Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng chuẩn đoán bệnh

Giải trình tự gen thế hệ mới
và ứng dụng chuẩn đoán bệnh

TH.S NGUYỄN THÁI QUỲNH ANH
04/2014


Giải mã bộ gen người
2

2001: Giải mã bộ gen người
2.7G$, 11năm

Log10(price)

10

8

6

2007: 454
1M$, 3 tháng
2008: ABI SOLiD
60K$, 2 tuần

2001: Celera
100M$, 3 năm

4

2009: Illumina,
Helicos
40-50K$

2

2000

2010: 5K$,
vài ngày?

2012: 100$, <24
vài giờ?
2005

Year

2010


Giải trình tự DNA
 Mục đích:

Xác định thứ tự của các nucleotide (A,C,G và T) trên mạch
DNA của bộ gen
 Ứng dụng trong công nghệ sinh học: nghiên cứu, khám
phá, chuẩn đoán và điều tra
 Vấn đề
 Phương pháp giải trình tự DNA hiện tại chỉ hữu hiệu trên
mạch DNA (1-2 Kbp)

 Giải pháp
o Giải trình tự và lắp ráp những đoạn nhỏ bằng máy tính



1977

Sanger Sequencing

2005

2006

2007

454 Sequencing

Illumina sequencing

ABI solid Sequencing


Chiến lược chung
5

TG..GT
TC..CC
AC..GC
CG..CA
TT..TC

TG..AC
AC..GC GA..GC
CT..TG
AC..GC
GT..GC
AC..GC
AA..GC
AT..AT
TT..CC

Genome

Những đoạn DNA ngắn

ACGTGGTAA
CGTATACAC
TAGGCCATA
GTAATGGCG
CACCCTTAG
TGGCGTATA
CATA…
ACGTGGTAATGGCGTATACACCCTTAGGCCATA

Trình tự DNA ngắn

ACGTGACCGGTACTGGTAACGTACA
CCTACGTGACCGGTACTGGTAACGT
ACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAA
CGTATACACGTGACCGGTACTGGTA
ACGTACACCTACGTGACCGGTACTG

GTAACGTACGCCTACGTGACCGGTA
CTGGTAACGTATACCTCT...

Trình tự genome
5


Phương pháp của Sanger (1977)

 Ưu điểm



Đọc đoạn dài (~900bps)
Các nghiên cứu nhỏ

 Khuyết điểm



Công nghệ
Đắt


Sanger

NGS

Các mảnh DNA

Các mảnh DNA

Tạo dòng in vivo và nhân bản

Giải trình tự chu kì

Điện di
1 đầu đọc/ống mao dẫn

Nối với các adaptor in vitro

Hình thành polony array

Giải trình tự cyclic array
>106 đầu đọc/array)


454 sequensing/Roche
Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA

Emulsion PCR

Pyrosequencing


Emulsion PCR


1. Biến tính mảnh DNA

4. Biến tính: mạch ngược “gốc” biến tính từ hạt
bead; mạch xuôi được nối với bead bởi khung
phosphate
đường DNA

5. Bám dính: mạch ngược
2. Bám dính: MỘT bám lên bead, primer bám
mảnh DNA (ngược) với lên mạch xuôi
adaptor trên bead
3.
Kéo
dài:
Polymerase khếch đại
mạch xuôi từ bead đến
vị trí primer

6. Kéo dài: polymerase khuếch đại mạch xuôi
từ hạt bead đến primersite; và mạch ngược từ
primer đến bead

7. Lặp lại 4-5-6 (30 -60 chu kì)



Pyrosequencing
 Cơ sở:
 Ánh sáng được phát ra tỉ lệ với số lượng nucleotide kếp hợp
1pmol DNA = 6*1011 ATP = 6*109 photons at 560nm

pyrophospate

Từ đom đóm, oxi hóa luciferin và tạo ra ánh sáng




Khuyết điểm

Ưu điểm
 Chiều dài đọc 400 base

(độ chính xác 99% tại
base thứ 400 và cao hơn
ở các base phía trước)
 Công nghệ cao so với
Sanger sequencing
 Không cần lặp lại cloning
 Thư viện DNA có thể
được mã hóa và tách
riêng trong suốt quá
trình phâ tích kết quả.

 Khó

phân tích các
homopolymer
 Chi phí cao => hạn chế
re-sequencing so với
SOLID sequencing

Ilumina sequencing
Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA
(reversible termination)

Khuếch đại bắt cầu

Giải trình tự đầu ngược


Khuếch đại bắt cầu và giải trình tự bằng sinh tổng hợp
Khuếch đại bắt cầu
x 35 chu kì

Kéo dài bởi Phusion
DNA Polymerase

Terminal transferase
bổ sung ddNTP blocker

Cắt periodate của
một của những oligo

Giải trình tự bằng
sinh tổng hợp


Polony PCR

Solid sequencing
Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA

Emulsion/Wildfire PCR

Giải trình tự ligation


Wildfire PCR