khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao methanol và các cao phân đoạn được ly trích từ thân cây cỏ mực (eclipta alba)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC
----------

TRẦN HOÀNG HẢI

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CAO METHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ĐƢỢC
LY TRÍCH TỪ THÂN CÂY CỎ MỰC (Eclipta alba)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: SINH HỌC

Cần Thơ, 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC
----------

TRẦN HOÀNG HẢI

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CAO METHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ĐƢỢC
LY TRÍCH TỪ THÂN CÂY CỎ MỰC (Eclipta alba)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: SINH HỌC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
GV. VÕ THỊ TÚ ANH

Cần Thơ, 2015


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37
LỜI CAM KẾT

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và cô hướng dẫn.
Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kì một luận văn nào trước đây.
Cán bộ hướng dẫn
Ký tên

Võ Thị Tú Anh

Tác giả luận văn
Ký tên

Trần Hoàng Hải


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

PHẦN KÝ DUYỆT

Cán bộ hướng dẫn

Tác giả luận văn

Ký tên

Ký tên

Võ Thị Tú Anh

Trần Hoàng Hải

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37
LỜI CẢM ƠN


Để hoàn thành được luận văn thì ngoài sự nổ lực và phấn đấu của bản thân trong
việc học tập, tìm tòi và nghiên cứu thì cũng còn không ít khó khăn. Nhờ có sự giúp đỡ,
động viên của quý thầy cô, cha mẹ, gia đình, bạn bè chính là nguồn động viên to lớn,
tạo nên động lực để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn. Với tấm lòng trân trọng và sự
biết ơn sâu sắc, em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến:
Cô TS. Đái Thị Xuân Trang và GV. Võ Thị Tú Anh đã tận tình hướng dẫn, truyền
đạt những kiến thức vô cùng quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi và luôn động viên
giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn.
Cô Ngô Thị Kim Thoa, cô Lý Thị Thanh Thủy, thầy TS. Nguyễn Trọng Tuân đã
tạo mọi điều kiện cho em được sử dụng các thiết bị và dụng cụ trong phòng thí nghiệm
để thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Bộ môn Sinh Học, Bộ môn
Hóa Học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên.
Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình và tập thể lớp Sinh
học K37 đã luôn bên cạnh, động viên tinh thần và tạo điều liện cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cám ơn
Cần Thơ, tháng 04 năm 2014

TRẦN HOÀNG HẢI


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

MỤC LỤC
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH................................................................................................... v
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ .................................................................... vi
TÓM TẮT ................................................................................................................... vii
1. MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2
2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
2.1. Các khái niệm về dịch tễ học nhiễm trùng ..................................................... 3
2.1.1. Thực trạng ................................................................................................... 3
2.1.2. Sơ lƣợc về bệnh nhiễm trùng ..................................................................... 3
2.1.2.1. Nhiễm trùng và lây lan ......................................................................... 3
2.1.2.2. Bệnh nhiễm trùng trong cộng đồng nói chung và bệnh nhiễm trùng
bệnh viện ...................................................................................................................... 4
2.1.2.3. Bệnh nhiễm trùng nhanh và bệnh nhiễm trùng chậm ...................... 4
2.1.2.4. Bệnh nhiễm trùng ngoại sinh và bệnh nhiễm trùng nội sinh ........... 4
2.2. Một số vi khuẩn gây hại phổ biến ................................................................... 4
2.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli .......................................................................... 4
2.2.1.1. Hệ thống phân loại khoa học .............................................................. 4
2.2.1.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 5
2.2.1.3. Tính chất nuôi cấy ................................................................................ 5
2.2.1.4. Kháng nguyên ....................................................................................... 5
2.2.1.6. Dịch bệnh do E. coli gây ra .................................................................. 6
2.2.2. Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ........................................................... 7
2.2.2.1. Hệ thống phân loại khoa học .............................................................. 7
2.2.2.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 7

2.2.2.3. Tính chất nuôi cấy ................................................................................ 7
2.2.2.4. Kháng nguyên ....................................................................................... 8
2.2.2.6. Dịch bệnh do P. aeruginosa gây ra ...................................................... 9
2.2.3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................................... 10
2.2.3.1. Hệ thống phân loại khoa học .............................................................. 10
2.2.3.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 10
2.2.3.3. Tính chất nuôi cấy ................................................................................ 10
2.2.3.4. Kháng nguyên ....................................................................................... 11
2.2.3.5. Dịch bệnh do S. aureus gây ra ............................................................. 11
i


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

2.2.4. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ............................................................ 12
2.2.4.1. Hệ thống phân loại khoa học .............................................................. 12
2.2.4.2. Đặc điểm hình thái................................................................................ 12
2.2.4.3. Tính chất nuôi cấy ................................................................................ 13
2.2.4.4. Kháng nguyên ....................................................................................... 13
2.2.4.5. Dịch bệnh do V. parahaemolyticus gây ra.......................................... 13
2.3. Sơ lƣợc về cây cỏ mực ...................................................................................... 14
2.3.1. Hệ thống phân loại khoa học ..................................................................... 14
2.3.2. Đặc điểm cây cỏ mực .................................................................................. 14
2.3.3. Khả năng kháng khuẩn của các hợp chất bên trong cỏ mực ................. 14
2.4.4. Một số dƣợc tính quan trọng khác ............................................................ 16
3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 17
3.1. Phƣơng tiện và vật liệu thí nghiệm ................................................................. 17
3.1.1. Phƣơng tiện thí nghiệm .............................................................................. 17

3.1.2. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 17
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ..................................................................... 18
3.2.1. Địa điểm ....................................................................................................... 18
3.2.2. Thời gian...................................................................................................... 18
3.3. Hóa chất ............................................................................................................. 18
3.4. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 19
3.4.1. Xử lý nguyên liệu và điều chế cao tổng (methanol) ................................. 19
3.4.2. Điều chế các cao phân đoạn (hexane, chloroform, ethyl acetate) .......... 21
3.4.3. Phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao thân ly trích
từ cây cỏ mực (Eclipta alba) ....................................................................................... 24
3.4.3.1. Chuẩn bị môi trƣờng ............................................................................ 24
3.4.3.2. Pha loãng cao chiết ............................................................................... 24
3.4.3.3. Nhân mật số vi khuẩn........................................................................... 26
3.4.3.4. Khuếch tán trên thạch.......................................................................... 26
3.4.4. Thống kê phân tích số liệu ......................................................................... 26
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................ 27
4.1. Hiệu suất chiết cao ............................................................................................ 27
4.2. Đối chứng âm….. .............................................................................................. 28
4.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao thân cây cỏ mực với kháng
sinh thƣơng mại .......................................................................................................... 28
4.3.1. Khảo sát hoạt tính kháng E. coli của các loại cao thân cây cỏ mực với
kháng sinh thƣơng mại.............................................................................................. 28

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

4.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng P. aeruginosa của các loại cao thân cỏ mực với
kháng sinh thƣơng mại............................................................................................... 31
4.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng S. aureus của các loại cao thân cây cỏ mực với
kháng sinh thƣơng mại............................................................................................... 33
4.3.4. Khảo sát hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của các loại cao thân cây
cỏ mực với kháng sinh thƣơng mại ........................................................................... 35
4.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của từng loại cao thân cỏ mực ................. 37
4.4.1. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao methanol thân cỏ mực ................. 37
4.4.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao hexane thân cỏ mực ..................... 38
4.4.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chloroform thân cỏ mực ............. 39
4.4.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao ethyl acetate thân cỏ mực ........... 41
5. Kết luận và kiến nghị ............................................................................................. 42
5.1. Kết luận ............................................................................................................. 42
5.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 43
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 48

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µm
cm
CDC
DA

DPPH
EMB
EMS/AHPNS
HUS
FRAP
LB
mm
PABA
PCA
SS
TCBS

micrometers
centimeters
Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh
Môi trường Desoxycholate Agar
1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl
Môi trường Eosine Methylene Blue
Hội chứng hủy hoại gan tụy cấp
Hội chứng tán huyết – tăng urê máu
Phương pháp chống oxy hóa bằng cách khử sắt Ferric
Reducing Antioxidant Power
Môi trường Luria – Bertani
millimeters
para-aminobenzoic acid
Môi trường Plate Count Agar
Môi trường Salmonella-Shigella
Môi trường Thiosulfate-Citrate Bile Salts

iv

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: E. coli........................................................................................................... 4
Hình 2.2: P. aeruginosa .............................................................................................. 7
Hình 2.3: S. aureus...................................................................................................... 10
Hình 2.4: V. parahaemolyticus ................................................................................... 12
Hình 2.5: Cỏ mực (Eclipta alba) ................................................................................ 14
Hình 3.1: Sự tách lớp trong quá trình chiết cao hexane ......................................... 22
Hình 3.2: Quy trình pha loãng cao chiết .................................................................. 25
Hình 4.1: Khả năng kháng E. coli cao methanol thân đƣợc sắp xếp theo chiều
tăng dần nồng độ ........................................................................................................ 29
Hình 4.2: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn của cao
methanol thân ............................................................................................................. 37
Hình 4.3: Khả năng kháng khuẩn các loại cao methanol thân trong cùng điều
kiện nồng độ ................................................................................................................ 38
Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn của cao
hexane thân ................................................................................................................. 38
Hình 4.5: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn của cao
chloroform thân .......................................................................................................... 40
Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn của cao
ethyl acetate thân ........................................................................................................ 41

v

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 4.1: Hiệu suất chiết cao của 3 bộ phận rễ, thân và lá cỏ mực ...................... 27
Bảng 4.2: Hoạt tính kháng E. coli của các loại cao thân với kháng sinh thƣơng
mại ................................................................................................................................ 28
Bảng 4.3: Hoạt tính kháng P. aeruginosa của các loại cao thân với kháng sinh
thƣơng mại .................................................................................................................. 31
Bảng 4.4: Hoạt tính kháng S. aureus của các loại cao thân với kháng sinh thƣơng
mại ................................................................................................................................ 33
Bảng 4.5: Hoạt tính kháng V. parahaemolyticus của các loại cao thân với kháng
sinh thƣơng mại .......................................................................................................... 35
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu và điều chế cao methanol cỏ mực............ 20
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các cao phân đoạn ................................................... 23

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

TÓM TẮT
Cỏ mực sau khi được thu hái ở huyện Cờ Đỏ, Thành phố Cần Thơ được tách lấy
phần thân, sấy khô và xử lý qua một số dung môi như methanol, hexane, chloroform và
ethyl acetate để có được cao tổng (methanol) và các cao phân đoạn. Hoạt tính kháng
khuẩn của các cao chiết được thực hiện trên các đối tượng: Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Vibrio parahaemolyticus ở 5

nồng độ: 8 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml và 128 µg/ml bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch. Kết quả khảo sát cho thấy, hầu hết các loại cao thân cỏ mực
đều có hoạt tính kháng khuẩn tốt ở cả 4 dòng vi khuẩn. Các hợp chất bên trong cao
methanol thân cây cỏ mực rất có hiệu quả đối với V. parahaemolyticus, kích thước
vòng vô khuẩn lớn nhất do cao methanol thân tạo ra là 34,33±0,58 mm ở nồng độ
128 µg/ml. Hiệu quả kháng khuẩn của cao chiết thân cây cỏ mực đối với E. coli tương
đối thấp trong số 4 dòng vi khuẩn khảo sát, cao hexane thân cỏ mực có hiệu quả kháng
E. coli tương đối tốt hơn so với các cao chiết còn lại, kích thước vòng vô khuẩn lớn
nhất cao hexane thân tạo ra là 24,67±1,53 mm ở nồng độ 32 µg/ml.
Từ khóa: Cỏ mực, Eclipta alba, kháng khuẩn, khuếch tán trên đĩa thạch, vi khuẩn.

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Chƣơng 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vào những thập niên đầu của thế kỷ XXI, con người đã phải đối mặt với rất nhiều
vấn đề mang tính toàn cầu, một trong những vấn đề mang tính toàn cầu đáng được
quan tâm nhất hiện nay có lẽ phải kể đến thực trạng nhiễm khuẩn. Trong những năm
gần đây, ngộ độc thực phẩm đang gia tăng đến mức cảnh báo ở nhiều quốc gia trên thế
giới; trong đó: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens,
Salmonella, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus
và Bacillus cereus là những tác nhân chính dẫn đến hàng loạt trường hợp chết người.
Bên cạnh chất lượng thực phẩm ngày một đi xuống, thực trạng nhiễm khuẩn nguồn
nước cũng bắt đầu có chiều hướng gia tăng. Một cuộc khảo sát trong nước cho thấy,
nước uống gia đình không đạt chỉ tiêu vi sinh nhiều nhất chiếm đến 52% mẫu kiểm tra,

nước uống đóng chai và nước uống công ty không đạt chỉ tiêu lần lượt là 20% và 28%.
Trong số các chỉ tiêu vi sinh, Pseudomonas aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm cao nhất,
chiếm đến 62% (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007).
Đứng trước thực trạng nhiễm khuẩn ngày một nghiêm trọng, nhiều người đã lựa
chọn kháng sinh như một giải pháp hàng đầu trong việc điều trị nhiễm khuẩn.
Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh vẫn còn tồn tại rất nhiều hạn chế như: phát sinh tác
dụng phụ, vi khuẩn dễ đột biến kháng thuốc, ô nhiễm môi trường,… làm mất lòng tin
người tiêu dùng. Nhận thức được mối nguy hiểm lâu dài kháng sinh mang lại, một số
hộ gia đình có xu hướng chuyển sang sử dụng thảo mộc thiên nhiên để điều trị nhiễm
khuẩn như nghệ, gừng, tỏi, cam thảo,… trong đó có cả cỏ mực.
Cỏ mực (Eclipta alba) là một loại cây phổ biến, mọc hoang ở nhiều nơi trên đất
nước. Theo kinh nghiệm dân gian, cỏ mực rất có hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh
nhiễm khuẩn. Mặc dù đã được sử dụng nhiều trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn
nhưng vẫn có rất ít bằng chứng khoa học cho thấy khả năng kháng khuẩn của các hợp
chất được ly trích từ cỏ mực.
1


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Việc chứng minh một cách khoa học tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất
được ly trích từ thân cây cỏ mực là cần thiết. Kết quả thí nghiệm nhằm góp phần làm
ổn định chất lượng sống của con người, đồng thời đưa nền y học dân tộc lên một tầm
cao mới.
Đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO
METHANOL VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ĐƢỢC LY TRÍCH TỪ THÂN CÂY
CỎ MỰC (Eclipta alba)” là một vấn đề mang tính cấp thiết trong cuộc sống hiện nay.
Từ kết quả mong muốn có được sẽ làm tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo về khả

năng kháng khuẩn của các các cơ quan còn lại cây cỏ mực, làm giảm nhẹ nỗi lo về dịch
bệnh trên người và gánh nặng kinh tế quốc gia.
1.2. Mục tiêu đề tài:
●

Tách chiết các hợp chất bên trong thân cây cỏ mực.

●

Khảo sát hoạt tính kháng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus và Vibrio parahaemolyticus của cao thân cây cỏ mực ở 5
nồng độ: 8 µg/ml, 16 µg/ml, 32 µg/ml, 64 µg/ml và 128 µg/ml.
●

Xác định loại cao thân có hiệu quả kháng khuẩn tối ưu nhất đối với từng loại

vi khuẩn khảo sát.
●

So sánh hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thân cây cỏ mực với một số kháng

sinh thương mại phổ biến.

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Chƣơng 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1

Các khái niệm về dịch tễ học nhiễm trùng

2.1.1

Thực trạng
Những tiến bộ to lớn của y học đã giúp chuẩn đoán và điều trị cũng như đề phòng

được nhiều bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên, bệnh nhiễm trùng vẫn chiếm vị trí quan trọng
ngay cả ở những nước công nghiệp phát triển. Đặc biệt ở các nước đang phát triển,
nhiễm trùng là nguyên nhân hàng đầu của bệnh tật, tử vong, … và cho đến nay, chỉ có
bệnh đậu mùa là bệnh duy nhất bị tiêu diệt trên Trái Đất. Thêm vào đó, các bệnh nhiễm
trùng mới xuất hiện ngày một nhiều, nguy hiểm, tính chất lây lan rộng rãi đưa loài
người vào nhiều tình huống khó khăn. Bệnh nhiễm trùng ở các nước đang phát triển
thường gắn liền với những tình trạng suy dinh dưỡng, văn hóa thấp kém và các hành vi
liên quan đến xã hội (Đinh Thanh Huề, 2006).
Sơ lƣợc về bệnh nhiễm trùng

2.1.2

Theo Đinh Thanh Huề (2006), có 4 khía cạnh để phân loại các bệnh về nhiễm
trùng là: nhiễm trùng và lây lan, bệnh nhiễm trùng trong cộng đồng nói chung và bệnh
nhiễm trùng trong bệnh viện, bệnh nhiễm trùng nhanh và nhiễm trùng chậm, nhiễm
trùng nội sinh và nhiễm trùng ngoại sinh.
2.1.2.1

Nhiễm trùng và lây lan

Nhiễm trùng là sự xâm nhập của một vi sinh vật gây bệnh vào bên trong một cơ
thể ký chủ (người hay động vật), vi sinh vật có khả năng phát triển bên trong ký chủ
đó. Nếu hoạt động chuyển hóa của vi sinh vật ảnh hưởng đến chuyển hóa của cơ thể ký
chủ thì sẽ xuất hiện bệnh.
Truyền nhiễm là sự truyền một bệnh nhiễm trùng nào đó từ cơ thể này sang cơ thể
khác do tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp.
Không phải bệnh nhiễm trùng nào cũng có khả năng lây lan, các bệnh như: uốn
ván, histoplasmosis, plastomycosis,… dưới một góc độ nào đó sẽ không lây nhiễm.
3


Luận văn tốt nghiệp Đại học
2.1.2.2

Sinh học k37

Bệnh nhiễm trùng trong cộng đồng nói chung và bệnh nhiễm trùng

trong bệnh viện
Theo cách nói chung, nhiễm trùng cộng đồng là bệnh nhiễm trùng thường gặp ở
một tập thể, những bệnh nhân nhập viện có tầm quan trọng khác biệt, bệnh lây truyền
theo phương thức khác biệt và để kiểm soát cần có một tiếp cận dịch tễ học đặc biệt.
2.1.2.3

Bệnh nhiễm trùng nhanh và bệnh nhiễm trùng chậm

Các bệnh nhiễm trùng cổ điển trong nhiều trường hợp, xuất hiện sau một thời kỳ
ủ bệnh tương đối ngắn, thường dưới 2 tháng. Những phát hiện mới đây cho thấy có
nhiều bệnh có thời kỳ ủ bệnh rất dài, thường gọi là những bệnh nhiễm trùng chậm.

2.1.2.4

Nhiễm trùng ngoại sinh và nhiễm trùng nội sinh

Thông thường, vi sinh vật gây bệnh khi xâm nhập vào cơ thể ký chủ sẽ dẫn đến
tác động qua lại với đặc điểm là gây biến đổi cơ thể ký chủ: đó là trường hợp nhiễm
trùng ngoại sinh. Nhưng có khi sự xâm nhập này không dẫn đến hậu quả gây bệnh
ngay cho ký chủ, mà chỉ xảy ra sau một thời gian dài với sự hiện diện của vi sinh vật
một cách thụ động trong cơ thể ký chủ, thường gọi là nhiễm trùng nội sinh.
2.2

Một số vi khuẩn gây hại phổ biến

2.2.1

Vi khuẩn Escherichia coli

2.2.1.1

Hệ thống phân loại khoa học
Lãnh giới

Bacteria

Ngành

Proteobacteria

Lớp

Gamma Proteobacteria

Bộ

Enterobacteriales

Họ

Enterobacteriaceae

Chi

Escherichia

Loài

E. coli

Hình 2.1: E. coli
4

( />

Luận văn tốt nghiệp Đại học
2.2.1.2

Sinh học k37

Đặc điểm hình thái

E. coli là một trực khuẩn hình que ngắn, dài khoảng 6 µm và rộng 2-3 µm, tròn ở
hai đầu, tế bào thường đứng riêng lẽ nhưng đôi khi cũng xếp thành chuỗi ngắn, có tiêm
mao quanh thân nên có thể di động, rất ít chủng E. coli có vỏ. Vi khuẩn không có khả
năng sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Như Thanh and et al, 2007).
2.2.1.3

Tính chất nuôi cấy

E. coli là một vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý, dễ dàng phát triển trên các môi
trường nuôi cấy thông thường. Một số chủng E. coli có thể phát triển trên môi trường
tổng hợp nghèo dinh dưỡng. E. coli có thể sinh trưởng tốt ở 15-44ºC nhưng tốt nhất là
ở 37ºC. pH thích hợp cho E. coli phát triển thường giao động từ 5,5-8,5 nhưng tốt nhất
là ở mức 7,4 (Nguyễn Như Thanh and et al, 2007).
Trong điều kiện môi trường thích hợp, E. coli phát triển rất nhanh, thời gian để
sản sinh ra một thế hệ mới chỉ mất khoảng 20 phút. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng
(canh thang), sau 3 đến 4 giờ E. coli có khả năng làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ
làm đục đều môi trường và sau 2 ngày tạo thành một váng mỏng trên bề mặt môi
trường. Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dùng kính lúp có thể
quan sát được những khuẩn lạc li ti. Sau 24 giờ, kích thước khuẩn lạc thường
khoảng 1,5 mm.
E. coli không phát triển trong môi trường Salmonella-Shigella (SS), Kauffmann
và môi trường Wilson Blair (Đoàn Thị Ngọc Tuyền, 2005).
2.2.1.4

Kháng nguyên

Từ năm 1930, Kauffmann đã đưa ra biểu đồ phân loại type huyết thanh của
E. coli dựa trên kháng nguyên thân (O), kháng nguyên vỏ (K), kháng nguyên lông (H).
●

Kháng nguyên O được cấu tạo bởi phức hợp lipopolysaccharide, có liên kết

chéo về đặc tính huyết thanh với vi khuẩn khác như Shigella, Salmonella.

5


Luận văn tốt nghiệp Đại học
●

Sinh học k37

Kháng nguyên K có thành phần chính là polysaccharide có tính acid được

chia ra làm 3 nhóm A, B và L. Tính ngưng kết của nhóm A không bị bất hoạt ở
121ºC trong khi L bị bất hoạt ở 100ºC trong 1 giờ.
●

Kháng nguyên H có tính đa dạng phụ thuộc vào sự hiện diện của tiêm mao ở

từng chủng. Nhiều E. coli ban đầu khi phân lập thì không di động hoặc chuyển
động chậm nhưng đến khi chuyển qua môi trường thạch bán rắn thì chuyển động
tích cực. Chỉ những chủng di động mới có kháng nguyên H.
2.2.1.5

Dịch bệnh do E. coli gây ra

Trong những năm gần đây, dịch bệnh do E. coli đang bùng phát mạnh mẽ tại các
nước Châu Âu. Năm 1996, dịch E. coli bùng phát tại Anh gây ra 11 ca tử vong và 216
trường hợp nhiễm bệnh. Năm 2011, E. coli trở thành một đại dịch nguy hiểm ở Đức,

làm hơn 3.800 người nhiễm bệnh và cướp đi sinh mạng của hơn 54 người, nhiều nạn
nhân may mắn thoát chết cũng rơi vào tình trạng suy thận nghiêm trọng. Theo bản báo
cáo của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh châu Âu, dịch bệnh đang có
chiều hướng lây lan sang các quốc gia lân cận. Tại Thụy Điển, các nhà chức trách địa
phương đã phát hiện ra 9 trường hợp mắc phải hội chứng HUS (hội chứng tán huyết –
tăng urê máu do nhiễm phải chủng E. coli O157:H7), trong đó có 4 người vừa đến
miền bắc nước Đức. Đan Mạch có 4 người nhiễm, Anh có 3 người nhễm và Hà Lan có
1 người bị nhiễm phải hội chứng HUS (ECDC, 2011).
Một cuộc khảo sát ở Việt Nam cho thấy, trong tổng số 90 mẫu thịt kiểm tra có
đến hơn 50% số mẫu bị nhiễm E. coli. Toàn bộ 100% chủng phân lập được có độc lực
cao, đều gây chết chuột bạch trong phòng thí nghiệm trong vòng 24-72 giờ. Trong số
các chủng E. coli phân lập được, có 3 chủng thuộc về serotype O26, O55, O157 có thể
gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng (Trần Thị Hương Giang và Huỳnh Thị
Mỹ Lệ, 2012).

6


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

2.2.2

Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

2.2.2.1

Hệ thống phân loại khoa học
Giới

Bacteria

Ngành

Proteobacteria

Lớp

Gramma Proteobacteria

Bộ

Pseudomonadales

Họ

Pseudomonadaceae

Chi

Pseudomonas

Loài

P. aeruginosa

Hình 2.2: P. aeruginosa
( />?img=3173056_ijn-6-1937f6&req=4)

2.2.2.2

Đặc điểm hình thái

P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, có lông duy nhất ở một đầu, thường dài
1,5-3 µm và rộng 0,5-1 µm. Hầu hết các chủng P. aeruginosa đều có vỏ và khả năng
di động (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2007).
2.2.2.3

Tính chất nuôi cấy

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Thu Trang (2007), P. aeruginosa là
vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối, có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-42ºC nhưng thích hợp nhất
là 37ºC ở mức pH trung tính, dễ dàng phát triển trong các môi trường thông thường.
Khi được nuôi cấy trên môi trường thạch máu khoảng sau 8 đến 10 giờ, có thể
quan sát thấy những khuẩn lạc li ti dưới kính lúp. Hình thái khuẩn lạc điển hình là dạng
S (Smooth), nhưng cũng có thể gặp dạng R (Rough) hoặc M (Mucoid), trong đó khuẩn
lạc dạng M và dạng S có khả năng gây bệnh mạnh nhất (Nguyễn Thị Hải, 2010).
●

Khuẩn lạc dạng S: đường kính 1-2 mm, tròn, trơn và hơi lồi sau 18-24 giờ,

có thể tan máu beta, có ánh kim, có sắc tố xanh lục, có thêm mùi thơm đặc biệt
như mùi nho.
7


Luận văn tốt nghiệp Đại học
●

Sinh học k37

Khuẩn lạc có dạng R: có kích thước nhỏ hơn so với dạng S, thô ráp, lồi,

thường phân lập được từ ngoại cảnh.
●

Khuẩn lạc dạng M: khuẩn lạc dạng nhày, tan máu beta.

Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố và chất thơm. Chất
thơm do trực khuẩn mủ xanh sinh ra là kimetylamin. Trực khuẩn mủ xanh có khả năng
tiết 4 loại sắc tố (Nguyễn Thị Hải, 2010).
●

Pyocyanin: là sắc tố phenazin, có màu xanh da trời, tan trong nước và tan

trong chloroform, 96% P. aeruginosa có khả năng sinh sắc tố pyocyanin.
Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí, dễ
dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thường hoặc
dùng môi trường King A để phát hiện sinh sắc tố.
●

Pyoverdin (hay còn gọi là fluorescent): sắc tố có màu xanh lục, tan trong

nước nhưng không tan trong chloroform. Dùng môi trường King B để phát hiện
sắc tố pyoverdin.
●

Pyorubrin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P. aeruginosa sinh sắc tố

pyorubrin.
●

Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ có 1 đến 2% số chủng P. aeruginosa

sinh sắc tố pyomelanin.
Có khoảng 5 đến 10% số chủng P. aeruginosa không sinh sắc tố.
2.2.2.4

Kháng nguyên

P. aeruginosa có 2 loại kháng nguyên: H và O (Nguyễn Hoàng Thu Trang, 2010).
●

Kháng nguyên H: là kháng nguyên lông của vi khuẩn. Kháng nguyên

thường không chịu được nhiệt, bị cồn 50º và các men tiêu protein phá hủy, chịu
được tác động của formol 0,5%.
●

Kháng nguyên O: là kháng nguyên thân, đã có đến 16 loại do đó dựa vào

kháng nguyên O để phân chia P. aeruginosa thành 16 type huyết thanh ký hiệu từ
8


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

P1 đến P16. Kháng nguyên O có đặc điểm chịu nhiệt, rất độc, kháng cồn nhưng
lại bị phá hủy bởi formol 0,5%.
2.2.2.5

Dịch bệnh do P. aeruginosa gây ra

Tỷ lệ P. aeruginosa gây nhiễm khuẩn bệnh viện đang tăng dần trong những năm
gần đây trên thế giới và cả Việt Nam. Cùng với sự gia tăng về tỷ lệ nhiễm khuẩn là sự
gia tăng về khả năng kháng kháng sinh, cụ thể là carbapenem. Theo báo cáo mới nhất
của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC) ước tính rằng ở Hoa Kỳ, hơn
hai triệu người bị bệnh mỗi năm với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì
có ít nhất 23.000 người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh có liên quan đến
P. aeruginosa. Trong số các ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa có hơn 6.000
ca (13%) là đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng. Ở Anh có hơn
50% chủng P. aeruginosa kháng Getamincin, 39% kháng Ceftazidime, 32% kháng
Piperacillin và 30% kháng Ciprofloxacin (T L. Pitt, 2003).
Ở Việt Nam, nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc trong năm 2006-2007
bao gồm 2 bệnh viện Trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh, 17 bệnh viện tuyến huyện
cho thấy có 553 người trong tổng số 7571 người mắc phải nhiễm trùng bệnh viện. Có 3
loại nhiễm khuẩn chính là: viêm phổi (41,9%), nhiễm khuẩn vết mổ (27,5%) và nhiễm
khuẩn tiêu hóa (13,1%). Căn nguyên chính của 3 loại nhiễm khuẩn là:
Acinetobacter baumannii (23,3%) và P. aeruginosa (31,5%). Theo kết quả nghiên cứu
từ 4 bệnh viện Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, bệnh viện 108 và bệnh viện 103 từ năm
2005-2008 cho thấy P. aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao
đối với các loại kháng sinh như: Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và
Getamicin (54%).

9

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

2.2.3

Vi khuẩn Staphylococcus aureus

2.2.3.1

Hệ thống phân loại khoa học
Lãnh giới Bacteria

2.2.3.2

Giới

Eubacteria

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Bộ

Bacillales

Họ

Staphylococcaceae

Chi

Staphylococcus

Loài

S. aureus

Hình 2.3: S. aureus
( />011/January/16011101.asp)

Đặc điểm hình thái

S. aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính khoảng 0,5-1,5 µm, có
thể đứng riêng lẽ, từng đôi, từng chuỗi ngắn hoặc từng chùm không đều nhau dạng
chùm nho. Vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, cư trú trên da, màng nhày
trong các cơ quan của con người và động vật máu nóng (Phạm Trần Xuân Hiền, 2006).
2.2.3.3

Tính chất nuôi cấy

Theo Nguyễn Trần Hải Hoàng (2014), S. aureus dễ dàng phát triển ở môi trường
thông thường, là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi. Phát triển được ở nhiệt độ 10-45ºC, mọc tốt
ở 37ºC nhưng tạo sắc tố tốt ở 20ºC. Ở môi trường canh thang thì sau 5-6 giờ làm đục
môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn. Ở môi trường thạch, khuẩn

lạc lồi, bóng láng, óng ánh, đường kính 1-2 mm, có thể có màu vàng đậm, vàng cam
hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ở môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát
triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn. Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố
(hemolysine) là: α, β, γ, δ và ε.

10


Luận văn tốt nghiệp Đại học
2.2.3.4

Sinh học k37

Kháng nguyên

S. aureus có chứa nhiều loại kháng nguyên như: protein, polysaccharide, acid
teichoic của vách tế bào vi khuẩn (Nguyễn Trần Hải Hoàng, 2014).
●

Acid teichoic: là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu làm tăng tác

dụng hoạt hóa bổ thể. Acid teichoic là một thành phần của kháng nguyên O có tác dụng
như một chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này thường gắn vào
polysaccharide của tụ cầu vàng.
●

Protein A: là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một

tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng. 100% chủng tụ cầu vàng có protein này.
●

Vỏ polysaccharide: bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên và có thể

chứng minh bằng phương pháp huyết thanh học. Vỏ của tụ cầu cũng có tác dụng chống
thực bào bởi vỏ đã che phủ peptidoglycan của vách, làm cho bổ thể này không có chỗ
bám để hoạt hóa theo đường tắt.
2.2.3.5

Dịch bệnh do S. aureus gây ra

Ngộ độc do S. aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonella. Những thực phẩm bị
nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá, gà và sản phẩm của chúng, rau cải,
trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem, phomai, thực phẩm lên men…(Normanno G.
and et al., 2004).
Ở Đài Loan, S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến năm
1995. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trường trung học
ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khi
ăn sáng (Wei H.L., Chiou and et al., 2002).
Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 người
bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có nhiễm tụ cầu (Simeão L.C and et al., 2002).

11


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Tại Pháp, năm 1997 các nhà chức trách địa phương đã phát hiện ra S. aureus là
tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm (Rosec J.P. và Gigaud

O., 2002).
Tại Mỹ, từ năm 1969-1990 có đến 50% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký
sinh trong thịt gây ra (đặc biệt là thịt muối), 22% số vụ ngộ độc thực phẩm do
S. aureus ký sinh trong gia cầm, 8% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh
trong sữa và sản phẩm từ sữa, 7% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh trong
cá, tôm, cua hoặc ghẹ và 3,5% số vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus ký sinh trong
trứng (Wieneke and et al., 1993).
2.2.4

Vi khuẩn V. parahaemolyticus

2.2.4.1

Hệ thống phân loại khoa học
Giới

Bacteria

Ngành

Proteobacteria

Lớp

Gamma Proteobacteria

Bộ

Vibrionales

Họ

Vibrionaceae

Chi

Vibrio

Loài

V. parahaemolyticus

Hình 2.4: V. parahaemolyticus
( />
2.2.4.2

Đặc điểm hình thái

V. parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình que không đều nhau, không sinh
nha bào và di chuyển bằng 1 tiêm mao.

2.2.4.3

Tính chất nuôi cấy
12


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

V. parahaemolyticus là vi khuẩn rất khó phát triển trên các loại thạch thông
thường. Vi khuẩn có thể phát triển được ở nhiệt độ từ 15ºC-65ºC, nhưng thuận lợi nhất
là ở 37ºC. pH thích hợp ở mức 7,8-8,6.
V. parahaemolyticus khi được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, có khả năng
làm đục môi trường rất nhanh.
Thiosulfate-Citrate Bile Salts (TCBS) là môi trường phát triển đặc trưng cho
vi khuẩn V. parahaemolyticus. Khuẩn lạc thường không màu (dễ bắt màu của môi
trường nuôi cấy), tâm thường bắt màu xanh lá cây đậm hơn so với màu của môi trường,
đường kính thường giao động từ 3-4 mm. Phản ứng tán huyết rất rõ trong môi trường
thạch máu.
2.2.4.4

Kháng nguyên

V. parahaemolyticus có 3 loại kháng nguyên là: O, H và K.
●

Kháng nguyên thân O: chịu nhiệt, được chia thành 12 type.

●

Kháng nguyên lông H.

●

Kháng nguyên vỏ K: không chịu nhiệt, được chia thành 59 type.

2.2.4.5

Dịch bệnh do V. parahaemolyticus gây ra

V. parahaemolyticus có thể gây ra viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết thương
và nhiễm trùng huyết ở người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm trọng vì sinh
vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc các độc tố của chúng sinh ra có thể tồn tại lâu dài và
lưu thông trong máu. Bệnh viêm ruột do V. parahaemolyticus là bệnh truyền nhiễm cấp
tính, thường xâm nhập vào cơ thể thông qua thực phẩm.
V. parahaemolyticus là tác nhân gây độc phổ biến ở nhiều nước châu Á như
Trung Quốc, Nhật Bản và Đài Loan; ở khắp châu Âu như Tây Ban Nha, Pháp và ở
khắp châu Mỹ, điển hình là Hoa Kỳ (Daniels et al., 2000). Tại Việt Nam từ năm 1999
đến năm 2008 đã có khoảng 1.000 vụ ngộ độc thực phẩm được báo cáo với trên 25.000
người mắc, trong đó có 300 người tử vong. Riêng tại tỉnh Khánh Hòa, từ năm 1995 đến
13