THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 týp KHÁNG NGUYÊN PHẾ cầu TRONG vắc XIN SYNFLORIX™

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
──────*****──────

LÊ THỊ HÒA

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP
KHÁNG NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN
SYNFLORIX™

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
──────*****──────

LÊ THỊ HÒA

THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH NHẬN DẠNG 10 TÝP KHÁNG
NGUYÊN PHẾ CẦU TRONG VẮC XIN SYNFLORIX™

Chuyên ngành : Động vật học (Vi sinh vật học)
Mã số

: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Văn Hùng

Hà Nội - 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp
kháng nguyên phế cầu trong vắc xin Synflorix™” là công trình nghiên cứu
của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Văn Hùng. Các
nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và
rõ ràng.
Hà Nội, ngày 29/10/2015
Học viên
Lê Thị Hòa

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên
hướng dẫn: TS. Phạm Văn Hùng, Phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia
Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình hướng dẫn và truyền dạy nhiều kiến
thức quý báu đồng thời luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.


Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các đồng nghiệp tại
Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công
Nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, chia sẻ và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ
ích trong quá trình tôi học tập tại Viện.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các anh, chị đồng nghiệp Khoa

Quản lý chất lượng Viện kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế đã
luôn động viên, chia sẻ và hỗ trợ công việc để tôi có điều kiện học tập và thực
hiện tốt đề tài nghiên cứu và luận văn này.
Nhân dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Lãnh đạo Viện
Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Ths. Lưu Anh Thư và các
đồng nghiệp Khoa Kiểm định vắc xin Vi khuẩn, phòng Tổ chức cán bộ,
phòng Khoa học và Đào tạo đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong
quá trình học tập, làm việc để tôi hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt, tôi xin dành những tình cảm thân thương nhất gửi tới gia đình
của tôi, những người đã luôn bên tôi, ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn !
Học viên
Lê Thị Hòa

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

BSA

Bovine Serum Albumin

Huyết thanh bào thai bê

CV

Coefficient Variation

Hệ số biến thiên

DT

Diphtheria toxoid

Giải độc tố Bạch Hầu


ELISA

Enzyme-linked Immunosorbent Phương pháp miễn dịch gắn
assay

Enzyme

EU

European Union

Liên hiệp Châu âu

GMP

Good Manufacturing Practice

Thực hành sản xuất tốt

GSK

Glaxo Smith Kline
International Conference on

Hiệp hội quốc tế về hài hòa

ICH
IEC
ISO
IU

Harmonization
International Electrotechnical
Commission
International Organization for
Standardization
Internationnal Unit

kỹ thuật về Dược phẩm
Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế
Đơn vị quốc tế

KKT

Kháng kháng thể

KN

Kháng nguyên

KT

Kháng thể

LAL

Limulusamoebocyte lysate

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

OD

Optic density
Pneumococcal Polysaccharide

Độ hấp thu của mẫu thử

PCV

vaccine

PD
PPV

Pneumococcal polysaccharide

Vắc xin phế cầu cộng hợp
Protein D
Vắc xin phế cầu
polysaccharide

PS

vaccine
Polysaccharide

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SOP

Standard Operating Procedure
Qui trình chuẩn

National Institute for Control of Viện kiểm định quốc gia vắc

NICVB

Vaccine and Biologicals

xin và sinh phẩm y tế


NTHi

Non-typeable H. influenzae

TB

Haemophilus influenza
không định týp
Giá trị trung bình

TMB

Tetramethylbenzidine

Cơ chất

TRS

Technical Report Series

Báo cáo kỹ thuật

TT

Tetanus toxoid

Giải độc tố uốn ván

TTB

Trang thiết bị

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

USP

United States of Pharmacopeia

Dược điển Mỹ

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN............................................................................4
1.1. Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn.........................................4
1.1.1. Phế cầu khuẩn.................................................................................................4
1.1.2. Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn................................................................7
1.2. Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™...............................................................7

1.2.1. Vắc xin phế cầu...............................................................................................7
1.2.2. Vắc xin Synflorix™........................................................................................10
1.3. Phương pháp phân tích miễn dịch sử dụng emzym đánh dấu (ELISA).............15
1.3.1. Nguyên lý chung............................................................................................15


1.3.2. Một số phương pháp ELISA..........................................................................15
1.4. Thẩm định quy trình............................................................................................18
1.4.1. Định nghĩa thẩm định quy trình....................................................................18
1.4.2. Phân loại thẩm định quy trình.......................................................................19
1.4.3. Các thông số trong thẩm định quy trình........................................................23
1.5. Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin
SynflorixTM bằng phương pháp ELISA...................................................................26
1.5.1.Quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin SynflorixTM
bằng phương pháp ELISA.......................................................................................26
1.5.2. Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu trong vắc xin
SynflorixTM bằng phương pháp ELISA...................................................................29

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............31
2.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................31
2.2. Vật liệu nghiên cứu..............................................................................................31
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................32
2.3.1. Thiết kế thử nghiệm.......................................................................................32
2.3.2. Cỡ mẫu..........................................................................................................33
2.3.3. Xây dựng quy trình thẩm định cho từng thông số và tiêu chuẩn chấp thuận
của từng thông số cần thẩm định.............................................................................33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ................................................................................36
3.1. Giới hạn phát hiện...............................................................................................36
3.2. Độ mạnh...............................................................................................................43

3.3. Độ đặc hiệu..........................................................................................................47

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN..............................................................................58


4.1. Giới hạn phát hiện...............................................................................................58
4.2. Độ mạnh...............................................................................................................59
4.3. Độ đặc hiệu..........................................................................................................59

KẾT LUẬN....................................................................................................61
KIẾN NGHỊ...................................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................63
66
PHỤ LỤC.......................................................................................................66
..............................................................................................................

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Thành phần týp kháng nguyên phế cầu của vắc xin
Synflorix™.....................................................................................................11
Bảng 1.2. Các thông số dùng trong thẩm định toàn phần.........................20
Bảng 1.3. Các thông số dùng trong thẩm định một phần..........................21


Bảng 1.4. Các thông số dùng trong tái thẩm định......................................21
Bảng 1.5. Các thông số dùng trong thẩm định...........................................26
Bảng 2.1. Mẫu chuẩn, hóa chất sử dụng cho thí nghiệm...........................31
Bảng 2.2. Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho thí nghiệm...................................32
Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 1 qua 6 lần thử nghiệm...........................................................................36
Bảng 3.2. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên

týp 4 qua 6 lần thử nghiệm...........................................................................37
Bảng 3.3. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 7F qua 6 lần thử nghiệm.........................................................................37
Bảng 3.4. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 14 qua 6 lần thử nghiệm.........................................................................38
Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 19F qua 6 lần thử nghiệm.......................................................................39
Bảng 3.6. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 5 qua 6 lần thử nghiệm...........................................................................39
Bảng 3.7. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 9V qua 6 lần thử nghiệm........................................................................40
Bảng 3.8. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 18C qua 6 lần thử nghiệm......................................................................40
Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 6B qua 6 lần thử nghiệm........................................................................41
Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện của thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên
týp 23F qua 6 lần thử nghiệm.......................................................................43


Bảng 3.11. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 kháng nguyên phế
cầu...................................................................................................................44
Bảng 3.12. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng 10 kháng nguyên do 2
người thực hiện..............................................................................................46
Bảng 3.13. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 1 của
3 mẫu thử........................................................................................................48
Bảng 3.14. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 4 của
3 mẫu thử........................................................................................................49
Bảng 3.15. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 7F
của 3 mẫu thử.................................................................................................49
Bảng 3.16. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 14 của

3 mẫu thử........................................................................................................50
Bảng 3.17. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 19F
của 3 mẫu thử.................................................................................................52
Bảng 3.18. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng týp 5 của 3 mẫu thử....52
Bảng 3.19. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 9V
của 3 mẫu thử.................................................................................................53
Bảng 3.20. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 18C
của 3 mẫu thử.................................................................................................54
Bảng 3.21. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 6B
của 3 mẫu thử.................................................................................................55
Bảng 3.22. Kết quả 6 lần thử nghiệm nhận dạng kháng nguyên týp 23F
của 3 mẫu thử.................................................................................................57
Bảng 4. 1. Giới hạn phát hiện của từng týp kháng nguyên phế cầu.........58


DANH MỤC HÌNH ẢNH


ĐẶT VẤN ĐỀ
Có thể tổng kết trong suốt hai thế kỷ vừa qua, với sự phát minh của Bác
sỹ người Anh E. Jenner ra chủng đậu bò dùng phòng ngừa dịch đậu mùa vào
cuối Thế kỷ 18. Từ nền tảng khoa học đó suốt giai đoạn 1857-1885 nhà bác
học thiên tài người Pháp L. Pasteur trở thành “Ông tổ” của ngành Vi sinh vật
và cũng là người đầu tiên chế tạo ra vắc xin phòng bệnh than, bệnh dại và
nhiều vắc xin khác tạo ra một trường phái riêng về sử dụng vắc xin phòng
bệnh truyền nhiễm tồn tại cho tới ngày nay [5]. Vì vậy, hiện nay Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) đã công nhận và khuyến cáo trên toàn cầu rằng tiêm phòng
vắc xin là phương thức bảo vệ hiệu quả nhất giúp nhân loại tránh được các
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho cộng đồng.
Khoa học công nghệ ngày càng phát triển trong các lĩnh vực vi sinh,

miễn dịch, sinh học phân tử, di truyền, hóa, lý, tin học và công nghệ nano,
peptid, gene và protein đã hỗ trợ đắc lực cho công cuộc nghiên cứu và sản
xuất ra nhiều loại vắc xin an toàn, hiệu quả và tiện lợi sử dụng hơn. Vắc xin
học cũng đã tiếp cận sang nhiều lĩnh vực mới như bệnh dị ứng, bệnh xã hội,
các bệnh nan y (ung thư, HIV/AIDS), bệnh ký sinh trùng (sốt rét) và đạt nhiều
thành quả đáng kể.
Vắc xin là chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật, được làm mất khả
năng gây bệnh hoặc từ vật liệu sinh học không phải vi sinh vật nhưng có khả
năng kích thích sự hình thành miễn dịch đặc hiệu để chống đỡ các mầm bệnh
tương ứng hoặc được dùng với mục đích khác, vắc xin dùng để bảo vệ cho
toàn thể cộng đồng người [6],[7]; Vì vậy việc kiểm soát chất lượng vắc xin
trước và trong quá trình sử dụng, bảo quản là đặc biệt quan trọng và phải tuân
thủ theo các yêu cầu khắt khe theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) cũng như tiêu chuẩn của Dược điển của các quốc gia, khu vực toàn

1


cầu. Theo qui định chung, tất cả các loạt vắc xin và sinh phẩm y tế trước khi
cấp phép xuất xưởng để sử dụng với mục đích phòng bệnh đều phải được
kiểm định nghiêm ngặt về chất lượng với các tiêu chí như: tính chất vật lý, an
toàn, nhận dạng đặc hiệu, công hiệu, vô trùng, chất gây sốt, và các đặc tính về
hoá lý [19].
Một trong các loại vắc xin công nghệ mới được sử dụng hiện nay là vắc
xin SynflorixTM phòng bệnh do phế cầu (Streptocuccus Pneumoniae) gây ra
như: Viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm màng não.. đã được nghiên cứu và sử
dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới và đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong. Vắc
xin Synflorix™ là một vắc xin Polysaccharide cộng hợp với Protein D của
Haemophilus influenzae không định týp (NTHi) và giải độc tố Bạch hầu và
Uốn ván, hấp phụ với nhôm phosphate, giúp bảo vệ trẻ nhỏ phòng được các

bệnh gây bởi 10 týp kháng nguyên phế cầu (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F,
23F) [26]. Khoảng 40% quốc gia và lãnh thổ áp dụng chương trình tiêm
chủng mở rộng vắc xin cộng hợp phế cầu (PCV) đang sử dụng vắc xin
Synflorix™. Tại Việt Nam, Synflorix™ là vắc xin được nhập khẩu từ nhà sản
xuất GSK. Để đảm bảo tính an toàn cho người sử dụng, việc đảm bảo chất
lượng vắc xin là rất quan trọng. Quy trình kiểm định chất lượng vắc xin gồm
rất nhiều chỉ tiêu, trong đó thử nghiệm nhận dạng là một trong những chỉ tiêu
quan trọng; Tuy nhiên thử nghiệm nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế cầu
trong vắc xin Synflorix™ chưa được thẩm định và chưa được xác nhận giá trị
sử dụng theo tiêu chuẩn của ISO 17025, theo tổ chức Y tế thế giới. Chính vì
vậy, với mục đích sử dụng quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên chứa
trong vắc xin Synflorix™ áp dụng tại phòng kiểm định của NICVB. Chúng
tôi tiến hành đề tài “Thẩm định quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên
phế cầu trong vắc xin Synflorix™”.

2


Với mục tiêu cụ thể như sau:
1.

Đánh giá độ mạnh của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế
cầu trong vắc xin Synflorix™.

2.

Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên
phế cầu trong vắc xin Synflorix™.

3.

Giới hạn phát hiện của quy trình nhận dạng 10 týp kháng nguyên phế
cầu trong vắc xin Synflorix™.

3


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Phế cầu khuẩn và một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn
1.1.1. Phế cầu khuẩn
Hình thái:
Phế cầu-Streptococcus pneumoniae là thành viên phổ biến của hệ vi
khuẩn chí vùng hầu họng, nhưng cũng là một tác nhân chủ yếu của viêm phổi
và viêm màng não ở trẻ em và người lớn [40].
S. pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae hoặc
pneumococcus (phế cầu khuẩn) là một tác nhân gây bệnh ở người được phân
lập đầu tiên ở Pháp bởi LouisPasteur năm 1880 từ mủ apxe. Năm 1883,
Talamon (Pháp) phát hiện được phế cầu khuẩn trong đờm, trong máu và trong
khối viêm phổi gan hóa của bệnh nhân và mô tả nó. Vai trò của phế cầu gây
viêm màng não cấp đã được Netter phát hiện vào năm 1909 khi quan sát thấy
hội chứng nhiễm trùng thần kinh trung ương ở một số người bệnh có triệu
chứng viêm phổi nặng [40].
Các chủng phế cầu khác nhau có thể được phân biệt nhờ vào cấu trúc
kháng nguyên của lớp vỏ polysaccharide bao bọc bên ngoài tế bào. Lớp vỏ
polysaccharide tạo nên 1 trong những đặc tính của vi khuẩn khi phát triển trên
môi trường nuôi cấy nhân tạo
+ Pneumococcus dạng S (smooth) có bề mặt khuẩn lạc nhẵn, tròn, kích
thước 1mm, mặt bóng hơi lõm được tạo nên bởi những vi khuẩn có vỏ và có
khả năng gây bệnh.

+ Pneumococcus dạng R (rough) là những phế cầu bị mất vỏ
polysaccharide (có thể do điều kiện nuôi cấy không đủ chất dinh dưỡng cho vi

4


khuẩn hoặc nuôi cấy trong một thời gian dài), tạo nên những khuẩn lạc có bề
mặt sần, bờ không đều, mặt gồ ghề, khô...những phế cầu này ít có khả năng
gây bệnh [40].
Dạng S có thể biến thành dạng R, mất vỏ và mất khả năng gây bệnh.
Ngược lại dạng R có thể biến thành dạng S khi cho vào môi trường nuôi cấy chất
ADN của dạng S.
Trên môi trường thạch máu 5% (cừu, thỏ), khuẩn lạc tròn bóng ướt do
vi khuẩn [40].
Phế cầu - Streptococcus pneumoniae là những cầu khuẩn dạng ngọn
nến, thường xếp đôi, đường kính khoảng 0,5 – 1,25 μm; là vi khuẩn Gram
dương, không di động, không sinh nha bào; trong bệnh phẩm hay môi trường
chứa nhiều albumin thì có vỏ [1],[9].

Hình 1. 1. Hình thái của phế cầu Streptococcus pneumonia sau khi nhuộm Gram dưới
kính hiển vi

Tính chất nuôi cấy:
Vi khuẩn phế cầu phát triển thích hợp ở 370C trong điều kiện hiếu khí
và kỵ khí tùy tiện; phát triển dễ dàng trong các môi trường chứa nhiều chất
5


dinh dưỡng. Trên thạch máu, khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, trơn trong như giọt
sương, xung quanh có vòng tan máu alpha. Trên môi trường nghèo dinh

dưỡng, phế cầu kém phát triển, khuẩn lạc thô, nhỏ, xù xì, những khuẩn lạc có
vỏ thường lớn, hơi nhày và có màu xám nhẹ. Có thể có khuẩn lạc trung gian
M [1],[9].
Tính chất hóa sinh:
Phế cầu bị ly giải bởi muối mật, hoặc mật; không có catalase; không
phát triển trong môi trường có ethylhydrocuperin [1],[9].
Bốn tính chất quan trọng để xác định phế cầu là:
-

Catalase ( -)

-

Optochin (+)

-

Bị ly giải trong muối mật

-

Tan máu α
Phế cầu được lây nhiễm qua tiếp xúc trực tiếp với các chất tiết hô hấp

của người bệnh. Vỏ của Streptococcus pneumonia là nhân tố gây bệnh chủ
yếu, vỏ phế cầu bao gồm các polysaccharide, chúng tạo thành các gel và nước
trên tế bào vi khuẩn. Vỏ phế cầu có tác dụng bão hòa opsonin hóa, làm vô
hiệu hóa tác dụng của IgG và bổ thể. Do vậy khả năng thực bào vi khuẩn bị
giảm xuống và phế cầu vẫn tồn tại để gây bệnh [1],[9].
Tính chất kháng nguyên:

Vỏ Polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc
lực duy nhất được biết. Hiện có trên 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn
(pneumococci) đã được nhận biết. Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất. Vỏ
của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh
sinh. Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong
tổ chức vật chủ và sinh bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có
tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay
ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân.

6


Phức hợp Polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, 2acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và
cholinphosphate [43].
1.1.2. Một số bệnh gây bởi phế cầu khuẩn
Phế cầu gây ra các bệnh lý xâm lấn nghiêm trọng như viêm màng
não, nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm xoang và những bệnh không xâm
lấn thông thường như viêm tai giữa... [23].

Hình 1.2. Hình ảnh một số bệnh gây bởi phế cầu Streptococcus pneumonia

1.2. Vắc xin phế cầu và vắc xin Synflorix™
1.2.1. Vắc xin phế cầu
Theo tổ chức Y tế Thế giới, ước lượng hàng năm có khoảng 476.000
trường hợp tử vong do bệnh phế cầu ở trẻ em dưới 5 tuổi [38].
Nhiễm phế cầu là nguyên nhân chính gây tử vong và gánh nặng bệnh tật ở trẻ
em trên toàn thế giới đặc biệt là các nước đang phát triển [14]. Ở Việt Nam tỷ

7

lệ mắc phải bệnh phế cầu xâm lấn được ước tính ít nhất là: 48,7 ca/100.000
trẻ em dưới 5 tuổi theo nghiên cứu trước đây được tiến hành tại tỉnh Khánh
Hòa năm 2005-2006 [13]. Các týp kháng nguyên phế cầu phổ biến nhất được
phát hiện ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà nội giữa những năm 1997-1999 là: các týp
23F, 19F,6B và 14 [15]. Theo một nghiên cứu hồi cứu vào năm 2008-2009 sự
phân bố các týp kháng nguyên tương tự được quan sát ở những người Việt
Nam mắc bệnh ở tất cả các lứa tuổi cho thấy các týp kháng nguyên phế cầu
chủ yếu là các týp: 19F, 23F, 14,11 và 6B [22].
Do phế cầu thường lây theo đường hô hấp nên việc phòng bệnh không
đặc hiệu rất khó khăn [18].
Phòng bệnh đặc hiệu đã được sử dụng ở một số nước bằng vắc xin
polysaccharide của vỏ phế cầu. Trên thế giới, có rất nhiều sản phẩm thương
mại vắc xin phòng bệnh gây ra bởi phế cầu: Synflorix™ (GSK), Pneumo 23
(Sanofi Pasteur), Prevenar (Phzer) [18].
Có 2 loại vắc xin phế cầu: vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu và vắc xin
phế cầu cộng hợp [18].
Vắc xin vỏ polysaccharide phế cầu (PPV – Pneumococcal polysaccharide
vaccine) được cấp phép sử dụng từ năm 1977. Những vắc xin này gây ra được
miễn dịch nhớ, nhưng với trẻ em dưới 2 tuổi lại không tạo đáp ứng miễn dịch
[30]. Vắc xin Pneumo 23 do hãng Sanofi Pasteur sản xuất là vắc xin
polysaccharide vỏ phế cầu, chứa 23 týp kháng nguyên: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8,
9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17, 18C, 19A, 19, 20, 22F, 23F, 33F. Vắc xin
này được sử dụng cho người trên 2 tuổi có nguy cơ cao nhiễm phế cầu: người
già trên 65 tuổi, người bị HIV, người giảm đáp ứng miễn dịch, người nghiện
rượu, nghiện thuốc lá...[18], đang được lưu hành trên thị trường Việt Nam.

8

Hình 1. 3. Hình ảnh của vắc xin vỏ phế cầu Pneumo 23

Vắc xin phế cầu cộng hợp (PCV – Pneumococcal conjugate vaccine)
gồm các polysaccharide của vỏ vi khuẩn Streptococcus pnemoniae được cộng
hợp với protein mang. Bằng việc sử dụng công nghệ cộng hợp, kháng nguyên
polysaccharide làm cho tế bào T đáp ứng miễn dịch, khả dụng đối với trẻ nhỏ.
Khác với vắc xin polysaccharide vỏ phế cầu, PCV bảo vệ được trẻ dưới 2
tuổi. PCV phòng được các bệnh phế cầu nặng như: Viêm màng não, viêm
phổi, nhiễm trùng huyết, viêm tai giữa... PCV không bảo vệ được trong
trường hợp bệnh gây bởi loại kháng nguyên khác, hoặc các týp kháng nguyên
không có trong vắc xin PCV. Vắc xin cộng hợp đầu tiên Prevnar 7 gồm 7 týp
kháng nguyên (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F và 23F) được cộng hợp với protein
CRM197 đã được cho phép sử dụng tại EU (2001) cho trẻ từ 2 tháng tuổi. Hai
loại vắc xin thế hệ sau được sử dụng từ năm 2009 là Synflorix™ gồm 10 týp
kháng nguyên (1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) và Prevnar 13 gồm 13
týp kháng nguyên (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, and 23F)
[17],[18].

9


1.2.2. Vắc xin Synflorix™
1.2.2.1. Đặc điểm vắc xin Synflorix™
Vắc xin Synflorix là vắc xin phế cầu cộng hợp, hấp phụ, gồm các vỏ
polysaccharide (PS) của 10 týp kháng nguyên phế cầu S. pneumoniae: 1, 4 , 5,
6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F và 23F, được cộng hợp với một protein mang
(carrier protein – CP): protein D – protein bề mặt tế bào của vi khuẩn không
điển hình Haemophilus influenzae (PD), giải độc tố uốn ván (tetanus toxoid TT), giải độc tố bạch hầu (diphtheria toxoid – DT).

Hình 1. 4. Hình ảnh của vắc xin phế cầu cộng hợp Synflorix™

Vắc xin Synflorix™ là vắc xin dạng lỏng, không chứa chất bảo quản,
được hồi chỉnh bằng nhôm phosphate, được trình bày dưới dạng liều đơn (0,5
ml, chứa trong sylanh. Vắc xin này được tiêm bằng đường tiêm bắp, đang lưu
hành trên thị trường Việt Nam..
Dưới đây là bảng thành phần các týp kháng nguyên phế cầu cho 1 liều
đơn dành cho người (0,5 ml) của vắc xin Synflorix ™, vắc xin này được pha
theo tỉ lệ hàm lượng polysaccharide và hàm lượng protein mang, do các týp
kháng nguyên là khác nhau nên tỉ lệ trên cũng khác nhau.

10


Bảng 1. 1. Thành phần týp kháng nguyên phế cầu của vắc xin Synflorix™

Týp kháng nguyên phế cầu cộng hợp

Hàm lượng của

với protein mang

từng týp (μg/ml)

1

Týp 1 cộng hợp với PD

1,0

2

Týp 4 cộng hợp với PD

3,0

3

Týp 5 cộng hợp với PD

1,0

4

Týp 6B cộng hợp với PD

1,0

5

Týp 7F cộng hợp với PD

1,0

6

Týp 9V cộng hợp với PD

1,0

7

Týp 14 cộng hợp với PD

1,0

8

Týp 18C cộng hợp với TT

3,0

9

Týp 19F cộng hợp với DT

3,0

10

Týp 23F cộng hợp với PD

1,0

STT

11


1.2.2.2. Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin phế cầu Synflorix™
Chủng làm việc tương ứng với từng týp huyết thanh

Hoạt hóa, nuôi cấy

Gặt vi khuẩn

Tách, thu polysaccharide

Tinh chế polysaccharide

Cộng hợp với protein mang

Thêm nhôm phosphate

Phối trộn với các týp khác
AlPO4→ ← NaCl
Bán thành phẩm cuối cùng

Đóng lọ
(vắc xin thành phẩm)

Hình 1. 5. Sơ đồ tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin Synflorix™

12


1.2.2.3. Kiểm định chất lượng vắc xin phế cầu Synflorix™
Yêu cầu chung:
Trong sản xuất vắc xin Synflorix™ việc kiểm tra đánh giá, chất lượng
là rất quan trọng. Thứ nhất, sản phẩm phải đủ an toàn để dùng cho người. Thứ
hai, vắc xin synflorix™ là sản phẩm có nguồn gốc từ vỏ polysaccharide của

phế cầu khuẩn thông qua quá trình hoạt hóa, nuôi cấy, gặt, tách, thu, tinh chế
polysaccharide, cộng hợp với protein mang và phối trộn các týp với nhau sau
đó thêm các tá dược và sản xuất thành vắc xin thành phẩm, sau khi sản xuất
xong điều quan trọng mà ta cần quan tâm đến đầu tiên đó chính là xem trong
vắc xin có chứa 10 týp kháng nguyên của phế cầu khuẩn hay không. Do đó,
việc kiểm tra nhận dạng kháng nguyên trong vắc xin synflorix™ phải được
thực hiện trong từng loạt sản xuất và ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu
đến bán thành phẩm và thành phẩm cuối cùng).
Việc đảm bảo chất lượng sản phẩm là một công việc phức tạp bắt đầu
từ công việc kiểm định nguồn nguyên liệu đầu, giám sát qui trình sản xuất và
tuân theo thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice, GMP) một
cách nghiêm ngặt để xuất xưởng sản phẩm có chất lượng tốt. Việc kiểm tra
đánh giá chất lượng vắc xin và sinh phẩm đòi hỏi tính khách quan và chính
xác, tuân thủ chặt chẽ các qui trình, các phương pháp, kỹ thuật của WHO và
Kiểm định quốc gia qui định nhằm đảm bảo độ chính xác cao [28].
Chất lượng của vắc xin synflorix™ được đánh giá bao gồm các chỉ số về
vô khuẩn, an toàn, công hiệu, nhận dạng và các tính chất lý, hóa học. Các chỉ số
này cần được thực hiện theo thường qui thống nhất chung [26],[28].
Tiêu chuẩn đăng ký và tiêu chuẩn xuất xưởng của vắc xin synflorix™:
Trong phòng thí nghiệm, kiểm định chất lượng vắc xin này dựa trên các
tiêu chí chính sau đây [2],[11],[26],[28]:
+ Nhận dạng:
Sử dụng phương pháp ELISA.

13


Tiêu chuẩn: dương tính với các huyết thanh đặc hiệu tương ứng.
+ Vô khuẩn:
Cấy trực tiếp vắc xin vào môi trường nuôi cấy phù hợp với sự phát triển

của vi khuẩn và nấm. Ủ môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 300C đến 350C đối với
vi khuẩn, 200C đến 250C đối với vi nấm.
Tiêu chuẩn: Không có vi khuẩn và nấm mọc sau 14 ngày theo dõi.
+ Hàm lượng polysaccharide:
Hàm lượng của từng týp: sử dụng phương pháp hóa miễn dịch (rate
nephelometry).
Tiêu chuẩn: Hàm lượng týp 1, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 23F: 1,4 - 2,6 µg/ml
Hàm lượng týp 4, 18C, 19F: 4,2 – 7,8 µg/ml
+ Nội độc tố:
Sử dụng phương pháp LAL (Limulusamoebocyte lysate) test.
Tiêu chuẩn: ≤ 12,5 IU/liều.
+ Hàm lượng nhôm:
Sử dụng phương pháp so màu.
Tiêu chuẩn: Hàm lượng nhôm 0,4-0,6 mg/liều
+ An toàn không đặc hiệu:
Tiêm ổ bụng 0,5 ml vắc xin vào từng 5 chuột nhắt trọng lượng 18-22 g,
5 ml vào từng 2 chuột lang trọng lượng 280 – 350 g.
Tiêu chuẩn: Sau 7 ngày theo dõi, chuột khỏe manh, tăng cân và không
có chuột chết.
+ pH: Giá trị pH nằm trong khoảng 5,6 – 6,6.
+ Cảm quan:
Quan sát bằng mắt thường vắc xin không có dấu hiệu bất thường: lỏng
nút, nắp, hàn không đạt yêu cầu, nứt, vỡ, không có vật thể lạ...

14