Quy trình nhân giống cây Hà Thủ ô đỏ

BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KĨ THUẬT MÔI TRƢỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT QUY TRÌNH NHÂN
GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(POYGONUM MULTIFLORUM)
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THU THỦY

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN
TH.S PHẠM VĂN LỘC

Tp.HCM ngày 30 tháng 6 năm 2014


BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KĨ THUẬT MÔI TRƢỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT QUY TRÌNH NHÂN

GIỐNG CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(POLYGONUM MULTIFLORUM)
Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Th.S PHẠM VĂN LỘC

NGUYỄN THU THỦY
MSSV: 2008100266
LỚP: 01DHSH1

T.p HCM, ngày 5 tháng 7 năm 2014
ii


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học & Kĩ Thuật Môi
Trƣờng của Trƣờng Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM đã truyền dạy cho em
những kiến thức quý báu trong suốt 4 năm học để em có hành trang cho tƣơng lai.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, thạc sĩ Phạm Văn Lộc, ngƣời đã trực
tiếp tận tình hƣớng dẫn em thực hiện môn khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin giử lời cảm ơn tới toàn bộ các bạn, anh chị em cùng làm việc và học tập trong
phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận
lợi cho em trong suốt quá trình thực thực hiện khóa luận.
Tuy em đã cố gắng rất nhiều, song bài báo cáo chắc chắn không thể tránh khỏi nhiều
thiếu sót. Em kính mong nhận đƣợc sự phê bình và những ý kiến đóng góp quý báu của
thầy cô!. Em xin chân thành cảm ơn.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thu Thủy

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan rằng báo cáo thực tập này là do chính tôi thực hiện. Các số liệu thu thập
và kết quả trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa
học nào.

Ngày 30 Tháng 06 Năm 2014
Sinh viên thực hiện
NGYỄN THU THỦY
(ký và ghi họ tên)

iv


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... iv
MỤC LỤC ............................................................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... viii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...................................................................................................... ix
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................................ x
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................ 0
1.1. Tổng quan về Hà thủ ô đỏ. ......................................................................................... 3

1.1.1. Vị trí phân loại .....................................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật................................................................................................4
1.2. Giới thiệu về vi nhân giống ....................................................................................... 7
1.2.1. Khái niệm vi nhân giống (Micropropagation) ...................................................7
1.2.2. Một số phƣơng pháp vi nhân giống .....................................................................7
1.3. Các giai đoạn chính nhân giống in vitro ................................................................... 9
1.3.1. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro ..........................................................................9
1.3.2. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi ............................................................................10
1.3.3. Tăng sinh cụm chồi in vitro..............................................................................10
1.3.4. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm ...................................10
1.4. Những vấn đề trong nuôi cấy mô ........................................................................... 11
1.4.1. Lựa chọn vật liệu đê nuôi cấy ...........................................................................11
1.4.2. Điều kiện nuôi cấy. ............................................................................................12
1.4.3. Sự tạp nhiễm .....................................................................................................12
1.4.4. Tính bất định về mặt di truyền ..........................................................................13
1.4.5. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy .....................................................13
1.5. Pha chế dung dịch và chuẩn bị môi trƣờng cho nuôi cấy......................................... 14
1.5.1. Các chất khử trùng thông dụng .........................................................................14
1.5.2. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (ĐHSTTV)..........................................14
v


1.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới liên quan .................................... 17
1.6.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc .....................................................................................17
1.6.2. Nghiên cứu trong nƣớc ......................................................................................18
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 20
2.1. Vật liệu .................................................................................................................... 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 21
2.3. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................................ 26
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................................. 26

2.5. Phân tích và xử lý số liệu ......................................................................................... 27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 28
3.1. Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ javen lên hiệu quả khử trùng mẫu.28
3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA và BA lên sự tăng sinh chồi
cây Hà thủ ô đỏ. ............................................................................................................... 30
3.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của nồng độ IBA lên sự tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ. ............. 34
3.4. Thí nghiệm 4: ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên sự tạo rễ cây Hà thủ ô đỏ. ........... 38
3.5. Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hƣởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây con Hà thủ ô đỏ
khi ex vitro. .................................................................................................................... 41
CHƢƠNG 4. CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 44
4.1. Kết luận .................................................................................................................... 44
4.2. Kiến nghị .................................................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 45

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Javen lên hiệu quả khử trùng
mẫu. ......................................................................................................................................21
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA và BA lên sự tăng sinh
chồi cây Hà thủ ô đỏ.............................................................................................................22
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IBA lên quá trình tạo rễ......24
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên quá trình tạo rễ. ...24
Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây ...........25
Bảng 4.1: Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ Javen lên hiệu quả khử trùng mẫu ..................28
Bảng 4.3: Các nghiệm thức không có ảnh hƣởng tốt lên sự tăng sinh chồi cây Hà thủ ô đỏ.
..............................................................................................................................................30
Bảng 4.5: ảnh hƣởng của nồng độ IBA lên số lƣợng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ ........31
Bảng 4.7: ảnh hƣởng của nồng độ IBA lên số lƣợng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ ........35

Bảng 4.9: Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên số lƣợng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô
..............................................................................................................................................39

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Hà thủ ô đỏ ..............................................................................................................3
Hình 2.2. A, B, C, D lần lƣợt là hoa, lá, củ của Hà thủ ô đỏ .................................................5
Hình 4.1: Hà thủ ô đỏ sau 10 ngày cấy ................................................................................29
Hình 4.2: Chồi tăng sinh trên môi trƣờng MS bổ sung BA kết hợp NAA với các nồng độ
khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy..............................................................................................34
Hình 4.4: Ảnh hƣởng của IBA lên quá trình tạo rễ ở các nồng độ khác nhau. ....................37
Hình 4.5: Hình thái sẹo ở gốc cây Hà thủ ô đỏ của các nghiệm thức .................................38
Hình 4.6: các nghiệm thức thăm dò ảnh hƣởng của NAA lên quá trình tạo rễ....................41
Hình 4.7: Cây đƣợc trồng vào giá thể sau khi huấn luyện 2 tuần. .......................................41
Hình 4.10: Các gốc cây ở nồng độ 0.1 và 0.3 NAA đều tạo sẹo ở gốc trong lần cấy khảo
sát lại. ...................................................................................................................................42
Hình 4.11: hình thái sẹo ở gốc cây Hà thủ ô đỏ sau khi xẻ đôi. ..........................................43

viii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ Javen lên hiệu quả khử trùng ..................................28
Biểu đồ 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA&BA lên số lƣợng và chiều cao chồi cây Hà thủ
ô đỏ. ......................................................................................................................................31
Biểu đồ 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ IBA lên số lƣợng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ...36
Biểu đồ 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên số lƣợng và chiều dài rễ cây Hà thủ ô đỏ. 39

ix


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4 D

2,4 dichlorophenoxyacetic acid

BA

6- Benzyladenine

Cs

Cộng sự

ĐHSTTV

Điều hòa sinh trƣởng thực vật

HTOĐ

Hà thủ ô đỏ

IBA

Indol butyric acid

KIN

Kinetin

MS

Murashige – Skoog, 1962

NAA

α – napthalenene acetic acid

NT

Nghiệm Thức

TCN

Trƣớc công nguyên

x


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vào thời kì tiền sử, con ngƣời phải tìm cây cỏ và động vật hoang dại để làm thức
ăn. Qua chọn lọc và thử thách, con ngƣời đã dần xác định đƣợc các loài thực vật, động
vật ăn đƣợc và không ăn đƣợc. Trong suốt quá trình lịch sử dài đó, những kinh nghiệm
về dƣợc liệu chữa bệnh đƣợc tích lũy dần.
Những tài liệu cổ ghi chép lại vào 5000 năm trƣớc công nguyên (TCN), ngƣời dân
Babilon đã hiểu biết về tác dụng dƣợc lý của nhiều cây thuốc. Vào thời Hy Lạp cổ đại,
Hippocrat (460 – 370 TCN) đƣợc coi là ông tổ của ngành y dƣợc, ngoài các công trình
về giải phẫu và sinh lý học ông còn đƣa vào sử dụng hơn 200 loại cây dƣợc liệu khác

nhau.
Đối với nền y học phƣơng Đông, phải kể đến Trung Quốc, vào thời kỳ Hoàng Đế
(2637 TCN) đã có sách nói về các phƣơng pháp chữa bệnh theo y lý đông phƣơng
cuốn “Nội kinh”. Sau đó năm 1596, cuốn “Bản thảo cƣơng mục” nói đến 1094 vị
thuốc đƣợc công nhận thực sự có giá trị khoa học và bổ ích do Lý Thời Trần biên
soạn, (1518 – 1593). Sau này, Bản thảo cƣơng mục đƣợc dịch ra 6 thứ tiếng khác nhau
trên thế giới: Nga, Anh, Đức, Pháp, Nhật,..
Đối với dân tộc ta, lịch sử y học cũng có tù rất lâu đời. 4000 năm TCN. Sau này,
Việt Nam có các danh y nổi tiếng nhƣ Tuệ Tĩnh (1330- ?) với bộ sách Nam dƣợc thần
hiệu 11 quyển, Hải Thƣợng Lãn Ông (1720 – 1791) với bộ sách Hải thƣợng y tôn tâm
tĩnh gồm 28 tập (Nguyễn Huy Công và cs, 2005).
Hà thủ ô đỏ (HTOĐ) là một vị dƣợc liệu quý đƣợc ghi nhận trong các tác phẩm của
các tác giả, danh y lớn nhƣ Bản thảo cƣơng mục, Hà thủ ô lục, Những cây thuốc và vị
thuốc Việt Nam,.. Cây HTOĐ đƣợc quan tâm, nghiên cứu ở cả phƣơng tây lẫn phƣơng
đông. Tác dụng dƣợc lý của HTOĐ đã đƣợc khoa học nghiên cứu và chứng minh là cải
thiện nhận thức và trí nhớ, hạ mỡ máu, bổ máu hoạt huyết, bổ gan, chống oxy hóa,
chống ung thƣ, ngoài ra hoạt chất trong HTOĐ có khả năng kháng khuẩn lao và kháng
vi rút cúm, đặc biệt là một số hoạt chất trong HTOĐ có khả năng kháng vi rút HIV – 1
khá mạnh, cải thiện bệnh Alzheimer, Parkinson, chống ung thƣ vú,.. Cây HTOĐ có
một số hợp chất quan trọng nhƣ: Anthraquinon (emodin và physcion), phenolic, rhein,
lecithin, catechin,.. (Liu và cs, 2011).
Tuy nhiên, hiện nay HTOĐ đang bị khai thác quá mức, vƣợt qua khả năng tự tái
sinh ngoài tự nhiên của loài. HTOĐ đang bị đe dọa (bậc R), thuộc diện cần bảo tồn,
nằm trong danh mục sách đỏ Việt Nam (2008). Cần thiết nhân giống và trồng trên diện
tích lớn để bảo tồn và phục vụ nguồn dƣợc liệu.
Cây HTOĐ là cây dƣợc liệu có một số hợp chất quan trọng nhƣ: anthraquinon
(emodin và physcion), phenolic, rhein, lecithin, catechin…(Liu và cs, 2011), thời gian
1

gần đây do bị khai thác qua mức và do nạn phá rừng nên lƣợng HTOĐ bị giảm sút,
mức độ đe dọa bậc R, đang thuộc diện cần bảo tồn. Trong tự nhiên, HTOĐ đỏ đƣợc
trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt (Đỗ Tất Lợi, 2004). Tuy nhiên, Lin
(2003) đã xác định các cây HTOĐ có nguồn gốc in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin
và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên.
Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật mang lại hiệu quả kinh tế
hơn hẳn các phƣơng pháp truyền thống. Kỹ thuật này cho phép sản xuất cây giống với
hệ số nhân giống rất cao, có thể tạo ra hàng loạt cá thể đồng nhất về mặt di truyền với
quy mô công nghiệp. Kỹ thuật này đƣợc áp dụng cho nhiều loại cây khác nhau để nhân
giống, tạo ra dòng cây sạch bệnh, bảo tồn nguồn gen, đặc biệt là các gen quý hiếm của
các loài hoa, cây dƣợc liệu.
Nuôi cấy in vitro giúp nhân nhanh số lƣợng cây HTOĐ nhằm mục đích bảo tồn
giống cây thuốc và phục vụ nguồn dƣợc liệu là hết sức cần thiết. Vì những lý do trên
tôi đã chọn đề tài là “Khảo sát quy trình nhân giống cây Hà thủ ô đỏ (polygonum
multiflorum)” với mục tiêu tìm hiểu quy trình nhân giống cây HTOĐ bằng phƣơng
pháp tái sinh chồi trực tiếp từ đốt thân cây HTOĐ in vitro.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Hà thủ ô đỏ.
1.1.1. Vị trí phân loại
Hà thủ ô đỏ thuộc:
Ngành (Division)
Lớp (Class)

Bộ (Ordo)
Họ (Familia)
Chi (Genus)
Loài (Species)
Tên Việt Nam:

Magnoliophyta
Eudicots
Caryophyllales
Polygonaceae
Polygonum
Polygonum multiflorum
Hà thủ ô đỏ, Giao Đằng, Dạ Hợp, Địa Tỉnh…

Hình 1.1 Hà thủ ô đỏ

3


Từ năm 1784, HTOĐ có tên khoa học là Polygonum multiflorum. Theo Haraldson
(1978) HTOĐ có tên khoa học là Fallopia multiflora, nhƣng tên này không đƣợc sử
dụng phổ biến, (Bộ công cụ xác định rừng có giá trị bảo tồn cao Việt Nam ,2008).
Hà thủ ô bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu bởi 2 nhà nghiên cứu nhật bản từ năm
1923, nhật bản dƣợc học tạp chí, 42: 144, 1923, theo nghiên cứu này, HTOĐ có chứa
1,7% các chất anthraglucozid (emodin, rhein, chyrsophanola,..), ngoài ra còn có
lexitin, đạm, đƣờng, tinh bột,.. Sự có mặt của các chất anthraglucozid, lexitin và các
chất khác đã chứng minh cho khả năng tác động lên hệ thần kinh suy nhƣợc, cơ thể
thiếu dinh dƣỡng, tác dụng bổ máu củ HTOĐ (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Theo Đỗ Tất Lợi thì có 1 vị thuốc khác mang tên Hà thủ ô trắng, thuộc họ thiên lý
Asclepiadaceae. Hà thủ ô trắng cũng có dạng thân leo, dây màu nâu đỏ, chứa nhựa sữa

trắng, đƣợc dùng thay thế cho HTOĐ trong các bài thuốc. Nhƣng hà thủ ô trắng không
có chứa các dẫn chất anthranoid là dẫn chất chức năng chủ yếu có trong HTOĐ. Tại
Trung Quốc có 1 vị thuốc khác đƣợc gọi là Bạch hà thủ ô thuộc họ thiên lý
Asclepiadaceae, chi Cynamchum, vị thuốc này cũng không có chứa các dẫn chất
anthranoid nhƣ Hà thủ ô đỏ. HTOĐ là vị đúng, đƣợc các quốc qia Trung Quốc, Nhật
Bản coi là vị chính thức (Đỗ Tất Lợi, 2004).
Ở Việt Nam, Trung Quốc,.. HTOĐ đƣợc sử dụng nhƣ một vị thuốc bổ máu, thận,
can, tỳ, phế,.. là một vị thuốc quan trọng trong nhiều bài thuốc cổ. Công năng và các
bài thuốc cổ của HTOĐ đƣợc ghi chép nhiều trong các sách y cổ nhƣ: Hà thủ ô lục,
Bản thảo cƣơng mục (do Lý Thời Trần biên soạn, 1518 – 1593), Thần nông bản thảo
kinh độc, Bản thảo cầu chân, Dƣợc phẩm hóa nghĩa, Bản kinh phùng nguyên, Nhật
hoa từ bản thảo, Bản thảo thuật, Bản thảo tái tân,..
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Hà thủ ô đỏ còn có tên là Giao đằng vì dây leo xoắn vào nhau hoặc Dạ hợp vì ban
đêm, dây sẽ quấn lấy nhau (Đỗ Tất Lợi, 2004).
1.1.2.1. Mô tả
Dây leo sống nhiều năm. Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau. Rễ củ to màu nâu
đỏ. Lá hình tim, cả hai mặt phiến lá đều nhẵn, đầu thuôn nhọn, dài 5 - 7cm, rộng 3 5cm, mép nguyên hoặc lƣợn sóng. Lá kèm mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Cụm hoa
chùy mọc ở đầu cành hoặc nách lá, mang nhiều hoa. Hoa nhỏ màu trắng có đƣờng
kính 2mm, cuống hoa dài 1mm – 3mm, nhị 8 với 3 nhị dài hơn. Quả 3 cạnh, khi khô

4


thì không tự mở đƣợc. Mùa hoa vào tháng 10, mùa quả vào tháng 11 – 12, (Đỗ Tất
Lợi, 2004).
1.1.2.2. Dược liệu
Rễ củ hình tròn, dài, không đều, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay
chặt thành từng miếng to. Mặt ngoài có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo
thành. Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có

nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ, vị chát.
1.1.2.3. Vi phẫu củ
Lớp bần gồm 3 – 4 hàng tế bào, mô mềm vỏ phát triển nhiều, rải rác có tinh thể
calci oxalat hình cầu gai, trong mô mềm có nhiều bó liber gỗ đƣợc thành lập, ở trung
tâm có 1 vòng liber gỗ cấp 2.
1.1.2.4. Bột củ
Vị đắng chát, màu nâu đỏ, quan sát vi phẫu thấy có nhiều hạt tinh bột hình cầu và
bán cầu đƣờng kính khoảng 5 – 25 μm, hình rốn sao, vạch hay phân nhánh, có hạt kép
2 – 3 hạt ghép chung. Mảnh mô mềm có thành tế bào mỏng, chứa tinh bột. tinh thể
calci oxalat hình cầu gai.

Hình 1.2. A, B, C, D lần lượt là hoa, lá, củ của Hà thủ ô đỏ

5


1.1.2.5. Thành phần hóa học
Thân rễ Hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein,
physcion, protid, tinh bột, lipid, chất vô cơ, các chất tan trong nƣớc, lecitin,
rhaponticin (rhapontin, ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene-2-O-b-D-glucoside, tanin,
axit galic,.. (Liu và cs 2011)
1.1.2.6. Phân bố
Trên thế giới HTOĐ có nhiều tại Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam.
Tại việt nam HTOĐ mọc hoang ở vùng rừng núi, cao nguyên, phân bố nhiều nhất ở
vùng núi Tây bắc và các tỉnh phía bắc, sau đó là Tây nguyên, Lâm đồng,.. (Đỗ Tất Lợi,
2004).
1.1.2.7. Trồng trọt
HTOĐ thƣờng mọc hoang ở vùng núi có khí hậu mát mẻ quanh năm, nhiệt độ thích
hợp từ 20oC - 25oC, lƣợng mƣa trung bình năm 1500 – 1800mm, PH từ 5 – 6.5, đất
cao ráo, ẩm, thoát nƣớc.

Thời điểm gieo hạt tốt nhất là vào mùa xuân hoặc mùa thu, có thể dùng củ để trồng
hoặc dùng các đoạn hom dây bánh tẻ chứa nhiều đốt để dâm giống nhƣ khoai lang, thu
hoạch khi củ đƣợc 2 – 3 năm tuổi.
1.1.2.8. Thu hoạch
Thu hoạch củ vào mùa thu, tốt nhất là khi lá khô úa, sau khi đào về chặt thành
từng miếng lớn rồi phơi khô hoặc đồ chín rồi mới phơi khô. Còn có cách khác là đồ
chín với đậu đen rồi phơi khô, làm nhƣ vậy 9 lần thì đƣợc gọi là hà thủ ô chế (Đỗ Tất
Lợi, 2004).
1.1.2.9. Công dụng
Hà thủ ô đƣợc dùng làm vị thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, bồi bổ khí huyết, bổ
gan thận, bổ máu, làm đen râu tóc,… Dùng chữa các bệnh đau lƣng mỏi gối, thần kinh
suy nhƣợc, hoa mắt, chóng mặt, nam giới yếu sinh lý, tóc bạc sớm
HTOĐ làm chậm nhịp tim. Làm tăng nhẹ lƣu lƣợng máu động mạch vành và
bảo vệ đƣợc cơ tim thiếu máu.

6


HTOĐ có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng
nhu động ruột. Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ ô chín.
Tác dụng kháng khuẩn và virus: HTOĐ có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn
lao ở ngƣời và trực khuẩn lỵ Flexner. HTOĐ có tác dụng ức chế virus cúm. Ngoài
ra, sử dụng HTOĐ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với ngƣời bạc tóc
sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng (Đỗ Tất Lợi, 2004).
HTOĐ có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, đƣợc chứng minh rõ trên mô hình
gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol của
ruột thỏ, theo Đỗ Tất Lợi, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol.
HTOĐ có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch. Có thể tác dụng
giảm xơ cứng động mạch và do thuốc có thành phần lecithin (Đỗ Huy Bích và cs,
2004).

1.1.2.10. Tình trạng
Sẽ nguy cấp. Do bị khai thác rễ củ quá mạnh mẽ, vƣợt quá khả năng tái sinh tự
nhiên của loài. Mức độ đe dọa: bậc R, (Bộ công cụ xác định rừng có giá trị bảo tồn cao
Việt Nam, 2008).
Đề nghị biện pháp bảo vệ: Cần trồng trên diện tích lớn để bảo tồn nguồn dƣợc liệu
dồi dào và ổn định.
1.2. Giới thiệu về vi nhân giống
1.2.1. Khái niệm vi nhân giống (Micropropagation)
Vi nhân giống là khái niệm dùng để miêu tả phƣơng pháp nhân giống từ việc nuôi
cấy mô thực vật, nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh nhỏ
thực vật vô trùng đặt vào môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà
mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh đƣợc phân chia và cấy chuyền nhân giống.
Nhân giống in vitro giúp nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm nhƣ các loại cây rừng,
cây cảnh, cây dƣợc liệu, làm sạch bệnh do vi rút bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng.
Đồng thời, giúp bảo quản ngân hàng gen giống (Dƣơng Công Kiên, 2002).
1.2.2. Một số phƣơng pháp vi nhân giống
a. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng

7


Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên. Sau khi vô
trùng mẫu sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp chứa đầy đủ dinh dƣỡng khoáng
vô cơ và hữu cơ hoặc có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng thích hợp,..
Từ đỉnh sinh trƣởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành
một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vƣơn thân, ra lá và rễ để trở thành cây
hoàn chỉnh. Cây con đƣợc chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển bình thƣờng
(Dƣơng Công Kiên, 2002).
b. Nuôi cấy tế bào đơn
Khi mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng và đƣợc đặt trên máy lắc có tốc độ

điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào
đơn đƣợc lọc và nuôi cấy trên môi trƣờng đặc biệt để tăng sinh khối.
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trƣờng lỏng tế bào đơn đƣợc tách ra
và trải trên môi trƣờng thạch. Khi môi trƣờng thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát
triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi môi trƣờng thạch có tỉ lệ cytokinin-auxin thích
hợp, tế bào đơn sẽ có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
c. Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một mô phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào
đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trƣờng có sự hiện diện của auxin.
Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trƣờng
thích hợp.
d. Nuôi cấy protoplast – chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy
thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh
thành cây hoàn chỉnh.
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp
với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Quá trình
dung hợp protoplast có thể đƣợc thực hiện trên hai đối tƣợng cùng loài hay khác loài
(Dƣơng Công Kiên, 2002).
e. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

8


Hạt phấn ở thực vật đƣợc nuôi cấy trên những môi trƣờng thích hợp sẽ tạo thành mô
sẹo. Mô sẹo này đƣợc tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.
Ƣu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có nhiều ƣu điểm nổi bật hơn các
phƣơng pháp cổ điển khác.
- Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, không chiếm nhiều diện tích trong quá

trình tiến hành, có thể tiến hành ở bất kì địa điểm nào.
- Phục tráng đƣợc các giống cây đã bị nhiễm, thoái hóa.
- Hệ số nhân cao, nhân nhanh. Có thể đáp ứng nhu cầu số lƣợng lớn trong thời gian
ngắn.
- Bảo quản giống dễ dàng.
- Tiết kiệm chi phí vận chuyển giống từ nơi này tới nơi khác.
- Vật liệu để nhân giống dồi dào, phong phú mà tiết kiệm chi phí, hiệu quả kinh tế
cao
Ứng dụng
-

Tạo cây trồng sạch bệnh và kháng bệnh.
Sản xuất cây đơn bội.
Lai xa.
Bảo quản nguồn gen.

Hiện nay nuôi cấy mô thực vật đang đƣợc đƣa vào chƣơng trình chọn giống, nhân
giống hiện đại. Mặc dù còn nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu để giải quyết trong
những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai
của nó và đã có những đóng góp tích cực đƣa lý luận sinh học cây trồng vào thực
tiễn nông nghiệp.
1.3. Các giai đoạn chính nhân giống in vitro
1.3.1. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro
Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro.
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguyên liệu vô trùng để đƣa vào nuôi cấy. Cụ
thể là quá trình khử trùng mẫu chồi bằng các thuốc khử trùng có sẵn: javel, cồn.
Quá trình này đƣợc xây dựng từ quá trình khử trùng mẫu với các thí nghiệm thay

9

đổi thời gian quá trình khử trùng đối với từng chất khử trùng dựa vào tỷ lệ nhiễm
(Dƣơng Công Kiên, 2002).
Chọn mẫu từ tự nhiên: Mẫu chồi đƣợc chọn cần phải khỏe mạnh, không có
biểu hiện bệnh sẽ đƣợc cắt đem vào phòng thí nghiệm và rửa sơ bộ với xà phòng
và nƣớc sạch.
Quy trình khử trùng: Toàn bộ chất khử trùng đều đƣợc pha với nƣớc cất vô
trùng, khi thay đổi dung dịch khử trùng thì phải thao tác trong tủ cấy.
Đánh giá kết quả và xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu: Dựa vào kết quả tỷ lệ
nhiễm và tỷ lệ sống sau 10 ngày của quá trình khử trùng lần đầu sẽ xây dựng đƣợc
nghiệm thức khử trùng mẫu.
1.3.2. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi
Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hƣớng các mô nuôi
cấy. Quá trình này đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất
auxin và cytokynin ngoại sinh đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên,
bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy, mô non
chƣa phân hóa nhiều có khả năng tái sinh cao hơn các mô già đã chuyên hóa
sâu. Các môi trƣờng khoáng cơ bản thƣờng đƣợc sử dụng là môi trƣờng MS và
B5 (Dƣơng Công Kiên, 2002).
1.3.3. Tăng sinh cụm chồi in vitro
Chồi sau khi đƣợc tái sinh sẽ đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng nhân nhanh
đƣợc bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng phù hợp, mục đích tạo ra thêm nhiều
chồi con để phục vụ cho quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Đây là giai đoạn then
chốt của quá trình, để tăng hệ số nhân chồi. Môi trƣờng nuôi cấy thƣờng đƣợc bổ
sung các các chất điều hòa nhƣ auxin, cytokynin, gibberellin,.. và một số hợp chất
có nguồn gốc hữu cơ nhƣ nƣớc dừa, chuối,…Tùy thuộc vào từng đối tƣợng đối
tƣợng nuôi cấy, ngƣời ta nhân nhanh chồi bằng kích thích sự hình thành qua các
cụm chồi hay kích thích sự phát triển của các chồi nách hoặc thông qua phôi vô tính
(Dƣơng Công Kiên, 2002).
1.3.4. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm

Từ cụm chồi tiến hành tách thành các chồi đơn và đƣợc cấy vào các môi
trƣờng tạo rễ (chứa auxin riêng lẻ hoặc auxin kết hợp cytokinin). Sau khi hình

10


hành rễ, môi trƣờng sẽ đƣợc khảo sát với nồng độ auxin và cytokinin phù hợp
nhất cho ra các cây hoàn chỉnh.
Giai đoạn đƣa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bƣớc cuối cùng của quá
trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả năng ứng dụng quá trình này
trong thực tiễn sản xuất.
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dƣỡng sang sống
hoàn toàn tự dƣỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, ánh
sáng, độ ẩm, giá thể,.. Phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vƣờn ƣơm cũng
nhƣ ruộng sản xuất (Dƣơng Công Kiên, 2002).
1.4. Những vấn đề trong nuôi cấy mô
1.4.1. Lựa chọn vật liệu đê nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc chọn lựa mẫu cấy thích hợp và
chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho
thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan đƣợc chọn, tuổi sinh
lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trƣởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu.
 Kiểu gen
Kiểu gen ảnh hƣởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá đƣợc sử dụng
nhƣu cây kiểu mẫu, Cheng và Smith ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi
cấy sinh trƣởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers ghi nhận kiểu di truyền ảnh
hƣởng đến số lƣợng và đƣờng kính mô sẹo qua nuôi cây hạt phấn cà chua (Bùi Trang
Việt, 2000).
Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng
nuôi cấy in vitro ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác nhau, nhƣ ở
petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller cho rằng chồi mầm

thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt.
 Tuổi và sinh lý
Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy
có ảnh hƣởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều nghiên cứu
khác nhau về ảnh hƣởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik ghi nhận rễ phát
sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.

11


 Mẫu in vitro
Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả
năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vƣờn ƣơm nhƣ ở
cây Azalea theo nghiên cứu của Economou và Read. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu
khác ghi nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây
đồng ruộng (Bùi Trang Việt, 2000).
 Những yếu tố khác
Có nhiều yếu tố khác nhƣ là mùa lấy mẫu, kích thƣớc mẫu, điều kiện ánh sáng và
thời gian chiếu sáng,.. Mùa lấy mẫu tốt nhất ở vùng nhiệt đới ẩm là xuân hạ, lúc sức
sống mô mạnh mẽ, nhiệt độ và thời gian chiếu sáng cao làm giảm khả năng phát triển
của nấm bệnh và vi khuẩn.
1.4.2. Điều kiện nuôi cấy.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20-27oC. Theo Murashige (1974), nhiệt độ
ảnh hƣởng sâu sắc đến sinh trƣởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh
lý nhƣ hô hấp hay hình thành tế bào hay cơ quan.
 Cƣờng độ ánh sáng
Cƣờng độ ánh sáng là một yếu tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hƣởng đến khả
năng nuôi cấy in vitro dể cho cây có lá xanh. Ảnh hƣởng của ánh sáng hình nhƣ có liên
hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay

tối. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dƣơng Công
Kiên, 2002).
 Quang kỳ và chất lƣợng ánh sáng
Thời gian chiếu sáng ảnh hƣởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng.
Chất lƣợng ánh sáng ảnh hƣởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng đỏ có ảnh hƣởng
đến những biến đổi sinh lý trên cây nhƣ ra hoa, chế độ dinh dƣỡng và những hiện
tƣợng khác nhƣ tăng sinh chồi in vitro.
1.4.3. Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất đƣợc quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,

12


gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm
nhƣ từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trƣờng, dụng cụ và các máy
móc thiết bị nhƣ màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy.
Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng đƣợc
xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh
sinh trƣởng, mẫu lá hay rễ non. Môi trƣờng bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật
bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy,.. của cây mẹ, đây là nơi cƣ ngụ
khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc đƣợc. Đặc biệt, vi khuẩn
thƣờng nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trƣờng sau 1 tuần nuôi cấy.
Nhiễm khuẩn trong trƣờng hợp này thƣờng gây những vệt trắng sữa hoặc nâu vàng
xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dƣới đáy chai nuôi cấy.
Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập
quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài
đồng ruộng. Các bộ phận nhƣ rễ, củ, thân bò thì thƣờng khó làm sạch hơn các bộ phận
khác. Môi trƣờng không khí, phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng
nếu không đƣợc xử lý kịp thời, nấm thƣờng là nguyên nhân gây nhiễm chính
trong trƣờng hợp này. Nấm thƣờng tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi

phòng nuôi có nhiều ngƣời ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu
màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy.
1.4.4. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng
nhất với số lƣợng lớn nhƣng phƣơng pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua
nuôi cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải
thiện giống cây trồng nhƣng thực tế có rất ít biến dị có lợi đƣợc báo cáo. Nuôi cấy
mô sẹo cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Đến nay việc gây ra biến dị chƣa
đƣợc làm sáng tỏ nhƣng đƣợc đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố
thƣờng gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều
càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài.
Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị
(Dƣơng Công Kiên, 2002).
1.4.5. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy
Hiện tƣợng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trƣởng của mẫu bị ngăn chặn
hay hƣ mẫu. Hiện tƣợng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất tannin và

13


hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non. Phƣơng pháp làm giảm
sự hóa nâu mẫu nhƣ than hoạt tính đƣa vào môi trƣờng giúp ngăn cản quá trình
hóa nâu hay đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis,
Cattleya và Aerides với nồng độ thƣờng dùng 0,1 – 0,3 %. Tuy nhiên than hoạt tính
cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thụ các chất kích thích tăng
trƣởng và các chất khác (Bùi Trang Việt, 2000).
Để hạn chế ảnh hƣởng phenolcác nhà khoa học đƣa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:
- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non.
- Gây vết thƣơng trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng.
- Nuôi cấy mẫu trong môi trƣờng lỏng.

1.5. Pha chế dung dịch và chuẩn bị môi trƣờng cho nuôi cấy
1.5.1. Các chất khử trùng thông dụng
a. Nƣớc Javen (NaOCL)
Trong thƣơng mại chất này đƣợc cung cấp trong các bình nhựa và chuẩn độ là 480
clore, ngƣời ta thƣờng sử dụng nồng độ từ 5 – 20% đối với sự pha loãng 5%, thời gian
ngâm từ 5 – 30 phút. NaOCL nếu ngấm vào trong mô thực vật sẽ làm trở ngại sự tăng
trƣởng của mô về sau.
b. Thủy ngân (HgCL2)
Đây là một loại chất độc cực mạnh, vì vậy khi sử dụng phải hết sức lƣu ý đảm bảo
an toàn. HgCL2 là một chất khử trùng rất hiệu quả; ngƣời ta thƣờng dùng với nồng độ
rất yếu, từ 0.01% đến 0.05%, HgCL2 rất khó đào thải ra, cũng nhƣ các lúc rửa mẫu cần
thực hiện cẩn thận. Ngƣời ta rửa mẫu 4 – 5 lần thay vì 3 lần nhƣ các chất khử trùng
bình thƣờng khác.
c. Cồn Ethanol 70o
Có thể đƣợc sử dụng để lau sạch vật liệu thực vật trƣớc khi khử trùng; nó có thể
đƣợc dùng để ngâm nguyên liệu thực vật trƣớc khi khử trùng; nó có thể đƣợc dùng để
ngâm nguyên liệu trƣớc hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1
– 5 phút.
1.5.2. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật (ĐHSTTV)
Chất ĐHSTTV là những hợp chất hữu cơ gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực
vật và các hợp chất nhân tạo, có tác dụng điều tiết quá trình sinh trƣởng và phát triển

14