Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhập poly y glutamic axit và hướng ứng dụng trong thực phẩm

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Khoa học công nghệ và ứng dụng của nó đời sống ngày càng
được quan tâm của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Những
ứng dụng của khoa học và công nghệ vào cuộc sống ngày càng thể
hiện sự quan trọng của lĩnh vực này. Các hợp chất có nguồn gốc
thiên nhiên dần thay thế các hợp chất có nguồn gốc hóa học. Sự phát
triển của công nghệ sinh học đã giúp xã hội phát triển theo hướng
thích ứng với tự nhiên, quá trình tổng hợp các hợp chất tự nhiên từ vi
sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu. Các hợp chất có
nguồn gốc tự nhiên được thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ
chu trình sống của chúng. So với các hợp chất được tổng hợp bằng
con đường hóa học, tổng hợp bằng phương pháp sinh học có những
ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức khỏe con người, thân thiện
với môi trường và có tính chất bền vững.
Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất của một polyme, nó có
thể được tạo ra bằng cách sử dụng axit glutamic thông qua phương
thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai là sử dụng vi sinh vật
có khả năng tổng hợp polyme từ quá trình sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật đó. Bản chất là một polyme có khả năng phân hủy,
không độc với con người, tự nhiên nên γ-PGA đang được nghiên cứu
và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực.Trong ngành công nghiệp xử lý
môi trường γ-PGA được sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình
lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học. Trong công
nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA được sử dụng như một dạng phụ
gia ổn định chất lượng sản phẩm, trong y dược γ-PGA được dùng
như các chất mang, chất giữ ẩm...
Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả
năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ có trong các sản phẩm nước
ngoài mà có thể phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm truyền
thống của Việt Nam như Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm,

Chao… Từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng
dụng tại Việt Nam cho thấy chúng ta cần có những nghiên cứu rộng
hơn về tính chất ưu việt của vi khuẩn Bacillus cũng như các sản
phẩm và vi khuẩn này tạo. Hơn nữa việc tạo ra những sản phẩm có
nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hướng phát triển,
bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hưởng đến môi

1


trường sống. Để đáp ứng nhu cầu đó đề tài “Nghiên cứu sinh tổng
hợp và thu nhận axit poly γ glutamic và hướng ứng dụng trong
thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi
khuẩn Bacillus và tạo ra những sản phẩm mới đáp ứng những nhu
cầu bức thiết của xã hội hiện nay.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án:
 Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi
sinh vật.
 Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào trong các sản
phẩm thực phẩm
Nội dung nghiên cứu gồm
 Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi sinh vật có
khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ các sản phẩm thực phẩm lên men
truyền thống.
 Khảo sát và tối ưu các điều kiện nuôi cấy cho chủng lựa
chọn để thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic.
 Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm của axit poly γ
glutamic.
 Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào một
số sản phẩm thực phẩm.

Những đóng góp mới của luận án
 Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ
thu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng
giống vi sinh vật, tối ưu hóa các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng
hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc và
đặc tính của γ-PGA.
 Bước đầu ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong việc ổn định
trạng thái, màu sắc, hương vị của nước cam và trong chế biến và bảo
quản, cũng như cải thiện độ giòn, dai, màu sắc trong sản xuất giò.
 Bố cục của luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số
liệu 53 hình và 130 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước; trong đó:
Mở đầu (2 trang); Chương 1 Tổng quan (37 trang), Chương 2 Vật
liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang), Chương 3 Kết quả và
thảo luận (58 trang), Chương 4 Kết luận (1 trang), Danh mục các
công trình nghiên cứu với 4 bài báo đã công bố (1 trang), Tài liệu
tham khảo (10 trang)
Chương 1. TỔNG QUAN

2


Phần tổng quan tài liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và
ngoài nước đề cập đến các vấn đề chính sau:
1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic
1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam
1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA
1.4 Tính chất γ-PGA
1.5 Phân loại γ-PGA

1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA
1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA
1.7.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng
1.7.2. Ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men
1.7.3. Phương pháp lên men γ-PGA
1.8 Xác định và đánh giá chất lượng và γ-PGA.
1.8.1. Định tính và định lượng γ-PGA
1.8.2. Thu nhận và tinh sạch γ-PGA
1.8.3. Đánh giá cấu trúc và khối lượng phân tử của γ-PGA
1.8.4. Xác định khối lượng phân tử γ-PGA.
1.9 Ứng dụng γ-PGA
1.9.1. Trong lĩnh vực môi trường
1.9.2. Trong lĩnh vực y dược
1.9.3. Trong lĩnh vực nông nghiệp
1.9.4. Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.
Vật liệu
2.1.1. Nguồn phân lập: tương Bần, tương Nam Đàn, chao Đại
Bình Dương, mắm Rươi Tứ Kỳ, Natto - Nhật Bản và Thua Nao -Thái
2.1.2. Hóa chất: Agarrose (Merck), ethidium bromide, PCR
buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs), kit
tinh sạch sản phẩm PCR (Promega), cặp mồi đọc trình tự 16SF và
16SR (Invitrogen), marker protein (hãng Sigma)
2.1.3. Môi trường nuôi cấy: môi trường LB và đặc hiệu E.
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị: Máy đo mật độ quang - Ultrospec
2000 uv/vis (Pharmacia Biotech); Máy li tâm lạnh -Avanti TM 30
Centifuge Beckman (Đức); Máy đo cấu trúc - Texture Analyser

3

TA.XT Plus (Đức); Máy đo phổ hồng ngoại Nicole 6700 FT-IR
(Đức); Thiết bị lên men phòng thí nghiệm BioTron (Hàn Quốc)
2.2.
Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử: sử dụng bộ kit
API 50CHB (BioMérieux, Pháp) và giải trình tự gen 16S rRNA
2.2.2. Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng
hợp γ-PGA theo phương pháp đơn yếu tố
2.2.3. Phương pháp toán học - tối ưu điều kiện nuôi cấy theo
quy hoạch thực nghiệm - Box-Behnken với phần mềm Desgin Expert
2.2.4. Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh: Đo quang,
HPLC, GPC, SDS-PAGE, đo độ quay cực, đo huyền phù Krop
2.2.5. Phương pháp đánh giá cảm quan.
2.2.6. Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hưởng của γ-PGA
đến chất lượng giò lụa bằng phương pháp đo lực nén, lực cắt và
cường lực gel.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp Poly γ-glutamic.
Từ các mẫu, phân lập bằng môi trường thạch LB, sau đó quan sát
hình thái khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn, kết quả sau thu được 27
chủng vi khuẩn trên tổng số 40 chủng vi sinh vật qua các phương
pháp hình thái, nhuộm bào tử, nhuộm gram. Tiến hành nuôi cấy 27
chủng vi khuẩn này trên môi trường đặc hiệu, thu được chủng phân
lập được 7 chủng có khả năng phát triển mạnh trên môi trường đặc
hiệu sau 72 h nuôi cấy. Từ 7 chủng thu được thông qua nuôi cấy trên
môi trường đặc hiệu E, cho thấy hai chủng B5 và T1 là hai chủng tạo
ra độ nhớt lớn nhất từ 5,2 – 5,3cp.

Hình 3.1. Sự tạo màng của các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu

4


Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá khả năng sinh tổng hợp
γ-PGA của các chủng chỉ mang tính chất định tính, được nhiều
nghiên cứu sử dụng như thước đo γ-PGA. Tuy vậy chưa thể kết luận
có γ-PGA trong thành phần dịch nhớt, để chứng minh trong dịch
nhớt có γ-PGA, tiến hành kết tủa phần dịch nhớt và thủy phân kết tủa
bằng HCL 6N, dịch sau thủy phân được đem đi thẩm tách loại muối
và chạy sắc ký bản mỏng dịch sau thẩm tích với mẫu chuẩn là axit
glutamic và chất hiển thị màu là ninhydrin. Kết quả cho thấy băng
chạy dịch nhớt sau thủy phân từ chủng B5 chỉ xuất hiện một vết ở vị
trí tương đương với vết của axit glutamic chuẩn. Điều đó chứng tỏ
dịch nhớt của canh trường lên men có chứa γ-PGA. Để đánh giá
chính xác hơn khả năng sinh γ-PGA, 7 chủng tạo màng trên một lần
nữa được đem nuôi trên môi trường đặc hiệu và thu nhận sau 24 h.
Đem đi xử lý và định lượng γ-PGA bằng đo phổ hấp thụ quang tại
vùng tử ngoại. Nghiên cứu cho thấy cho thấy hàm lượng γ-PGA tạo
thành cao nhất là hai chủng B5 và T1 với giá trị lần lượt là 5,564 g/l
và 5,041 g/l sau 96h nuôi cấy và khả năng sinh γ-PGA mạnh nhất là
thời điểm 96h của các chủng phân lập được.
Dựa trên các kết quả đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA bằng
phương pháp phổ tử ngoại và các đặc điểm hình thái thấy hai chủng
vi khuẩn có mã hiệu B5 và T1 có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA lớn
nhất trong số 7 chủng vi khuẩn phân lập được. Trên cơ sở đó lựa
chọn hai chủng vi khuẩn B5 và T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γPGA.
3.2. Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA

3.2.1. Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng
kit API 50CHB
Dựa vào kết quả phân loại theo các đặc tính: hình thái khuẩn lạc,
tế bào, khả năng sinh bào tử, khả năng nhuộm Gram, nhu cầu oxy,
ảnh hưởng của pH, nồng độ muối...
Đánh giá khả năng sử dụng các loại đường của 2 chủng với bộ Kit
API 50 CHB và đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS để
đánh giá thu được kết quả trong bảng 3.6

5


Bảng 3.6. Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API
50 CHB
Khả năng
Khả năng sử
sử dụng
dụng
TT
Phép thử
TT
Phép thử
B5
T1
B5
T1
0
Đối chứng
25
Esculin

+
+
1
Glycerol
+
+
26
Salixin
+
+
2
Erythritol
27
Xelobiose
+
+
3
D-Arabinose
28
Mantose
+
+
4
L-Arabinose
+
+
29
Lactose
+
+

5
Ribose
+
+
30
Melibiose
+
6
D-Xylose
+
31
Saccarose
+
+
7
L-Xylose
32
Trehalose
+
+
8
Adonitol
33
Inulin
-Metyl-D9
34
Melezitose
Glucozit
10
Galactose

35
Rafinose
+
+
11
Glucose
+
+
36
Tinh bột
+
+
12
Fructose
+
+
37
Glycogen
+
+
13
Manose
+
+
38
Xylitol
14
Sorbose
39
Gentiobiose

+
+
15
Rhamnose
40
D-Turanose
+
16

Dulxitol

-

-

41

D-Lyxose

-

-

17
18
19

Inozitol
Mannitol
Sorbitol

-Metyl-DManozit
-Metyl-DGlucozit
N-AcetylGlucosamin
Amygdalin
Arbutin

+
+
+

+
+
+

42
43
44

D-TAgartose
D-Fucose
L-Fucose

-

-

-

-

45

D-Arabitol

-

-

+

+

46

L-Arabitol

-

-

-

+

47

D-TAgartose

-

-

20
21
22
23
24

+
48 2-ketogluconat
+
+
49 5-ketogluconat
(+): Phản ứng dương tính
(-): Phản ứng âm tính

6


Sau khi kết hợp giữa việc đánh giá dựa trên đặc điểm sinh lý, sinh
hóa và phần mềm API PLUS cho thấy chủng vi khuẩn B5 có độ
tương đồng với B. subtilis là 98% và độ tương đồng của vi khuẩn T1
với loài B. subtilis là 73%.
3.2.2. Định tên bằng phương pháp sinh học phân tử:
Trình tự đoạn gen được giải trình tự trên hệ thống máy ABI
3103XL, xác định được đoạn gen 16S rRNA của chủng B5 có 1250
bp và của T1 là 1516bp (phụ lục). Phân tích mối quan hệ phát sinh
loài được tiến hành dựa trên thuật toán Maximum Likelihood, sử
dụng phần mềm Phylogeny với dữ liệu trên ngân hàng gen NBCI,
cho thấy các chủng vi sinh vật B5 và T1 đều có quan hệ gần nhất

(98-99%) với loài B. subtilis.

Hình 3.6. Cây phát sinh chủng (B5) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA

Kết quả định danh bằng hai phương pháp hóa sinh và phương
pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 là chủng vi khuẩn
có độ tương đồng 98-99% với B. Subtilis BA-71. Từ kết quả trên,
luận án đã đề xuất định tên cho chủng vi khuẩn này là Bacillus
subtilis B5. Đối với chủng T1 sau khi định danh bằng phương pháp
hóa sinh cho thấy có độ tương đồng là là 73% và phương pháp sinh
học phân tử cho kết quả có độ tương đồng với B. subtilis C-3-9 (9899%) nên chưa thể kết luận chủng T1 thuộc loài B. subtilis
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng
hợp γ-PGA
3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA
Những nghiên cứu về sinh tổng hợp γ-PGA cho thấy tiền chất để
tạo thành γ-PGA chủ yếu là hợp chất glutamic, glutamat hay bột đậu
tương. Việc bổ sung đậu tương dạng bột vào canh trường lên men
không làm tăng lượng γ-PGA, không những vậy khi bổ sung đậu
tương còn gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của vi khuẩn, ảnh
hưởng đến sự hình thành của γ-PGA. Trong môi trường có chứa natri
glutamat, hàm lượng γ-PGA tạo thành cao hơn trong môi trường có

7


chứa glutamic. Như vậy có thể sử dụng natri glutamat làm nguồn tiền
chất trong quá trình tạo γ-PGA thay thế cho axit glutamic trong toàn
bộ quá trình nghiên cứu.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
B. subtilis là loài vi khuẩn ưa ấm có khả năng sinh trưởng và phát

triển tốt ở dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC. Để có thể tìm ra một chế độ
nhiệt thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi
trường nghiên cứu có natri glutamat, trong điều kiện nuôi tĩnh, lên
men tại các nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC và 45oC và 50oC để nuôi cấy,
thu nhận kết quả 24h một lần, kết thúc quá trình lên men sau thời
gian 120h. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua đồ thị hình 3.9. Kết
quả nghiên cứu cho thấy chủng B. subtilis B5 có khả năng sinh tổng
hợp γ-PGA cao nhất ở nhiệt độ 40oC, tạo ra γ-PGA đạt giá trị lớn
nhất 9,07 g/l tại thời điểm 96h lên men.
3.3.3.Ảnh hưởng của tốc độ lắc.
Tốc độ lắc của quá trình lên men được khảo sát ở tốc đô từ 0 –
200 v/p, tốc độ lắc là thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho
môi trường lên men.

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ
đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tốc độ lắc
đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA

Kết quả biểu diễn ở hình 3.10 cho thấy: lượng γ-PGA đạt giá trị
lớn nhất ở tốc độ 0 v/p (10,36 g/l ), khi tốc độ lắc càng cao xu hướng
hình thành γ-PGA càng giảm. Đối với mẫu nuôi tĩnh do không tạo áp
lực tác động lên lớp vỏ tế bào, nên sự hình thành γ-PGA không bị
ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men trong
bình tam giác của các mẫu thí nghiệm vừa đủ để vi khuẩn sinh
trưởng và tổng hợp γ-PGA. Do vậy, phương án nuôi tĩnh được lựa
chọn cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo trên quy mô thí nghiệm.

8

3.3.4. Ảnh hưởng của pH.
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường tới chủng B. subtilis
B5, tiến hành khảo sát ở các giá trị pH từ 5 – 9. Kết quả cho thấy sự
ảnh hưởng của pH đến sự phát triển và sinh trưởng của vi khuẩn B.
subtilis B5 thể hiện rất rõ tại các giá trị pH = 5 và pH =9, khả năng
sinh tổng hợp γ-PGA hầu là không thấy. Sự hình thành γ-PGA tăng
mạnh trong khoảng pH từ 6 đến 8 trong thời gian 96h. Giá trị γ-PGA
cao nhất (13,03 g/l) tại thời điểm 96h trong môi trường có pH = 8.
3.3.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng
hợp γ-PGA.
Nguồn carbon là phần cốt lõi để tạo lên bộ khung tế bào vi sinh
vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn carbon
phù hợp sẽ giúp sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 phát
triển tốt, tạo tiền đề cho sinh tổng hợp γ-PGA. Sau khi nghiên cứu
lựa chọn 4 nguồn carbon là lactose, glucose, saccarose và axit citric,
đã lựa chọn được nguồn carbon sử dụng là axit citric nồng độ 1,5%
(15g/l) làm thông số cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
3.3.6. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ.
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp γPGA với 3 nguồn nitơ thông dụng và rẻ tiền là NH4Cl, cao nấm men,
NH4NO3, kết quả quá trình sinh tổng hợp γ-PGA đạt nồng độ cao
nhất là 13,5 g/l khi sử dụng nguồn nitơ là NH4NO3

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ-PGA

Như vậy quá trình sinh tổng hợp γ-PGA có thể sử dụng NH4NO3
làm nguồn nitơ chính cho quá trình tổng hợp γ-PGA, thay thế nguồn
nitơ đang dùng trong môi trường E hiện tại là NH4Cl.
3.3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống.

9


Tỷ lệ cấp giống là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình lên men. Tỷ lệ cấp giống cao quá hay ít quá đều ảnh hưởng đến
khả năng sinh tổng hợp. Nghiên cứu với các tỷ lệ cấp giống đến quá
trình lên men dao động trong khoảng 1% đến 15% với thời gian lên
men là 96h cho thấy: Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γPGA lớn nhất là 16,48 g/l, ở hai tỷ lệ cấp giống 1% và 15% lượng γPGA tạo thành nhỏ nhất dao động trong khoảng 6 g/l. Vì vậy tỷ lệ
cấp giống 5% được lựa chọn làm thông số cho các nghiên cứu tiếp
theo.
3.3.8. Ảnh hưởng của nồng độ natri-glutamat
Các nghiên cứu trên đã chỉ ra việc thay thế L-glutamic nồng độ
20 g/l bằng natri glutamat nồng độ 20 g/l. Sau khi thay đổi các điều
kiện, môi trường, chế độ nuôi cấy, nồng độ γ-PGA tạo thành có phần
cải thiện. Để tạo điều kiện cho sự hình thành γ-PGA là cực đại với
nguồn tiền chất mới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ tiền chất đến
lượng γ-PGA hình thành cho thấy với nguồn tiền chất Natri –
Glutamat với nồng độ 25 g/l sẽ tạo nên một lượng γ-PGA cao hơn
khi sử dụng natri – glutamat ở nồng độ 20g/l và tạo thành γ-PGA =
20,5 g/l.
3.4. Tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ-PGA
Dựa vào số liệu đã khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ,
thời gian, nồng độ tìền chất, pH, nguồn carbon, tỷ lệ cấp giống... và
những nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành
γ-PGA. Theo nguyên tắc của ma trận Box – Behnken, ta tiến hành 29
thí nghiệm với sự thay đổi đồng thời của bốn yếu tố quanh giá trị
trung bình. Từ những phân tích phương sai, phần mềm đã đưa ra
phương trình hồi quy theo giá trị thực của mô hình nghiên cứu như
sau:

Hàm lượng γ- PGA = - 2356,079 + 49,003X1 + 0,267X2 1,375X3 – 0,022X1X2 + 0,055X2X3 - 0,542X1X2 - 0,009X2X2 0,115X3X2 – 21,617X4X2
X1, X2, X3 và X4 là các yếu tố nhiệt độ, thời gian, tiền chất và pH
bởi đây là những yếu tố ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp
γ-PGA sau khi đã được khảo sát qua một số thí nghiệm.
Giá trị chuẩn Fisher (F) là 24,70 và mô hình hoàn toàn có ý nghĩa
với độ tin cậy 99,99% (p<0,0001), trong phép thử giá trị thông số

10


không phù hợp (Lack of Fit) giá trị p = 0,2043 (> 0,05) điều đó có
nghĩa là mô hình này tương thích với thực nghiệm.
Đánh giá dựa trên các giá trị hệ số xác định bội (R-square) và hệ
số xác định bội hiệu chỉnh (Adj R-square), hai thông số đặc trưng
cho mức độ phù hợp của mô hình trong việc giải thích các thí
nghiệm. Trong nghiên cứu này giá trị R-square = 0,9611 và Adj Rsquare = 0,9222 đều > 0,9 điều đó chứng tỏ mô hình được lựa chọn
là phù hợp để giải thích các kết quả nghiên cứu thí nghiệm.
Mô hình cho thấy tương quan giữa yếu tố: nhiệt độ - thời gian; nhiệt
độ - tiền chất, ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA.

Hình 3.16. Biểu đồ bề mặt đáp ứng
khi thời gian và nhiệt độ thay đổi

Hình 3.17. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi
nhiệt độ và tiền chất thay đổi

Tối ưu hóa mô hình nghiên cứu.
Hai trong 12 phương án tối ưu nhất trên lý thuyết được lựa chọn
như sau:
Phương án 1: Nếu xét trên góc độ tính toán để tối ưu hàm lượng

γ-PGA hay nói cách khác đặt mức độ quan trọng của chỉ tiêu này đến
mức cao nhất, phần mềm sẽ cho phương án sau thời gian 115,97 giờ,
ở điều kiện pH ban đầu 8,04 hàm lượng tiền chất 30 g/l và nhiệt độ
nuôi 39,41oC, thu được nồng độ γ-PGA cao nhất là 26,40 g/l và
phương án có giá trị mong đợi (Desirability) là 0,978. Dựa trên kết
quả tối ưu tiến hành thực nghiệm kiểm chứng ở nhiệt độ 39,5oC, pH
= 8, nồng độ tiền chất 30g/l và với các điều kiện khác tương tự sau
116 giờ nuôi cấy nồng độ γ-PGA thu được là 26,04 g/l.
Phương án 2: Nếu xét tính tối ưu để áp dụng được trong sản xuất
quy mô lớn, cần phải xem xét về các yếu tố như thời gian ngắn, đầu
vào nguyên liệu thấp, cho sản lượng tối ưu, tiến hành đặt các mức độ
quan trọng của thời gian, tiền chất lên mức độ quan trọng nhất, sản
lượng γ-PGA ở mức khá, nhiệt độ ở mức trung bình và các giá trị

11


ảnh hưởng ít là pH ở mức độ vừa phải. Sau khi chạy phần mềm tối
ưu ta được các thông số nhiệt độ = 39,74oC; thời gian thu nhận 97,02
giờ; nồng độ tiền chất 25 g/l và pH=8,0 và hàm lượng theo phần
mềm tính tinh toán là 23,71 g/l phương án đạt giá trị mong đợi là
1,000. Dựa trên kết quả tính toán lý thuyết, tiến hành thực nghiệm
kiểm chứng với các thông số nhiệt độ 40oC, pH = 8 và nồng độ tiền
chất = 25 g/l sau thời gian 97 giờ thu nhận được γ-PGA có nồng độ
25,02 g/l cao hơn với tính toán lý thuyết là 1,31 g/l.
So sánh hai phương án đưa ra theo tối ưu hóa trên lý thuyết và
thực nghiệm ta thấy, thời gian chênh lệch giữa 2 phương án là 19 giờ
(giảm 16%), chênh lệch tiền chất 5 g/l (giảm 16,7%) hàm lượng γPGA thu được chênh lệch 1,02 g/l (tăng 3,9%). Như vậy xét trên góc
độ hiệu quả kinh tế phương án 2 là tối ưu hơn phương án 1. Do vậy
phương án 2 với các thông số nghiên cứu: nhiệt độ 40oC, pH = 8 và

nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 giờ thu nhận γ-PGA =
25,02 g/l là phương án được chọn cho các nghiên cứu sau của đề tài.
3.5. Nghiên cứu động học của quá trình lên men
Trước khi đi vào nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA trên quy mô
pilot (100lít/mẻ) tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên men
này trên quy mô phòng thí nghiệm BioTron quy mô 5-7 lít/mẻ, kết
quả được biểu diễn trên hình 3.20:

Hình 3.20: Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA

Kết quả cho thấy, quá trình sinh trưởng của chủng B5 theo 4 giai
đoạn. Từ 0 đến 24h sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn này chủng
B5 thích ứng dần với môi trường lên men, có thể khẳng định đây là
pha tiềm phát. Giai đoạn từ 24h đến 72h sinh khối tế bào tăng rất
mạnh từ 15,1 đến 54,6 g/l, cho thấy tế bào sinh sản rất nhanh, chất
dinh dưỡng chủ yếu được tổng hợp sinh khối. Trong khoảng thời

12


gian từ 72h-120h, quần thể đi vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ
ở mức ổn định số tế bào chết bằng số tế bào được sinh ra. Giai đoạn
cuối từ 120h đến 144h sinh khối thế bào bắt đầu giảm, có thể do
chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp gây ức chế sinh trưởng, môi trường
dinh dưỡng dần cạn kiệt
Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h và bắt đầu
giảm khi đi vào cuối pha cân bằng. Điều này có thể thấy sự tạo thành
sinh khối mạnh sau 48h lên men đã tạo ra lượng enzym PGA
synthetase lớn làm xúc tác cho quá trình tổng hợp γ-PGA. Trong giai
đoạn cuối pha cân bằng một phần γ-PGA được vi khuẩn sử dụng

làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm.
Trong toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển, giá trị pH của
môi trường hầu như không thay đổi so với giá trị ban đầu.
3.6. Nghiên cứu các yếu tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γPGA của chủng B5 ở quy mô 100 lít/mẻ
3.6.1. Ảnh hưởng của chế độ khuấy và sục khí.
Đánh giá mức độ phát triển của vi sinh vật trong canh trường
bằng cách đó mật độ quang OD ở bước sóng 600nm ở thời gian 96h,
kết quả được thể hiện trong bảng 3.9:
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml)
Chế độ cấp khí
0h
24h
48h
72h
96h
γ-PGA
(g/l)
Tĩnh
Khuấy 350 v/p
Sục khí
10lít/phút
Khuấy 350 v/p +
sục khí 10 l/ph

1x106
1x106
1x106

4x106
7x108

8x108

5x108
1x109
2x109

7x103
1x109
1x109

2x102
4x107
5x107

3,8 ±0,02
19,7±0,03
24,1±0,02

1x106

2x109

6x109

1x109

7x107

25,3±0,05

Qua kết quả trong bảng 3.9 nhận thấy: khi nghiên cứu tại quy mô
100 lít/mẻ, nếu xét ở góc độ năng suất cao, nên kết hợp cả phương
pháp khuấy trộn và sục khí thì khả năng sinh tổng hợp γ-PGA sẽ cao
hơn so với các phương pháp lên men tĩnh, khuấy hoặc sục khí.
3.6.2. Sự thay đổi của hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình
lên men.
Khảo sát cho thấy nồng độ oxy hòa tan trong thiết bị lên men
giảm mạnh trong thời gian từ 0 đến 24h và nồng độ oxy hòa tan ở
giai đoạn 24 đến 48h rất thấp, sự tiêu thụ oxy cho quá trình sinh

13


trưởng và phát triển của vi khuẩn làm lượng oxy hòa tan trong dịch
giảm xuống cực tiểu, đồng nghĩa với sự sinh trưởng của vi sinh vật
đạt cực đại. Sau 48h quá trình tổng hợp γ-PGA đi vào giai đoạn tăng
trưởng, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đi vào giai
đoạn suy thoái. Sau 72h nồng độ γ-PGA và độ nhớt dịch lên men
tăng đến giá trị cực đại, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, gây ức
chế sự phát triển của vi khuẩn, rất ít oxy được sử dụng. Trong giai
đoạn này các đơn phân glutamic và các muối của nó được chuyển
hóa thành các chuỗi polyme γ-PGA.
3.7. Nghiên cứu một số phương án tinh sạch γ-PGA
Quá trình tinh sạch của γ-PGA được sử dụng để nghiên cứu dựa
trên những công bố khoa học của nước ngoài với 3 phương pháp đã
được công bố, các phương pháp được lựa chọn với mục các tiêu chí:
3.7.1. So sánh phương pháp tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm
lượng protein và carbonhydrat
Các mẫu nghiên cứu thu được, tiến hành tinh sạch trên 3 phương
pháp đã được quốc tế công bố, sau đó kiểm tra hàm lượng protein,

carbonhydrate và hiệu suất thu hồi sau khi tinh sạch. Thu được kết
quả trong bảng 3.10 sau:
Bảng 3.10: Hàm lượng protein và carbonhydrat còn lại sau khi tinh
sạch γ-PGA
Hàm lượng
Carbonhydrat
Hiệu suất
Mẫu
Protein
(µg/g)
(%)
(µg/g)
PP 1
8,1
6,39
78
PP 2
8,4
5,75
77
PP 3
9,6
7,01
73

Dựa trên những qui trình, kết quả sau khi tinh sạch có thể lựa
chọn phương pháp 1 làm phương pháp tinh sạch cho các nghiên cứu
sau. Nếu sử dụng cách này sẽ không phải sử dụng nhiều cồn và các
hóa chất gây hại cho cơ thể, môi trường (NaOH, HCl) như các
phương pháp còn lại.

3.7.2. Nghiên cứu đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi
tinh sạch
Đánh giá cảm quan và thông số độ nhớt cho các mẫu nghiên cứu
thấy phương pháp 1 có sử dụng than hoạt tính và celite (đất hoạt
tính) hai tác nhân này có tác dụng hấp thụ màu và hấp thụ mùi của

14


các sản phẩm nên không có mùi lạ như các phương pháp còn lại. Do
vậy phương pháp tinh sạch γ-PGA được lựa chọn cho các nghiên cứu
tiếp theo là phương pháp 1 như sau:

Hình 1.4. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phương pháp của Ho và cộng sự

3.7.3. Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Để đánh giá mức độ tinh sạch của sản phẩm, ngoài việc kiểm tra
protein, carbonhydrat có trong sản phẩm sau tinh sạch, ta còn có thể
kiểm tra các axit amin còn lại sau quá trình tinh sạch bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp sản phẩm γ-PGA. Kết quả sắc ký cho thấy
có sự hiển diện của axit L-glutamic, ngoài ra chỉ có 1 peak nhỏ thể
hiện sự lẫn tạp chất trong sản phẩm sau thủy phân, hình 3.22.
3.7.4. Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh sạch qua kính hiển vi
điện tử quét
Mẫu thô do vẫn còn lẫn nhiều tạp chất trong đó nên cấu trúc γPGA chưa được hiển thị rõ cấu trúc là các khối, sự hiển thị chỉ nhìn
thấy dưới dạng phẳng hai chiều, không làm nổi rõ các cấu trúc phân
tử của γ-PGA như ở mẫu tinh sạch và mẫu chuẩn. Giữa các mẫu tinh
sạch và mẫu chuẩn thấy sự rõ nét của các cấu trúc γ-PGA dưới dạng
không gian ba chiều. Mẫu tinh sạch thể hiện là các cụm nhỏ liên kết

với nhau thành nhiều đám rời rạc tạo ra những khoảng trống, mẫu

15


chuẩn cũng là những cụm nhỏ có hình bất định liên kết với nhau, tuy
nhiên sự liên kết này chặt chẽ và ít tạo khoảng trống, làm cho cấu
trúc nhìn trông mịn và liền khối.

Hình 3.24. Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA bằng kính hiển vi điện tử quét độ phóng
đại 100.000 lần
A-mẫu γ-PGA thô; B- mẫu γ-PGA sau tinh sạch; C- mẫu γ-PGA kiểm
chứng

3.7.5. Xác định cấu trúc và độ sạch của γ-PGA thông qua phổ
FT-IR và phổ H NMR.
Các phổ FT-IR và H NMR của γ-PGA sau tinh sạch thu được bởi
chủng Bacillus subtilis B5 cho thấy: có sự thể hiện của gốc muối
carboxyl (COO- giãn bất đối xứng) trong mẫu γ-PGA được phân tích,
phổ cũng thể hiện sự hình thành của liên kết C=O tuy nhiên bị che
bởi peak giãn của COO-. Tiếp đến là các giải phổ này có liên quan
đến các liên kết của nhóm NH; CH3; COO-; γ-CH2; α-CH2 và các
nhóm chức khác của γ-PGA. Những kết quả trên cũng cho thấy sự
kết hợp giữa hai phổ FT –IR và phổ H NMR để đánh giá cấu trúc
phân tử γ-PGA là tương đối giống nhau.

Hình 3.22. Sắc ký đồ HPLC mẫu γPGA thủy phân thành glutamic.

Hình 3.27. Phổ H NMR của γ-PGA tinh
sạch thu được bởi chủng B.subtilis B5

3.8. Nghiên cứu một số đặc tính của γ-PGA
3.8.1. Xác định khối lượng phân tử

16


Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử của các mẫu γ-PGA
bằng phương pháp điện di trên SDS Page các mẫu sau khi tinh sạch
cho thấy khối lượng phân tử các mẫu sau khi chạy điện di với marker
hiển thị màu chuẩn có thể xác định được khối lượng phân tử của γPGA lớn hơn 176 kDa.
Đánh giá khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm γ-PGA trên
sắc ký lọc gel (GPC) kết quả được sau khi tính toán dựa trên peak
thu nhận được khối lượng phân tử trung bình Mw của γ-PGA dao
động trong khoảng từ 158 – 426 Kda. Đối chiếu và so sánh với các
nghiên cứu về γ-PGA tạo ra bởi chủng Bacillus subtilis cho thấy
thông thường có khối lượng phân tử từ 100 – 1.500 kDa.
3.8.2. Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γPGA
Từ γ-PGA được tạo thành từ B. subtilis B5 sau khi thủy phân
băng axit và làm sạch sản phẩm đến độ tinh khiết nhất định, tiến
hành đo độ phân cực của hỗn hợp đồng phân quang học D và L
glutamic. Sau khi tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit là
47,97/52,03 trong hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh bởi B.
subtilis B5. Kết quả này cũng một lần nữa khẳng định cho nguồn gốc
chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA là B. subtilis.
3.8.3. Nghiên cứu tính bền axit của γ-PGA.
Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất của γ-PGA trên các
môi trường axit citric có nồng độ từ 0 – 30g/l qua việc xác định độ
nhớt của dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng của nồng
độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm của γ-PGA tại nồng độ 1

g/l.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của axit đến tính chất của sản phẩm
Axit citric
(g/l)
0
5
10
15
20
25
pH
7
3,45
2,94
2,74
2,6
2,46
Độ nhớt 4,5 ±
4,0 ±
4,0 ±
3,5 ±
3,0 ±
2,5 ±
(cp)
0,04
0,03
0,03
0,02
0,01
0,01

γ-PGA
30
2,38
3,0 ±
0,01

Kết quả khi nồng độ axit tăng (độ pH giảm) khả năng tạo nhớt
của γ-PGA giảm đi, đến nồng độ axit 20g/l sự biến đổi độ nhớt
không có sự thay đổi nhiều. Qua khảo sát này kết luận có thể sử dụng
γ-PGA trong các sản phẩm đồ uống có độ axit cao.
3.8.4. Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ-PGA

17


Để tìm hiểu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt của γ-PGA
hay tính bền nhiệt, tiến hành nghiên cứu với γ-PGA nồng độ 1 g/l để
ở các nhiệt độ 25oC; 50oC; 75oC; 100oC và 125oC trong thời gian 30
phút.

Hình 3.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi độ nhớt của dịch γ-PGA

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ nhớt γ-PGA tỷ lệ nghịch với
nhiệt độ, khi bị tác động của nhiệt độ càng cao độ nhớt của γ-PGA
càng giảm. Mức độ giảm độ nhớt của γ-PGA là rất nhỏ trong khoảng
nhiệt độ từ 75-100oC. Đây cũng là một đặc tính ưu việt khi sử dụng
γ-PGA áp dụng cho mỗi loại sản phẩm trong thực tế.
3.9. Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA
3.9.1. Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA

Sau khi nghiên cứu trên thực nghiệm thu được kết quả sấy phun
tốt nhất đối với chế phẩm γ-PGA trong bảng 3.14:
Bảng 3.14. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA

Chỉ tiêu
Chất trợ sấy: Maltodextrin
Nhiệt độ sấy
Tốc độ đĩa phun
Hiệu suất thu hồi
Lưu lượng dịch cấp
Đánh giá cảm quan

Thông số
5%
160 oC
11.00-12.000 v/ph
85,8 -90,4%
5 lít/h
Bột khô, hút ẩm chậm, màu trắng,
dễ lấy sau khi sấy phun. Độ hòa tan
tốt, không bị vón khi hòa tan
3.9.2. Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng
làm phụ gia thực phẩm.
Căn cứ theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN 421:2011/BYT) về phụ gia thực phẩm – với các loại phụ gia chất làm
dày. Căn cứ vào công bố sử dụng γ-PGA sản xuất từ vi khuẩn B.

18


subtilis của Công ty Ajinomoto đã công bố đến Cục quản lý thực

phẩm và dược phẩm Hoa kỳ về việc chấp nhận sử dụng γ-PGA từ B.
subtilis như một loại phụ gia thực phẩm an toàn. Sau khi áp dụng
những quy chuẩn kỹ thuật, sản phẩm γ-PGA được đem đi phân tích
kiểm nghiệm tại các phòng thí nghiệm đươc nhà nước công nhận. Từ
các kết quả phân tích cùng một số mẫu được kiểm tra tại cơ quan
chức năng, sản phẩm γ-PGA đã được Cục vệ sinh An toàn thực phẩm
xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm cho sản phẩm
PGA. Liều dùng thấp hơn 0,1% khối lượng sử dụng.
3.10. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong ổn định nước cam
3.10.1. Khảo sát chất lượng nguyên liệu
Kết quả khảo sát thể hiện cam nguyên liệu có tỉ lệ vitamin C khá
cao 40mg%, hàm lượng đường tổng số ở mức 9,0% cùng với hàm
lượng axit hữu cơ tổng số 0,6 %. Sau khi đánh giá các công thức, tỷ
lệ phối trộn trong nước cam cho thấy với tỷ lệ nước cốt chiếm 30%
là phù hợp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
3.10.2. So sánh ảnh hưởng của γ-PGA đến độ ổn định của nước
cam với các phụ gia khác
3.10.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định
khác thông qua chỉ số huyền phù:
Sử dụng γ-PGA cùng các loại phụ gia ổn định khác như CMC,
Xanthan Gum, Agar ở cùng một nồng độ như nhau là 0,05%, chế
biến ở cùng một chế độ công nghệ, sau khi phối chế, thanh trùng, bảo
ôn và sau bảo ôn được đem đi phân tích chỉ số huyền phù không bền
theo phương pháp Krop để đánh giá mức độ phân tách của sản phẩm,
cho kết quả trong đồ thị hình 3.32.

Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia
thường dùng khác trong việc ổn định cho nước cam

19

Chỉ số huyền phù không bền được sử dụng để đánh giá độ ổn
định của nước cam. Nếu chỉ số này càng cao đồng nghĩa với chất
lượng nước cam càng kém ổn định. Trước thanh trùng mẫu nước
cam có bổ sung CMC có chỉ số huyền phù không bền thấp nhất nên
độ ổn định cao nhất, trong khi đó độ ổn định của mẫu chứa γ-PGA
thấp nhất. Tuy nhiên, sau quá trình thanh trùng, độ ổn định của nước
cam có sử dụng γ-PGA tăng lên rõ rệt và còn cao hơn cả mẫu chứa
CMC. Sau quá trình bảo ôn chỉ số huyền phù không bền trong tất cả
các mẫu đều tăng dần phản ánh độ ổn định giảm nhưng mẫu chứa γPGA vẫn giữ được độ ổn định cao hơn mẫu không bổ sung hóa chất
khá nhiều. Hơn nữa, độ ổn định của mẫu bổ sung γ-PGA này đạt
được thậm chí là vượt so với các mẫu bổ sung hai loại phụ gia thông
dụng như CMC và Xanthan gum. Do đó γ-PGA có thể sử dụng làm
phụ gia làm ổn định nước cam đầy tiềm năng, bởi nó giữ cho nước
cam được luôn ở trạng thái đồng nhất, không bị lắng cặn, tách lớp.
3.10.2.2. Ảnh hưởng của γ-PGA và các phụ gia ổn định nước cam
thông qua sự biến đổi độ nhớt.
Sự ảnh hưởng của các chất phụ gia đến chất lượng nước cam đối
với các chất phụ gia được khảo sát cho thấy các chỉ số độ nhớt của
các mẫu đều bị giảm sau quá trình thanh trùng, điều đó chứng tỏ sự
ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định cấu trúc của các phụ gia. Lý giải cho
hiện tượng độ nhớt giảm sau thời gian bảo quan là do nồng độ axít
trong nước cam ảnh hưởng đến độ bền của các cấu trúc phân tử các
phụ gia này gây ra hiện tượng phân cắt mạch làm giảm độ nhớt
3.10.2.3. Ảnh hưởng γ-PGA đến màu sắc sản phẩm nước cam.
Tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung ΔE cho thấy sự
thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy sự biến đổi nhiều nhất của
mẫu γ-PGA, mẫu Xanthan Gum và mẫu CMC xu hướng biến đổi
màu sắc của các mẫu nước cam này là màu nhạt đi, thiên về màu

vàng, các mẫu sử dụng Agar và mẫu đối chứng màu sắc sản phẩm
không thay đổi nhiều, tuy nhiên có xu hướng sẫm màu, chuyển sang
màu đen, giảm tính cảm quan của sản phẩm.
3.10.2.4. Đánh giá tính chất cảm quan của sản phẩm nước cam
có sử dụng γ-PGA và các loại phụ gia khác.
Kết quả đánh giá cảm quan trên các tiêu chí mùi, vị và trạng thái
các chất ổn định như: Xanthan gum, γ-PGA và CMC cho điểm đánh
giá cao, sản phẩm chất lượng đồng nhất sau quá trình bảo ôn. Qua

20


đánh giá cảm quan về chất lượng sản phẩm khi sử dụng γ-PGA và
một số phụ gia khác trong ổn định chất lượng sản phẩm nước cam,
cho thấy γ-PGA có khả năng ổn định trong môi trường nước quả có
độ axít từ 3g/l đến 5 g/l, tương tự như các chất phụ gia cùng loại như
CMC và Xanthan Gum
3.10.3. Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam
Tiến hành các thí nghiệm với các nồng độ γ-PGA là 0,05%;
0,10%; 0,15% và 0,20% trong sản phẩm nước cam, sau đó đem đi
đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm.
Bảng 3.21. Chất lượng cảm quan của nước cam ép đục ở các tỷ lệ
bổ sung γ-PGA

Nồng độ bổ sung γ-PGA trong nước cam (%)
Chỉ tiêu đánh giá
cảm quan
ĐC
0,05
0,10

0,15
0,20
Tổng điểm chưa
12
13,5
13,2
12,1
11,7
có hệ số trọng
lượng
Điểm chất lượng
16,52
17,8
17,41
15,6
15,04
Xếp loại
Khá
Khá
Khá
Khá
TB
Kết quả thu được với nồng độ γ-PGA là 0,05% cho điểm chất
lượng cao nhất, có điểm cảm quan về màu sắc, mùi vị và hình thái
cao. Lựa chọn công thức tương ứng với tỷ lệ bổ sung γ-PGA cho sản
phẩm là 0,05%.
3.10.4. Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng tới chất lượng cảm
quan của nước cam
Nhiệt độ 80oC, 90oC và thời gian 5, 10, 15 phút sản phẩm có
hương tốt và màu sắc thì không đổi vàng đẹp. Ở nhiệt độ 100oC thì

thời gian là 5 phút thì màu sắc và hương vị không đổi nhưng thanh
trùng ở 10 phút và 15 phút thì sản phẩm có mùi nấu chín. Do vậy
nghiên cứu đã đưa ra lựa chọn thanh trùng nước cam ở nhiệt độ 90oC
cho thanh trùng nước cam có sử dụng γ-PGA nồng độ 0,05% trong
thời gian 10-15 phút.
3.11. Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong cải thiện chất lượng giò
3.11.1. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt
xay.
Nghiên cứu này được dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo
của khối thịt khi sử dụng mỗi loại phụ gia. Các phụ gia được sử dụng
trong nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate (STPP),

21


borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) và chitosan là những phụ
gia đã được sử dụng và không được sử dụng trong ngành chế biến
thực phẩm hiện nay. Các phụ gia được sử dụng mức giới hạn của Bộ
Y tế cho phép và phụ gia bị cấm trong danh mục (hàn the) được sử
dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%), mục đích của việc sử
dụng phụ gia bị cấm nhằm so sánh, gợi mở ra những thay đổi trong
việc sử dụng phụ gia an toàn trong thực phẩm hình 3.36.

Hình 3.36. Biểu đồ ảnh hưởng của Hình 3.37. Biểu đồ lực nén và lực cắt
phụ gia tạo cấu trúc đến chất lượng của giò thành phẩm
khối thịt xay.

3.11.2. Ảnh hưởng của các loại phụ gia đến chất lượng của giò.
3.11.2.1 Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén và lực cắt.
Sự thay đổi về tính chất, cấu trúc của khối thịt xay trong quá trình

làm giò đã phần nào đánh giá được mức độ ảnh hưởng của các loại
phụ gia đến quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên để phân tích
đánh giá cấu trúc của sản phẩm cần đánh giá trên các mẫu sản phẩm
cuối cùng. Các mẫu phụ gia được bổ sung vào các mẫu giò nghiên
cứu sau đó được chế biến trong cùng một điều kiện (bao gói tiêu
chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ như nhau) các
mẫu được bảo ôn và đem đi phân tích trên máy đo cấu trúc cho kết
quả trong hình 3.37.
Khi kết hợp giữa hai yếu tố lực nén và lực cắt lên sản phẩm giò có
thể đánh giá được mức độ giòn, cứng của sản phẩm. Nhìn vào biểu
đồ 3.37 về lực nén (LN) và lực cắt (LC) của máy đo cấu trúc phân
tích giò thành phẩm cho thấy lực nén của các mẫu có sử dụng
Chitosan và γ-PGA là lớn nhất, đồng nghĩa với độ đàn hồi và độ
cứng của giò thành phẩm là tốt nhất. Để đánh giá mức độ đồng nhất,
độ đàn hồi về cấu trúc của giò tiến hành thử nghiệm cường lực gel

22


đối với các mẫu khi sử dụng các loại phụ gia khác nhau, kết quả cho
thấy cường lực gel lớn nhất ở mẫu có sử dụng chitosan thấp hơn nữa
lần lượt là các mẫu chứa γ-PGA; STPP; Tinh bột biến tính và thấp
nhất là hàn the và mẫu đối chứng. Qua phân tích về cường lực gel
một lần nữa khẳng định việc sử dụng chitosan và γ-PGA làm phụ gia
ổn định cải thiện cấu trúc trong sản phẩm giò lụa là ưu việt và an
toàn.
3.11.2.2. Đánh giá chất lượng giò sử dụng các loại phụ gia tạo
cấu trúc bằng phương pháp cảm quan
Các mẫu giò sau khi được đánh giá qua phân tích lực nén, lực cắt
được phân tích bằng phương pháp cảm quan để đánh giá chất lượng,

kết quả cho thấy: Khả năng sử dụng các loại phụ gia thực phẩm trong
việc ổn định và cải thiện chất lượng của giò được thử nghiệm so sánh
giữa γ-PGA và 4 loại phụ gia khác hiện đang được sử dụng rộng rãi
trên thị thường sản xuất, cho thấy γ-PGA có khả năng ổn định trạng
thái, cho màu sắc đặc trưng của giò tươi, có thể thay thế các phụ gia
độc hại như hàn the, tạo cấu trúc trong sản phẩm giò tốt hơn khi sử
dụng các hợp chất photphat và các loại tinh bột biến tính. Về mặt
ứng dụng thực tiễn và hiệu quả kinh tế chưa đáp ứng được như
chitosan, nhưng ở một góc độ nhất định γ-PGA có khả năng tạo màu
cho sản phẩm nên đây cũng là một lợi thế của γ-PGA trong quá trình
ứng dụng.
3.11.3. Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lượng của giò.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của γ-PGA đến khả năng ổn định, cải
thiện cấu trúc của giò cho thấy ở nồng độ 0,1% γ-PGA cải thiện
được chất lượng giò tốt hơn các phụ gia hiện đang sử dụng trên thị
trường.
Từ nghiên cứu thực tế cho thấy có thể sử dụng γ-PGA nồng độ
0,20% làm phụ gia trong chế biến giò, nhằm cải thiện chất lượng giò,
thay thế cho hàn the đang sử dụng tràn lan trên thị trường chế biến.
KẾT LUẬN
Sau một quá trình nghiên cứu, luận án đã thu được kết quả cơ bản
sau:
Từ các mẫu thực phẩm truyền thống đã phân lập được 27 chủng
vi khuẩn và đã tuyển chọn được chủng B5 có khả năng sinh tổng hợp
γ-PGA cao từ sản phẩm tương Bần. Bằng phương pháp xác định đặc

23


điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử đã định tên

được chủng B5 là B. subtilis B5.
Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố và phương pháp quy
hoạch thực nghiệm bậc 2 Box- Bernken đã xác định được điều kiện
tối ưu chủng B. subtilis B5 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất natri
glutamat là 25 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống
5%, nuôi tĩnh ở nhiệt độ 39,7oC, pH = 8 sau thời gian 97 giờ thu
nhận γ-PGA có nồng độ 25,02 g/l.
Đã đưa ra quy trình thu nhận, tinh sạch chế phẩm γ-PGA dạng
bột: Chủng giống Lên men Dịch lên men Bổ sung H2O gia nhiệt
(100oC) Tảy màu, tảy mùi Lọc thô Lọc tinh Kết tủa bằng cồn 98%
(2 lần, tỷ lệ 3:1) Thẩm tích γ-PGA Sấy phun (maltodextrin 5%,
nhiệt độ 160oC ở 11.000 v/p, lưu lượng cấp dịch 5 l/h) Chế phẩm γPGA dạng bột. Hiệu suất thu hồi γ-PGA trên thực tế triển khai quy
mô pilot so với tính toán lý thuyết đạt 95%.
Đã xác định được cấu trúc và một số đặc tính của sản phẩm γPGA thu được: Mw>158 kDa, trong γ-PGA có chứa α NH+ và γ
COO-; tỷ lệ đồng phần D:L glutamic – 47,97:52,03; có tính chất nhớt
trong vùng axít từ pH 2,5 đến 7,0; bền nhiệt trong khoảng 25–125oC
và đáp ứng tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm, về vi sinh vật và
hàm lượng kim loại nặng.
Bước đầu thử nghiệm ứng dụng γ-PGA 0,05% trong ổn định nước
cam tự nhiên và 0,1- 0,2% trong sản phẩm giò lụa cho kết quả tốt.
Chế phẩm γ-PGA có thể dùng để thay thế hàn the trong chế biến bảo
quản giò cũng như các sản phẩm chế biến từ thịt khác.
Các hướng nghiên cứu tiếp tục dự kiến.
- Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong lĩnh vực nông nghiệp và mỹ
phẩm
- Nghiên cứu tạo γ-PGA từ các phụ phẩm của nhà máy chế biến
thực phẩm
- Nghiên cứu sản xuất các túi đựng sinh học từ γ-PGA

24