Đồ án Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông (Gossypium L.) sử dụng chỉ thị phân tử SSR

Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Mở đầu
I. Đặt vấn đề
Đợc trồng rộng rãi ở hơn 80 quốc gia trên thế giới, cây bông (Gossypium
L.) là loại cây trồng lấy sợi tự nhiên hàng đầu và quan trọng nhất. Hàng năm
ngành công nghiệp dệt đã đóng góp vào nền kinh tế khoảng 500 tỉ USD với việc
sử dụng khoảng 115 triệu kiện bông xơ [14]. Cùng với nhận thức về vấn đề chăm
sóc sức khỏe và mức sống phát triển, con ngời quay trở lại sử dụng sợi bông thay
cho sợi nhân tạo (sợi bông có những lợi thế nh vốn thấp, năng suất cao, độ thấm,
độ thoáng, giữ nhiệt tốt và không tĩnh điện) làm cho nhu cầu cung cấp sợi bông
ngày càng tăng.
Việt Nam là một trong những nớc có ngành công nghiệp dệt may phát
triển, sản phẩm dệt may chiếm tới 4,8% cơ cấu giá trị sản xuất công nghiệp [7].
Năm 2007, dệt may vơn lên vị trí dẫn đầu trong danh mục các mặt hàng xuất
khẩu, vợt qua cả dầu thô [8], chính vì vậy cây bông (Gossypium L.) cũng là cây
trồng đợc chú trọng. Nhng do nhiều khó khăn (sâu bệnh, chi phí sản xuất cao...),
thực trạng sản xuất bông vải ở Việt Nam ngày càng giảm, năm 2005 diện tích
bông của cả nớc là 27.996 ha với tổng sản lợng 32.615 tấn, năm 2006 diện tích
giảm xuống còn 20.900 ha với sản lợng 28.600 tấn [29]. Năm 2007 trong tổng số
220.000 tấn bông nguyên liệu, Việt Nam phải nhập trên 95% từ các nớc Mỹ, ấn
Độ, Tây Phi, Uzebekistan... Theo quyết định phê duyệt chơng trình Phát triển
cây bông vải Việt Nam của Thủ tớng Chính phủ, chỉ tiêu đến năm 2015 diện tích
trồng bông nớc ta cần đạt 30.000 ha, năng suất bình quân 1.5 tấn/ha, sản lợng
bông xơ đạt 20.000 tấn, định hớng đến năm 2020 diện tích đạt 76.000 ha, năng
suất bình quân 2 tấn/ha, sản lợng bông xơ đạt 60.000 tấn, để cung cấp nguyên
liệu bông xơ cho sản xuất trong nớc, tạo điều kiện cho ngành dệt may phát triển
ổn định [9].
Muốn mở rộng đợc diện tích trồng bông cần phải có chính sách hỗ trợ, tạo

điều kiện cho ngời trồng và quan trọng nhất là phải có giống tốt. Các giống
bông hiện nay ở Việt Nam chủ yếu chọn tạo bằng phơng pháp truyền thống (một
số giống bông do Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố chọn tạo đã đợc công
nhận là giống quốc gia và đa vào phổ biến trong sản xuất, gồm có các giống
bông lai: L18, VN20, VN15, VN01-2, VN01-4, GL03 và các giống bông Luồi:
TH1, TH2, M45610, TM1, MCU9, LRA5166, D162, C118). Tuy nhiên phơng
pháp chọn tạo giống truyền thống có hạn chế là rất khó đáp ứng đợc mục tiêu cải
tiến đồng thời cả năng suất, chất lợng sợi và sức chống chịu với điều kiện khắc
nghiệt của môi trờng [17]. Sự phát triển gần đây của di truyền phân tử đã giúp

Lê Công Tùng

1

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

cho các nhà chọn giống tiếp cận nhanh chóng và chính xác để phối hợp với chọn
lọc truyền thống, giúp khắc phục nhợc điểm của phơng pháp này.
Chỉ thị phân tử là công cụ hữu hiệu, đợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu
đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền. Nghiên cứu tính đa dạng di truyền
đóng vai trò rất quan trọng, thông qua phân tích đa dạng có thể chọn tạo đợc
những cặp bố mẹ lai thích hợp trong chọn tạo giống cây trồng [3]. Van Esbroeck
and Bowman (1998) chỉ ra rằng đa dạng di truyền đảm bảo sản xuất chống lại
bệnh cây và loài gây hại, do đó có thể thấy đợc lợi ích của gen di truyền trong tơng lai [13]. Cho đến nay chỉ thị ADN tiềm năng cho những chơng trình chọn
giống bông nhờ chỉ thị phân tử (MAS) đã trợ giúp rất nhiều cho việc chọn tạo đợc những giống bông có năng suất cao, chất lợng tốt [27].

Đối với cây bông, hiện nay đã có số lợng rất lớn các chỉ thị SSR đợc phát
hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và đợc lu trữ trong cơ sở dữ liệu các
chỉ thị bông (Cotton Marker Database-CDM), cung cấp nguồn chỉ thị phong phú
cho các nhà nghiên cứu [12]. Đây chính là thuận lợi để chúng tôi thực hiện đề
tài:
"Nghiên cứu đa dạng dạng di truyền nguồn gen bông (Gossypium L.)
sử dụng chỉ thị phân tử SSR"
Đề tài nghiên cứu này là một nội dung nghiên cứu của đề tài thuộc chơng
trình Công nghệ sinh học cấp Nhà nớc "Nghiên cứu áp dụng chỉ thị phân tử
để chọn tạo giống bông có chất lợng xơ tốt".
II. Mục tiêu của đề tài
Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 21 giống bông chọn lọc từ tập
đoàn giống của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố, từ đó chọn lọc những
cặp giống có đa hình di truyền cao nhất phục vụ lai tạo, tạo quần thể con lai.

Lê Công Tùng

2

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Chơng I: Tổng quan tài liệu
I.1 Giới thiệu về cây bông
Cây bông là cây công nghiệp quan trọng, có giá trị kinh tế. Sản phẩm
chính của cây bông là xơ bông, cung cấp nguyên liệu cho dệt may... Ngoài ra vỏ

rễ của cây bông còn có thể làm thuốc.
Hệ thống phân loại cây bông [30]
Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliophy
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Malvales
Họ: Malvanceae
Phân họ: Malvoideae
Chi: Gossypium L.
I.1.1 Nguồn gốc, xuất xứ cây bông
Cây bông (Gossypium L.) bao gồm khoảng 45 loài nhị bội và 5 loài tứ bội
với cách thức di truyền phức tạp. Nhóm bông nhị bội chia làm 8 nhóm genome
từ A- G và k [15], cho đến nay các loài bông nhị bội có 3 nhóm bông chính:
nhóm bông châu phi có kiểu gen a, b, e, f có xuất xứ từ châu phi và châu á;
nhóm bông có kiểu genome d có nguồn gốc xuất xứ từ các nớc châu mỹ; nhóm
bông thứ 3 có kiểu gen c, g, k đợc tìm thấy ở châu úc [24]. 52 loài bông kể cả
hai loài bông tứ bội tự nhiên Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, đều
có nguồn gốc từ các loài bông tổ tiên Châu Phi A genome và các loài bông D

Lê Công Tùng

3

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

genome. Tổ tiên của các loài bông tứ bội còn tồn tại cho đến ngày nay là các loài
bông nhị bội Gossypium herbaceum(A1) và Gossypium arboreum (A2) và
Gossypium raimondii (D5) Ulbrich [11]. Quá trình tứ bội hóa xẩy ra khoảng 1-2
triệu năm trớc đây [24] đã tạo ra 5 loài bông tứ bội.

I.1.2 Đặc điểm hình thái cây bông
Rễ: bông có 1 rễ cọc đâm sâu xuống đất, từ rễ cọc phát triển rễ thứ cấp và
phân nhánh mạnh.
Thân, cành: thân bông cao từ 0.7-1.5m tùy vào giống và điều kiện môi trờng, trên thân có các đốt, trung bình từ 20-30 đốt. Cành có 2 loại là cành đực và
cành quả.
Lá: lá có màu xanh, một số giống có màu nâu đỏ. Lá bông có từ 3-5 đến 7
thùy.
Hoa: hoa bông đợc hình thành từ nách của lá, thân hoặc cành. Hoa lỡng
tính có 3 lá đài, 5 cánh hoa có màu trắng, màu kem và màu vàng, bầu lớn nằm
giữa hoa, bầu hoa có 3-5 ô, mỗi ô phát triển thành một múi, mỗi múi có 6-11
noãn. Bông là cây tự thụ phấn nhng cũng có thụ phấn chéo nhờ côn trùng. Có
những giống bông thụ phấn kín do hoa không nở.
Xơ: là biến dạng của lớp biểu bì của hạt. Sau khi thụ tinh xơ bông trởng
thành cùng quả, sau khi hoa nở 15-20 ngày xơ bông đạt chiều dài cao nhất khi
quả chín. Xơ khô có dạng sợi xoắn.
Quả và hạt: mỗi cây có từ 100-300 quả, mỗi quả nặng 4-6g, mỗi quả có 45 múi, mỗi múi có 6-7 hạt.
I.1.3 Điều kiện sinh thái của cây bông
Bông là cây có nguồn gốc nhiệt đới, a sáng nên đòi hỏi cao về nhiệt độ và
ánh sáng. Nhiệt độ tối u cho bông nảy mầm, sinh trởng, phát triển là 25-30oC, dới 25oC phát triển chậm lại, ở 37-40oC cây ngừng phát triển. Bông là cây cần
đầu khô, chân ẩm, nhng không chịu úng. Do có bộ rễ khá phát triển nên bông
có khả năng chịu hạn tốt. Hầu hết các loại đất trồng cạn đều có thể trồng bông
vải, có pH thích hợp pHKCl>5 và độ mặn < 0.4% [1]
Các vùng trồng bông truyền thống có điều kiện đất đai, khí hậu thích hợp
tại các tỉnh [9]:
Tây Nguyên: Đắc Lắk, Đắc Nông, Gia Lai.

Duyên hải Nam Trung Bộ: Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Phớc, Đồng
Nai, và Bà Rịa- Vũng Tàu.
Các tỉnh vùng núi phía Bắc: Điện Biên, Sơn La, Thanh Hóa, Bắc Giang.

Lê Công Tùng

4

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Trong đó vùng trọng tâm là Tây Nguyên.
I.1.4 Đặc điểm genome cây bông
Kích thớc genome cây bông biến động tùy loài: kích thớc genome nhỏ
nhất đợc ghi nhận ở loài G.raimondii Ulbrich, đạt khoảng 880 Mb. Genome đơn
bội của G.arboreum có kích thớc khoảng 1,75 Gb và G.hirsutum có kích thớc 2,5
Gb [16]. Biến động thành phần DNA ở các loài nhị bội phản ánh mức độ nhiều
hay ít của các bản sao các trình tự lặp lại khác nhau [28]. Thành phần DNA của
các loài đa bội xấp xỉ bằng tổng số của genome bố mẹ A và D [18]
I.1.5 Giá trị sản xuất thơng mại của các loài bông
Trong các loài bông chỉ có 4 loài bông đợc trồng lấy sợi bao gồm hai dạng
nhị bội genome A (2n=2x=26) là G.herbaceum (A1) và G.arboreum (A2) và 2
dạng tứ bội (song lỡng bội khác nguồn A, D (2n=2x=52) là G.hirsutum,
G.barbadense.
Hiện nay các giống bông đợc trồng phổ biến trong sản xuất đều là bông tứ
bội có nguồn gốc lai giữa hai nhóm genome A và D. Trong khi đó, chỉ có các

loài bông thuộc nhóm genome A cho bông lấy sợi còn nhóm genome D thì
không [14]. Hai loài bông tứ bội G.hirsutum L, G.barbadense L chiếm tơng ứng
90% và 5% sản lợng bông trên toàn thế giới [25].
I.2 Đa dạng di truyền
I.2.1 Khái niệm [4]
Đa dạng di truyền: là tập hợp biến đổi của các gen và các kiểu gen trong
nội bộ của một loài.
Đa dạng di truyền là chìa khóa của một loài có thể tồn tại trong tự nhiên,
vì nó có khả năng thích nghi với thay đổi bất lợi của thời tiết, khí hậu, môi trờng,
phơng thức canh tác, sức đề kháng của các loài sâu bệnh. Do đó nó là nguồn
cung cấp vật liệu cho mọi chơng trình chọn tạo và cải tiến giống, cho một nền
nông nghiệp phát triển bền vững.
Đa dạng di truyền thể hiện sự tách biệt về tính kế thừa trong hay giữa các
quần thể sinh vật.
I.2.2 Nguyên nhân phát sinh đa dạng di truyền
Trong suốt quá trình tồn tại và phát triển, một loài có thể tạo thành những
nhóm quần thể phân bố trong những điều kiện sinh thái khác nhau và luôn biến
đổi, nên sẽ có những chiều hớng biến đổi khác nhau gây ra do đột biến (đột biến
gen, đột biến NST). Biến đổi đó trớc hết là trong kiểu gen và cuối cùng là kiểu
hình thích nghi, điều đó tạo nên sự khác nhau giữa các nhóm loài. Sự biến đổi
này không chỉ xẩy ra giữa các quần thể của loài mà ngay giữa các cá thể trong
một quần thể, đã đợc biểu hiện ra bằng hình thái hoặc chỉ mới là sự thay đổi

Lê Công Tùng

5

MSSV: 507301110

Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

trong genome. Bên cạnh những biến đổi di truyền do áp lực chọn lọc tự nhiên thì
biến đổi do áp lực nhân tạo (gây đột biến nhân tạo) cũng góp phân rất lớn. Do
vật chất di truyền có thể sao chép chính xác từ thế hệ sinh vật này sang thế hệ
sinh vật khác qua sinh sản nên những biến đổi về mặt di truyền luôn đợc bảo tồn
và phát triển tạo nên tính đa dạng di truyền.
I.2.3 Các mức độ đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền thể hiện ở mức độ phân tử và cá thể. Mức độ phân tử
biểu hiện ở sự đa dạng các alen giữa các cá thể sinh ra do đột biến gen hoặc do
sự tách biệt về tính kế thừa các nguồn genome có trớc. Nói xa hơn, tập hợp đa
dạng các alen giữa 2 cá thể sẽ tạo nên sự khác nhau về genome của 2 cá thể đó.
Mức độ cá thể biểu hiện ở số lợng các NST của cá thể hay nhóm cá thể đó nh: có
các loài đơn bội, lỡng bội và đa bội.
Trong sinh học phân tử, khi nói đến sự đa dạng ADN, nghĩa là sự khác
nhau ở mức độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở một
vùng địa lý nhất định. Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nhng ở mức độ ADN để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa 2 cá thể cùng
loài [4].

I.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền
I.3.1 Chỉ thị hình thái [2]
Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật đợc sử dụng từ rất sớm.
Nguyên tắc cơ bản của phơng pháp này là: hai đơn vị phân loại (taxon) càng có
nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần gũi
nhau. Ngời ta thờng kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết
quả so sánh.
Các chỉ thị hình thái có u điểm là tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, nhng việc
lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong

những khâu khó khăn nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinh
nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học. Bên cạnh đó phơng pháp này
nhiều khi không chính xác vì có hiện tợng đồng quy tính trạng và không phân
biệt đợc các loài đồng hình.
I.3.2 Chỉ thị isozym
Các isozym đợc định nghĩa nh các dạng khác nhau của một enzym
(protein), có chức năng giống hay gần gũi nhau ở cùng một cá thể [21]. Sự khác
nhau về cấu trúc bậc 1 của protein enzym do đột biến gen và quá trình chọn lọc

Lê Công Tùng

6

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

các quần thể cùng loại theo chiều hớng ngoại cảnh khác nhau, làm các enzym
khác nhau về trọng lợng, kích thớc.
Protein enzym là chất đa điện ly nên ở dạng dung dịch nó ở trạng thái
phân cực về điện tích. Dới tác dụng của dung dịch đệm có pH khác nhau protein
sẽ mang điện tích (-) hoặc (+). Trong điện trờng của dòng một chiều các protein
khác nhau di chuyển về phía anot hay catot theo tốc độ khác nhau. Nếu phân tử
protein có kích thớc nhỏ, trọng lợng phân tử bé, lực hút tĩnh điện lớn thì sẽ
chuyển động nhanh và ngợc lại. Do đó chúng sẽ nằm ở vị trí khác nhau trên bản
gel khi chạy điện di hỗn hợp protein, sự khác nhau của các cấu tử điện di của các
isozym đợc dùng để so sánh, đánh giá sự khác nhau về bản chất di truyền của

các loài. Sự khác nhau càng ít thì mối quan hệ họ hàng giữa chúng càng gần và
ngợc lại.
Việc phân tích isozym cho ta những allen đồng trội, là phơng pháp tơng
đối rẻ, dễ tiến hành hơn các phơng pháp phân tích ADN. Tuy nhiên với số lợng ít
ỏi các isozym và chúng chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá trình phát
triển cá thể và là sản phẩm của gen nên cha phản ánh thật chính xác bản chất di
truyền của các cá thể. Do vậy việc sử dụng chỉ thị isozym còn có những hạn chế
nhất định.
I.3.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Chỉ thị phân tử đợc ứng dụng rộng dãi trong phân tích di truyền, nghiên
cứu lai giống, nghiên cứu đa dạng di truyền và họ hàng giữa các giống, loài và tổ
tiên hoang dại của chúng. Chỉ thị phân tử có một vài u điểm khi so sánh với chỉ
thị hình thái nh: mức độ đa dạng cao và nhận ra đợc ảnh hởng của điều kiện môi
trờng và phạm vi hoạt động sinh thái của thực vật [13].
Các chỉ thị phân tử rất phong phú do tính đa dạng của ADN. Các chỉ thị
phân tử chia làm 2 nhóm bao gồm: Chỉ thị dựa trên cở sở lai acid nucleic (RFLP
- Restriction Fragment Length Polymorphism). Các chỉ thị dựa trên cơ sở của
phản ứng PCR (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA, SSR - Simple
Sequence Repeats, và các loại chỉ thị phân tử khác nh SNP (Single Nucleotide
Polymorphism ). Các chỉ thị phân tử hiện nay đợc ứng dụng có hiệu quả trong
nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật.
I.4 Một số LOạI chỉ thị phân tử
I.4.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai acid nucleic: RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism)
Lai acid nucleic gồm 2 kiểu: lai ADN (ADN hibrization) hay còn gọi là lai
Southern và lai ARN (ARN hibrization) hay còn gọi là Northern [3]

Lê Công Tùng

7

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

RFLP có nghĩa là đa hình độ dài đoạn phân cắt giới hạn. Các đa hình
RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn
trong hệ gen.
Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN đặc hiệu trong cấu trúc, sự thay đổi,
mất đi hay thêm vào các nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng của
mỗi họ, giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Vì vậy khi dùng enzym cắt giới hạn để
cắt phân tử ADN của hệ gen của các đối tợng khác nhau, nếu nh có đa hình các
đoạn cắt hạn chế thì các đoạn ADN cần kiểm tra đa hình (các đoạn ADN có đoạn
trình tự bổ sung với ADN mẫu dò) ở các đối tợng sau khi bị cắt sẽ có chiều dài
khác nhau. Sau đó dùng kỹ thuật lai Southern ngời ta có thể nhận biết đợc những
đoạn ADN có chiều dài khác nhau này. ADN mẫu dò đợc sử dụng để lai sẽ có
trình tự bổ sung với đoạn trình tự ADN bảo thủ của ADN đích.
Chỉ thị RFLP đợc ứng dụng rộng rãi và có ý nghĩa quan trọng trong lập
bản đồ gen, phân lập gen, xác định số bản sao của gen, phân tích cấu trúc và
chức năng gen [3]. Chỉ thị RFLP đợc sử dụng lần đầu tiên bởi Bitstein và cs
(1980) để xây dựng bản đồ liên kết di truyền ở ngời. RFLP cũng đợc dùng để
nghiên cứu về di truyền của nhiều đối tợng thực vật khác nhau nh: lúa, cà chua,
ngô, khoai tây, bắp cải, bông Đối với đối tợng bông, công trình của Rong và
cộng sự 2004 sử dụng chỉ thị RFLP đã định vị đợc 2.584 locus phân bố thành 26
nhóm liên kết cách nhau 1.72 cM (khoảng 600 Kb) [20].
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội có nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả
các allen của cùng một locus gen. Do vậy, có thể phân biệt đợc các cá thể đồng

hợp tử AA hoặc aa và các cá thể dị hợp tử Aa. Do sử dụng mẫu dò mang tính đặc
hiệu nên chỉ thị này có độ chính xác rất cao, dùng để kiểm tra chỉ thị phân tử
khác.
Hạn chế của chỉ thị RFLP: tiêu tốn nhiều thời gian, sức lực, khối lợng
công việc cồng kềnh.
I.4.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở PCR
I.4.2.1 Phản ứng PCR
PCR (Polymeraza Chain Reaction) có nghĩa là phản ứng trùng phân, phản
ứng chuỗi polymeraza, hay phản ứng PCR, đợc Kary Mullis phát minh vào năm
1985 [3], đã đa ra một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là kỹ
thuật invitro để nhân nhanh một đoạn ADN trong hệ gen của sinh vật. ADN đợc
nhân lên theo cấp số nhân theo công thức:

N = D ì 2n 1
Lê Công Tùng

8

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Trong đó:
D: Là lợng ADN ban đầu
N: Tổng số ADN tổng hợp mới sau n chu kỳ.
Thành phần phản ứng PCR
Trong phản ứng PCR gồm có thành phân cơ bản sau: ADN khuôn, dNTP,

mồi (primer), enzyme polymeraza (Taq), MgCl 2, và đệm PCR. Phản ứng PCR đợc thực hiện trong chu kỳ máy nhiệt (máy PCR).
ADN khuôn (DNA template): có thể là đoạn mạch đơn hoặc mạch đôi của
chuỗi ADN hay ARN, thờng dài từ 300 bp trở lên, đã biết trớc trình tự hai đầu để
thiết kế mồi. Thông thờng lợng ADN khuôn cho vào mỗi phản ứng nên sử dụng
khoảng dới 1 g đối với ADN hệ gen.
ADN mồi (primer): là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 6-100 bp
(thờng có độ dài từ 20-30 bp), có trình tự bazơ nitơ bổ trợ với trình tự bazơ nitơ
hai đầu của đoạn ADN khuôn. Nó đợc sử dụng làm mồi cho sự khởi đầu quá
trình tổng hợp ADN. Các đoạn mồi cần mang tính đặc thù để làm tăng tính đặc
hiệu của phản ứng. Mồi càng dài, khả năng tổng hợp chính xác đoạn ADN đích
càng lớn. Nồng độ mồi thờng dùng khoảng 1-2 M.
Các nucleotide (dNTP): là hỗn hợp của 4 loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP
làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Nồng độ dNTP thờng dùng
khoảng 100 M.
Enzym ADN polymeraza chịu nhiệt: có nhiều loại enzym polymeraza chịu
nhiệt nh: Taq ADN polymeraza tách ra từ vi khuẩn Thermus aquatucus, Pfu ADN
polymeraza đợc tổng hợp từ vi khuẩn Thermococcus litoralis, Tth ADN
polymeraza tổng hợp từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus Mỗi loại đều có đặc
điểm riêng nhng thông dụng nhất là Taq ADN polymeraza, có trọng lợng phân tử
94 kDa và hoạt động tốt nhất ở 70-80 oC. Enzym này có hoạt tính 5-3
exonucleaza.
Dung dịch đệm: thành phần chung nhất của dung dịch đệm gồm: KCl,
MgCl2, và Tris [3]. Trong đó quan trọng nhất là ion Mg ++. Nó hình thành một
phức hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của ADN sợi đôi và
tăng khả năng gắn mồi vào khuôn. Nồng độ cuối cùng của Mg ++ trong phản ứng
biến đổi từ 0.5-5.0 mM, tối u là 1- 1.5 mM.
Diễn biến phản ứng PCR

Lê Công Tùng

9

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Giai đoạn 1: Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 93-98 oC, thời gian từ 1-5 phút.
ADN khuôn sợi đôi (ADN tổng số) đợc biến tính. Khi đó các liên kết hydro giữa
hai mạch đơn sẽ bị phá vỡ và hai mạch đơn tách nhau ra. Nếu G+C > A+T (liên
kết bổ sung giữa hai sợi đơn bền hơn) hoặc khuôn ADN khá dài thì nhiệt độ biến
tính càng phải cao hay thời gian biến tính lâu hơn.
Giai đoạn 2: Phản ứng diễn ra theo chu kỳ. Thờng là 20-40 chu kỳ. Mỗi
chu kỳ gồm các bớc sau:
Chu kỳ 1
Bớc 1: Biến tính ADN khuôn - diễn ra nh giai đoạn 1
3
5
5
3

3
5

5

3

Bớc 2: Gắn mồi ở nhiệt độ 35-65 oC (mồi càng ngắn và ít G, C thì nhiệt độ
gắn mồi càng thấp), thời gian từ 30 giây - 3 phút. Đoạn mồi gắn vào đoạn ADN
khuôn cần nhân có trong ADN tổng số theo nguyên tắc bổ trợ với trình tự bazơ
nitơ ở 2 đầu của nó.

3

5
5 3

3 5

5,

3

Bớc 3: Tổng hợp ADN ở nhiệt độ 70-75 oC, thời gian từ 1-5 phút. Enzyme
ADN polymeraza chịu nhiệt hoạt động và sự tổng hợp ADN diễn ra trên những
đoạn mồi gắn vào. ở nhiệt độ này enzyme hoạt động với vận tốc cao.

Lê Công Tùng

10

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

3

5
5

3

3

5

5
3
Đoạn ADN tổng hợp đợc ở chu kỳ 1 có chiều dài tùy thuộc vào thời gian
tổng hợp. Thời gian tổng hợp đợc cài đặt sao cho đoạn ADN này ít nhất phải
bằng hoặc dài hơn đoạn ADN cần tổng hợp. Kết thúc chu kỳ 1.
Chu kỳ 2.n
Từ chu kỳ thứ 2.n có diễn biến tơng tự nh chu kỳ 1. Tuy nhiên thời gian
biến tính là 30 giây -1 phút. ADN khuôn trong các chu kỳ này ngoài ADN tổng
số còn có các đoạn ADN đợc tổng hợp ở các chu kỳ trớc đó, lúc này sẽ cho sản
phẩm là đoạn ADN cần tổng hợp do nó sẽ bị chặn 2 đầu bởi cặp mồi.
Số lợng các đoạn ADN cần tổng hợp sau mỗi chu kỳ ngày càng nhiều. Do
đó sau khi kết thúc phản ứng PCR ta sẽ khuếch đại đợc số lợng lớn ADN cần
nhân lên
Chu kỳ 2
3 5
5
3
3

5
5 3
3
5

5
3

3

5
3

5
Kết thúc chu kỳ 2
Chu kỳ 3

Lê Công Tùng

11

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

3

Khoa CNSH&MT

5
5 3

Sản phẩm ADN
Kết thúc chu kỳ 3

3

5
3
5

5
3
5
3

Chu kỳ 4 đến chu kỳ n diễn ra giống chu kỳ 1, 2, 3 nhng ADN khuôn sử dụng
chủ yếu là ADN sản phẩm.
Giai đoạn 3: Sau khi kết thúc chu kỳ cuối cùng, Các đoạn ADN ở các chu
kỳ trớc cha tổng hợp xong sẽ đợc tổng hợp nốt ở nhiệt độ 70-75 oC, thời gian từ
5-10 phút.
Chấm dứt phản ứng và cất giữ ở nhiệt độ lạnh.
I.4.2.2 Chỉ thị RAPD (Random Amplymorphic ADN).
RAPD nghĩa là kỹ thuật nhân ngẫu nhiên đa hình các đoạn ADN, đợc phát
hiện bởi William và cs, 1990. RAPD là kỹ thuật dựa trên nguyên lý PCR, sử
dụng những đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) đợc tổng hợp ngẫu nhiên.
Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kỳ vị trí
nào có trình tự bổ sung với nó. Sản phẩm PCR đợc chạy điện di trên gel agarose

2% nhuộm cùng EtBr để phân tách các băng ADN và phát hiện các băng ADN d-

Lê Công Tùng

12

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

ới tia sáng của đèn cực tím [3].Do tính ngẫu nhiên nên có thể có rất nhiều đoạn
ADN đa hình có kích thớc khác nhau đợc nhân bản sau phản ứng PCR. RAPDtrong đánh giá tính đa dạng di truyền chính là dựa vào việc phân tích, so sánh
các đoạn ADN đa hình của các đối tợng nghiên cứu để thấy đợc sự giống và
khác nhau trong cấu trúc genome của nó.
Chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi nó biểu hiện sự có mặt hay vắng mặt
những băng ADN đặc trng. Vì vậy không phân biệt đợc thể dị hợp tử trong quần
thể F2.
Chỉ thị RAPD có u điểm là không cần phải biết trớc thông tin về trình tự
ADN để thiết kế mồi, rẻ tiền, nhanh gọn. Tuy nhiên do sử dụng mồi ngắn và
nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 34-37 oC) nên độ chính xác kém. Vì thế cần tiến
hành thí nghiệm nhiều lần để có kết quả chính xác.
RAPD rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ sử dụng
quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) [3].
I.4.2.3 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [3]
AFLP có nghĩa là đa hình độ dài các đoạn ADN đợc khuếch đại chọn lọc,
do Vos và cs phát hiện ra năm 1975.
Kỹ thuật này đợc phát triển trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạn

ADN đã đợc cắt bằng enzym cắt giới hạn. Điểm cơ bản nhất của kỹ thuật này là
sự thiết kế mồi PCR đặc trng.
Quy trình thiết kế mồi đặc trng nh sau:
Bớc 1: ADN đợc cắt bằng enzym cắt giới hạn, thờng là enzym EcoRI
(nhận biết 6 nucleotide) và MseI (nhận biết 4 nucleotide), tạo thành vô số mảnh
có kích thớc khác nhau, mỗi mảnh đều biết trớc trình tự nucleotide hai đầu cắt
Bớc 2: Dựa vào trình tự ở đầu cắt, thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắn
chúng vào mỗi đầu.
Bới 3: Dựa vào trình tự adapter, ngời ta thiết kế mồi PCR. Mồi gồm 2
phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần kia là những
nucleotide đợc thêm vào tùy ý, thông thờng từ 1-3 nucleotide.
Với mồi đợc thiết kế nh vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự hai
đầu bổ sung với trình tự mồi mới đợc nhân bản.
Nh vậy có thể nói kỹ thuật AFLP đợc phát triển bởi sự kết hợp các yếu tố
kỹ thuật RFLP và phản ứng PCR để nhân các đoạn giới hạn đặc trng. Sản phẩm
PCR của mỗi mồi ở mỗi mẫu nghiên cứu sẽ xuất hiện băng ADN đặc trng nếu
không có đột biến tại điểm cắt của enzym giới hạn tơng ứng với vị trí bắt cặp của
mồi, ngợc lại sẽ không xuất hiện băng ADN đặc trng.

Lê Công Tùng

13

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội, và vị trí trên nhiễm sắc thể của chúng ch a
đợc xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F 2 thì
cần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trớc vị trí trên NST nh
RFLP và SSR.
I.4.2.4 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)
SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn trình tự lặp lại đơn giản, còn gọi là
phơng pháp vi vệ tinh (Microsatellite), do Lit và Luty giới thiệu và năm 1989 khi
nghiên cứu genome của một số sinh vật đã phát hiện ra những đoạn ADN có
chiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm
các nhóm nucleotide lặp lại một cách có trình tự [5].
Các nhóm nucleotide lặp lại này thờng có trình tự không vợt quá 5
nucleotide nh (TG)n hoặc (AAT)n. ở lúa các nucleotide đã phát hiện đợc gồm
GA, GT, CAT, CTT. Những đoạn ADN lặp lại nh vậy đợc gọi là Microsateline
hay còn có tên khác nh: SSLPs (single sequennce length polymorphisms), SSRs
(simple sequence repeats), STRs (short tADNom repeats). Các đoạn ADN này có
trình tự hai đầu rất đặc trng cho mỗi đoạn, bởi vậy trình tự đặc trng cho mỗi đầu
của đoạn nhắc lại này đợc sử dụng để thiết kế mồi cho PCR [3].
Các vi vệ tinh rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật. Vùng có
ADN lặp lại thờng kém ổn định hơn các vùng khác, nên ở các cá thể khác nhau,
trình tự đó đợc lặp lại với số lần khác nhau. Do đó vùng này thờng đa dạng hơn
các vùng khác.
Các đa hình SSR đợc sinh ra do mồi SSR khuếch đại vùng ADN lặp lại có
trình tự bổ sung với hai đầu của vùng này trong phản ứng PCR; dùng để so sánh
giữa các đối tợng cần nghiên cứu. Nếu các vùng ADN lặp lại của các đối tợng
này (do cùng một mồi SSR khuếch đại) có đa hình, do có số lần lặp lại khác
nhau thì khi sản phẩm PCR đợc điện di và chụp ảnh gel sẽ phát hiện đợc các
băng đa hình.
Kỹ thuật SSR đơn giản, tiện lợi và rất hữu ích trong nghiên cứu genome vì
chúng đợc thiết kế dựa trên những vùng mã hóa có tính bảo thủ cao trong hệ gen
[22]. Hơn nữa chỉ thị ssr thờng chỉ khuếch đại các locus đặc trng cho sự đa

dạng của các loài trong 1 chi, đôi khi 1 họ [19]. Tuy nhiên nhợc điểm của chỉ thị
này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém.
Trong số các chỉ thị đợc sử dụng để lập bản đồ, ssr là loại chỉ thị đặc biệt
đợc sử dụng nhiều bởi tính đồng trội và đa allen [22]. Chỉ thị ssr có thể sử dụng
cho các quần thể để lập bản đồ khác nhau, cho các nghiên cứu về tiến hóa của
genome, so sánh genome cũng nh sử dụng hiệu quả nguồn gen trong chọn tạo
giống nhờ chỉ thị phân tử.

Lê Công Tùng

14

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Đối với đối tợng genome cây bông, nhiều lỗ lực phát triển chỉ thị ssr đã
đợc tiến hành và chỉ thị ssr đang đợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản
đồ di truyền cây bông [20], [23], [26].
Hàng nghìn chỉ thị ssr của bông đợc xác định tại các phòng thí nghiệm
khác nhau: Brookhaven National Laboratoy (BNL), Texas A&M University [23]
nghiên cứu gần đây nhất của Wangzhen Guo và cs 2007 đã sử dụng chỉ thị ssr
định vị đợc 1790 locus ở 26 nhóm liên kết bao phủ một vùng 3425,8 cM với
khoảng cách trung bình giữa các locus là 1,91 cM. Trong đó bản đồ liên kết
genome này bao gồm 71,96% các locus gen chức năng, 475 locus có liên kết với
3 loại gen chính quy định quá trình sinh học, thành tế bào, chức năng phân tử ở
bông.

Ngoài các chỉ thị phân tử đã đợc đề cập đến trong nội dung đề tài này còn
có rất nhiều các chỉ thị khác nữa: STS (sequennce tag site), SCAR (sequence
characterized amplified region), CAPS (cleaved amplified polymorphic
sequence).

I.5 tình hình Nghiên cứu đa dạng di truyền trên đối
tợng cây bông
I.5.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông trên thế giới
Là một cây trồng quan trọng nhng do có bộ gen lớn và phức tạp, nên công
tác nghiên cứu genome bông tiến chậm hơn so với các cây trồng khác nh lúa,
ngô, đậu tơng...[26]
Những thành tựu khoa học sử dụng chỉ thị phân tử nh sử dụng chỉ thị
RFLP, chỉ thị SSR, hay RAPD (mục I.4) ...định vị đợc rất nhiều các locus trên
genome bông đã tạo điều kiện để việc nghiên cứu đa dạng di truyền trên đối tợng
bông sử dụng chỉ thị phân tử, trở nên thuận tiện hơn.
Trong các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền chỉ thị
RFLP, SSR có mức độ chính xác rất cao, nhng RFLP có khối lợng công việc
cồng kềnh nên ít đợc sử dụng hơn chỉ thị SSR.
Cãndida H.C. de Magalhães Bertini và cs (2006) đánh giá đa dạng di
truyền các giống bông (Gosypium hirsutum L) đang đợc trồng ở Brazil,
Argentine và Paraguay. Sau khi tách chiết ADN của 53 giống bông và nghiên
cứu tính đa dạng, sử dụng 31 cặp mồi SSR, khuếch đại 33 locus. Kết quả thu đợc tổng số 66 allen, trung bình 2,13 allen/locus SSR và giá trị PIC khác nhau từ
0,18 - 0,62 giá trị trung bình là 0.4, hệ số không tơng đồng từ 0 - 0,41. Cũng trên

Lê Công Tùng

15

MSSV: 507301110

Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

đối tợng bông, Gutierrez và cs (2002) đã sử dụng 60 cặp mồi cho đa hình, kết
quả khuếch đại 69 locus với tổng số 139 allen và trung bình có 2 allen/locus. Liu
và cs (2000b) đã sử dụng 56 cặp mồi cho đa hình, khuếch đại 62 locus bông và
thu đợc tổng số 325 allen, trung bình 5 allen/lucus, giá trị PIC tính đợc là từ
0.05- 0.82 giá trị trung bình là 0.31. Các giống bông mà Liu và cs (2000b) sử
dụng có cả các giống G.hirsutum hoang dại. Multani và Lyon (1995), khi phân
tích đa dạng di truyền giữa 9 giống bông của úc sử dụng chỉ thị RAPD cũng thu
đợc kết quả giá trị khoảng cách di truyền thấp (0.01-0.08). Iqbal và cs (1997)
cũng sử dụng chỉ thị RADP tìm ra khoảng cách di truyền thấp (0.18-0.07) giữa
17 giống G.hirsutum [13].
A B Dongre* và cs, (2007) đã đánh giá đa dạng di truyền của 19 đối tợng
bông gồm: 11 kiểu gen của loài G. hirsutum và 8 kiểu gen của loài G. arboreum,
sử dụng 25 mồi SSR đợc lựa chọn ngẫu nhiên từ tập hợp mồi JESPR-307 do
phòng thí nghiệm Brookhaven National Laboratories công bố và 19 mồi ISSR.
Trong số 25 chỉ thị SSR có 17 chỉ thị cho tổng số 56 băng đa hình, 4 chỉ thị là
đơn hình và 4 chỉ thị còn lại là không ghi đợc kết quả và không cho băng đa
hình. Hệ số tơng đồng giứa hai loài G.hirsutum và G.arboreum là 0.59, khi so
sánh hệ số tơng đồng của các giống nhị bội G.arboreum (0.618) thấy nhỏ hơn
của các giống tứ bội G.hirsutum (0.718). Trong số 19 chỉ thị ISSR tạo ra 72 băng
đa hình, một mồi là đơn hình, 3 mồi không ghi đợc kết quả và không cho đa
hình. Hệ số tơng đồng giữa hai loài G.hirsutum và G.arboreum là 0.59 và cũng
cho kết quả hệ số tơng đồng của các loài tứ bội cao hơn các loài lỡng bội [10].
I.5.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây bông tại Việt Nam [6].
ở Việt Nam, Nguyễn thị Minh Nguyệt và cs (2009) đã nghiên cứu đa
dạng di truyền của 49 giống bông địa phơng và nhập nội, đại diện cho 3 nhóm

bông Luồi (G.hirsutum L.), bông Hải Đảo (G.babardense L.), bông Cỏ
(G.arboreum L.) sử dụng 50 cặp mồi SSR. Kết quả trong số 50 cặp mồi kiểm tra,
có 27 cặp mồi cho đa hình với tổng số allen thu đợc là 128, độ tơng đồng di
truyền giữa các giống bông nằm trong khoảng 0.48-0.97 trung bình là 0.8, các
cặp giống xa nhau nhất về di truyền (có hệ số tơng đồng 48%) chủ yếu là những
cặp bông Luồi-bông Hải Đảo. Đa dạng di truyền quan sát đợc trong nhóm các
giống bông Luồi cao hơn so với 2 nhóm bông Hải Đảo và bông Cỏ. Cũng trong
nghiên cứu này, 49 giống bông nghiên cứu đã chia làm 3 nhóm: nhóm 1 gồm 16
giống bông Hải Đảo, nhóm 2 gồm 21 giống bông Luồi, nhóm 3 gồm 12 giống
bông Cỏ. Độ tơng đồng di truyền của nhóm 1 với 2 nhóm bông còn lại thấp, chỉ
khoảng 59%. Nhóm bông Luồi và bông Cỏ gần nhau về mặt di truyền hơn, với

Lê Công Tùng

16

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

độ tơng đồng di truyền khoảng 67%. Độ tơng đồng di truyền giữa các giống
bông trong cùng nhóm phân loại khá cao, trên 84%.

Chơng II: Vật liệu và phơng pháp
nghiên cứu
II.1 Vật liệu
II.1.1 Vật liệu thực vật

Chúng tôi nghiên cứu 21 giống bông bao gồm: 11 giống bông luồi
(G.hirsutum L.) và 10 giống bông Hải đảo (G.barbadense L.) chọn lọc từ tập
đoàn giống của Viện nghiên cứu bông và PTNN Nha Hố.
Bảng 1: Danh sách các giống bông Luồi
Tt

Tên giống

MstĐ

Nguồn gốc

Năm thu thập

1

591

ấn Độ

1984

2

1358

Nam Mỹ

1999

3

1426

Nam Mỹ

1999

4

1458

Thái Lan

2000

5

1488

Thái Lan

2000

6

1490

Thái Lan

2000

7

1503

Thái Lan

2000

8

1516

Thái Lan

2000

9

1530

Trung Quốc

2000

10
11

1562

1598

Trung Quốc
Trung Quốc

2000
2001

Bảng 2: Danh sách các giống bông Hải Đảo

Lê Công Tùng

17

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp
tt

Khoa CNSH&MT
MstĐ

Nguồn gốc

Năm thu thập

1

10

Ai cập

1965

2

62

ấn độ

1984

3

128

Ai cập

1984

4

129

Ai cập

1984

5

138

Ai cập

1984

6

139

Ai cập

1984

7

141

agy

1984

8

147

agy

1984

9

148

Zaf

1984

10

156

Zaf

1984

Tên giống

Chú thích: MSTĐ: mã số tập đoàn
II.1.2 Hóa chất, thiết bị
II.1.2.1 Hóa chất
Các hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử:
CTAB, NaCl, Taq polymeraza, dNTP, PVP, BSA, Tris- HCl, Na 2-EDTA,
DIECA, - mercaptoethanol, Ascorbic acid, Etanol 100%, NaOAc (sodium
acetat), isoamyl alcohol, chloroform, isopropanol, ethidium bromide (EtBr)...
II.1.2.2 Thiết bị
Máy li tâm, máy nghiền mô, máy PCR Veriti 96 well thermal cycler, máy
quang phổ Nanodrop, tủ hút...
II.1.3 Chỉ thị ssr

Các cặp mồi ssr (20 cặp) đợc chọn lọc từ cặp mồi đã đợc lập bản đồ trên
hệ genome cây bông(Cotton Marker Database:,
Cotton Genome database:).
TT

1

2

18

3

4

5

6

7

8

9

10

Lê Công Tùng

MSSV: 507301110

Tªn måi
Forward primer

Tr×nh tù måi

Reverse primer

TT

11

12

TCGAATTTTCTCTCTCTCTCTCTCT

TCCAGTTCTTTTTGCCTTGG

CGCAAGCCACCTGTAAAAC
AGAGGGAGTAAAGATTTGGGG

BNL1551
BNL1604

15

13

AATGGAATTTGAACCCATGC

16

TGGGCATTTAGCCATTTACC

ACCGCCATTACTGGACAAAG

CTCCCTCTCTCTAACCGGCT

17

CAATGAACAAAAAATGTAAGGG

BNL2495

GAAAAACCAAAAAGGAAAATCG

TGTAGGAACAACATGCCCAA

18

BNL1611

BNL2590

TGTTTTTGCATCATCCTTGC

TACCATCTCACGGATCCACA

19

14

BNL2821

CGATTTTACTGCTTCAGACTTG

GGTGAAACATAGCGTGTTGC

20

CGATTCCGGACTCTTGATGT

BNL2895

CAATCTGGGATCAAAAAAACC

AGTACCGGACTCGGCACTAT

ATCTTTCAAACAACGGCAGC

BNL3257

CTCTTAATGCTTGGCCTTGG

BNL2449

BNL1673

MSSV: 507301110

19

Lª C«ng Tïng

Khoa CNSH&MT
§å ¸n tèt nghiÖp


Tªn måi
Forward primer

Tr×nh tù måi

Reverse primer

CCCAAACCTGTCTCACCAAC

GTGCATGTGGTATGTTGGGA

AAACGGAAACGAAGAAGGGT
AACGGAACAAACCTTGAGGA

BNL3261
BNL3379

CATGTGTCTCCGTGTGTGTGTG

ACTGCAAGCTCTGCCCTAAA

CCCTTGGGAATAGCAGGTG

TTTAGCCCCAGTAACATGCC

CCATCCCCAGTGGTGTTATC

BNL1693

BNL3599

GAGTTACGCCTGGCAATCAT

TGACCTCAATTTAGAAACCC

ATCGATCACTTGCTGGTTCC

BNL4059

GGGTGTTACATAGAGTGTATAAAATTG

ATCAAGTTTTCAGGGCAATC

GTTAGCCACGTGTTAGTTCTATG

JESPR296

GAGAAGTTAGTTACTTGCAT

BNL3816

NAU2556

TGCTTTGGGGTTTGATATTT

CTGATTGTACTTTGCGGGTA

AATATGGAGATCACCCCTCA
TGCAAGGAATCAAGTTCACA

NAU3171
NAU3377

MSSV: 507301110

20

Lª C«ng Tïng

Khoa CNSH&MT
§å ¸n tèt nghiÖp

II.2 Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
II.2.1 T¸ch chiÕt ADN tæng sè


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

ADN lá bông đợc tách chiết và tinh sạch theo phơng pháp CTAB và Doyle

và Doyle (1987) có cải tiến.
II.2.1.1 Chuẩn bị vật liệu
-Chuẩn bị mẫu lá non của mỗi giống: các tế bào lá non có cấu trúc màng
tế bào dễ bị phá vỡ, sẽ thuận lợi khi tách chiết ADN.
-Dung dịch đệm chiết
Bảng 4: Thành phần đệm chiết
Hóa chất

Nồng độ

Thể tích

1 M Tris- HCl pH 8.0

100 mM

100 ml

5 M NaCl

1.4 M

280 ml

0.5M Na2-EDTA, pH 8.0

20 mM

40 ml

CTAB

2% (w/v)

20g

PVP40

2% (w/v)

20g

DIECA

0.1%

1g

- mercaptoethanol
Ascorbic acid

0.2% (v/v)

2 ml

0.1% (w/v)

1g

H2O

Tổng số

1000 ml

Hỗn hợp này có tác dụng:
+Phá vỡ màng tế bào và màng nhân đồng thời giải phóng ADN ra ngoài.
+Dung dịch Tris- HCl pH 8.0 làm ổn định pH dung dịch đệm chiết.
+Na2-EDTA pH 8.0 có tác dụng gắn chặt các ion Mg ++ là yếu tố cần thiết
cho sự hoạt động của enzyme nucleaza, làm bất hoạt enzyme này.
+NaCl làm tăng khả năng hòa tan nucleic acid trong dung dịch.
-Dung dịch đệm rửa:
Hỗn hợp đệm rửa phải có nồng độ cồn cao, nồng độ muối cao để tránh cho
ADN đã kết tủa bị hòa tan trở lại gây tổn thất ADN.
Bảng 5: Thành phần Wash buffer I
Hóa chất

Nồng độ

Thể tích

Etanol 100%

76%

380 ml

1M NaOAc (sodium acetat)

0.2M

100 ml

H2O

Lê Công Tùng

20 ml
21

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Tổng số

500 ml
Bảng 6: Thành phần Wash buffer II

Hóa chất

Nồng độ

Thể tích

Etanol 100%

76%

380 ml

1M NaOAc (sodium acetat)

0.2M

100 ml

H2O

20 ml

Tổng số

500 ml

-Các hóa chất và dụng cụ cần dùng khác...
II.2.1.2 Quy trình tách chiết
-Mẫu lá non đợc nghiền trong nitơ lỏng (-196oC) trong ống eppendorf 2
ml. Trong nitơ lỏng các mô bị đông cứng, dới tác dụng của cơ học chúng dễ dàng
bị phá vỡ. Ngoài ra ở nhiệt độ thấp các enzyme đều bị bất hoạt, tránh cho ADN
bị phân hủy bởi enzyme Dnase có trong tế bào khi nghiền.
-Thêm 1 ml dung dịch đệm chiết.
-ủ 65oC trong 90 phút , cứ 15 phút lắc đều 1 lần.
-Cho 500 à l chloroform: isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ trong 5 phút, sau
đó ly tâm 12.000 (vòng/phút) trong 15 phút. Trong quá trình này protein,
polysaccharide, lipid và các chất hữu cơ khác bị biến tính. Khi ly tâm các chất
này và xác tế bào tách ra khỏi hỗn hợp, còn lại phần dịch hòa tan ADN ở phía
trên.

-Chuyển phần dịch phía trên sang ống eppendorf mới, cho 500 à l
isopropanol để tủa ADN. Ly tâm 12.000 (vòng/phút) trong 15 phút để thu tủa.
-Rửa tủa bằng 500 à l Wash buffer I, sau đó ly tâm 12.000 (vòng/phút)
trong 5 phút để thu tủa.
-Tiếp tục rửa bằng 500 à l Wash buffer II, sau đó ly tâm 12.000
(vòng/phút) trong 5 phút để thu tủa.
-Để khô ADN sau đó cho 50 à l TE
-Khử ARN bằng cách cho thêm 4 à l RNAse/eppendorf trong tủ ấm 37oC
trong 3h.
II.2.1.3 Kiểm tra ADN tổng số

Lê Công Tùng

22

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Chất lợng và nồng độ ADN tổng số đợc kiểm tra trên gel agarose 0.8%.
Nồng độ chính xác đợc đo trên máy quang phổ Nanodrop.
Nếu ADN tách chiết có chất lợng tốt, khi kiểm tra trên gel agarose 0.8%
chỉ có 1 vạch ADN quan sát đợc. Nếu ADN bị gãy vụn thành nhiều đoạn trong
quá trình tách chiết thì trên gel agarose sẽ quan sát thấy có nhiều vạch ADN tơng
ứng với các đoạn có mức độ dài ngắn khác nhau.
II.2.2 Phản ứng PCR
II.2.2.1 Thành phần phản ứng PCR: Mỗi phản ứng PCR bao gồm các

thành phần đợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR
tt

Thành phần

Thể tích à l

1

50 ng ADN tổng số

3

2

0.15 à M mồi

3

3

0.2 à M dNTPs

1.5

4

1X dịch đệm PCR

1.5

5

Taq 16X

0.75

6

PVP 10%

1.5

7

BSA 10%

1.5

8

H2O

2.25

Tổng thể tích

15

II.2.2.2 Chơng trình chạy PCR: Tiến hành phản ứng PCR lần lợt từng
mồi đối với ADN tổng số của 21 giống. Phản ứng PCR đợc tiến hành trên máy
Veriti 96 Well Thermal Cycler. Tổng thể tích dung dịch phản ứng là 15 l
Bảng 8: Chơng trình chạy PCR
Các bớc

Nhiệt độ( oC )

Thời gian

1

95

5 phút

2

94

30 giây

3

55

30 giây

4

72

2 phút

5
6

Lê Công Tùng

Lặp lại 35 chu kỳ (các bớc 2,3,4)
4

23

MSSV: 507301110


Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

II.2.3 Điện di, phát hiện sản phẩm
Phơng pháp điện di tiến hành theo phơng pháp điện di trên gel agarose của
Khoa Genome thực vật, Trờng Đại học công nghệ Texas Mỹ 2004 có cải tiến.
II.2.3.1 Nguyên tắc
Trong quá trình điện di do ADN tích điện (-) nên các băng ADN sẽ di
chuyển từ phía cực (-) sang phía cực (+) của bể điện di. Điện áp càng cao ADN
di chuyển càng nhanh. Thời gian điện di tùy thuộc vào kích thớc sản phẩm PCR.
Sau khi kết thúc điện di các băng ADN có kích thớc khác nhau sẽ đợc
phân tách do chúng có tốc độ di chuyển khác nhau. Có thể quan sát thấy khi

chụp ảnh gel.
II.2.3.2 Chuẩn bị gel agarose
Gel agarose: là một loại polymer tách từ rong biển, cấu tạo bởi 2 monomer
là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.
-Bột agarose đợc hòa tan trong dung dịch đệm theo đúng tỷ lệ (đối với
kiểm tra ADN tổng số, gel agarose đợc chuẩn bị với nồng độ 0.8%, đối với kiểm
tra sản phẩm PCR, gel agarose đợc chuẩn bị với nồng độ 3.5%)
-Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng.
-Hạ nhiệt độ sôi của gel xuống khoảng 50oC
-Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) có nồng độ 0.5 à g/ ml. Quan sát chất
này khi chiếu đèn cực tím nó phát huỳnh quang màu cam, khi EtBr liên kết với
ADN cờng độ màu có thể tăng lên gần 20 lần.
-Chuẩn bị khay gel và lợc.
-Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel, cắm lợc. Thời gian chờ gel
đông là 45-60 phút.
Gel trớc khi đổ vào khay phải không có bọt. Nếu nh có bọt sẽ làm ảnh hởng đến kết quả của ảnh gel không đợc đẹp.
II.2.3.3 Điện di sản phẩm PCR
Sau khi chuẩn bị gel xong tiến hành điện di theo các bớc sau:
-Tra mẫu ADN
-Chuẩn bị dung dich đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di.
-Chạy điện di tại 100 mA
-Rửa gel trong nớc, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.
II.2.4 Phơng pháp phân tích số liệu: phơng pháp phân tích đa dạng di
truyền bằng phần mềm NTSYS pc v.2.1 ( Biostatistics Inc, 2002)

Lê Công Tùng

24

MSSV: 507301110

Đồ án tốt nghiệp

Khoa CNSH&MT

Gel điện di sản phẩm của phản ứng PCR đợc soi trên máy UV và chụp
ảnh. ảnh gel đợc dùng để nhận dạng ADN của từng các thể, sau đó so sánh nhận
dạng ADN giữa các giống để phân tích đa dạng di truyền, thể hiện thông qua:
-Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) đợc coi là thớc đo tính đa
dạng di truyền của các alen ở từng locus SSR. Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC
có thể đợc coi nh là sự đa dạng di truyền của locus gen nghiên cứu và tính theo
phơng trình [13]:
n

PIC = 1 j = 1 pij2
j =1

Pij : là tần số xuất hiện của alen thứ j tơng ứng với mồi i.
Giá trị PIC càng lớn tức là mức độ đa hình của locus do mồi i khuếch đại
Trong đó:

càng lớn, tức là càng nhiều allen đợc sinh ra.
-Hệ số tơng đồng di truyền S [3]: phản ánh mức độ giống nhau và khác
nhau giữa các giống. Cơ sở để tính toán hệ số này là mô hình toán Nei và Li
(1979) nh sau:

S=
Trong đó:

2 N xy
Nx + N y

S: là hệ số tơng đồng( hệ số khác nhau là d = 1 S )
Nxy: là số băng cùng vị trí của mẫu x và y
Nx, Ny: là số băng AND của mẫu x và y

Trong trờng hợp số lợng mẫu ít, hệ số tơng đồng có thể tính thủ công; tuy
nhiên ngời ta có thể sử dụng phần mềm NTSYS để thay cho việc tính thủ công và
trong trờng hợp số lợng mẫu quá lớn.
Sau khi nhận dạng ADN, bảng dữ liệu nhị phân đợc chuẩn bị gồm các số 0
và 1, trong đó 0 là không có băng ADN và 1 là có băng ADN ở cùng một vị trí.
Bảng dữ liệu nhị phân này sẽ đợc nhập vào chơng trình NTSYS để cho ra bảng
hệ số tơng đồng S và sơ đồ hình cây biểu thị mối liên kết di truyền giữa 21 giống
bông nghiên cứu.
Ví dụ khi kiểm tra đa dạng di truyền của 5 đối tợng, sử dụng một cặp mồi
SSR, có sơ đồ nhận dạng ADN nh sau:

Lê Công Tùng

25

MSSV: 507301110