Bài giảng kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật

Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp
tế bào động vật
ThS. Phan Lữ Chính Nhân


Khái niệm
Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) là quá trình nuôi tế bào
trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên (subculture).
Sau đó, việc nuôi cấy được gọi là thứ cấp (secondary
culture)


Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp
KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH
MÔ SƠ CẤP

KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP
TẾ BÀO ĐƠN

Là việc nuôi cấy các mảnh mô
in vitro. Trong quá trình nuôi
cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ
phát triển lan ra từ vùng mô
trung tâm.

Là việc nuôi cấy các tế bào đơn
được tách ra từ mảnh mô. Trong
quá trình nuôi, từng mỗi tế bào
sẽ phát triển tăng sinh thành
nhiều tế bào mới.

NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP
(mảnh mô ung thư vú)



Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột


Nuôi cấy chọn lọc tế bào Tua (DC)
từ tủy xương chuột


NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN
PHÙ TẾ BÀO ĐƠN
(thu từ máu cuống rốn)


Quy trình nuôi cấy sơ cấp
Thu nhận mẫu

Xử lí mẫu
Nuôi cấy tế bào đơn:
Tách mô thành tế bào đơn

Nuôi cấy mảnh mô:
Cố định mảnh mô

Nuôi cấy

Thu nhận mẫu
• Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kì mô
sống nào của cơ thể.
• Trước hết phải làm sạch mô tại vị trí lấy mẫu
bằng cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh
chóng chuyển về phòng thí nghiệm.
• Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết
vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch
vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.


Bảo quản mẫu


Bảo quản mẫu


Xử lí mẫu đối với nuôi cấy huyền phù tế bào đơn
Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau
nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau.

Biện pháp:
– (1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối.
– (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên.


Cắt
nhuyễn

Biện pháp
cơ học

Ép
nhuyễn

Tách
bằng
màng lọc


Phương pháp cắt nhuyễn
Sử dụng lục sơ học bẻ gãy các cầu nối liên
bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mô.
Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch
trong


Phương pháp ép nhuyễn

Ép nhuyễn mô: dùng 2
phiến lame ép chặt mảnh
mô để thu tế bào đơn đối với
những mô có liên kết yếu.


Phương pháp tách bằng màng lọc
Tách bằng màng lọc
tế bào (Cell strainer):
kích thước lỗ trên

màng từ 70–100 µm,
chỉ cho những tế bào
đơn có kích thước
tương ứng qua màng.


Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym

• Quy trình trypsin ấm
• Quy trình trypsin lạnh


Quy trình trypsin ấm


Quy trình trypsin lạnh
Cắt mẫu mô [2 –
3mm], rửa nhiều lần
với PBS vô trùng

Thêm môi trường, sục
nhẹ nhành cho đến khi
mô rời ra

Nếu các mảnh mô chưa
rời ra có thể thêm môi
trường để dễ huyền phù
hoặc dùng màng lọc

Thay PBS bằng

trypsin 0.25%

ủ ống chứa mẫu mô
trong 36,50C,
20 – 30 phút

Thu dịch huyền phù
tế bào, xác định mật
độ, tiến hành nuôi

Ủ trong 40C, 6- 18 giờ

Loại bỏ trypsin


Tách tế bào bằng phương pháp khác

• Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng
• Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề
mặt


Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng


Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào


Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô
Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi

Mảnh mô nổi
Cố định mảnh mô
Mảnh mô sống
Thành công


Phương pháp cố định mảnh mô

• Lammel
• Huyết thanh
• Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi