Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc an giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa của tetrastigma erubescens planch và nauclea orientalis (l ) l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THỊ ANH ĐÀO

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY
THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA
ERUBESCENS PLANCH. VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L.

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THỊ ANH ĐÀO

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY
THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA
ERUBESCENS PLANCH. VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L.
Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
Mã số chuyên ngành: 62 44 01 18
Phản biện 1: TS. Tôn Thất Quang
Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương
Phản biện 3: TS. Mai Đình Trị
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Trần Khắc Vũ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1.PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
2. PGS.TS. Trần Lê Quan

TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015

Tp. Hồ Chí Minh - Năm
Phản biện độc lập 2:


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến:
PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS. TS. Trần Lê Quan, người đã tận
tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Cô
Thầy luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
PGS.TS. Nguyễn Trung Nhân và các Quý Thầy Cô trong Bộ môn Hóa Phân
Tích đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các môn học phần bổ sung.
Thạc sỹ Nguyễn Xuân Hải và các bạn cùng phòng thí nghiệm đã luôn chia sẻ
những kinh nghiệm cũng như tạo cho tôi những giây phút vui vẻ giữa những tháng
ngày miệt mài với công việc.
TS. Trương Thị Huỳnh Hoa cùng các kỹ thuật viên phòng máy NMR và
HPLC-MS thuộc phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm-ĐH Khoa học Tự nhiênĐH Quốc gia TP. HCM.
PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương cùng các anh chị thuộc Trung tâm Sâm và
Dược liệu TP. HCM- ĐH Y Dược TP. HCM.
Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều
kiện thuận lợi giúp tôi giải quyết các thủ tục hành chính.
Ban Giám hiệu và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩmTrường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện về
thời gian, cũng như các đồng nghiệp đã gánh vác công việc, hỗ trợ tôi trong thời

gian tôi đi học.
Con xin cám ơn Ba Mẹ và Bố Mẹ đã hỗ trợ, động viên con yên tâm hoàn thành
việc học. Cảm ơn Anh và hai Con đã cho em một gia đình êm ấm để em vững tin
tiếp tục học tập và công tác.


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án Tiến sĩ Hóa học “Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số
cây thuốc An giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa,
bảo vệ gan của Tetrastigma erubescens Planch. và Nauclea orientalis (L.) L.” là do
tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS.
Trần Lê Quan. Những kết quả nghiên cứu trong luận án này chưa được các tác giả
khác công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Điều này đã được kiểm tra bằng
cách tra cứu tài liệu tham khảo cung cấp bởi phần mềm SciFinder.
Tôi xin cam đoan danh dự về công trình khoa học này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 09 năm 2015
Tác giả luận án

Phan Thị Anh Đào


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
MỞ ĐẦU

..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA ........................................................ 2
1.1.1 Khái niệm về gốc tự do .................................................................................... 2
1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể .................................................... 3
1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể ................................................................... 7
1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa ................................................................. 10
1.1.5 Phân loại ........................................................................................................ 11
1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa..................................... 16
1.2 TỒNG QUAN VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY
HÓA...............................................................................................................................20
1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH. .......... 21
1.3.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Tetrastigma erubescens Planch.
................................................................................................................................ 21
1.3.2 Nghiên cứu về dược học của cây T.erubescens ............................................. 22
1.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây T.erubescens ............................ 23
1.3.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetrastigma ............................... 24
1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L............................. 28
1.4.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) L. ....... 28
1.4.2 Nghiên cứu dược học của cây N. orientalis................................................... 30
1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N. orientalis .................................. 31
1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Nauclea ........................................ 34
1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU .............................................................................. 39


1.5.1 Những vấn đề còn tồn tại ............................................................................... 39

1.5.2 Định hướng nghiên cứu ................................................................................. 40
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 42
2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ............................................................................. 42
2.1.1 Hóa chất ......................................................................................................... 42
2.1.2 Thiết bị ........................................................................................................... 42
2.2 ĐIỀU CHẾ MẪU CAO SÀNG LỌC, TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP
CHẤT TINH KHIẾT ..................................................................................................... 44
2.2.1 Nguyên liệu .................................................................................................... 44
2.2.2 Điều chế các mẫu cao methanol .................................................................... 51
2.2.3 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây T.erubescens ......................... 51
2.2.4 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây N.orientalis ........................... 55
2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC .......................................................... 59
2.3.1 Nguyên tắc ..................................................................................................... 59
2.3.2 Chuẩn bị mẫu ................................................................................................. 59
2.3.3 Điều kiện chạy HPLC .................................................................................... 59
2.3.4 Điều kiện chạy MS ........................................................................................ 60
2.3.5 Dựng đường chuẩn ........................................................................................ 60
2.3.6 Xử lý kết quả ................................................................................................. 61
2.3.7 Nơi thực nghiệm ............................................................................................ 61
2.4 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA ............................................... 61
2.4.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH .............................................. 61
2.4.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ................................. 63
2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên chuột nhắt bị suy giảm hệ
miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) ............................................ 65
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................... 67
3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA .......................... 67
3.1.1 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH....................................... 67
3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid .................... 70
3.1.3 Bàn luận kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa ................... 71

3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY
T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS ..................................................... 73
3.2.1 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây T. erubescens ............. 73
3.2.2 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây N. orientalis ............... 74
3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY TETRASTIGMA
ERUBESCENS PLANCH. ............................................................................................. 75
3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng ............................. 75
3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất stilbene ........................................... 86
3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoid ........................................ 93
3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất benzopyranoid ....................... 112
3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan ........................................... 116
3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất steroid .................................... 119
3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất norisoprenoid ............................... 130
3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA
ORIENTALIS (L.) L. .................................................................................................... 133
3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng ........................... 134
3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoid .............................. 138
3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất triterpenoid ................................... 147
3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoid ............................. 157
3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất anthraquinone............................... 170
3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan ........................................... 172
3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................................ 174
3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA................................................... 175
3.6.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ............................... 175
3.6.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............. 181
3.6.3 Kết quả nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm miễn dịch ở chuột nhắt bằng
cyclophosphamide (mô hình in vivo) .................................................................... 183
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 187
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AO (AH)

: Antioxidant (chất kháng oxy hóa)

Asc

: Ascorbic acid (vitamin C)

BHA

: Butylated hydroxyanisole

br

: Broad (rộng)

BHT

: Butylated hydroxytoluene

CHCl3

: Chloroform

CTPT

: Công thức phân tử

CY

: Cyclophosphamide

d

: Doublet (mũi đôi)

DEPT

: Distortionless enhancement by polarization transfer

DMSO

: Dimethyl sulfoxide

DNA

: Acid deoxyribonucleic

DPPH

: 2,2-diphenylpicrylhydrazyl

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

ET

: Electron transfer methods

GSH

: Glutathione

HAT

: Hydrogen atom transfer methods

HMBC

: Heteronuclear multiple bond correlation

HR-ESI-MS

: High resolution electro spray ionization mass spectroscopy

HSQC

: Heteronuclear single quantum coherence

IC50

: Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do

J

: Hằng số ghép

m

: Multiplet (mũi đa)

MDA

: Malonyldialdehyde

NADPH

: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NMR

: Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

NOS

: Nitrogen oxygen species

NP

: Nomal phase (pha thường)

PBS

: Phosphate buffered saline

PG

: Propyl gallate

Pr

: Protein


PTLC

: Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế)

quin

: quintet (mũi năm)

RNS

: Reactive nitrogen species

ROS

: Reactive oxygen species

s

: Singlet (mũi đơn)

SEM

: Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình)

SKC

: Sắc ký cột

TBA

: Acid thiobarbituric

TBHQ

: tert-Butylhydroquinone

TCA

: Acid Trichloroacetic

TLC

: Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng)

Trolox

: Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic

UV

: Ultraviolet (tử ngoại)

XO

: Xanthine oxidase

YHCT

: Y học cổ truyền


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1

Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp .......................................................... 12

Hình 1.2

Công thức cấu tạo của acid L-ascorbic và acid dehydro ascorbic ......... 14

Hình 1.3

Công thức cấu tạo của vitamin E ............................................................... 14

Hình 1.4

Công thức cấu tạo của β-carotene.............................................................. 15

Hình 1.5

Công thức cấu tạo của taurine và hypotaurine .......................................... 15

Hình 1.6

Công thức cấu tạo của acid α-lipoic ........................................................... 15

Hình 1.7

Phản ứng trung hòa gốc DPPH .................................................................. 17

Hình 1.8

Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric .......... 19

Hình 1.9

Ảnh minh họa cây và quả của T. erubescens............................................. 21

Hình 1.10

Cấu trúc các hợp chất béo phân lập từ chi Tetrastigma ............................ 25

Hình 1.11

Cấu trúc các hợp chất steroid phân lập từ chi Tetrastigma ....................... 25

Hình 1.13

Cấu trúc các hợp chất phenol phân lập từ chi Tetrastigma ....................... 26

Hình 1.14

Cấu trúc các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Tetrastigma ................... 27

Hình 1.15

Cấu trúc hợp chất trans-reveratrol phân lập từ chi Tetrastigma ............... 27

Hình 1.16

Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen phân lập từ chi Tetrastigma ............ 28

Hình 1.17

Cấu trúc một số hợp chất khác phân lập từ chi Tetrastigma ..................... 28

Hình 1.18

Ảnh minh họa cây, hoa và lá của N. orientalis .......................................... 29

Hình 1.19

Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ cây N. orientalis .............. 33

Hình 1.20

Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo phân lập từ cây N. orientalis33

Hình 1.21

Cấu trúc một số hợp chất terpenoid phân lập từ cây N. orientalis ............ 34

Hình 1.22

Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ cây N. orientalis ......... 34

Hình 1.24

Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea ....... 38

Hình 1.25

Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea ................. 39

Hình 3.1

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-2................................................. 77

Hình 3.2

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-4................................................. 79

Hình 3.3

Tương quan HMBC của hợp chất DR-5 ................................................... 81

Hình 3.4

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-9 ................................ 85

Hình 3.5

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-10 .............................. 88

Hình 3.6

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-11 .............................. 90

Hình 3.7

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-12 .............................. 92


Hình 3.8

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-13............................................... 94

Hình 3.9

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-14............................................... 96

Hình 3.10

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-15............................................... 98

Hình 3.11

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-17 ............................ 101

Hình 3.12

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-18 ............................ 104

Hình 3.13

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-19 ............................ 107

Hình 3.14a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ nhất của hợp
chất DR-20............. ................................................................................. 109
Hình 3.14b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ hai của hợp chất
DR-20............. ......................................................................................... 110
Hình 3.14c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-20 ............................ 110
Hình 3.15

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-21 ............................ 113

Hình 3.16

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-22 ............................ 115

Hình 3.17

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-23 ............................ 118

Hình 3.18

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-25............................................. 122

Hình 3.19

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-26............................................. 124

Hình 3.20

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-27............................................. 126

Hình 3.21

Tương quan HMBC trong hợp chất DR-28............................................. 128

Hình 3.22

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-29 ............................ 131

Hình 3.23

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-30 ........................... 133

Hình 3.24

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-5 .............................. 135

Hình 3.25

Tương quan HMBC trong hợp chất GV-6 .............................................. 137

Hình 3.26

Tương quan HMBC trong hợp chất GV-8 .............................................. 140

Hình 3.27

Tương quan HMBC trong hợp chất GV-9 .............................................. 141

Hình 3.28

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-10 ............................ 143

Hình 3.29

Tương quan HMBC trong hợp chất GV-12 ............................................ 146

Hình 3.30

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-13 ............................ 148

Hình 3.31

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-14 ............................ 151

Hình 3.32

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-15 ............................ 153

Hình 3.33

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-16 ............................ 156

Hình 3.34

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-17 ............................ 158


Hình 3.35

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-18 ............................ 160

Hình 3.36

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-19 ............................ 162

Hình 3.37

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-20 ............................ 164

Hình 3.38a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần aglycone của hợp
chất GV-21...... ........................................................................................ 167
Hình 3.38b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần đường của hợp chất
GV-21............. ......................................................................................... 168
Hình 3.38c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-21 ............................ 169
Hình 3.38d Tương quan NOESY trong hợp chất GV-21 ........................................... 169
Hình 3.39

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-22 ............................ 171

Hình 3.40

Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-23 ............................ 173

Hình 3.41

Tổng kết các hợp chất phenolic đơn vòng có hoạt tính kháng oxy hóa ........
.............................................................................................................178

Hình 3.42

Tổng kết các hợp chất benzopyranoid có hoạt tính kháng oxy hóa ........ 179

Hình 3.43

Tổng kết các hợp chất stilbene có hoạt tính kháng oxy hóa .................... 179

Hình 3.44

Tổng kết các hợp chất flavonoid có hoạt tính kháng oxy hóa ................. 180

Hình 4.1

Cấu trúc của 30 chất phân lập từ thân cây T. erusbescens ...................... 189

Hình 4.2

Cấu trúc của 23 chất phân lập từ thân cây N. orientalis .......................... 190


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1

Các dạng hoạt động của nitrogen ................................................................ 2

Bảng 1.2

Các dạng hoạt động của oxygen .................................................................. 2

Bảng 1.3

Các chất được phân lập từ các cây thuộc chi Tetrastigma ........................ 24

Bảng 1.4

Các hợp chất được phân lập từ các cây N. orientalis ................................ 31

Bảng 1.5

Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea ....................................................... 35

Bảng 2.1

Danh mục, tiêu chí lựa chọn, độ ẩm nguyên liệu và thu suất điều chế cao
chiết methanol của các cây thuốc nghiên cứu sàng lọc ............................. 45

Bảng 2.2

Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây T.erubescens .................. 51

Bảng 2.3

Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây T. erubescens .............. 53

Bảng 2.4

Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây N.orientalis .................... 55

Bảng 2.5

Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N. orientalis ................ 57

Bảng 2.6

Chương trình gradient pha động ................................................................ 59

Bảng 2.7

Khối lượng các mảnh ion phân tử được phân tách trên cột C18 ............... 60

Bảng 2.8

Điều kiện chạy MS .................................................................................... 60

Bảng 2.9

Dữ liệu đường chuẩn của các hợp chất cần định lượng ............................ 61

Bảng 2.10

Đường chuẩn của các hợp chất .................................................................. 61

Bảng 2.11

Bố trí thử nghiệm ....................................................................................... 65

Bảng 3.1

Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, trolox thử
nghiệm bằng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH.................................. 67

Bảng 3.2

Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của 82 mẫu cao sàng lọc theo phương
pháp ức chế gốc tự do DPPH ..................................................................... 67

Bảng 3.3

Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của tám mẫu cao thử nghiệm bằng phương
pháp ức chế gốc tự do DPPH ..................................................................... 69

Bảng 3.4

Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, trolox thử
nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............... 70

Bảng 3.5

Thu suất, phần trăm ức chế và giá trị IC50 của tám mẫu cao thử nghiệm
bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............................ 71

Bảng 3.6

Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn trích
ly từ thân cây T. erubescens ...................................................................... 73

Bảng 3.7

Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao
ethyl acetate của thân cây T. erubescens ................................................... 73

Bảng 3.8

Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn từ
thân cây N. orientalis ................................................................................. 74

Bảng 3.9

Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao
ethyl acetate của thân cây N. orientalis ..................................................... 75

Bảng 3.10

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-1 so sánh với acid 4-hydroxybenzoic 76

Bảng 3.11

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-2 so sánh với methyl 4hydroxybenzoate ........................................................................................ 77

Bảng 3.12

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-3 so sánh với acid protocatechuic .... 78

Bảng 3.13

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-4 so sánh với methyl protocatechuate80

Bảng 3.14

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-5 so sánh với acid vanillic................ 81

Bảng 3.15

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-6 so sánh với acid gallic ................... 82

Bảng 3.16

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-7 so sánh với methyl gallate ............ 83

Bảng 3.17

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-8 so sánh với catechol ...................... 84

Bảng 3.18

Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-9 so sánh với của mallonanoside B.. 86

Bảng 3.19

Số liệu phổ của hợp chất DR-10 so sánh với (E)-resveratrol .................... 88

Bảng 3.20

Số liệu phổ của hợp chất DR-11 so sánh với (E) 2,3,5,4’tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside .................................................. 90

Bảng 3.21

Số liệu phổ của hợp chất DR-12 so sánh với trans-polydatin ................... 92

Bảng 3.22

Số liệu phổ của hợp chất DR-13 so sánh với 6-demethoxytangeretin ...... 94

Bảng 3.23

Số liệu phổ của hợp chất DR-14 so sánh với tangeretin ........................... 96

Bảng 3.24

Số liệu phổ của hợp chất DR-15 so sánh với 6-demethoxynobiletin ........ 98

Bảng 3.25

Số liệu phổ của hợp chất DR-16 so sánh với nobiletin ........................... 100

Bảng 3.26

Số liệu phổ của hợp chất DR-17 so sánh với catechin và epicatechin .... 102

Bảng 3.27

Số liệu phổ của hợp chất DR-18 so sánh với (-)-epigallocatechin-3-Ogallate....................................................................................................... 104

Bảng 3.28

Số liệu phổ của hợp chất DR-19 so sánh với phlorizin ........................... 107

Bảng 3.29

Số liệu phổ của hợp chất DR-20 so sánh với phổ tham khảo.................. 111

Bảng 3.30

Số liệu phổ của hợp chất DR-21 so sánh với bergenin ........................... 113

Bảng 3.31

Số liệu phổ của hợp chất DR-22 so sánh với 4-O-galloylbergenin ......... 115


Bảng 3.32

Số liệu phổ của hợp chất DR-23 so sánh với (+)-lyoniresinol ................ 118

Bảng 3.33

Số liệu phổ của hợp chất DR-24 so sánh với -sitosterol ....................... 120

Bảng 3.34

Số liệu phổ của hợp chất DR-25 so sánh với stigmast-4-en-3-one ......... 122

Bảng 3.33

Số liệu phổ của hợp chất DR-26 so sánh với 3β-hydroxystigmast-5-en-7one ........................................................................................................... 124

Bảng 3.36

Số liệu phổ của hợp chất DR-27 so sánh với stigmast-4-ene-3β,6β-diol ......
...........................................................................................................129

Bảng 3.37

Số liệu phổ của hợp chất DR-28 so sánh với β-sitosterol-3-O-β-Dglucopyranoside ....................................................................................... 129

Bảng 3.38

Số liệu phổ của hợp chất DR-29 so sánh với loliolide ............................ 131

Bảng 3.39

Số liệu phổ của hợp chất DR-30 so sánh với (+)-dehydrovomifoliol ..... 133

Bảng 3.40

Số liệu phổ của hợp chất GV-5 so sánh với acid 3-(2,4dihydroxylphenyl)propanoic ................................................................... 135

Bảng 3.41

Số liệu phổ của hợp chất GV-6 so sánh với methyl 3-(2,4
dihydroxylphenyl)propanoate .................................................................. 137

Bảng 3.42

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-7 so sánh với acid trans-p-coumaric ...
..........................................................................................................141

Bảng 3.43

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-8 so sánh với umbelliferone........... 140

Bảng 3.44

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-9 so sánh với skimmin ................... 141

Bảng 3.45

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-10 so sánh với adicardin ................ 143

Bảng 3.46

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-11 so sánh với esculetin ................. 145

Bảng 3.47

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-12 so sánh với scopoletin............... 146

Bảng 3.48

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-13 so sánh với acid quinovic 3β-O-βD-glucopyranoside................................................................................... 148

Bảng 3.49

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-14 so sánh với acid quinovic 3β-O-βD-quinovopyranoside .............................................................................. 151

Bảng 3.50

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-15 so sánh với acid quinovic-3β-O-βD-glucopyranosyl-(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester ........................... 153

Bảng 3.51

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-16 so sánh với acid quinovic-3β-O-βD-quinovopyranosyl-(28→1)-β-D-glucopyranosyl ester ........................ 156

Bảng 3.52

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-17 so sánh với loganetin ................ 159


Bảng 3.53

Số liệu phổ NMR của hợp chất GV-18 so sánh với loganin ................... 159

Bảng 3.54

Số liệu phổ hợp chất GV-19 so sánh với sweroside ............................... 162

Bảng 3.55

Số liệu phổ hợp chất GV-20 so sánh với grandifloroside ....................... 165

Bảng 3.56

Số liệu phổ hợp chất GV-21 .................................................................... 168

Bảng 3.57

Số liệu phổ của hợp chất GV-22 so sánh với aloe emodin ..................... 171

Bảng 3.58

Số liệu phổ của hợp chất GV-23 so sánh với (+)-pinoresinol ................. 173

Bảng 3.60

Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các hợp chất phân lập trên hai cây176

Bảng 3.61

Hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid của 18 hoạt chất lựa chọn....3

Bảng 3.62

Thể trọng trước và sau thử nghiệm ở các lô ............................................ 183

Bảng 3.63

Hàm lượng malonyl dialdehyde trong gan chuột ở các lô....................... 184

Bảng 3.64

Hàm lượng glutathione trong gan chuột ở các lô .................................... 185

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 Các bộ phận cơ thể và các bệnh lý liên quan tới gốc tự do ............................ 7

Sơ đồ 1.2 Phân loại các chất kháng oxy hóa tự nhiên................................................... 12
Sơ đồ 2.1 Quá trình trích ly ............................................................................................ 51
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ điều chế các loại cao từ thân cây T. erubescens .................................. 52
Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ thân cây T.erubescens ................................. 54
Sơ đồ 2.4 Sơ đồ điều chế các loại cao từ thân cây N.orientalis ..................................... 56
Sơ đồ 2.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ thân cây N. orientalis .................................. 58
Sơ đồ 2.6 Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ............................................ 62
Sơ đồ 2.7 Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ................. 64


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến các vấn đề
gốc tự do, chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể con người,
khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn dịch, gốc
tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn các
quá trình sinh hóa trong cơ thể.[26,86] Gốc tự do được biết là thủ phạm có liên quan
tới nhiều căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ung
thư, viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson ….[26,86] Chất kháng oxy
hóa được đưa vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng
ngăn ngừa, ức chế và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp
hoặc gián tiếp. Nhu cầu và thị hiếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi,
nghiên cứu của các nhà khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời.
Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự
nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng
nhiều trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày.
Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú và đa
dạng, được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền (YHCT).[2,5,6,7] Có nhiều cây thuốc
được sử dụng trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự do như
ung thư, tim mạch, viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, cho đến nay, chưa
có bất kỳ một nghiên cứu quy mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có

hoạt tính kháng oxy hóa.
Do đó, luận án thực hiện với mục tiêu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các
cây thuốc An Giang, từ đó lựa chọn các cây thuốc có hoạt tính mạnh làm đối tượng
nghiên cứu phân lập và định danh các hoạt chất kháng oxy hóa.
Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa được sử dụng trong luận
án bao gồm phương pháp ức chế gốc tự do DPPH và ức chế quá trình peroxide hóa
lipid (mô hình in vitro) và mô hình thử nghiệm khả năng bảo vệ gan trên chuột
trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo).

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA
1.1.1 Khái niệm về gốc tự do
Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm
nguyên tử có chứa một hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài
cùng.[26,33,36]
Gốc tự do gồm hai dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen
(RNS- reactive nitrogen species) (bảng 1.1) và dạng hoạt động của oxygen (ROSreactive oxygen species) (bảng 1.2).
Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen [26]
Các dạng hoạt
động

Ký hiệu

Thời gian
tồn tại

Hoạt động

Nitric oxide

NO●

1s

Nitrogen dioxide
Acid
peroxynitrous
Peroxynitrite

NO2●

1s

ONOOH

Khá ổn định

ONOO─

10-3 s

Vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh
trung ương và ngoại biên.
Hình thành trong quá trình ô nhiễm không khí
Được hình thành khi ONOO─ nhận thêm một
proton.
Hoạt tính cao, hình thành từ NO● và O2●─

Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen [26]
Các dạng hoạt
động
Superoxide
Gốc hydroxyl

Ký
hiệu

Thời gian
tồn tại

O2●─

10-6s

HO●

10-9s

Alkoxyl
Gốc peroxyl
Hydroperoxide
hữu cơ
Hydrogen
peroxide

RO●
ROO●

1s
1s

ROOH

Ổn định

H2O2

Bền

Oxygen đơn bội

1

10-6s

Ozon

O3

O2

1s

Hoạt động
Tạo ra trong ty thể (mitochondria), hệ thống tim mạch
và các bộ phận khác
Hoạt tính cao, được tạo ra trong tình trạng cơ thể dư

chất sắt (phản ứng Fenton)
Hoạt tính cao, được hình thành khi các đại phân tử bị
gốc tự do tấn công
Phản ứng với các ion kim loại chuyển tiếp để tạo ra
các dạng hoạt động.
Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận một electron
để chuyển hóa thành gốc tự do HO●
Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học
(photosensitization) và phản ứng hóa học
Là một chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản
ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2.

Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao, dễ dàng tham gia vào
nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa…. Gốc

2


tự do có hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc
nhiều yếu tố: cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[83]
Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc
tự do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần
kinh trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt
động của nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là
tác nhân nguy hiểm gây ra nhiều bệnh lý.[26,86] Các dạng oxygen hoạt động này có
năng lượng cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học
như protein, lipid, DNA… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng
thời khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành
một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi
phản ứng thường gọi là phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có

tác hại đối với cơ thể.[26,86]
1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể
1.1.2.1. Nguồn nội sinh
Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô
hấp ở tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme
thân oxy hóa (prooxidant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp
trong cơ thể.
a) Quá trình hô hấp của tế bào [27,41,101]
Quá trình hô hấp ở tế bào là một chuỗi những phản ứng oxy hóa-khử và gốc tự
do là các sản phẩm trung gian được sinh ra trong quá trình này.
Ví dụ: quá trình khử oxygen tạo nước trong quá trình hô hấp tạo các gốc tự do
như O2●-, HO● thông qua những phản ứng như sau:
O2 + 4 H+ + 4e  2H2O

(1.1)

O2 + e  O2●-

(1.2)

H2O2  O2●- + 2H+ + e
H2O2 + H+ + e  HO● + H2O
HO●

+

H+

+ e  H2 O

(1.3)
(1.4)
(1.5)

3


Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ
hình thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là
phản ứng Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy ra giữa gốc O2●- và H2O2 tạo nên gốc
HO● và oxygen đơn bội:
O2●- + H2O2 

1O

2

+ HO● + HO-

(1.6)

Phản ứng 1.6 sẽ xảy ra nhanh hơn khi được xúc tác bởi các ion kim loại chuyển
tiếp như sắt, đồng, coban,… Oxygen đơn bội và gốc hydroxyl hình thành là những
gốc tự do có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại. Chúng là nguyên nhân chính
gây ra các quá trình peroxide hóa màng lipid.
b) Hội chứng viêm nhiễm [27,78]
Hội chứng viêm nhiễm là một phản ứng tự vệ của cơ thể sống nhằm chống lại
sự tấn công của các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ từ bên ngoài xâm nhập vào cơ thể
hoặc sinh ra ngay trong cơ thể.
Khi các vi khuẩn hoặc các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa

nhân trung tính (neutrophil) bao kín để làm nhiệm vụ thực bào. Lúc này, enzyme
NADPH oxidase ở màng bạch cầu được hoạt hóa, xúc tác phản ứng giữa O2 và
NADPH tạo nên gốc tự do O2●- (phản ứng 1.7), từ đó tạo nhiều gốc tự do khác nhằm
phân hủy các sinh vật lạ. Một phần các gốc tự do bị thoát ra ngoài bạch cầu, gây
nên những phản ứng viêm.
2O2 + NADPH

NADPH oxidase

c) Các enzyme thân oxy hóa

2O2●- + NADP

+ H+

(1.7)

[27,34,86]

Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do
như xanthine oxidase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxidase … Gốc O2●- và
NO● là hai gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy
hóa này.
- Xanthine oxidase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các
hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron trong quá trình phản
ứng và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2●-. Điều này được minh họa bằng phản
ứng 1.8 như sau:
4

O
HN
O

O

H
N
+

N
H

H 2O

+

2O2

XO

HN

N
O

N
H

H

N

2O2
O +

+

2H+ (1.8)

N
H

Sự tạo thành gốc O2●- bởi XO đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra các tổn
thương trong hiện tượng thiếu máu cục bộ (ischaemia injury).
- Nitric oxide synthase là một enzyme xúc tác sự oxy hóa L-arginine thành
citrulline và tạo gốc NO●. Enzyme này dùng NADPH làm chất chuyển electron
trong quá trình phản ứng. Nếu trong phản ứng có tồn tại gốc O2●- thì gốc O2●- dễ
dàng phản ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại đối với DNA).
- Enzyme myeloperoxidase được tạo ra do sự hoạt hóa bởi bạch cầu đa nhân
trung tính, sử dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl- tạo ra HOCl, một hợp chất không phải
là gốc tự do nhưng có khả năng oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho các mô cơ trong
quá trình viêm nhiễm.
d) Các ion kim loại chuyển tiếp [27,78]
Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxide cũng góp
phần sản sinh gốc tự do trong cơ thể. Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● dưới
xúc tác ion sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 và 1.10)
Fe2+ + H2O2  HO- + HO● + Fe3+

(1.9)

Fe3+ + H2O2  H+ + HOO● + Fe2+

(1.10)

Hai phản ứng trên được gọi là phản ứng Fenton. Ngoài sắt, các ion kim loại
chuyển tiếp khác như đồng, cobalt cũng có thể tham gia quá trình này.
1.1.2.2 Nguồn ngoại sinh
Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi
các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc, ozon …
a) Sự bức xạ [27]
Thành phần chủ yếu của cơ thể là nước, do đó các bức xạ có năng lượng cao
(tia X, tia UV…) khi chiếu vào cơ thể sẽ phân hủy các phân tử nước thành các gốc
tự do, có khả năng phản ứng rất mạnh (phản ứng 1.11 và 1.12):
H2O  HO● + H+ + e-aq

(1.11)

5


H2O  HO● + H●

(1.12)

Nếu trong nước có oxygen thì sẽ xảy ra phản ứng sau (phản ứng 1.13 và 1.14):
O2 + e-aq  O2●-

(1.13)

H● + O2  HOO● (gốc hydroperoxide)

(1.14)

Như vậy, dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO ●, O2●-, HOO● được
hình thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ
tăng lên tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia
cực tím đã làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxide
hóa lipid ở các tế bào da.
Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như
sự tự oxy hóa các lipid. Đồng thời, các phân tử DNA cũng là mục tiêu bị nguy hại
bởi các bức xạ vì các gốc tự do sản sinh từ sự phân giải nước sẽ tấn công các base
của DNA.
b) Khói thuốc lá [60]
Khói thuốc chứa một lượng lớn những hợp chất như aldehyde, epoxide,
peroxide và những gốc tự do như nitric oxide, gốc peroxyl, gốc với trung tâm
carbon hiện diện trong pha khí. Theo ước tính, trong một làn hơi thuốc lá có khoảng
1015 gốc tự do. Chúng có khả năng tồn tại trong thời gian dài cho đến khi chúng tấn
công túi phổi.
Bên cạnh đó, khói thuốc còn chứa các gốc tự do bền trong nhựa thuốc. Sự vi
xuất huyết là nguyên nhân chủ yếu của sự kết tủa sắt được tìm thấy ở mô phổi của
những người hút thuốc. Sắt trong thể này dễ dàng xúc tác cho phản ứng Fenton,
sinh ra gốc HO● độc hại.
c) Ozon [42]
Ozon là một trong những tác nhân độc hại tạo ra gốc tự do và sự ảnh hưởng của
nó trên cơ thể sống biểu hiện chủ yếu qua các tổn thương ở phổi và máu. Ozon có
thể phản ứng trực tiếp với các hợp chất bất bão hòa như các acid béo trong lipid
hoặc có thể tự phân hủy sinh ra O2, từ đó gia tăng khả năng hình thành các gốc tự
do trong cơ thể .

6

1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể
Theo ước tính, trung bình một ngày có khoảng 10 000-20 000 gốc tự do hoạt
động trong cơ thể con người.[36] Xét về phương diện có lợi, gốc tự do rất cần thiết
đối với các hoạt động của cơ thể sống. Trong quá trình trao đổi chất, gốc tự do đóng
vai trò trung gian di chuyển các điện tử từ phân tử này sang phân tử khác nhằm tạo
ra năng lượng. Gốc tự do góp phần cùng với bạch cầu tiêu diệt các vi sinh vật có
hại, tăng cường khả năng bảo vệ cho hệ thống miễn dịch của cơ thể. Gốc tự do giúp
tiêu diệt các vi sinh vật lạ, gốc tự do còn góp phần quét dọn những tế bào già, chết
trong cơ thể tạo điều kiện cho những tế bào mới sinh sôi, phát triển và tiêu diệt
những tế bào bất thường như tế bào ung thư. Ngoài ra, gốc tự do còn tham gia vào
nhiều quá trình có lợi khác cho cơ thể như đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh
(NO•) và tác nhân điều hòa huyết áp.





Não
Bệnh Parkinson
Bệnh Alzheimer
Thoái hoá thần kinh
Tai biến mạch máu não

Mạch máu
 Thiếu máu
 Đột qụi
 Huyết áp

Da
 Rối loạn chuyển hoá
porphyrin
 Lão hoá
 Viêm da
Tim
 Bệnh Keshan
 Xơ vữa động mạch
 Thiếu máu cơ tim

Mắt
 Đục thuỷ tinh thể
 Thoái hoá võng mạc /
điểm vàng.

Gốc tự
do
Hệ miễn dịch
 Viêm nhiễm mãn tính
 Bệnh lupus
 Viêm đường ruột

Thận
 Thận mãn tính
 Viêm cầu thận

Cơ quan khác
 Tiểu đường
 Lão hoá
 Mệt mỏi

Khớp
 Viêm khớp
 Thấp khớp
 Thoái hoá khớp

Phổi
 Hen phế quản
 Dị ứng
 Ung thư phổi

Sơ đồ 1.1 Các bộ phận cơ thể và các bệnh lý liên quan tới gốc tự do [25,85]

7


Trong cơ thể sống luôn tồn tại sự cân bằng các dạng hoạt động và dạng kháng
oxy hóa, đó là một trạng thái cân bằng nội môi (homeostasis). Tuy nhiên, do ảnh
hưởng của nhiều yếu tố tác động ngoại sinh làm gia tăng nồng độ của các dạng hoạt
động (ROS và RNS), vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống kháng oxy hóa
trong cơ thể. Hiện tượng stress oxy hóa (oxidative stress) xảy ra, mang lại nhiều
nguy hại cho con người khi các gốc tự do bùng phát và tấn công các phân tử sống
như lipid, protein, DNA và có thể gây chết tế bào.[82,84] Các bộ phận cơ thể chịu sự
tấn công của gốc tự do và các bệnh lý liên quan được trình bày trong sơ đồ 1.1.
Theo các nhà khoa học, gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra nhiều căn bệnh (sơ
đồ 1.1), đáng kể nhất gồm có: viêm khớp, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ
tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp, xơ gan, thiếu máu cơ tim...

[26,86]

Các bệnh

lý này thường xảy ra do quá trình tổn thương oxy hóa trong cơ thể.
1.1.3.1 Sự tổn thương do quá trình peroxide hóa lipid [82,84]
Trong cơ thể, ngoài nước ra thì các tổ chức màng chiếm phần lớn và giữ vai trò
quan trọng. Thành phần của màng chủ yếu là các acid béo chưa no,
phospholipid,…Vì vậy, xác suất các gốc tự do tấn công vào thành phần lipid gây ra
quá trình peroxide hóa lipid là rất cao. Quá trình peroxide hóa là sự tương tác của
các dạng oxygen hoạt động với các acid béo chưa no, tạo ra nhiều sản phẩm độc hại
và các phản ứng gốc tự do lan truyền trong cơ thể. Quá trình peroxide hóa lipid là
chuỗi phản ứng gốc tự do điển hình với ba giai đoạn: khơi mào, phát triển và kết
thúc.
Trong giai đoạn khơi mào, gốc HO• sẽ lấy một nguyên tử hydrogen trong nhóm
methylene của lipid (LH) hình thành gốc tự do lipid (L•) (phản ứng 1.15). Gốc tự do
lipid sẽ tiếp tục phản ứng với oxygen trong cơ thể tạo gốc tự do lipid peroxyl
(LOO•). Gốc LOO• sẽ hình thành hợp chất lipid hydroperoxide (LOOH) bằng cách
lấy đi một nguyên tử hydrogen từ một acid béo không no kế cận nó trong giai đoạn
thứ hai gọi là giai đoạn phát triển (phản ứng 1.16 và 1.17). Giai đoạn kết thúc xảy ra
khi hai gốc tự do kết hợp với nhau tạo thành phân tử trung hòa hoặc khi sản phẩm
của phản ứng không còn ở trạng thái gốc (phản ứng 1.18-1.20).
8


LH + HO•  L• +

H2O

(1.15)

L• + O2  LOO•

(1.16)

LOO• + LH  LOOH

(1.17)

L• + L•  L-L

(1.18)

 LOOL

(1.19)

+ LOO•  LOOOOL

(1.20)

L• + LOO•
LOO•

LOOH + Fe2+  LO• + OH- + Fe3+

(1.21)

LOOH + Fe3+  LOO• + OH- + Fe2+

(1.22)

LOOH  LO•  MDA

(1.23)

Quá trình peroxide hóa cũng có thể được xúc tiến bởi oxygen đơn bội,
hypochlorite, sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp (phản ứng 1.21 và 1.22).
Lipid hydroperoxide bị phân hủy thành rất nhiều sản phẩm như aldehyde
(malonyldialdehyde, acrolein, crotonaldehyde), alkane, lipid epoxide, alcohol.
Trong đó, hợp chất malonyldialdehyde (MDA) là sản phẩm aldehyde phổ biến nhất
và nó được xem là dấu hiệu của quá trình peroxide hóa lipid (phản ứng 1.23).
Các gốc tự do lipid có thể phản ứng với nhau, gây xáo trộn cấu trúc màng tế
bào. Quá trình peroxide hóa lipid làm thay đổi độ nhớt, tính thấm của màng tế bào
và chức năng của các kênh ion trên màng. Điều này sẽ gây nguy hiểm cho các thành
phần bên trong tế bào. Khi màng tế bào mất chức năng sinh học, tế bào sẽ bị chết
kéo theo sự thoái hóa mô.
1.1.3.2 Sự tổn thương các phân tử protein [44]
Các dạng hoạt động có thể phản ứng trực tiếp hoặc gián tiếp với protein bằng
cách tấn công vào lipid, carbohydrate, hình thành sản phẩm có thể phản ứng với
protein. Trong sự có mặt của oxygen, gốc tự do hydroxyl tấn công protein, tạo
thành sản phẩm hydroperoxide và hydroxide trên protein (các phản ứng 1.24-1.29):
PrH + X• (HO•)  Pr• + XH (H2O)

(1.24)

Pr• + O2  PrOO•

(1.25)

PrOO• + e-  PrOO-

(1.26)

PrOO- + H+  PrOOH (protein hydroperoxide)

(1.27)

PrOOH + PrH  PrO• + H2O + Pr•

(1.28)

PrO• + PrH  PrOH (protein hydroxide) + Pr•

(1.29)

9