báo cáo thực hánh hóa sinh thực phẩm

BÀI BÁO CÁO HÓA SINH THỰC PHẨM

BÀI 1: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE
I.

Nguyên tắc
Invertase là một enzyme thủy phân sacharose thanh glucose va fructose. Dựa
vào tính chất Iod trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định
lượng glucose sinh ra bằng các h định phân Iod dư với dung dịch Na 2S2O3.

II.

Cách tiến hành
1. Sơ đồ quy trình

Men bánh mì 1(g)
Định mức 100ml
Nước cất 50ml
Lọc
Đun cách thủy (2’)
Hút ra 5ml ở mỗi ống nghiệm
ống 1
ống 2
ống 3
Dung dịch
Để yên trong tối 10-20’
Mất màu
dd sacharose
10%

Nước cất

Iod 10ml
NaOH 15ml
Định phân
dd emzyme
dd Na2SO3
Đun sôi
1


2


2. Giải thích quy trình

Cân 1g men bánh mì, hòa tan vào 5ml nước cất, cho vào bình định mức
100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng, lọc ta thu được dịch
enzyme.
Chuẩn bị 3 ống nghiệm cho lần lượt các chất theo bảng sau.

Số ống

1

2

3

Dung dịch sacharose 10%(ml)

0

10

10

Nước cất(ml)

10

0

0

Dịch enzyme (ml)

10

10

0

Dịch enzyme đã đun sôi(ml)

0

0

10

Để 3 ống nghiệm ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 30 phút sau đó đem đi

đun cách thủy trong 2 phút và làm lạnh dưới vòi nước.
ở từng ống nghiệm, hút ra 5ml hỗn hợp dung dịch cho vào một bình tam giác
250ml để xác định hàm lượng glucose.
Xác định hàm lượng glucose: cho thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung
dịch Iod 0,1N và 15ml NaOH 0,1N. Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao
cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2 phút.Để yên trong bóng tối 10-20 phút.Lấy
ra thêm vào 2ml H2SO4 1N định phân lượng iod thừa bằng Na 2S2O3 với hồ tinh
bột 1% làm chất chỉ thị.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần.

3


Kết quả thí nghiệm.

III.

Lần TN

Lần 1

Lần 2

Lần 3

V1

4.3

4.8

4.8

V2

4.15

4.7

4.75

V3

4.2

4.6

4.6

4,22

4,7

4,72

Thể tích

Tổng thể tích

Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol sacharose thủy phân bởi

lượng enzyme có trong 1g men trong một phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Được tính bằng công thức:

IV.

Nhận xét.

Qua quá trình thực hành khảo sát hoạt tính invertase cho ta thấy ở ống nghiệm số
3 ống nghiệm có chứa dịch enzyme đã đun sôi thì bị bức hoạt không thủy phân
sacharose thành glucose va fructose.
Xác định hoạt tính enzyme phụ thuoc5 vào 3 yếu tố:
Nồng độ cơ chất
Thời gian
Nồng độ enzyme

4


BÀI 2: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘNG VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH ENZYME UREASE
I.

Nguyên tắc

Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu theo phản ứng:
NH2 – C = O + H2O

NH3 + CO2

NH2

Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene tetramine và
giải phóng acid carbonic.
2(NH4)2CO3 + 6HCHO

(CH2)6N4 +2H2CO3+6H2O

Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành sẽ tính được lượng urea
bị thủy phân.
II.

Cách tiến hành
Đậu nành 10g
Định mức 250ml

Lọc

Khảo sát động học

Xác định hoạt tính

ống nghiệm 6 cái thành 2 dãy

ống nghiệm 3 cái

Tủ ấm 30oC

Bể ổn nhiệt 40oC

Dung dich
5

Định phân

Dung dich

Định phân

Hồng nhạt
Bể ổn nhiệt 40oC

Dung dich

Định phân

Hồng nhạt
Nước cất 150ml
dd urease

1. Sơ đồ tiến hành

6


Sau 20phút lấy ra
Lắc đều 2 phút

7

2. Giải thích quy trình
2.1 Điều chế dung dịch urease

Cân 10g đậu nành đã được xay thành khối bột vào 150ml, cho vào bình
định mức 250ml, định mức tới vạch bằng nước cất. Lọc và thu dịch lọc.
2.2

Khảo sát động học

Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống nghiệm.ở từng dãy cho lần
lượt các dung dịch theo bảng sau:
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

Ure M/3(ml)

0

1

2

3

4

5

Nước cất(ml)

5

4

3

2

1

0

Dd urease(ml)

5

5

5

5

5

5

Đặt dãy thứ nhất vào bể ổn nhiệt 40 oC, dãy thứ 2 vào tủ ấm 30 oC trong
thời gian 20 phút.Sau khi kết thúc thời gian thủy phân thì thêm vào mỗi ống
nghiệm 5ml fromol trung tính, lắc đều trong 2 phút. Chuyển từng ống
nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một vài nước cất. Thêm vài
giọt phenolphthalein 1%, định phân với NaOH 0,05N.
Lặp lại thí nghiệm 2 lần.
2.3 Xác định hoạt tính

Thực hiện các ống nghiệm sau
Ống nghiệm

1

2

3

Ure 2% (ml)

0

5

5

Nước cất (ml)

5

0

0

Dd urease (ml)

5

5

0

Dd urease đã đun sôi (ml)

0

0

5

Mang tất cả các ống nghiệm đặt ở 40oC.Sau 20 phút cho vào mỗi ống
nghiệm 5ml formol trung tính, lắc đều trong 2 phút. Đổ lần lượt mỗi ống
ra một erlen 100ml. Định phân bằng NaOH0,05N với phenolphthalein 1%
làm chất chỉ thị. Cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt.

Lặp lại thí nghiệm 2 lần.

8


III.

Kết quả thí nghiệm.
1. Khảo sát hoạt động

Kết quả thí nghiệm

•

Ống
nghiệm

1

2

3

4

5

6

V1

1,2 (ml)

1,5 (ml)

1,6 (ml)

1,75 (ml)

1,8 (ml)

1,9(ml)

V2

1,1(ml)

3,2 (ml) 2 (ml)
(loại)

2,3 (ml)

2,4 (ml)

2,8 (ml)

1,5 ml

2 ml

2,1 ml

2,35ml

Tổng thể 1,15 ml
tích
•

1,8 ml

Tính toán kết quả
Ta có phương trình phản ứng:
H2CO3+ 2NaOH ---> Na2CO3 + H2O
1ml
1,15ml

2ml
?

 nNaOH = 1/3 . VNaOH .10-3= 1/3 .1,15. 10-3 = 0,383. 10-3

nH2CO3

tỉ lệ 1:2

 nH2CO3= 2 . nNaOH = 2 . 0,383. 10-3 = 0,00076 (mol)

Số mol ban đầu được tính bằng công thức:
 CM ure = 1/3 M
 nure= 1/3 . Vure .10-3 = 1/3 .0.10-3 = 0 (mol)

Cách tính tương tự ta được bảng sau:
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

1,15 (ml)

1.5 (ml)

1.8(ml)

2 (ml)

2.1(ml)

2.35(ml)

Y= số mol ure bị
thủy phân (mol)

0,0076

0,001

0,0012

0,0013

0,0014

0,00157

Vận tốc phản
ứng = Y/20

0,0038

0,00005

0,00006

0,000065 0,00007

0,000078

S = số mol ure
ban đầu

0

0,003

0,0067

NaOH dùng
chuẩn độ ml

0,001

0,0013

0,00167

9


Đồ thị biểu diễn vận tốc phản ứng thủy phân 1/v

Phương trình y=0,0141x với R2 =0,243
Y1, v = 0,0038 => x = 0,0038/0,0141 =0,27
Y2,v = 0,00005thay vào phương trình ta được
0,00005 = 0,0141 x => x=0,0035
Theo công thức phương trình động học của Micheaelis –Menten

2. Xác định hoạt tính
•

Lần TN

Kết quả thí nghiệm
Lần 1

Lần 2

V1

1,1

1,25

V2

1,6

2,15

V3

1,2

1,1

Tổng thể tích

1,3

1,5

Thể tích

Hoạt tính urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng
enzyme urease có trong 1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.

10


Bài 3
PHẦN I: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA LIPASE
1. Nguyên tắc

Dưới tác dụng của Lipase,lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo,lượng acid
béo được chuẩn độ bằng kiềm.Lượng kiềm cẩn để trung hòa lượng acid sinh ra là
hoạt độ enzyme cần tìm
Đậu nành (10g)
Đệm acetate
erlen 10ml
Nghiền
Lắc đều
Tủ ấm (20-24)
Dung dịch
Hồng nhạt
Giọt toluene
Cồn 96o
Ether 15ml
Chuẩn độ
NaOH 0,05N
2. Cách tiến hành
 Giải thích quy trình

Nghiền nhỏ
a) Cân 5g đậu nành

+5ml nước cất
dạng đồng thể
Lắc đều(300C)

+1ml dầu đậu nành
erlen

hỗn hợp

tủ ấm(20-24h)

5ml acetate
+vài giọt toluen

b)

Bình kiểm chứng làm như (a) nhưng dịch enzyme đã đun sôi 3-5p( mất hoạt
tính enzyme)
11


Bước 2. Sau khi lấy hỗn hợp từ tủ ấm ra thì ta cho 25ml cồn 96 0 + 15ml ether rồi
lắc đều và để yên trong hai phút
Bước 3. Đem chuẩn độ bằng NaOH 0,05N dung dịch trteen + phenolphthalein
1% đến khi dung dịch chuyển sang hồng nhạt
3. Kết quả thí nghiệm:

Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0.1N dùng để chuản độ
lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 5g hạt thủy phân
a. Bảng kết quả

V NaOH (ml) chuẩn độ
mẫu

Mẫu 1

Mẫu 2

Mẫu 3

VTB

37

36

38

37

V NaOH (ml) chuẩn độ
mẫu kiểm chứng

b.

32.5

Tính toán kết quả

Trong đó:
a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm
b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng
k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
m: khối lượng hạt sử dụng
4. Kết luận:

Vậy hoạt độ của enzyme lipase thủy phân lipid trong 5g hạt đạu nành để giải phóng
acid béo là bằng 9

5. Hiện tượng và giải thích

a. Hiện tượng:
12


o

Bổ sung dung dịch đệm acetate và vài giọt toluene

o

Khi đem mẫu dung dịch trên thêm vài giọt chỉ thị phenolphatalein (không
có màu) chuẩn độ bằng NaOH 0.1N thì xuất hiện màu hồng

b. Gỉai thích
o

Vì khi thủy phân thì giá trị pH môi trường thay đổi không ổn định, hoạt
tính Enzyme bị giảm nên cần bổ sung dung dịch đệm để ổn định giá trị pH
của môi trường

o

Bổ sung vài giọt Toluen để làm dung môi hòa tan cơ chất dầu đậu nành

o

Vì lượng NaOH chuẩn độ cho vào ban đầu sẽ làm trung hòa muôi trường
acid trong dung dịch, khi tiếp tục chuẩn độ lượng NaOH dư ra sẽ làm chỉ
thị phenolphthalein chuyển sang màu hồng.

PHẦN II: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM AMYLASE
THEO WOHLGEMUTH
I.

Nguyên tắc
Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thề, để thủy phân tinh
bột đến erytrodextrin.
Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau
30 phút ở 37˚C có Cl làm chất hoạt hóa.

II.

Cách tiến hành
1. Chuẩn bị chiết dịch amylase.

Malt(10g)

Nước cất
Định mức 100ml
Nghiền
Lắc đều
Ngâm 15 phút
Lọc
Dung dịch
 Sơ đồ tiến hành:
 Giải thích tiến hành:
13


-Cân 10g Matl (hạt đại mạch) đem đi nghiền sau đấy chuyền vào bình
định mức 100ml và định mức cho tới vạch, lắc đều thật kỉ.
Ngâm dung dịch định mức 15 phút và lắc đều bình định mức sau đó
lọc qua giấy lọc mịn khi đó ta thu được dung dịch trong suốt chứa
Enzyme amylase.

NaCl 0,5% (1ml)
Enzym amylase(1ml)
H SO 10%(1ml )
2

4

Iod/KI (2giọt)
Lắc đều
Ống nghiệm
Tủ điều nhiệt 37˚(30phút)
Dung dịch

Lắc đều
Dung dịch
2. Tiến hành khảo sát hoạt tính amylase.
 Sơ đồ tiến hành:

Nước cất (3ml)
Iod/KI (2giọt)
ống nghiệm
Lắc đều
Dung dịch
•

Sơ đồ 2:

 Giải thích tiến hành :

-Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự. Hút vào mỗi ống nghiệm 1ml
dung dịch NaCl 0,5% trong ống nghiệm 1cho vào 1 ml dung dịch
enzym amylase và lắc đều sau đó lấy 1ml dung dịch từ ống nghiệm
1 cho vào ống nghiệm thứ 2 và lắc đều sau đấy lặp lại đến ống
nghiệm thứ 10 thì hút 1ml ra và bỏ đi. Tiếp theo trong mổi ống
nghiệm ta cho vào 1ml dung dịch hồ tinh bột 0,5 % lắc đều.
14


-Để vảo tự đều nhiệt ở 37ºC sau 30 phút lấy ra và thêm vào mỗi ống
nghiệm 1ml dung dịch H2S04 10% và 2 giọt Iod/KI ,lắc đều. Nhằm
mục đích thay đổi nồng độ enzym.
-Lấy 1ống nghiệm khác cho vào 3ml nước cất và 2 giọt Iod lắc đều
ta thu được dung dịch nàu vàng nhạt và sau đó so sánh với 10 ống

nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzym amylase thấp nhất
thủy phân hoàn toàn tinh bột.
III.

Kết quả thí nghiệm và tính toán kết quả
1. Bảng kết quả màu

ống
nghiệm
Độ pha
loãng
(F)
Nồng
độ
enzyme
Màu

1

2

n/2

Vàng

2

4

3

8

n/4

n/8

Vàng Vàng
+

++

4

5

6

7

8

9

10

16

32

64

128

256

512

1024

n/16

n/32

n/64

n/128

n/256

n/512

n/1024

Nâu

Nâu

Nâu

Nâu

Nâu

Nâu

Nâu

Nâu nhạt đến đậm dần

2.Nhận xét:
Ống nghiệm 1 là ống nghiệm có màu gần giống nhất so với ống số 11 (màu vàng)

Hình 2: Kết quả màu của 10 ống nghiệm (tính từ trái sang phải)

15


Hình 3: Chọn ống nghiệm (ống số 01) có màu gần giống với ống số 11
3. Hiện tượng và giải thích
a. Hiện tượng:
- Để 10 ống nghiêm ở bể ổn nhiệt ở 650C
- Các ống nghiệm có màu khác nhau từ vàng nhạt đến nâu đậm dần
3.2.2 Gỉai thích
- Để 10 ống nghiệm ở 650C nhằm tăng khả hoạt động của enzyme
- Các ống nghiệm có màu vàng đến nâu đậm dần vì nồng độ enzyme bị giảm dần
khi pha loãng. Enzyme càng nhiều thì thủy phân tinh bột càng mạnh (làm ống nghiệm
có màu vàng) và ngược lại.

4.Tính toán kết quả:

Lượng enzyme được cho vào ống nghiệm (1):

Một đơn vị Wohlgemuth:

Số đơn vị Wohlgemuuth có trong 1ml dịch chiết enzyme (

):

Trong đó:
V1: Thể tích dịch enzyme cho vào ống nghiêm (1)
V2: Thể tích dịch enzyme amylase định mức (100ml)
V: Thể tích dung dịch Tẻmamyl (ml)
16


F: Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh
bột (ống nhiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

17


BÀI 4. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH BROMELIN
1. Nguyên tắc:
Cho enzyme Bromelin thủy phân,các cơ chất protein như hemoglobin hay casein.Để
xác định lượng tyrosin trong các peptid được giải phóng ra thì ta cho tác dụng với thuốc
thử Folin
2. Tiến hành:
 Sơ đồ quy trình

Thơm

Gọt vỏ

Xay

Xác định hoạt tính

ống nghiệm 9 cái

Dung dich

Lắc đều, để yên 10 ở 25oC

Lọc trong

dd urease

3 ống nghiệm khác

Để yên 15’

NaOH 0,5N
18


Đem do OD

Folin
1ml
Lọc

 Giải thích quy trình
 Chiết enzyme

Quả thơm đem đi gọt vỏ sao đó dem đi xay nát rồi đem đi lọc ta thu được dịch
chiết enzyme.
 Khảo sát hoạt tính.

Chuẩn bị 9 ống nghiệm và lần lượt cho các chất theo thứ tự.
Sao đó lắc đều mỗi ống rồi để yên 10’ ở nhiệt dộ 25o C , đem lọc.

19


Lấy 3 ống nghiệm khác cho vào mỗi ống nghiệm 5ml NaOH 0,5N và hút thêm
vào mỗi ống 2,5 ml dung dịch mẫu sau khi lọc, và cuối cùng cho thuốc thử
Folin vào mỗi ống nghiệm lắc kỹ. để yên 15’ đem di đo mật độ quang điện.
3. Kết quả thí nghiệm:
Kết quả đo OD ở bước sóng 650nm
Mẫu

Mẫu lần 1

Mẫu lần 2

TB

OD mẫu

0.098A

0.080A

0.089A

OD tyrosin

0.173A

0.176A

0.175A

4. Hiện tượng và giải thích :
a. Hiện tượng:
Sau khi cho Folin vào ống nghiệm để yên 15 phút ta thấy trong ống nghiệm có màu
xanh dương suất hiện.
b. Giải thích:

Trong ống nghiệm có màu xanh là vì enzyme bromelin thủy phân casein tạo ra
tyrosin và tyrosin tác dụng với thuốc thử Folin tạo ra màu xanh.

5. Tính kết quả:
Hoạt tính của enzyme bromelin:

 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME.
Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ
hoạt động của enzyme. Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải
xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng thông qua khả năng làm giảm
cơ chất sau 1 thời gian phản ứng.
Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng 1 trong 3 nhóm phương pháp sau để

xác định khả năng xúc tác của enzyme:
1/Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau
một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước. Phương pháp này được áp
dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác.
20


2/Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi
nhấy định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất
định.
3/Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một khoảng thời gian nhất
định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Có thể tóm tắt các nhóm phương pháp trong bảng sau:

Nhóm
phương pháp
1

2

Các thông số cố định
-Thời gian

Các thông số thay đổi

-Nồng độ enzyme

Biến đổi của cơ chất và
của sản phẩm

-Lượng cơ chất mất đi hay lượng sản
phẩm tạo thành

Thời gian

-Nồng độ enzyme
3

Thời gian lượgn cơ chất mất đi hay
lượgn sản phẩm tạo thành

Nồng độ enzym

21