
tại thời điểm nuôi cấy là 96h.

3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
γ-PGA.
Nguồn cacbon là phần cốt lõi để tạo lên bộ khung tế bào vi sinh
vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn
cacbon phù hợp sẽ giúp sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis
B5 phát triển tốt, tạo tiền đề cho sinh tổng hợp γ-PGA. Sau khi
nghiên cứu lựa chọn 4 nguồn cacbon là lactoza, glucoza, saccaroza
và axit xitric, đã lựa chọn được nguồn cacbon sử dụng là axit citric
nồng độ 1,5% (15g/l) làm thông số cho quá trình nghiên cứu tiếp
theo.
3.3.6. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ.
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp
Poly γ glutamic axit với 3 nguồn nitơ thông dụng và rẻ tiền là
NH4Cl, cao nấm men, NH4NO3 cho thấy quá trình sinh tổng hợp γ
7


PGA đạt nồng độ cao nhất là 13,5 g/l khi sử dụng nguồn nitơ là
NH4NO3.
γ-PGA (g/l)
16
14

12
10
8
6
4

2

0

5

10
Cao nấm men

15

20
NH4NO3

25
NH4Cl

30

nguồn nitơ (g/l)

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ PGA

Quá trình sinh tổng hợp γ-PGA có thể sử dụng NH4NO3 làm
nguồn nitơ chính cho quá trình tổng hợp γ-PGA, thay thế nguồn
nitơ đang dùng trong môi trường E hiện tại là NH4Cl.
3.3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống.
Tỷ lệ cấp giống là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình lên men. Nghiên cứu với các tỷ lệ cấp giống đến quá trình
lên men dao động trong khoảng 1% đến 15% với thời gian lên
men là 96h cho thấy: Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γPGA lớn nhất là 16,48 g/l, ở hai tỷ lệ cấp giống 1% và 15% lượng
γ-PGA tạo thành nhỏ nhất dao động trong khoảng 6 g/l. Tỷ lệ cấp

giống cao quá hay ít quá đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp, bởi nếu ít quá vi khuẩn cần phải có thời gian sinh trưởng và
phát triển, khi đó sự hình thành γ-PGA cần phải kéo dài hơn, đối
với tỷ lệ cấp giống cao dẫn tới sự cạnh tranh nguồn dinh dưỡng
trong giai đoạn sinh trưởng và phát triển, gây sự mất cân bằng
trong canh trường dẫn đến sự hình thành các sản phẩm phụ, thay
đổi môi trường pH, ảnh hưởng đến hiệu suất sinh γ-PGA.
Vì vậy tỷ lệ cấp giống 5% được lựa chọn làm thông số cho các
nghiên cứu tiếp theo.
8


3.3.8. Ảnh hưởng của nồng độ Natri-glutamat
Các nghiên cứu trên đã chỉ ra việc thay thế L-glutamic nồng độ 20
g/l bằng Natri glutamat nồng độ 20 g/l. Sau khi thay đổi các điều
kiện, môi trường, chế độ nuôi cấy, nồng độ γ-PGA tạo thành có
phần cải thiện. Để tạo điều kiện cho sự hình thành γ-PGA là cực
đại với nguồn tiền chất mới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ tiền
chất đến lượng γ-PGA hình thành cho thấy với nguồn tiền chất
Natri – Glutamat với nồng độ 25 g/l sẽ tạo nên một lượng γ-PGA
cao hơn sơ với sử dụng Natri – glutamat ở nồng độ 20g/l và tạo
thành γ PGA = 20,5 g/l.
3.4. Tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ PGA
Theo nguyên tắc của ma trận Box – Behnken, ta tiến hành 29 thí
nghiệm với sự thay đổi đồng thời của bốn yếu tố quanh giá trị
trung bình. Từ những phân tích phương sai, phần mềm đã đưa ra
phương trình hồi quy theo giá trị thực của mô hình nghiên cứu như
sau:
Hàm lượng γ- PGA = - 2356,079 + 49,003X1 + 0,267X2 - 1,375X3
– 0,022X1X2 + 0,055X2X3 - 0,542X1X2 - 0,009X2X2 - 0,115X3X2

– 21,617X4X2
Giá trị chuẩn Fisher (F) là 24,70 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa
với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001), trong phép thử giá trị thông số
không phù hợp (Lack of Fit) giá trị p = 0,2043 (> 0,05) điều đó có
nghĩa là mô hình này tương thích với thực nghiệm.
Đánh giá dựa trên các giá trị hệ số xác định bội (R2 hay R-square
để đo mức độ của hàm hồi quy) và hệ số xác định bội hiệu chỉnh
(Adj R-square), hai thông số đặc trưng cho mức độ phù hợp của
mô hình trong việc giải thích các thí nghiệm. Trong nghiên cứu
này giá trị R-square = 0,9611 và Adj R-square = 0,9222 đều > 0,9
điều đó chứng tỏ mô hình được lựa chọn là phù hợp để giải thích
các kết quả nghiên cứu thí nghiệm.
Tối ƣu hóa mô hình nghiên cứu.
Sau khi được phương trình hồi quy sử dụng phương pháp hàm kỳ
vọng, phần mềm DX 7.0.0 có thể tính được các giá trị của biến
độc lập để tính được giá trị tối ưu của γ-PGA đồng thời có thể
đánh giá bằng hình ảnh, ảnh hưởng của các biến độc lập đến lượng

9


γ-PGA được sinh tổng hợp. Hai trong 12 phương án tối ưu nhất
trên lý thuyết được lựa chọn như sau:
Phương án 1: Nếu xét trên góc độ tính toán để tối ưu hàm lượng γ
PGA hay nói cách khác đặt mức độ quan trọng của chỉ tiêu này
đến mức cao nhất, phần mềm sẽ cho phương án sau thời gian
115,97 giờ, ở điều kiện pH ban đầu 8,04 hàm lượng tiền chất 30
g/l và nhiệt độ nuôi 39,41oC, thu được nồng độ γ-PGA cao nhất là
26,40 g/l và phương án có giá trị mong đợi (Desirability) là 0,978.
Dựa trên kết quả tối ưu tiến hành thực nghiệm kiểm chứng ở nhiệt

độ 39,5oC, pH = 8, nồng độ tiền chất 30g/l và với các điều kiện
khác tương tự sau 116 giờ nuôi cấy nồng độ γ-PGA thu được là
26,04 g/l.
Phương án 2: Nếu xét trên góc độ tính toán tối ưu để áp dụng được
trong sản xuất quy mô lớn, cần phải xem xét về các yếu tố như
thời gian ngắn, đầu vào nguyên liệu thấp, cho sản lượng tối ưu,
tiến hành đặt các mức độ quan trọng của thời gian, tiền chất lên
mức độ quan trọng nhất, sản lượng γ PGA ở mức khá, nhiệt độ ở
mức trung bình và các giá trị ảnh hưởng ít là pH ở mức độ vừa
phải. Sau khi chạy phần mềm tối ưu ta được các thông số nhiệt độ
= 39,74OC; thời gian thu nhận 97,02 giờ; nồng độ tiền chất 25 g/l
và pH=8,0 và hàm lượng theo phần mềm tính tinh toán là 23,71 g/l
phương án đạt giá trị mong đợi là 1,000. Dựa trên kết quả tính
toán lý thuyết, tiến hành thực nghiệm kiểm chứng với các thông số
nhiệt độ 40OC, pH = 8 và nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian
97 giờ thu nhận được γ PGA có nồng độ 25,02 g/l cao hơn với tính
toán lý thuyết là 1,31 g/l.
So sánh hai phương án đưa ra theo tối ưu hóa trên lý thuyết và
thực nghiệm ta thấy, thời gian chênh lệch giữa 2 phương án là 19
giờ (giảm 16%), chênh lệch tiền chất 5 g/l (giảm 16,7%) hàm
lượng γ PGA thu được chênh lệch 1,02 g/l (tăng 3,9%). Như vậy
xét trên góc độ hiệu quả kinh tế phương án 2 là tối ưu hơn phương
án 1. Do vậy phương án 2 với các thông số nghiên cứu: nhiệt độ
40OC, pH = 8 và nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 giờ
thu nhận γ PGA là phương án được lựa chọn cho các nghiên cứu
sau của đề tài.

10

3.5. Nghiên cứu động thái trong quá trình lên men
Quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng B5 theo 4 pha. Từ 0
đến 24h sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn này chủng B5 thích
ứng dần với môi trường lên men, có thể khẳng định đây là pha lag.
Giai đoạn từ 24 đến 72h sinh khối tế bào tăng rất mạnh từ 15,1 đến
54,6 g/l, cho thấy tế bào sinh sản rất nhanh, chất dinh dưỡng chủ
yếu được tổng hợp sinh khối. Trong khoảng thời gian từ 72h-120h,
quần thể đi vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ ở mức ổn định
số tế bào chết bằng số tế bào được sinh ra. Giai đoạn cuối từ 120
đến 144h sinh khối thế bào bắt giảm có thể do chứa nhiều chất
trao đổi thứ cấp gây ức chế sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng
dần cạn kiệt
Sinh khối
ướt
10
9 (g/100ml)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0h

PGA
(g/l)

30
25
20
15
10
5
0

24h

48h
pH

72h

Sinh Khối ướt g/100ml)

96h

120h

144h

Hàm lượng PGA (g/l)

Hình 3.20: Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA

Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h và bắt đầu
giảm khi đi vào cuối pha cân bằng. Điều này có thể thấy sự tạo
thành sinh khối mạnh sau 48h lên men đã tạo ra lượng enzim PGA

synthetase lớn làm xúc tác cho quá trình tổng hợp γ-PGA. Trong
giai đoạn cuối pha cân bằng một phần γ-PGA được vi khuẩn sử
dụng làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm.
Trong toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển, giá trị pH của
môi trường hầu như không thay đổi so với giá trị ban đầu.
11


3.6. Nghiên cứu các thông số sinh tổng hợp γ PGA quy mô 100
lít/mẻ
3.6.1. Ảnh hưởng của chế độ khuấy và sục khí.
Đánh giá mức độ phát triển của vi sinh vật trong canh trường bằng
cách đó mật độ quang OD ở bước sóng 600nm để đánh giá tốc độ
phát triển trong 96h với chu kỳ lấy mẫu là 24h một lần, kết quả
được thể hiện trong bảng 3.9:
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn
(CFU/ml)
Chế độ cấp khí

0h

24h

48h

72h

96h

γ-PGA

(g/l)

Tĩnh
Khuấy 350 v/p
Sục khí 10lít/phút
Khuấy 350 v/p +
sục khí 10 lít/phút

1x106
1x106
1x106
1x106

4x106
7x108
8x108
2x109

5x108
1x109
2x109
6x109

7x103
1x109
1x109
1x109

2x102
4x107

5x107
7x107

3,8
19,7
24,1
25,3

Qua kết quả trong bảng 3.9 nhận thấy sự hình thành γ-PGA đối
với quá trình nuôi tĩnh là ít nhất, không giống như nghiên cứu
trong quy mô thí nghiệm. Nghiên cứu cho thấy nếu kết hợp cả
phương pháp khuấy trộn và sục khí cho môi trường lên men ở quy
mô 100 lít khả năng sinh tổng hợp γ-PGA sẽ cao hơn so với các
phương pháp lên men tĩnh, khuấy hoặc sục khí. Hàm lượng γ-PGA
= 25,3 g/l sau 96h khi kết hợp của khuấy trộn và sục khí trong quá
trình lên men quy mô pilot 100 lít/mẻ. Như vậy khi nghiên cứu tại
quy mô 100 lít/mẻ cần kết hợp cả phương pháp khuấy trộn và sục
khí cho môi trường lên men ở quy mô 100 lít thì khả năng sinh
tổng hợp γ-PGA sẽ cao hơn so với các phương pháp lên men tĩnh,
khuấy hoặc sục khí. Hàm lượng γ-PGA = 25,3 g/l sau 96h khi kết
hợp của khuấy trộn và sục khí trong quá trình lên men quy mô
pilot 100 lít/mẻ.
3.6.2. Sự thay đổi của hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên
men
Khảo sát cho thấy nồng độ oxy hòa tan trong thiết bị lên men giảm
mạnh trong thời gian từ 0 đến 24h và nồng độ oxy hòa tan ở giai
đoạn 24 đến 48h rất thấp, sự tiêu thụ oxy cho quá trình sinh trưởng
12

và phát triển của vi khuẩn làm lượng oxy hoa tan trong dịch giảm
mạnh. Sau 48h quá trình tổng hợp γ-PGA đi vào giai đoạn tăng
trưởng, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đi vào giai
đoạn suy thoái. Sau 72h nồng độ γ-PGA và độ nhớt dịch lên men
tăng đến giá trị cực đại, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, gây
ức chế sự phát triển của vi khuẩn, rất ít oxy được sử dụng. Trong
giai đoạn này các enzim xúc tác quá trình chuyển hóa các đơn
phân glutamic và các muối của nó thành các chuỗi polyme γ
PGA.Tại 24h- 48h nồng độ oxy hòa tan giảm xuống cực tiểu, đồng
nghĩa với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, khi mật độ
vi sinh vật tăng, mức độ tiêu thụ oxy trong môi trường đạt cực đại,
làm giảm lượng oxy trong môi trường. Qua khảo sát này có thể
thấy quy luật cung cấp và tiêu thụ oxy cho quá trình lên men và
các giai đoạn sinh trưởng của B. subtilis B5 trong lên men quy mô
pilot. Đây là thông số cơ bản cho quá trình cung cấp oxy hòa tan,
thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật, tăng hiệu suất của quá trình
tổng hợp γ PGA.
3.7. Nghiên cứu một số phương án tinh sạch γ PGA
Quá trình tinh sạch của γ-PGA được sử dụng để nghiên cứu dựa
trên những công bố khoa học của nước ngoài với 3 phương pháp
đã được công bố. Các phương pháp được lựa chọn với mục các
tiêu chí:
3.6.1. So sánh phương pháp tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm lượng
protein và cacbonhydrat
Các mẫu nghiên cứu thu được, tiến hành tinh sạch trên 3 phương
pháp nêu trên với các mẫu là PP1, PP1, PP3 kiểm tra hàm lượng
protein theo phương pháp Brandford, tính toán đo các thông số
cacbonhydrate trong sản phẩm sau khi tinh sạch, kết quả: phương
pháp 1 sau khi tinh sạch hàm lượng cacbonhydrat còn lại ít nhất,
sau đó đến phương pháp 2 và phương pháp 3, điều này có thể thấy

sự ảnh hưởng của than hoạt tính, celite đến việc hấp thụ các hợp
chất cacbonhydrat.
3.6.2. Nghiên cứu đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi
tinh sạch
Đánh giá cảm quan và thông số độ nhớt cho các mẫu nghiên cứu
thấy phương pháp 1 có sử dụng than hoạt tính và celite (đất hoạt
13


tính) hai tác nhân này có tác dụng hấp thụ màu và hấp thụ mùi của
các sản phẩm đi qua do vậy sản phẩm tạo thành không có mùi lạ
như các phương pháp còn lại. Do vậy phương pháp tinh sạch γPGA được lựa chọn để nghiên cứu và đưa vào ứng dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo là phương pháp có sử dụng kết hợp giữa than
hoạt tính, Celite, cồn và các phương pháp lọc, thẩm tích để thu
nhận γ-PGA có chất lượng tốt nhất.
3.6.3. Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phương pháp
sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Để đánh giá mức độ tinh sạch của sản phẩm sau mỗi phương pháp,
ngoài việc kiểm tra protein, cacbonhydrat có trong sản phẩm sau
tinh sạch, ta còn có thể kiểm tra các axit amin còn lại sau quá trình
tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sản phẩm γ-PGA.
Kết quả sắc ký cho thấy có sự hiển diện của axit L-glutamic, ngoài
ra chỉ có 1 peak nhỏ thể hiện sự lẫn tạp chất trong sản phẩm sau
thủy phân. Phương pháp tinh sạch sử dụng cồn, than hoạt tính
Celite được lựa chọn làm phương pháp sử dụng cho tinh sạch γPGA.
3.6.4.Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh sạch qua kính hiển vi
điện tử quét
Nhìn vào các mẫu sử dụng kính hiển vi điện tử quét thấy: đối với
mẫu thô do vẫn còn lẫn nhiều tạp chất trong đó nên cấu trúc γPGA chưa được hiển thị rõ cấu trúc là các khối, sự hiển thị chỉ
nhìn thấy dưới dạng phẳng hai chiều, không làm nổi rõ các cấu

trúc phân tử của γ-PGA như ở mẫu tinh sạch và mẫu chuẩn. So
sánh hình ảnh do kính hiển vi điện tử giữa các mẫu tinh sạch và
mẫu chuẩn thấy sự rõ nét của các cấu trúc γ-PGA dưới dạng không
gian ba chiều. Mẫu tinh sạch thể hiện là các cụm nhỏ liên kết với
nhau thành nhiều đám rời rạc tạo ra những khoảng trống, mẫu
chuẩn cũng là những cụm nhỏ có hình bất định liên kết với nhau,
tuy nhiên sự liên kết này chặt chẽ và ít tạo khoảng trống, làm cho
cấu trúc nhìn trông mịn và liền khối.
3.6.5. Xác định cấu trúc và độ sạch của γ PGA thông qua phổ FTIR và phổ H NMR.
Các phổ FT-IR và H NMR của γ PGA sau tinh sạch thu được bởi
chủng Bacillus subtilis B5 cho thấy: có sự thể hiện của gốc muối
14


carboxyl (COO- giãn bất đối xứng) trong mẫu γ PGA được phân
tích, phổ cũng thể hiện sự hình thành của liên kết C=O tuy nhiên
bị che bởi peak giãn của COO-. Tiếp đến là các giải phổ này có
liên quan đến các liên kết của nhóm NH; CH3; COO-; γ-CH2; αCH2 và các nhóm chức khác của γ-PGA. Những kết quả trên cũng
cho thấy sự kết hợp giữa hai phổ FT –IR và phổ H NMR để đánh
giá cấu trúc phân tử γ PGA là tương đối giống nhau.
3.8. Nghiên cứu một số đặc tính của γ PGA
3.8.1. Xác định khối lượng phân tử
Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử của các mẫu γ-PGA bằng
phương pháp điện di trên SDS Page các mẫu sau khi tinh sạch cho
thấy khối lượng phân tử các mẫu sau khi chạy điện di với maker
hiển thị màu chuẩn có khối lượng phân tử lớn hơn 176 kDa và
khối lượng phân tử trung bình dao động trong khoảng 200KDa.
Đánh giá khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm γ PGA trên
sắc ký lọc gel (GPC) kết quả được sau khi tính toán dựa trên peak
thu nhận được khối lượng phân tử trung bình Mw của γ PGA dao

động trong khoảng từ 158 – 426 Kda. Đối chiếu và so sánh với các
nghiên cứu về γ PGA tạo ra bởi chủng Bacillus subtilis cho thấy
thông thường có khối lượng phân tử từ 100 – 1.500 KDa.
3.8.2. Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ-PGA
Từ γ-PGA được tạo thành từ Bacillus subtilis B5 sau khi thủy
phân băng axit và làm sạch sản phẩm đến độ tinh khiết nhất định,
tiến hành đo độ phân cực của hỗn hợp đồng phân quang học D và
L glutamic. Sau khi tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit là
47,97/52,03 trong hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh bởi
Bacillus subtilis B5. Kết quả này cũng một lần nữa khẳng định cho
nguồn gốc chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA là Bacillus subtilis.
3.8.3. Nghiên cứu tính bền axit của γ PGA.
Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất của γ PGA trên các
môi trường axit citric có nồng độ từ 0 – 30g/l qua việc xác định độ
nhớt của dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nồng
độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm của γ PGA tại nồng độ 1
g/l. Kết quả khi nồng độ axit tăng (độ pH giảm) khả năng tạo nhớt
của γ-PGA giảm đi, đến nồng độ axit 20g/l sự biến đổi độ nhớt
15


không có sự thay đổi nhiều. Qua khảo sát này kết luận có thể sử
dụng γ-PGA trong các sản phẩm đồ uống có độ axit cao.
3.8.4. Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ PGA
Để tìm hiểu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của γ-PGA
hay tính bền nhiệt, tiến hành nghiên cứu với γ-PGA nồng độ 1 g/l
để ở các nhiệt độ 25oC; 50oC; 75oC; 100oC và 125oC trong thời
gian 30 phút. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ nhớt γ-PGA tỷ lệ
nghịch với nhiệt độ, khi bị tác động của nhiệt độ càng cao độ nhớt
của γ-PGA càng giảm. Mức độ giảm độ nhớt của γ-PGA là rất nhỏ

trong khoảng nhiệt độ từ 75-100OC. Đây cũng là một đặc tính ưu
việt khi sử dụng γ-PGA áp dụng cho mỗi loại sản phẩm trong thực
tế.
3.9. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ PGA
3.9.1. Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ PGA
Sau khi nghiên cứu trên thực nghiệm thu được kết quả sấy phun
tốt nhất đối với chế phẩm γ PGA trong bảng 3.14:
Bảng 3.14. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ PGA
Chỉ tiêu
Chất trợ sấy: Maltodextrin
Nhiệt độ sấy
Tốc độ đĩa phun
Hiệu suất thu hồi
Lưu lượng dịch cấp
Đánh giá cảm quan

Thông số
5%
160 oC
11.00-12.000 v/ph
85,8 -90,4%
5 lít/h
Bột khô, hút ẩm chậm, màu
trắng, dễ lấy sau khi sấy phun.
Độ hòa tan tốt, không bị vón khi
hòa tan
3.9.1. Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng
làm phụ gia thực phẩm.
Căn cứ theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm –
Chất làm dày (QCVN 4-21:2011/BYT) ban hành năm 2011 đối

với các loại phụ gia làm dày. Căn cứ vào công bố sử dụng γ-PGA
sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis của Công ty Ajinomoto đã công bố
đến Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa kỳ về việc chấp
nhận sử dụng γ-PGA từ Bacillus subtilis như một loại phụ gia thực
phẩm an toàn. Sau khi áp dụng những quy chuẩn kỹ thuật, sản
16


phẩm γ-PGA được đem đi phân tích kiểm nghiệm tại các phòng
thí nghiệm đươc nhà nước công nhận.
Từ các kết quả phân tích cùng một số mẫu được kiểm tra tại cơ
quan chức năng, sản phẩm γ-PGA đã được Cục vệ sinh An toàn
thực phẩm xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm
cho sản phẩm PGA. Liều lượng sử dụng của các sản phẩm này sử
dụng theo hướng dẫn của Bộ Y tế trong khoảng thấp hơn 0,1%
khối lượng sử dụng.
3.10. Nghiên cứu ứng dụng γ PGA trong ổn định nƣớc cam
3.10.1. Khảo sát chất lượng nguyên liệu
Kết quả khảo sát thể hiện cam nguyên liệu có tỉ lệ vitamin C khá
cao 40mg%, hàm lượng đường tổng số ở mức 9,0% cùng với hàm
lượng axit hữu cơ tổng số 0,6 %. Sau khi đánh giá các công thức,
tỷ lệ phối trộn trong nước cam cho thấy với tỷ lệ nước cốt chiếm
30% là phù hợp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
3.10.2. So sánh ảnh hưởng của γ-PGA đến độ ổn định của nước
cam với các phụ gia khác
3.10.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định
khác thông qua chỉ số huyền phù
Tiến hành sử dụng γ-PGA cùng các loại phụ gia ổn định khác như
CMC, Xanthan Gum, Agar ở cùng một nồng độ như nhau là
0,05%, chế biến ở cùng một chế độ công nghệ, sau khi phối chế,

thanh trùng, bảo ôn và sau bảo ôn được đem đi phân tích chỉ số
huyền phù không bền theo phương pháp Krop để đánh giá mức độ
phân tách của sản phẩm, cho kết quả trong đồ thị hình 3.31 sau
Chỉ số huyền phù
không bền
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Mẫu ban đầu

γ-PGA
CMC
Xanthan
Agar
ĐC
Mẫu sau thanh Mẫu sau bảo ôn Mẫu sau bảo ôn
trùng
10 ngày
30 ngày

17


Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia

thường dùng khác trong việc ổn định cho nước cam

Chỉ số huyền phù không bền được sử dụng để đánh giá độ ổn định
của nước cam. Nếu chỉ số này càng cao đồng nghĩa với chất lượng
nước cam càng kém ổn định. Trước thanh trùng mẫu nước cam có
bổ sung CMC có chỉ số huyền phù không bền thấp nhất nên độ ổn
định cao nhất, trong khi đó độ ổn định của mẫu chứa γ-PGA thấp
nhất. Tuy nhiên, sau quá trình thanh trùng, độ ổn định của nước
cam có sử dụng γ-PGA tăng lên rõ rệt và còn cao hơn cả mẫu chứa
CMC. Sau quá trình bảo ôn chỉ số huyền phù không bền trong tất
cả các mẫu đều tăng dần phản ánh độ ổn định giảm nhưng mẫu
chứa γ-PGA vẫn giữ được độ ổn định cao hơn mẫu không bổ sung
hóa chất khá nhiều. Hơn nữa, độ ổn định của mẫu bổ sung γ-PGA
này đạt được thậm chí là vượt so với các mẫu bổ sung hai loại phụ
gia thông dụng như CMC và Xanthan gum. Do đó γ-PGA có thể
sử dụng làm phụ gia làm ổn định nước cam đầy tiềm năng, bởi nó
giữ cho nước cam được luôn ở trạng thái đồng nhất, không bị lắng
cặn, tách lớpẢnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định nước
cam thông qua sự biến đổi độ nhớt.
Các mẫu nước cam đối chứng và mẫu sử dụng Aga sau thời gian
bảo quản 6 tháng có xu hướng tăng độ nhớt. Đối với những mẫu γPGA, CMC và Xanthan Gum có độ nhớt giảm sau thời gian bảo
quản, có thể các chất này có cấu tạo phân cực, do vậy trong nước
cam chúng có liên kết với nước và không liên kết với các phần tử
huyền phù nước cam, nhờ liên kết với nước các khoảng trống giữa
các phần tử nước cam giảm, không cho các phần tử nước cam dồn
về phía đáy bao bì.
3.10.2.2. Ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định nước cam
thông qua sự biến đổi độ nhớt.
Sự ảnh hưởng của các chất phụ gia đến chất lượng nước cam đối
với các chất phụ gia được khảo sát cho thấy các chỉ số độ nhớt của

các mẫu đều bị giảm sau quá trình thanh trùng, điều đó chứng tỏ
sự ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định cấu trúc của các phụ gia. Lý
giải cho hiện tượng độ nhớt giảm sau thời gian bảo quan là do
nồng độ axít trong nước cam ảnh hưởng đến độ bền của các cấu
18


trúc phân tử các phụ gia này gây ra hiện tượng phân cắt mạch làm
giảm độ nhớt
3.10.2.3. Ảnh hưởng γ-PGA đến màu sắc sản phẩm nước cam.
Tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung ΔE cho thấy sự
thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy sự biến đổi nhiều nhất
của mẫu γ-PGA, mẫu Xanthan Gum và mẫu CMC xu hướng biến
đổi màu sắc của các mẫu nước cam này là màu nhạt đi, thiên về
màu vàng, các mẫu sử dụng Aga và mẫu đối chứng màu sắc sản
phẩm không thay đổi nhiều, tuy nhiên có xu hướng sẫm màu,
chuyển sang màu đen, giảm tính cảm quan của sản phẩm.
3.10.2.4. Đánh giá tính chất cảm quan của sản phẩm nước cam có
sử dụng γ-PGA và các loại phụ gia khác.
Kết quả đánh giá cảm quan trên các tiêu chí mùi, vị và trạng thái
các chất ổn định như: Xanthan gum, γ-PGA và CMC cho điểm
đánh giá cao, sản phẩm chất lượng đồng nhất sau quá trình bảo ôn.
3.10.3. Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam
Tiến hành các thí nghiệm với các nồng độ γ-PGA là 0,05%;
0,10%; 0,15% và 0,20% trong sản phẩm nước cam, sau đó đem đi
đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm. Kết quả thu được với
nồng độ γ-PGA là 0,05% cho điểm chất lượng cao nhất, có điểm
cảm quan về màu sắc, mùi vị và hình thái cao. Lựa chọn công thức
tương ứng với tỷ lệ bổ sung γ-PGA cho sản phẩm là 0,05%.
3.10.4. Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng cảm

quan của nước cam
Nhiệt độ 800C, 900C và thời gian 5, 10, 15 phút sản phẩm có
hương tốt và màu sắc thì không đổi vàng đẹp. Ở nhiệt độ 1000C
thì thời gian là 5 phút thì màu sắc và hương vị không đổi nhưng
thanh trùng ở 10 phút và 15 phút thì sản phẩm có mùi nấu chín.
Do vậy nghiên cứu đã đưa ra lựa chọn thanh trùng nước cam ở
nhiệt độ 900C cho thanh trùng nước cam có sử dụng γ-PGA nồng
độ 0,05% trong thời gian 10-15 phút.

19


3.11. Nghiên cứu ứng dụng γ PGA trong cải thiện chất lƣợng
giò
3.11.1. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt
xay.
Nghiên cứu này được dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo
của khối thịt khi sử dụng mỗi loại phụ gia. Các phụ gia được sử
dụng trong nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate
(STPP), borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) và chitosan là
những phụ gia đã được sử dụng và không được sử dụng trong
ngành chế biến thực phẩm hiện nay. Các phụ gia được sử dụng
mức giới hạn của Bộ Y tế cho phép và phụ gia bị cấm trong danh
mục (hàn the) được sử dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 –
0,5%), mục đích của việc sử dụng phụ gia bị cấm nhằm so sánh,
gợi mở ra những thay đổi trong việc sử dụng phụ gia an toàn trong
thực phẩm. Sau khi thử nghiệm trên các khối thịt xay tiến hành đo
độ nhớt của các mẫu nghiên cứu thấy được sự thay đổi rõ rệt nhất
về độ nhớt, độ quánh là ở các mẫu sử dụng hàn the và stpp, sự
thay đổi không đáng kể về độ dẻo quánh và độ nhớt ở các mẫu sử

dụng γ-PGA, tinh bột biến tính và chitosan.
3.11.2. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến chất lượng của giò.
3.11.2.1 Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén và lực cắt.
Sự thay đổi về tính chất, cấu trúc của khối thịt xay trong quá trình
làm giò đã phần nào đánh giá được mức độ ảnh hưởng của các loại
phụ gia đến quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên để phân tích
đánh giá cấu trúc của sản phẩm cần đánh giá trên các mẫu sản
phẩm cuối cùng. Các mẫu phụ gia được bổ sung vào các mẫu giò
nghiên cứu sau đó được chế biến trong cùng một điều kiện (bao
gói tiêu chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ như
nhau) các mẫu được bảo ôn và đem đi phân tích trên máy đo cấu
trúc cho kết quả trong hình 3.36:

20


1200

2000

1000
800

1500
1000
500

LN(g)

LC (g)

2500

600

LN

400

LC

200

0

0
Đối
chứng

Hàn the

TBBT

STPP

γ-PGA

Chitosan

Hình 3.37. Biểu đồ lực nén và lực cắt của giò thành phẩm

Khi kết hợp giữa hai yếu tố lực nén và lực cắt lên sản phẩm giò có
thể đánh giá được mức độ giòn, cứng của sản phẩm. Nhìn vào biểu
đồ 3.36 về lực nén (LN) và lực cắt (LC) của máy đo cấu trúc phân
tích giò thành phẩm cho thấy lực nén của các mẫu có sử dụng
Chitosan và γ PGA là lớn nhất, đồng nghĩa với độ đàn hồi và độ
cứng của giò thành phẩm là tốt nhất các mẫu có lực nén gần nhau
là mẫu đối chứng, mẫu bổ sung hàn the và mẫu sử dụng stpp các
mẫu này có lực nén trung bình từ 1200-1300g. Mẫu có lực nén
thấp nhất là mẫu sử dụng tinh bột biến tính, lực nén đo được từ
mẫu này phản ánh đúng bản chất của tinh bột khi bổ sung vào các
sản phẩm giò. Mẫu bổ sung tinh bột tạo cho giò bở, cấu trúc bề
mặt mịn kém xốp. Chỉ số lực cắt và lực nén là hai thông số thể
hiện tính chất, đặc tính của sản phẩm giò, để đánh giá mức độ
đồng nhất, độ đàn hồi về cấu trúc của giò tiến hành khảo sát lực
cắt và lực nén khi các đầu đâm xuyên cách mẫu 15mm đối với đầu
P/5S để đánh giá cường lực gel đối với các mẫu khi sử dụng các
loại phụ gia khác nhau, kết quả cho thấy cường lực gel lớn nhất ở
mẫu có sử dụng chitosan thấp hơn nữa lần lượt là các mẫu chứa γ
PGA; STPP; Tinh bột biến tính và thấp nhất là hàn the và mẫu đối
chứng. Qua phân tích về cường lực gel một lần nữa khẳng định
việc sử dụng chitosan và γ PGA làm phụ gia ổn định cải thiện cấu
trúc trong sản phẩm giò lụa là ưu việt và an toàn.

21


3.11.2.2. Đánh giá chất lượng giò sử dụng các loại phụ gia tạo
cấu trúc bằng phương pháp cảm quan
Các mẫu giò sau khi được đánh giá qua phân tích lực nén, lực cắt

được phân tích bằng phương pháp cảm quan để đánh giá chất
lượng, kết quả thu cho thấy:
Màu sắc của sản phẩm không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu
trong quá trình phân tích. Màu sắc chia làm hai nhóm chính nhóm
sản phẩm có màu hồng nhạt là các sản phẩm sử dụng hàn the, γPGA, nhóm có màu trắng nhạt gồm có mẫu đối chứng, mẫu có
chứa chitosan, tinh bột biến tính và mẫu chứa stpp.
Về mùi vị, mẫu có sử dụng γ-PGA đạt giá trị nghiệm thức cao
nhất và khác biệt không có ý nghĩa so với mẫu đối chứng và mẫu
sử dụng stpp, so với mẫu sử dụng hàn the, tinh bột biến tính và
chitosan thì khác biệt là có ý nghĩa về mặt thống kê.
Về hình dáng, các mẫu khác nhau không đáng kể, về độ giòn dai,
mẫu sử dụng chitosan có giá trị nghiệm thức cao nhất và khác biệt
so với các mẫu còn lại, trên góc độ phân tích cảm quan độ giòn và
dai kém nhất khi sử dụng tinh bột biến tính.
Khả năng sử dụng các loại phụ gia thực phẩm trong việc ổn định
và cải thiện chất lượng của giò được thử nghiệm so sánh giữa γPGA và 4 loại phụ gia khác hiện đang được sử dụng rộng rãi trên
thị thường sản xuất, cho thấy γ-PGA có khả năng ổn định trạng
thái, cho màu sắc đặc trưng của giò tươi, có thể thay thế các phụ
gia độc hại như hàn the, tạo cấu trúc trong sản phẩm giò tốt hơn
khi sử dụng các hợp chất photphat và các loại tinh bột biến tính.
Về mặt ứng dụng thực tiễn và hiệu quả kinh tế chưa đáp ứng được
như chitosan, nhưng ở một góc độ nhất định γ-PGA có khả năng
tạo màu cho sản phẩm nên đây cũng là một lợi thế của γ-PGA
trong quá trình ứng dụng.
3.11.3. Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lượng của giò.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của γ-PGA đến khả năng ổn định, cải
thiện cấu trúc của giò cho thấy ở nồng độ 0,1% γ-PGA cải thiện
được chất lượng giò tốt hơn các phụ gia hiện đang sử dụng trên thị
trường. Tuy nhiên để tối ưu nồng độ sử dụng cho sản phẩm cần có
những nghiên cứu sơ bộ về γ-PGA khi sử dụng trong sản phẩm

giò. Để khảo sát nồng độ thích hợp của γ-PGA cho cải thiện và ổn
22


định chất lượng giò, tiến hành thử nghiệm tại các nồng độ γ-PGA
từ 0 đến 0,25% với bước nhảy nồng độ là 0,05% sau khi thử
nghiệm tiến hành đánh giá cảm quan và đo cường lực gel của từng
mẫu nghiên cứu kết quả:
Khi đem so sánh với các mẫu có bổ sung γ-PGA thấy sự khác
nhau rõ rệt giữa các mẫu có và không có γ-PGA. Ở các nồng độ từ
0,05% đến 0,15% cường lực gel của các mẫu này có giá trị dao
động từ 8582 g.mm đến 9356 g.mm. Cường lực gel của mẫu giò
đạt giá trị cao nhất trong mẫu có sử dụng γ-PGA với nồng độ
0,20% và có xu hướng giảm ở nồng độ γ-PGA là 0,25%. Nhìn vào
đồ thị có thể thấy cường lực gel của các mẫu giò đạt cực đại ở
nồng độ γ-PGA là 0,20%.
Từ nghiên cứu thực tế cho thấy có thể sử dụng γ-PGA nồng độ
0,20% làm phụ gia trong chế biến giò, nhằm cải thiện chất lượng
giò, thay thế cho hàn the đang sử dụng tràn lan trên thị trường chế
biến.
KẾT LUẬN
Sau một quá trình nghiên cứu, luận án đã thu được kết quả cơ bản
sau:
- Từ các mẫu thực phẩm đã phân lập được 27 chủng vi khuẩn và
đã tuyển chọn được chủng B5 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA
cao từ sản phẩm tương Bần. Bằng phương pháp xác định đặc điểm
hình thái, sinh lý, sinh hóa, sinh học phân tử đã định tên được
chủng B5 là B. subtilis B5.
- Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố và phương pháp quy
hoạch thực nghiệm bậc 2 Box- Bernken đã tìm được điều kiện tối

ưu chủng B. subtilis B5 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất natri
glutamat là 25 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp
giống 5%, nuôi tĩnh ở nhiệt độ 39,7oC, pH = 8 sau thời gian 97 giờ
thu nhận γ PGA có nồng độ 25,02 g/l.
- Đã đưa ra quy trình thu nhận, tinh sạch chế phẩm γ-PGA dạng
bột: Chủng giống  Lên men  Dịch lên men  Bổ sung H2O
gia nhiệt (100oC)  Tảy màu, tảy mùi  Lọc thô  Lọc tinh 
Kết tủa bằng cồn 98% (2 lần, tỷ lệ 3:1)  Thẩm tích  γ PGA
Sấy phun (maltodextrin 5%, nhiệt độ 160oC ở 11.000 v/p, lưu
lượng cấp dịch 5 l/h)  Chế phẩm γ-PGA dạng bột.
23


- Đã xác định được cấu trúc và một số đặc tính của γ-PGA:
Mw>158 kDa, trong γ-PGA có chứa α NH+ và γ COO-; tỷ lệ đồng
phần D:L glutamic – 47,97:52,03; có tính chất nhớt trong vùng
axít từ pH 2,5 đến 7,0; bền nhiệt trong khoảng 25 – 125oC, đảm
bảo vệ sinh an toàn thực phẩm về vi sinh vật và hàm lượng kim
loại nặng.
- Bước đầu ứng dụng γ-PGA 0,05% trong ổn định nước cam tự
nhiên và 0,1- 0,2% trong sản phẩm giò lụa cho kết quả tốt. Chế
phẩm γ-PGA có thể dùng để thay thế hàn the trong chế biến bảo
quản giò cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt khác.
Các hƣớng nghiên cứu tiếp tục dự kiến.
- Nghiên cứu ứng dụng γ PGA trong lĩnh vực nông nghiệp và mỹ
phẩm
- Nghiên cứu tạo γ PGA từ các phụ phẩm của nhà máy chế biến
thực phẩm
- Nghiên cứu sản xuất các túi đựng sinh học từ γ PGA

24