CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM VI SINH VẬT

PGS. TS. Cao Minh Nga
BM Vi sinh - Khoa Y - ÑH Y Döôïc TP. HCM


I

Mở đầu

II

Phương pháp Vi sinh học

III

Phương pháp Miễn dòch học

IV

Phương pháp Sinh học phân tử

V

Kết luận


I. Môû ñaàu
 Vi sinh vật (VSV): - gây nhiều bệnh nhiễm nguy hiểm.
- có thể gây dịch, đại dịch.
 Các bệnh nhiễm VSV:
- thường có triệu chứng lâm sàng điển hình
VD: bệnh tả, sốt xuất huyết, …

- một số khác: không có triệu chứng điển hình
VD: viêm gan virus A, B, C, D, E và G, …
 Xét nghiệm chẩn đoán () đóng vai trò quan trọng:
  (+) từng bệnh lý cụ thể
là tiêu chuẩn vàng:  nhiều bệnh nhiễm VSV


I. Môû ñaàu (tt)
 Các phương pháp (pp)  bệnh nhiễm VSV chính:
- pp vi sinh học: soi, nhuộm, cấy.
- pp miễn dịch học: phản ứng kháng nguyên – kháng thể
- pp sinh học phân tử: phát hiện gen đặc hiệu
 Các pp   (sinh hóa, huyết học, giải phẫu bệnh, … )
 Cần chọn lựa pp thích hợp tùy loại bệnh lý, giai đoạn bệnh
 , theo dõi diễn tiến bệnh nhiễm VSV.


II. Phöông phaùp Vi sinh hoïc
 Quan sát trực tiếp:
1. Soi tươi
2. Nhuộm

 Nuôi cấy vi vi khuẩn (VK):
1. Nuôi cấy - Phân lập VK
2. Kháng sinh đồ
 Nuôi cấy virus
1. Định danh
2. Định typ huyết thanh, …

II. PP Vi sinh hoïc (tt)
 Quan sát trực tiếp:
1. Soi tươi: phát hiện VSV còn sống, di động
VD: VK tả, VK giang mai, Leptospira.
2. Nhuộm: nhiều pp
- nhuộm Gram: quan sát hình thể & cách bắt màu Gram của VK


II. PP Vi sinh hoïc (tt)
 Quan sát trực tiếp:
1. Soi tươi
2. Nhuộm: - nhuộm Gram
- Nhuộm kháng acid

- Nhuộm bạc:

M. tuberculosis trên phết nhuộm

Legionella_Silver_Stain


II. PP Vi sinh hoïc (tt)
 Quan sát trực tiếp
 Nuôi cấy vi khuẩn:
1. Nuôi cấy  phân lập VK: trên các môi trường thích hợp
Môi trường BA - S. aureus

Môi trường EMB - E. coli

II. PP Vi sinh hoïc (tt)
 Quan sát trực tiếp
 Nuôi cấy vi khuẩn:


II. PP Vi sinh hoïc (tt)
 Quan sát trực tiếp
 Nuôi cấy vi khuẩn:
1. Phân lập VK
2. Kháng sinh đồ:
2.1. Phương pháp khuếch tán
trên đĩa thạch (Kirby Bauer)


2.2. Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng
104 cfu

mg/ml 4

2

1

0,5

0,25

0,12

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 0,5mg/ml

(Minimum inhibitory concentration - MIC)

0


II. PP Vi sinh hoïc (tt)
 Quan sát trực tiếp
 Nuôi cấy vi khuẩn
 Nuôi cấy virus:
 Định danh bằng kỹ thuật Miễn dịch hoặc Sinh học phân tử


II. Phöông phaùp Mieãn dòch hoïc
 Khái niệm
 Phân loại

 Các phản ứng miễn dịch (MD) thường dùng
trong Vi sinh lâm sàng: 1. Phản ứng ngưng kết
2. Phản ứng MD đánh dấu:
- MD huỳnh quang
- ELISA

 Nhận định kết quả


II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
 Khái niệm:
1. ĐN: Là phản ứng kháng nguyên - kháng thể (KN - KT)
2. Mục đích: Xác định hoặc / và
- chuẩn độ một KN

- định lượng hiệu giá một KT
- đo lường một phức hợp KN-KT
- đo lường các nhân tố  tham gia / hệ thống MD.
VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể.


• Điểm quyết định KN (epitope):
phần trên phân tử KN có khả
năng liên kết đặc hiệu vào phần
liên kết với KN trên phân tử KT

Khaùng nguyeân


Tương tác KN - KT


Hiện tượng vùng


II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
 Phân loại:

A. Phản ứng dựa trên sự tạo thành “hạt”:
1. Kết tủa (precipitation reaction): KN hòa tan.
2. Ngưng kết (agglutination reaction): KN hữu hình

B. Phản ứng dựa trên hoạt động sinh học của KT:
1. Kết hợp bổ thể (complement binding reaction)
2. Trung hòa (neutralization reaction)

C. Phản ứng MD đánh dấu:
1. MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction)
2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA)
3. MD phóng xạ (radio immmuno assay - RIA).


Các phản ứng MD có độ nhạy khác nhau
Loại phản ứng MD

Ngưỡng phát hiện (mg/ml)

Kết tủa / môi trường lỏng
Kết tủa / thạch:
- khuếch tán đơn (Mancini)
- khuếch tán kép (Ouchterlony)
- MD điện di (Immuno electrophoresis )

20

Ngưng kết: - trực tiếp
- gián tiếp
- ngưng kết vi khuẩn

10
3
50
0,5
0,001
0,001

Cố định bổ thể (CF)

0,1

Miễn dịch huỳnh quang (IF)

0,1

Định lượng MD phóng xạ (RIA)

0,0001

Định lượng MD enzym (EIA)

0,0001


II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
 Các phản ứng MD thường dùng / Vi sinh lâm sàng:
A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction):
- Ngưng kết: nhóm máu, nhóm VKĐR, …
- Latex, ngăn ngưng kết (HI)
B. Phản ứng MD đánh dấu:
- MDHQ (IF),
- ELISA


II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
A. Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction)

Tạo mạng


Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
(thụ động)
Ngưng kết hồng cầu thụ động

KN hoặc hapten
gắn trên giá khoác

KT / mẫu


Phản ứng NK hồng cầu gián tiếp
(thụ động) - 2
Ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược

KT / giá khoác

KN / mẫu


Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
(Hemagglutination Inhibition - HI)


II. PP Mieãn dòch hoïc (tt)
B. Phản ứng MD đánh dấu:
1. MD huỳnh quang (immunofluorescence - IF)

VD:  RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, …

* Đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry):
đếm & phân loại TB.
2. MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA).
VD:  HBV, HCV, HIV, Rubella, …