Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng (tóm tắt + toàn văn)

Bộ khoa học và công nghệ
chơng trình KH&CN Biển phục vụ phát triển bền vững
kinh tế-xã hội, mã số kc.09/06-10

Báo cáo tóm tắt đề tài
Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh
học theo định hớng kháng sinh, gây độc tế bào
và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các
sản phẩm có giá trị dợc dụng
Mã số: KC.09.09/06-10
Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Châu Văn Minh
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội, 5 năm 2009


Bộ khoa học và công nghệ
chơng trình KH&CN Biển phục vụ phát triển bền vững
kinh tế-xã hội, mã số kc.09/06-10

Báo cáo tóm tắt đề tài
Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh
học theo định hớng kháng sinh, gây độc tế bào
và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các
sản phẩm có giá trị dợc dụng
Mã số: KC.09.09/06-10
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Châu Văn Minh - Chủ nhiệm đề tài
Phan Văn Kiệm - Th ký đề tài, Lê Mai Hơng, Phạm Quốc

Long, Hoàng Thanh Hơng, Nguyễn Minh Hà, Đỗ Công
Thung, Tống Kim Thuần, Nguyễn Huy Nam, Trơng
Hơng Lan, Đặng Diễm Hồng, Đoàn Thái Hng.


Thông tin tóm tắt về đề tài
1.Tên và mã số đề tài:
Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hớng kháng sinh,
gây độc tế bào và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị
dợc dụng
Thuộc chơng trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nớc KC09/06-10: Khoa học và Công
nghệ Biển phục vụ phát triển bền vững kinh tế xã hội
Mã số: KC09.09/06-10
Thời gian thực hiện: 1/2006-12/2008.
2. Cơ quan chủ trì đề tài:

Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà Nội
Điện thoại: 04-8360830; Fax: 04-7564390
Cơ quan phối hợp chính: Viện Tài nguyên và Môi trờng biển Hải Phòng, Viện Y
học cổ truyền Quân đội, Viện Công nghệ Sinh học, Viện
Công nghiệp Thực phẩm, Công ty Dợc phẩm Đông
Dơng
3. Chủ nhiệm Đề tài:
GS. TS. Châu Văn Minh
Địa chỉ: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Điện thoại: 04-8363375; Fax: 04- 7564390
Email:
Th kí khoa học:

TS. Phan Văn Kiệm
Địa chỉ: Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Điện thoại: 04-7562378; Fax: 04- 7564390
Email:
4. Mục tiêu của đề tài:
4.1. Xây dựng đợc danh mục sinh vật biển có chất kháng sinh, gây độc tế bào và
chống ôxy hoá.
4.2. Xây dựng đợc qui trình công nghệ tách chiết các chất có hoạt tính sinh học
và tạo ra một số sản phẩm có giá trị dợc dụng.
4.3. Đào tạo cán bộ trong lĩnh vực Hợp chất thiên nhiên biển, một lĩnh vực còn rất
mới mẻ ở Việt nam.
4.4. Phối hợp với các cơ quan liên quan để đa vào ứng dụng thực tế.
5. Những nội dung chính của đề tài:
5.1. Thu thập mẫu, phân loại sinh vật biển, xác định tên phân loại, tạo tiêu bản, xây
dựng cơ sở dữ liệu về nguồn dợc liệu biển Việt Nam.
5.2. Sàng lọc hoạt tính sinh học các mẫu sinh vật biển theo định hớng kháng sinh,
gây độc tế bào và chống ôxy hoá.
5.3. Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của một số loài sinh vật
biển đợc lựa chọn thông qua quá trình sàng lọc.
5.4. Nghiên cứu thăm dò khả năng kháng viêm từ rong - tảo và khả năng sinh các chất
có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển
5.5. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm, xây dựng và thẩm định tiêu chuẩn
cơ sở, tiến hành các nghiên cứu về dợc lý và đăng ký tiêu chuẩn sản phẩm và
giấy phép lu hành của Bộ Y tế cho 04 chế phẩm: CEFISH, BIONAMINE,
HALIOTIS và HASAMIN
1


Danh sách những ngời thực hiện

A. Tác giả chính
1. GS TS Châu Văn Minh
2. TS Phan Văn Kiệm
3. PGS TS Lê Mai Hơng
4. PGS TS Phạm Quốc Long
5. PGS TS Hoàng Thanh Hơng
6. TS Nguyễn Minh Hà
7. TS Đỗ Công Thung
8. PGS TS Tống Kim Thuần
9. ThS Nguyễn Huy Nam
10. TS Trơng Hơng Lan
11. TS Đặng Diễm Hồng
12. ThS Đoàn Thái Hng

Chủ nhiệm đề tài
Th ký đề tài
Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên
Viện Y học Cổ truyền quân đội
Viện Tài nguyên và Môi trờng Biển
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghệ Sinh học
Viện Công nghiệp thực phẩm
Viện Công nghệ Sinh học
Công ty Dợc Đông Dơng

B. Những ngời tham gia
1. TS Lu Văn Chính
2. TS Nguyễn Tiến Đạt

3. NCS Nguyễn Hoài Nam
4. NCS Đoàn Lan Phơng
5. NCS Trần Thị Nh Hằng
6. ThS Trần Hồng Quang
7. ThS Trịnh Thu Hơng

Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN

27. BS Phạm Thị Dung
28. TS Lê Văn Ty
29. CN Võ Thị Ninh
30. PGS TS Vũ Mạnh Hùng
31. GS TS Lê Quý Phợng
32. CN Đặng Trần Hoàn
33. BS Ngô Đức Nhuận

8. TS Lê Minh Hà

Viện HCTN

34. DS Nguyễn Văn Chung

9. ThS Nguyễn Xuân Cờng
10. CN Nguyễn Phơng Thảo

11. CN Trần Hồng Hạnh
12. NCS Nguyễn Hồng Vân

Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN

13. ThS Nguyễn Hải Đăng

Viện HCTN

35. TS Nguyễn Văn Xá
36. ThS. Hoàng T Minh Hiền
37. ThS. Hoàng Thị Lan Anh
38. CN Hoàng Sỹ Nam
39. CN Nguyễn T Minh
Thanh

14. ThS Đỗ Hữu Nghị

Viện HCTN

15. NCS Nguyễn Văn Thanh

Viện HCTN

16. ThS Mai Ngọc Toàn
17. NCS Phạm Hải Yến
18. CN Phan T Thanh Hơng

19. CN Trần Anh Tuấn
20. NCS Trần Thu Hà
21. ThS. Nguyễn T Kim Thúy
22. Ths Lại Quốc Phong
23. KS Dơng Văn Đồng
24. ThS. Trần T Minh Hà
25. CN Phạm Linh Khoa
26. KS Nguyễn Thị Làn

Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện HCTN
Viện CNTP
Viện CNTP
Viện CNTP
Viện CNTP
Viện CNTP

40. CN Huỳnh Quang Năng
41. PGS TS Nguyễn Trọng
Thông
42. ThS Nguyễn Thị Vân Anh
43. TS Nguyễn Công Thực
44. ThS Nguyễn Văn Lĩnh
45. NCS. Nguyễn Đăng Ngải
46. NCS. Trần Mạnh Hà
47. CN Nguyễn Thế Hoàng

48. CN Lê Thị Thúy
49. NCS. Nguyễn Văn Quân
50. CN Vũ Thị Lựu
51. TS. Đàm Đức Tiến
52. ThS. Chu Thế Cờng
2

BVĐK Hà Tây
Viện CNSH
Viện CNSH
Học viện QY
Viện KHTDTT
Viện KHTDTT
Viện KHTDTT
Công ty
INTECPHARM
TT GD&PT Sắc ký
Viện CNSH
Viện CNSH
Viện CNSH
Viện CNSH
Viện NC&UD CN
Nha Trang
Đại học Y HN
Đại học Y HN
Viện YHCT
Viện YHCT
Viện TN&MT Biển
Viện TN&MT Biển
Viện TN&MT Biển

Viện TN&MT Biển
Viện TN&MT Biển
Viện TN&MT Biển
Viện TN&MT Biển
Viện TN&MT Biển


Tóm tắt báo cáo
Bố cục của báo cáo đợc trình bày nh sau:
Mở đầu
Phần I. Tổng quan, mô hình và phơng pháp nghiên cứu
I. Tổng quan về dợc liệu biển
II. Mô hình nghiên cứu và phơng pháp nghiên cứu.
Phần II. Kết quả nghiên cứu
A. Thu thập mẫu và sàng lọc hoạt tính sinh học
Chơng I. Thu thập, định loại mẫu SVB và xây dựng cơ sở dữ liệu
Chơng II. Xử lý mẫu, tạo dịch chiết và sàng lọc hoạt tính sinh học
B. Nghiên cứu hóa học theo định hớng hoạt tính sinh học
Chơng III. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của một số
loài san hô mềm
Chơng IV. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của một số
loài da gai
Chơng V. Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học của một số
loài hải miên
Chơng VI. Tổng hợp các chất phân lập đợc trong khuôn khổ đề tài
C. Các nghiên cứu về rong, tảo và vi sinh vật biển
Chơng VII. Nghiên cứu thăm dò khả năng kháng viêm từ rong và tảo biển Việt
Nam
Chơng VIII. Nghiên cứu thăm dò khả năng sinh các chất có HTSH từ vi sinh vật
biển

D. Các nghiên cứu ứng dụng sản xuất các sản phẩm
Chơng IX. Nghiên cứu công nghệ sản xuất thức ăn chức năng bổ sung Omega 3
phòng và hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch.
Chơng X. Nghiên cứu quy trình sản xuất thực phẩm chức năng tăng cờng thể lực
cho vận động viên từ sao biển
Chơng XI. Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng bồi bổ cơ thể của viên nang
HALIOTIS từ bào ng
Chơng XII. Nghiên cứu công nghệ sản xuất viên nang mềm hải sâm HASAMIN
Phần III. Kết luận và kiến nghị chung

Nội dung chính của toàn bộ báo cáo đợc tóm tắt nh sau:

3


Phần I. Tổng quan, mô hình và phơng pháp nghiên cứu
I. Tổng quan về dợc liệu biển
Phần tổng quan đợc trình bày trong báo cáo gồm các mục sau:
I.1. Tổng quan chung tình hình nghiên cứu trên thế giới
1. Lợc sử hình thành, phát triển và các hớng nghiên cứu hoạt chất sinh học biển
hiện nay.
Mục này trình bày một cách tóm tắt sự hình thành và phát triển của nghiên cứu
dợc liệu biển, đồng thời nêu ra một số hớng nghiên cứu hoạt chất sinh học biển hiện
nay trên thế giới. Trong đó, hớng sàng lọc theo định hớng hoạt tính sinh học đợc
đánh giá là một bớc tiến trong việc nghiên cứu, phát triển các dợc phẩm mới đã và
đang đợc nhiều trung tâm trên thế giới sử dụng nh là một trong những công cụ hàng
đầu để phát hiện ra các dợc tố mới.
2. Các hợp chất thiên nhiên biển và hoạt tính sinh học từ các loài hải miên, da gai và
san hô mềm.
Mục này trình bày một cách tổng quát về các hoạt chất đợc phân lập từ hải miên,

da gai và san hô mềm có hoạt tính đặc biệt hấp dẫn hoặc đang đợc tiến hành thử
nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng theo các hớng: kháng viêm, chống ung th, kháng vi
rút, kháng sinh, kháng nấm... Điển hình nh: Contignasterol đợc phân lập từ hải miên
Petrosia congignata thể hiện hoạt tính kháng viêm rất cao hoạt động theo cơ chế kìm
hãm sự giải phóng histamine từ các bạch cầu, các dẫn xuất tổng hợp của nó đang đợc
tiến hành nghiên cứu lâm sàng pha II điều trị bệnh hen. Các hợp chất sarcodictyin phân
lập từ loài san hô mềm Sarcodictyon roseum hiện đang là những ứng viên nặng ký cho
nghiên cứu tạo thuốc trị ung th. Hàng ngàn hợp chất khác đã và đang đợc nghiên cứu,
phát triển ở các Viện nghiên cứu và Bệnh viện trên toàn thế giới.
3. Khả năng khai thác nguồn dợc liệu biển, cơ hội và thách thức
Triển vọng và thách thức trong việc nghiên cứu các hoạt chất từ sinh vật biển đợc
trình bày vắn tắt trong mục này. Với u thế về cấu trúc hóa học độc đáo, đa dạng và thể
hiện nhiều hoạt tính quý báu, các hợp chất thiên nhiên biển có nhiều tiềm năng để
nghiên cứu và phát triển các dợc phẩm mới. Tuy nhiên cũng có không ít trở ngại nh:
sự khó khăn trong công tác lấy mẫu, khả năng thu mẫu lợng lớn.... Các hoạt chất từ
sinh vật biển thờng có hàm lợng thấp do đó để thu đợc lợng chất đủ để sản xuất
thuốc sẽ cần một lợng nguyên liệu khổng lồ, ví dụ để thu đợc 1 gam ET-743 thì phải
cần tới 1 tấn E. turbunata.
4. Phơng hớng nghiên cứu sàng lọc hoạt tính từ nguồn dợc liệu biển trên thế giới
Mục này đa ra các phơng hớng nghiên cứu sàng lọc hoạt tính từ nguồn dợc
liệu đang đợc sử dụng trên thế giới
I.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nớc
Mục này trình bày một cách tóm tắt và hệ thống các nghiên cứu trong nớc về các
chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dợc liệu biển nh: sàng lọc hoạt tính sinh học,
nghiên cứu hóa học theo định hớng HTSH và nghiên cứu chế tạo sản phẩm.
II. Mô hình nghiên cứu và phơng pháp nghiên cứu

II.1. Lựa chọn mô hình nghiên cứu và thiết kế nghiên cứu
II.1.1. Lựa chọn mô hình nghiên cứu
Nghiên cứu về dợc liệu biển là một lĩnh vực còn mới mẻ đối với các nhà khoa

học trong nớc. Đề tài đã chọn cách tiếp cận, phơng pháp nghiên cứu và các kỹ thuật
hiện đại để thực hiện đề tài. Cụ thể nh sau:

4


Cách tiếp cận nghiên cứu của đề tài:
Mô hình nghiên cứu lựa chọn trong đề tài là mô hình nghiên cứu hoá học theo
định hớng hoạt tính sinh học (bioassay-guided chemical study). Đây là mô hình nghiên
cứu khép kín, từ thực tiễn nghiên cứu đến cơ bản triển khai, tạo sản phẩm cụ thể phục vụ
cho cuộc sống bằng con đờng ngắn nhất, nâng cao giá trị sử dụng và góp phần bảo vệ
nguồn tài nguyên thiên nhiên. Sơ đồ tóm tắt các bớc tiến hành của mô hình này đợc
trình bày ở sơ đồ1:
Mẫu sinh vật biển đã xử lý
Chiết bằng MeOH 90%
Dịch MeOH thô

Không có hoạt tính
Dừng lại hoặc
thử hoạt tính
khác

Thử hoạt
tính
Có hoạt tính
Dịch chiết MeOH
- Tách phân đoạn
(Chiết dung môi phân cực khác nhau hoặc sắc ký cột)

Phân đoạn 1

Phân đoạn 2

Phân đoạn 3

Thử hoạt
tính

Thử hoạt
tính

Thử hoạt
tính

Không có hoạt tính
Dừng lại

Không có hoạt tính

Có hoạt tính
Tách chất sạch và tinh chế
chế bằng TLC/CC/HPLC

Chất 1

Chất 2

Thử hoạt
tính

Thử hoạt
tính

Không có hoạt
tính
Dừng lại

Dừng lại

Chất 3

Thử hoạt
tính

Không có
hoạt tính

Có hoạt tính
Các nghiên cứu sâu
hơn về dợc lý

Dừng lại

Sơ đồ 1: Nghiên cứu hoá học theo định hớng hoạt tính sinh học
5


II.1.2. Thiết kế nghiên cứu
Đây là một đề tài nghiên cứu liên ngành, để giải quyết đợc các nhiệm vụ đặt ra,
chúng tôi đã bàn bạc và xây dựng sơ đồ nghiên cứu nh sau:

Cở sở dữ
liệu

Xử lý, lu
giữ mẫu, tạo
chiết phẩm
phục vụ
sàng lọc
HTSH

Thu thập
mẫu sinh
vật biển.
Xác định
tên KH và
tạo tiêu bản

Xây dựng
các qui trình
NCHH theo
định hớng
HTSH

Sàng lọc
hoạt tính
Sinh học
(Bioassay
sceening)

Các QT
tách chiết,
phân lập
các chất có
HTSH

Các kết quả nghiên cứu đã
triển khai trong đề tài KC09.15
Dây chuyền
thiết bị quy mô
Pilot

Thực phẩm chức năng
HASAMIN tăng cờng
sinh lực từ hải sâm

Qui trình sản xuất nguyên liệu

Thực phẩm chức năng
HALIOTIS từ bào ng

Thực phẩm chức năng
CEFISH hỗ trợ điều trị
bệnh tim mạch từ
Omega 3

Thực phẩm chức năng
BIONAMINE từ
sao biển

Sản phẩm thực
thực tế phục vụ
cuộc sống

Các thử nghiệm dợc lý, độc tính bán trờng diễn,
hiệu lực chế phẩm (HASAMIN, BIONAMINE,
HALIOTIS và CEFISH)

Thử nghiệm và hoàn thành quy trình sản xuât
HASAMIN, BIONAMINE, HALIOTIS và CEFISH

Các thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân

6

Đăng ký
sản phẩm


Tổ chức thực hiện
Đề tài KC09.09/06-10 là đề tài nghiên cứu liên ngành (Hoá, Sinh, Y, Dợc và
Công nghệ), các mảng nghiên cứu gắn kết với nhau và kết quả thực hiện của mỗi nhóm
nghiên cứu đều đóng vai trò quan trọng đến kết quả chung của đề tài. Vì vậy, ngay từ
khi xây dựng đề cơng cũng nh khi bắt đầu thực hiện đề tài, chúng tôi đã tập trung
đợc lực lợng cán bộ khoa học và triển khai để xây dựng tiến độ nghiên cứu và nội
dung nghiên cứu thống nhất.
1) Viện Tài nguyên và Môi trờng Biển Hải Phòng
Chịu trách nhiệm thu thập mẫu sinh vật biển, xác định tên, phân loại, tạo tiêu bản
mẫu và các thông tin về mẫu. Số lợng mẫu, địa điểm thu mẫu, số chuyến khảo sát và
các kỹ thuật xử lý sơ bộ, bảo quản mẫu theo yêu cầu của đề tài.

2) Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên:
Cơ quan chủ trì đề tài KC09.09/06-10, chịu trách nhiệm chung. Các phòng
nghiên cứu trong Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên tham gia vào các phần việc
chính bao gồm:
Xử lý mẫu sinh vật biển, tạo dịch chiết phục vụ cho sàng lọc hoạt tính sinh học
và nghiên cứu hoá học. Xây dựng qui trình xử lý mẫu thống nhất.
Sàng lọc hoạt tính sinh học của các mẫu sinh vật biển theo các hớng sau:
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity assay)
Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)
Hoạt tính chống ôxi hoá (Antioxidant activity assay)
Nghiên cứu hóa học theo định hớng hoạt tính sinh học: Tách chiết và xác định
cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các đối tợng chọn lọc và hớng sử
dụng.
- Xây dựng qui trình tách chiết tổng hợp các chế phẩm cụ thể phục vụ y tế
Chế phẩm HASAMIN từ Hải sâm.
Chế phẩm BIONAMINE từ Sao biển.
Chế phẩm HALIOTIS từ Bào ng.
Chế phẩm Thức ăn chức năng CEFISH phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh tim
mạch.
- Tham gia xây dựng tiêu chuẩn cơ sở các chế phẩm trên, thẩm định tiêu chuẩn
cơ sở tại Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm Bộ Y tế
- Xây dựng cơ sở dữ liệu về dợc liệu biển
3) Viện Y học Cổ truyền Quân đội:
- Thử độc tính cấp (LD50)
-Thử độc tính bán trờng diễn
- Thử hiệu lực chế phẩm trên động vật thực nghiệm
- Hoàn chỉnh hồ sơ thử nghiệm dợc lý.
- Tạo chế phẩm HALIOTIS từ Bào ng
4) Viện Công nghệ Sinh học:
- Thăm dò khả năng làm dợc liệu của vi sinh vật biển, xây dựng qui trình tách

chất có hoạt tính
- Phối hợp tạo sản phẩm BIONAMINE và thơng mại hoá sản phẩm
5) Viện Công nghiệp thực phẩm

7


Xây dựng và tiến hành qui trình sản xuất thực phẩm chức năng CEFISH phòng
ngừa và hỗ trợ điều trị tim mạch
6) Công ty Dợc phẩm Đông Dơng
Sản xuất thử, đăng ký lu hành và thơng mại hoá sản phẩm HASAMIN
7) Một số đơn vị khác
Cùng phối hợp với Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên trong việc thực hiện
một số công việc liên quan đến đề tài.
II.2. Các phơng pháp nghiên cứu
II.2.1. Phơng pháp thu mẫu, xử lý số liệu phân tích mẫu và xây dựng cơ sở dữ liệu
II.2.1.1. Phơng pháp thu mẫu
Mục này trình bày các phơng pháp thu mẫu đợc áp dụng gồm:
- Theo quy phạm thu thập mẫu sinh vật biển do UBKH KTNN ban hành năm 1981.
- Phơng pháp thu mẫu sinh vật trong quan trắc và phân tích môi trờng biển do Bộ KHCN và
MT ban hành năm 2002.
- Phơng pháp thu mẫu sinh vật của Winkinson và Baker năm 1998.
- Sử dụng phơng pháp lặn sâu kết hợp với các thiết bị quay phim chụp ảnh.

II.2.1.2. Các loại hoá chất
Mục này trình bày các loại hóa chất đợc sử dụng để nhuộm màu, định hình và
bảo quản lâu dài mẫu tiêu bản.
II.2.1.3. Xử lí số liệu và phân tích mẫu
- Tất cả mẫu thu đợc đều đợc chụp ảnh trên máy ảnh kĩ thuật số và lu giữ trong máy
vi tính, sâu đó ngâm trong cồn 70 độ để lu trữ làm mẫu so sánh sau này

- Mẫu dợc gửi đến các chuyên gia trong nớc và ngoài nớc giám định theo các
phơng pháp chuyên dụng
- Sử dụng phần mềm visual basic và Microsoft Acess để xây dựng cơ sở dữ liệu về các
loài sinh vật chứa dợc liệu.
- Xây dựng cơ sở dữ liệu về các loài sinh vật chứa dợc liệu
II.2.2 Phơng pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết và sàng lọc hoạt tính sinh học
Do có những đặc trng riêng, các mẫu sinh vật biển đòi hỏi phải đợc bảo quản
và xử lý rất cẩn thận để tránh h hỏng và mất hoạt tính trong quá trình xử lý. Phần này
giới thiệu tóm tắt cách thức xây dựng quy trình xử lý, tạo dịch chiết và bảo quản mẫu
phục vụ cho sàng lọc hoạt tính sinh học và xây dựng các protocol thống nhất trong đánh
giá hoạt tính sinh học. Các qui trình và protocol này đợc tuân thủ trong suốt quá trình
thực hiện dự án. Nội dung chính gồm:
II.2.2.1. Xử lý mẫu và tạo chiết phẩm phục vụ sàng lọc hoạt tính sinh học
Chi tiết các công đoạn phải đợc tiến hành để xử lý mẫu, tạo dịch chiết và bảo
quản mẫu đợc trình bày trong mục này. Tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình này sẽ
đảm bảo đợc độ chính xác cao, tránh nhầm lẫn giữa các mẫu hoặc chiết xuất không
triệt để các hoạt chất giúp định hớng một cách chính xác cho các nghiên cứu tiếp theo.

8


II.2.2.2 Các phơng pháp sàng lọc hoạt tính sinh học
a) Quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity
assay):
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đợc đánh giá trên các phiến vi lợng 96
giếng (96-well microtiter plate) theo phơng pháp hiện đại của Vander Bergher và
Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996), hiện đang đợc áp dụng tại trờng
đại học Dợc, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Các chủng vi sinh vật kiểm định
đợc sử dụng bao gồm:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus.
- Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.
- Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.
Thực nghiệm đợc tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các
Hợp chất Thiên nhiên.
b) Quy trình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic assay):
Hoạt tính gây độc tế bào đợc đánh giá theo phơng pháp của Skehan và cộng sự
(1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự (1993) tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện
Hóa học các HCTN. Các dòng tế bào ung th ngời đợc sử dụng là:
- Dòng KB (Human epidemoid carcinoma - Ung th biểu mô) từ phòng thí
nghiệm Bioassay trờng Đại học Dợc Illinois- USA.
- Dòng Fl (Fibril sarcoma of Uteus - Ung th màng tử cung).
- Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma- Ung th gan) từ Viện VSDT TƯ.
c) Quy trình thử hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng
bao vây gốc tự do DPPH (DPPH radical scavenging activity)
Thử nghiệm bao vây các gốc tự do tạo ra bởi DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) của các chất chiết dựa trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc
tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này,
nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cờng độ
hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ôxy hoá đợc đánh giá dựa
trên giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy
Elisa ở bớc sóng 515nm. Thực nghiệm đợc tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm,
Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên.
d. Đánh giá hoạt tính chống loãng xơng thông qua các cơ chế kích thích sự biệt hóa
của nguyên bào xơng MC3T3-E1.
Hoạt tính chống loãng xơng đợc đánh giá bằng ảnh hởng của mẫu thử đối với
sự sinh trởng của tế bào, hoạt lực của enzim ALP (Alkaline Phosphatase), hàm lợng
collagen và và sự tích tụ canxi đối với tế bào MC3T3-E1, một tiền nguyên bào xơng, đã
đợc chấp nhận rộng rãi làm mô hình in vitro để nghiên cứu sự biệt hóa của nguyên bào
xơng tại trờng Đại học Dợc, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
e. Đánh giá hoạt tính kháng NF-B.

Các thử nghiệm hoạt tính kháng NF-B đợc tiến hành theo phơng pháp SEAP
ASSAY trên dòng tế bào chuẩn RAW264 tại Phòng nghiên cứu ung th, Viện Sinh học
và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB).
II.2.3. Phơng pháp phân lập và xác định cấu trúc hoá học
Các phơng pháp cứu chủ yếu gồm:
- Các phơng pháp sắc ký: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC)...
- Các phơng pháp phổ bao gồm: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lợng (ESI-MS), phổ
khối lợng phân giải cao (HR FAB-MS), phổ cộng hởng từ hạt nhân (NMR)...

9


II.2.4. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu thăm dò khả năng kháng viêm từ
rong tảo biển Việt Nam
II.2.4.1. Nguyên liệu
a. Mẫu rong
Danh sách 22 mẫu rong tảo biển đợc sử dụng trong nghiên cứu do cán bộ Phòng
Công nghệ Tảo, Viện CNSH và CN. Huỳnh Quang Năng, Viện nghiên cứu và ứng dụng
Công nghệ Nha Trang (VAST) thu thập và định tên khoa học. Thời gian thu mẫu 20072008. Trong đó, Undaria pinnatifida, Enteromorpha linza là hai loài có hoạt tính kháng
viêm cao do Trờng Đại học Quốc gia Pukyong, Hàn Quốc cung cấp đợc sử dụng làm
mẫu thử so sánh với rong biển Việt Nam.
Danh sách 22 mẫu rong biển đợc dùng để tách dịch chiết có hoạt tính kháng viêm
TT
1

Tên mẫu
Gracilaria asiatica

2

G. blodgettii

3
4
5
6
7

Sargassum duplicatum
Ulva reticulata (1)
Sargassum polycystum
Codium arabicum
Enteromorpha
compressa
Ulva reticulata (2)
Dictyota dichotoma
Sargassum microcustum
S. mcclurei
S. denticarpum
S. swartzii
S. binderi
Gracilaria arcuata
G. eucheumoides
G. salicornia
Hypnea valentina
Porphyra crispata
P. suborbiculata
Undaria pinnatifida
Enteromopha linza

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

Địa điểm thu mẫu
Đầm nuôi trồng thuỷ sản, Trạm Nghiên cứu nuôi trồng
thuỷ sản nớc lợ Quý Kim, Hải Phòng
Đầm nuôi trồng thuỷ sản, Trạm Nghiên cứu nuôi trồng
thuỷ sản nớc lợ Quý Kim, Hải Phòng
Cửa lò, Nghệ An
Do Công ty TNHH Việt Đài cung cấp
Do Công ty TNHH Việt Đài cung cấp
Nha Trang, Khánh Hoà
Nha Trang, Khánh Hoà
Nha Trang, Khánh Hoà
Nha Trang, Khánh Hoà
Đảo tri Nguyên, Nha Trang, Khánh Hoà
Hòn Chồng, Vĩnh Phớc, Nha Trang, Khánh Hoà

Mỹ Hoà, Ninh Hải, Ninh Thuận
Bãi Tiên, Vĩnh Hoà, Nha Trang, Khánh Hoà
Trại Bầu, Vĩnh Nguyên, Nha Trang, Khánh Hoà
Bãi Tiên, Vĩnh Hoà, Nha Trang, Khánh Hoà
Nha Trang Khánh Hoà
Nha Trang Khánh Hoà
Nha Trang Khánh Hoà
Thừa Thiên Huế
Thừa Thiên Huế
Đại học Quốc gia Pukyong, Hàn Quốc
Đại học Quốc gia Pukyong, Hàn Quốc

b. Động vật thí nghiệm
+ Chuột cống trắng (đực và cái) khoẻ mạnh có trọng lợng khoảng 120 20g do
Trung tâm chăn nuôi của Học Viện Quân Y cung cấp.
+ Chuột nhắt đực có trọng lợng khoảng 22-25 gam do Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ơng cung cấp.
Các động vật thí nghiệm đợc nuôi trong điều kiện đồng nhất của phòng thí
nghiệm có đầy đủ thức ăn và nớc uống trớc khi dùng làm thí nghiệm.
II.2.4.2. Phơng pháp nghiên cứu
a. Quy trình tách chiết dịch có hoạt tính kháng viêm
Dịch chiết có hoạt tính kháng viêm trong các mẫu tảo nghiên cứu đợc tách chiết
theo phơng pháp của Jin và cs, 1997 và Khan 2007.
10


b. Phơng pháp thử hoạt tính kháng viêm trên tai chuột
Theo phơng pháp của Van Arman (1974).
c. Phơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (pha loãng nồng độ)
- Pha loãng mẫu thử bằng phơng pháp pha loãng đa nồng độ: Mẫu ban đầu có

nồng độ 20mg/ml đợc pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các
chủng có nồng độ 128 àg/ml; 32 àg/ml; 8 àg/ml; 2 àg/ml; 0,5 àg/ml đối với chất sạch.,
256 àg/ml; 64 àg/ml; 16 àg/ml .. 1 àg/ml; 0,25 àg/ml đối với dịch chiết.
d. Nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của dich chiết có hoạt tính kháng viêm
từ Sargassum swartzii (S) và Ulva reticulata (U) trên chuột nhắt trắng bằng phơng
pháp của Litchfield và Wilcoxon (1949)
e. Nghiên cứu tác dụng giảm đau
Tác dụng giảm đau đợc xác định bằng phơng pháp Koster - quặn đau axit acetic
và phơng pháp mâm nóng:
* Phơng pháp gây viêm cấp
+ Gây phù chân chuột bằng carrageenin.
+ Gây viêm màng bụng
* Gây viêm mạn (gây u hạt)
f. Xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu đợc xử lý thống kê theo phơng pháp t-test Student và test
trớc - sau(Avant - Après). Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
II.2.5. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu thăm dò khả năng sinh các chất có
Hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển
II.2.5.1. Nguyên liệu
- Các mẫu nớc và trầm tích đợc lấy ở các địa điểm khác nhau của biển Việt Nam:
Quảng Bình, Bình Định, Phú Yên vào tháng 5/2007. Các mẫu này đợc Viện Địa Lý
cung cấp.
- Các mẫu san hô và rong lấy từ biển Nha Trang, đảo Trờng Sa 6/2007 do Phòng Sinh
thái nớc Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga cung cấp. Các mẫu nớc biển, trầm tích biển ở
độ sâu > 2m trở lên đợc lấy bằng các dụng cụ chuyên dụng.
- Các mẫu nớc bề mặt biển Hải Phòng, Cát Bà, Nha Trang, Hạ Long, Nam Định do
nhóm đề tài thu thập tháng 6-7/2007.
- Các mẫu cá biển, ngao, sò huyết mua tại chợ Thành Công, Hà Nội vào tháng 5/2007.
- Sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Heliothis armigera) do Viện Bảo vệ Thực vật

cung cấp.
- Giun nhiều tơ Derodigitata miiler (thức ăn cho cá cảnh) mua tại chợ Hà Nội.
- 5 chủng VSV kiểm định nhận từ bảo tàng giống chuẩn của Trung tâm CNSH, Đại học
khoa học tự nhiên Hà Nội: vi khuẩn Gram (-): E. coli; Pseudomonas aeruginose, vi
khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis; Streptococcus aureus, Nấm men gây bệnh: Candida
albicans.
II.2.5.2. Môi trờng phân lập vi sinh vật (g/l)
- Môi trờng MPA (phân lập vi khuẩn) Cao thịt: 5; pepton: 10; NaCl: 5; Thạch: 20;
Nớc biển 100%.
- Môi trờng Gause 1 (phân lập xạ khuẩn) Glucoza :10; K2HPO4: 0,5; MgSO4: 0,5;
KNO3: 1; FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nớc biển.
- Môi trờng Hansen (phân lập nấm men) Glucoza: 50; pepton 5; MgSO4.7H2O: 3;
K2HPO4: 3; KH2PO4: 3; Cao nấm men: 1; Thạch: 20; Nớc biển.
11


- Môi trờng Czapek (phân lập nấm mốc) Glucose: 5: MgSO4: 0,5; KCl: 0,5; MgCl2: 3;
FeSO4: 0,01; NaNO3: 3; KH2PO4: 1; K2HPO4 : 1; Thạch: 20; Nớc biển. Tất cả các môi
trờng trên đều đợc bổ sung dung dịch nguyên tố vi lợng.
II.2.5.3. Phơng pháp nghiên cứu
- Số lợng vi sinh vật trong các mẫu phân tích đợc xác định theo phơng pháp
pha loãng tới hạn của Koch.
- Sàng lọc sơ bộ khả năng sinh chất kháng khuẩn, kháng nấm của các chủng
phân lập đợc trên đĩa thạch MPA chứa 2% dịch VSV kiểm định.
- Nhuộm Gram: làm tiêu bản các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học.
- Mô tả hình thái khuẩn lạc bằng phơng pháp cấy khuẩn lạc lớn trên đĩa thạch.
- Hoạt hoá các chủng vi khuẩn kiểm định trên môi trờng MPA ở 370C trong
vòng 24 giờ, còn chủng nấm men C. albicans trên môi trờng Hansen ở 300C trong 48
giờ.
- Nuôi cấy VSV biển để thử khả năng sinh các chất có HTSH.

- Xác định khả năng kháng các VSV kiểm định bằng phơng pháp đục lỗ và đo
vòng vô khuẩn.
- Phơng pháp xác định khả năng gây độc tế bào trên giun tơ Derodigitata
miiler.
- Phơng pháp thử khả năng diệt sâu hại.
- Xác định hoạt tính amilaza trên môi trờng chứa 1% tinh bột tan; hoạt tính
xenluloza trên môi trờng chứa 1% bột giấy và hoạt tính proteaza trên môi trờng chứa
1% cazein. Dung dịch hiện màu là Lugol 1%.
- Xác định ảnh hởng của nguồn cacbon, nitơ, pH và độ thoáng khí lên sinh
truởng và sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn, kháng nấm theo phơng pháp VSV thông
dụng.
- Định tên khoa học các chủng vi sinh vật biển có hoạt tính sinh học theo phơng
pháp hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử.
II.2.6. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu tạo thực phẩm chức năng bổ sung
omega-3 phòng và hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch
II.2.6.1. Phơng pháp nghiên cứu
a. Phơng pháp công nghệ
- Phơng pháp ép đùn trên máy ép đùn VTP 2006 do Viện Công nghiệp Thực phẩm
thiết kế.
b. Phơng pháp phân tích hoá lý
- Xác định hàm ẩm theo phơng pháp sấy đến 1050C trong 3 giờ đến trọng lợng
không đổi.
- Xác định đạm toàn phần bằng phơng pháp Kieldahn.
- Xác định hàm lợng béo bằng phơng pháp Sochlex.
- Xác định độ nở: Độ nở của bỏng đợc xác định bằng tỷ số giữa diện tích của
bỏng/diện tích đầu khuôn.
- Xác định độ màu (L,a, b) bằng máy Hunter Mỹ.
- Xác định độ nhớt trên máy đo độ nhớt Brookfield DV-II.
- Hàm lợng DHA đợc xác định tại Viện Dinh dỡng.
- Xác định axít béo omega 3 trên máy sắc ký khí: chất béo đợc methyl hoá, chạy trên

máy GC PLUS HP 6890 của Viện Nghiên cứu Dợc phẩm và Mỹ phẩm miền Nam.
c. Phơng pháp vi sinh
- Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên môi trờng thạch thịt, pepton.
- Phát hiện E. coli trên canh thang thờng, canh thang lactoza, nớc pepton.
12


- Phát hiện vi khuẩn Salmonella trên môi trờng EMB (eosin methylen blue).
- Phát hiện nấm mốc, nấm men trên môi trờng thạch malt.
d. Phơng pháp thử nghiệm lâm sàng
Đối tợng thử nghiệm là các bệnh nhân có các yếu tố và nguy cơ của bệnh tim mạch
nh cao huyết áp, rối loạn chuyển hoá lipit máu đang đợc điều trị tại Bệnh viện Đa
khoa tỉnh Hà Tây.
e. Phơng pháp đánh giá cảm quan: theo TCVN
f. Phơng pháp toán học
Qui hoạch toán học thực nghiệm tối u hóa các điều kiện công nghệ của quá trình
ép đùn bằng ma trận toán học thực nghiệm Doehlert.
II.2.6.2. Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu và hoá chất sử dụng cho nghiên cứu
Mục này trình bày các thiết bị, nguyên vật liệu và hóa chất đợc sử dụng trong
nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung Omega-3 phòng và điều trị bệnh tim
mạch.
II.2.7. Phơng pháp nghiên cứu tạo thực phẩm chức năng Bionamine tăng cờng
sức khỏe cho vận động viên từ sao biển
II.2.7.1. Nghiên cứu xác định hàm lợng hoạt chất sinh học hoocmôn steroit
(testosteron, progesteron, cortilson, oestradoen) trong các đối tợng nghiên cứu (theo
phơng pháp miễn dịch Eliza trên máy Multiskan - Phần Lan với kit của hãng Biotech
Mỹ).
II.2.7.2. Nghiên cứu xác định hàm lợng hoạt chất sinh học, các nguyên tố khoáng vi
lợng cần thiết (Fe, Zn, Mn, Se) trong các đối tợng nghiên cứu (bằng phơng
pháp phân tích huỳnh quang tia X trên máy ký hiệu XRF SEA-2110 của Nhật).

II.2.7.3. Nghiên cứu xác định hàm lợng hoạt chất sinh học (protein, axit amin) của
các đối tợng nghiên cứu (bằng phơng pháp điện di trên máy axít amin tự động HP
Amino Quant Series II của Nhật).
II.2.7.4. Nghiên cứu quy trình khai thác các hoạt chất sinh học từ tạo chế phẩm thực
phẩm chức năng viên tăng lực Bionamine bằng công nghệ enzim.
* Phân tích hoạt chất sinh học trong một số loài sao biển bằng phơng pháp sinh
hóa, phơng pháp miễn dịch Eliza, phơng pháp vi sinh và phơng pháp phân tích huỳnh
quang tia X.
* ứng dụng công nghệ enzyme, công nghệ hóa sinh để tạo các sản phẩm bột nguyên
liệu Bionamine.
* Phơng pháp xác định mức độ thuỷ phân cơ chất: Phơng pháp Auson cải tiến, và
phơng pháp chuẩn độ formol.
II.2.7.5. Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trờng diễn của bột Bionamine.
Các nghiên cứu thực nghiệm về độc tính cấp và bán trờng diễn đợc thực hiện tại
Trung tâm nghiên cứu độc học Học Viện Quân Y.
II.2.7.6. Phơng pháp thử nghiệm tác dụng của viên tăng lực Bionamine trên động
vật thực nghiệm.
Tác dụng của viên tăng lực Bionamine trên động vật thực nghiệm đợc đánh giá
thông qua các chỉ tiêu huyết học, tăng cờng thể lực và sức bền của chuột trong quá
trình bơi lặn.
II.2.7.7. Phơng pháp đánh giá tác dụng lâm sàng của viên Bionamine trên vận động
viên điền kinh
Đánh giá tác dụng về sức bền, sức nhanh (phản xạ thần kinh) và sức mạnh cơ bắp
trên vận động viên của các đội điền kinh Hà Nội.

13


II.2.8. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu sản xuất viên nang mềm bào ng
HALIOTIS

II.2.8.1. Phơng pháp nghiên cứu qui trình bào chế viên nang Haliotis
a. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu lựa chọn dợc liệu và xây dựng qui trình bào chế viên nang mềm Bào ng
HALIOTIS thành dạng bán thành phẩm và thành phẩm
- Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm viên nang mềm bào ng
HALIOTIS
- Kiểm nghiệm sản phẩm viên nang mềm HALIOTIS theo tiêu chẩn cơ sở đã xây dựng
- Tiến hành đăng ký sản phẩm dới dạng thực phẩm chức năng với Bộ y tế xin cấp giấy
phép lu hành toàn Quốc.
b. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu:
+ Nguyên liệu:
Thịt bào ng đợc lấy từ vùng biển Nha Trang do Trung tâm nhiệt đới Việt Nga
chi nhánh Nha Trang cung cấp với số lợng 30 kg.
+ Cách xử lý:
- Bào ng sau khi thu hoạch tách bỏ vỏ cứng loại hết tạp chất và phủ tạng, rửa sạch
xử lý bảo quản đông khô.
- Thái lát mỏng, sấy cho đến khô
- Nghiền thành bột mịn
+ Phơng pháp nghiên cứu:
* Nghiên cứu lựa chọn dợc liệu và xây dng qui trình bào chế viên nang mềm Bào ng
Haliotis:
- Bào ng đợc lựa chọn đạt theo tiêu chuẩn qui định của Dợc điển cụ thể: Tỷ lệ
thuỷ phần khoảng 73%, 24,58% protit, 0,44% chất béo, 1,98% tro.
- Xây dựng qui trình bào chế viên nang mềm Haliotis:
- Bào ng sau khi thu hoạch tách bỏ vỏ cứng loại hết tạp chất và phủ tạng, rửa sạch
xử lý bảo quản đông khô.
- Thái lát mỏng, sấy cho đến khô
- Nghiền thành bột mịn
- Nhũ hoá bằng dầu đậu lành thu đợc dạng bán thành phẩm
- Đóng nang mềm Gelatine trên dây chuyền đóng nang mềm đạt tiêu chuẩn GMP

WHO
- Sấy viên
- Đóng lọ hoặc ép vỉ, dán nhãn hoàn thiện sản phẩm
- Kiểm nghiệm thành phẩm
- Nghiên cứu
II.2.8.2. Phơng pháp nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp đợc thực hiện tại Khoa Nghiên cứu thực nghiệm - Viện
Y học cổ truyền Quân đội theo các phơng pháp:
- Phơng pháp xác định độc tính cấp của thuốc Nhà xuất bản Y học, 1996.
- Hớng dẫn kèm theo quyết định số 371/BYT QĐ ngày 12/3/1996 về xác định độ an
toàn cho thuốc cổ truyền của Bộ Y tế
- General guidelines for methodologies on research and evaluational of traditional
medicine. World Health Organization 2000
- Principles and Methods of Toxicology A. Wallace Hayes, 1994.
II.2.8.3. Phơng pháp nghiên cứu độc tính bán trờng diễn
Mẫu thử: Liều thử: 2 viên/ kg/ ngày
14


Cắt viên nang mềm, ép ra hết chất dịch và thêm nớc, trộn đều để thu đợc hỗn
dịch có chứa lợng thuốc tơng đơng 2 viên/ 5ml. Khuấy trộn đều hỗn dịch mỗi khi lấy
cho thỏ uống.
Chuẩn bị mẫu thử hàng ngày trớc khi cho thỏ uống.
Bố trí thí nghiệm và tiến hành: Thí nghiệm đợc tiến hành trên 20 thỏ, chia làm hai
nhóm chứng và thử, mỗi nhóm 10 thỏ.
- Nhóm chứng: uống nớc cất 5,0 ml/ kg/ ngày
- Nhóm thử : uống 5 ml dịch mẫu thử đã chuẩn bị nh trên với liều 0,3 g/ kg/ ngày
Cho thỏ uống hàng ngày, liên tục trong một tháng.
Thỏ ở cả 2 nhóm đợc nuôi dỡng trong cùng điều kiện và cùng chế độ dinh dỡng.
Theo dõi và đánh giá: Theo dõi thỏ hàng ngày về mức độ tiêu thụ thức ăn, khả năng

hoạt động, tình trạng phân, lông.
Trớc khi thí nghiệm, xác định chỉ số bình thờng của thỏ về cân nặng, các dấu
hiệu toàn thân, các chỉ số về huyết học, hoá sinh chức năng gan, thận. Hết thời gian thí
nghiệm, đánh giá lại thỏ trên các chỉ tiêu nh trớc thí nghiệm. Mổ thỏ quan sát đại thể
các tổ chức gan, thận, phổi, tim về hình dạng, màu sắc, thể chất, tình trạng xung huyết...
So sánh kết quả trớc và sau thí nghiệm của nhóm chứng, nhóm thử, giữa nhóm
chứng và nhóm thử theo phơng pháp thống kê y sinh học.
II.2.8.4. Phơng pháp nghiên cứu tác dụng bồi bổ cơ thể trên lâm sàng
a. Chất liệu nghiên cứu:
Viên nang mềm Haliotis bào chế từ Bào ng đợc đóng gói 170 mg/ viên, do
khoa dợc - Viện YHCT Quân đội sản xuất.
b. Đối tợng nghiên cứu
Gồm 45 bệnh nhân (BN) tự nguyện 40 tuổi
+ Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân
- Bệnh nhân 40 tuổi, không phân biệt giới, nghề nghiệp.
- Bệnh nhân đợc chẩn đoán là suy nhợc cơ thể theo tiêu chuẩn chẩn đoán của CDC
năm 1994.
- Theo YHCT bệnh nhân thuộc chứng h lao thể can thận âm h: Đau đầu, hoa mắt,
chóng mặt, tai ù, mất ngủ, hay quên, thể trạng gầy; ngời mệt mỏi, hay cáu gắt, lòng
bàn tay chân nóng; ra mồ hôi trộm; đau lng; mỏi gối; nhức trong xơng.
- Bệnh nhân chấp nhận dùng thuốc, tham gia công trình nghiên cứu, thực hiện những
điều quy định trong quá trình nghiên cứu.
- Bệnh nhân điều trị nội trú tại khoa lão khoa và điều trị ngoại trú tại phòng khám bệnh
viện YHCT Quân đội.
+ Tiêu chuẩn loại trừ
- BN đang dùng thuốc khác hoặc suy thận, suy gan, suy tim, thiếu máu nặng, bệnh thần
kinh thực tổn
- BN không hợp tác nghiên cứu.
c. Phơng pháp nghiên cứu
- Phơng pháp nghiên cứu: Theo phơng pháp thử nghiệm lâm sàng so sánh trớc và

sau điều trị.
- Thiết kế nghiên cứu: 45 bệnh nhân đáp ứng tiêu chuẩn nghiên cứu. Thời gian nghiên
cứu 4 tuần.
- Phơng pháp dùng thuốc: dùng viên nang mềm bào ng 2 viên/lần x 2 - 3 lần/ngày x
30 ngày điều trị nội trú tại Khoa Lão khoa và điều trị ngoại trú tại phòng khám bệnh Viện YHCT Quân đội.

15


- Tất cả các bệnh nhân nghiên cứu đều đợc khám xét tỷ mỉ về nội khoa, làm bệnh án
đợc chẩn đoán theo YHCT và y học hiện đại, có phiếu theo dõi, thăm khám hàng ngày
để theo dõi kết quả và ghi tác dụng phụ không mong muốn của thuốc.
II.2.9. Phơng pháp nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng viên nang mềm hải
sâm HASAMIN
II.2.9.1. Phơng pháp xác định các thành phần dinh dỡng, hoocmon và khoáng
chất trong Viên nang hasamin
a. Nghiên cứu xác định hàm lợng hoạt chất sinh học hoocmôn steroit (testosteron,
progesteron, cortilson, oestradoen) trong các đối tợng nghiên cứu theo phơng pháp
miễn dịch Eliza trên máy Multiskan - Phần Lan với kit của hãng BiotechMỹ.
b. Nghiên cứu xác định hàm lợng các nguyên tố khoáng vi lợng cần thiết (Fe, Zn,
Mn, Se) trong viên Hasamin bằng phơng pháp phân tích huỳnh quang tia X trên máy
ký hiệu XRF SEA-2110 của Nhật.
c. Nghiên cứu xác định hàm lợng hoạt chất sinh học (protein, axit amin) của trong
viên Hasamin bằng máy axít amin tự động HP Amino Quant Series II của Nhật.
II.2.9.2. Phơng pháp thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trờng diễn
Độc tính cấp và độc tính bán trờng diễn của viên nang mềm hải sâm Hasamin
đợc nghiên cứu tại Viện Y học Cổ truyền Quân đội theo các phơng pháp đã đợc trình
bày ở mục II.2.7.2 và II.2.7.3.
II.2.9.3. Phơng pháp thử nghiệm tác dụng của viên Hasamin trên động vật
Đối tợng:

Thí nghiệm tiến hành đối với 10 thỏ đực thuộc giống Newzealand, nuôi tại Trung
tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây. Thỏ giống có trọng lợng 3,0 - 5,0 kg, tuổi 12 - 26
tháng, khoẻ mạnh, giao phối thuần thục, nuôi ở những chuồng riêng biệt, chế độ nuôi dỡng bao gồm thức ăn tinh hỗn hợp 16% protein 80g/ngày và 600g thức ăn xanh.
Phơng pháp:
Lấy tinh thỏ bằng âm đạo giả, nhiệt độ âm đạo giả 45oC, lấy tinh vào buổi sáng.
Thể tích tinh dịch (V), hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng (A), nồng độ tinh trùng (C), sức
kháng (R) đối với dung dịch NaCl 1% của tinh trùng xác định theo phơng pháp của
Milovanov (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng của một lần lấy tinh (V.A.C) xác định
theo phơng pháp của Herrick và Self (1962), tỷ lệ tinh trùng sống (LS) theo phơng
pháp nhuộm màu phân biệt với eosin 5% của Morozov (1938), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình
(K) theo phơng pháp nhuộm màu với fuxine của Serdiuc (1970), pH tinh dịch đo bằng
giấy đo pH của Trung Quốc.
Mô hình thí nghiệm:
Lô 1: 05 con (số tai:4182; 813; 853; 833; 91531), thỏ ăn theo khẩu phần cơ sở +
HASAMIN.
Lô 2: 05 con (số tai:94514; 11558; 1471; 1000; 836), thỏ ăn theo khẩu phần cơ sở
+ viên Placebo (Viên trắng)
Thời điểm đánh giá phẩm chất tinh dịch:
Trớc khi cho ăn viên HASAMIN, Placebo.
Sau 10 ngày bổ sung viên HASAMIN, Placebo.
Sau 20 ngày bổ sung viên HASAMIN, Placebo.
Liều lợng và cách cho ăn: Liều luợng bổ sung: 01 viên/con/ngày. Cách bổ sung
viên thuốc: trộn đều thuốc với một ít thức ăn tinh, cho thỏ ăn hết, sau mới cho ăn thức ăn
cơ sở.
16


Phần II. kết quả nghiên cứu
A. Kết quả Thu thập mẫu sinh vật biển và sàng lọc
hoạt tính sinh học

Chơng I. Thu thập, định loại mẫu sinh vật biển và xây dựng
cơ sở dữ liệu
I.1. tình hình nghiên cứu nhóm Hải miên, Da gai, San hô mềm
Phần này trình bày một cách vắn tắt các nghiên cứu thu thập, định loài, và phân bố
của các loài sinh vật biển thuộc ba nhóm hải miên, da gai và san hô mềm.
I.2. Địa điểm và thời gian thu mẫu
Đề tài đã tổ chức 9 chuyến thu mẫu (Cát bà tháng 11/2006; Cn C thỏng
11/2006; Trng Sa thỏng 3-4/2007; Cụn o thỏng 6/2007; Vnh H Long thỏng
7/2007 ; Cỏt B thỏng 8/2007; Cn C t 6 n 10/6/2008; Cỏt B t 27/ 6 n
5/7/2008; Vnh H Long t 9/9 n 16/9/2008). Tổng số mẫu thu đợc trong đề tài này
là 101 mẫu sinh vật Biển. Cụ thể bản đồ các đợt thu mẫu đợc trình bày trên hình dới
đây:

Vịnh Hạ
Long
Cát Bà

Côn
Cổ

Trờng
Sa
Côn đảo

Các địa điểm thu mẫu năm 2006 - 2008.
17


I.3. Một số nét cơ bản về đặc điểm môi trờng ở các địa
điểm nghiên cứu

Mục này trình bày một số nét cơ bản về đặc điểm môi trờng tại các địa điểm lấy
mẫu: Cát Bà, Côn Đảo và Trờng Sa.
I.4.Kết quả thu thập mẫu
Trong ba năm 2006-2008, qua 9 đợt thu mẫu đề tài đã tiến hành thu thập đợc 101
mẫu sinh vật Biển có khả năng chứa dợc liệu tại các địa điểm nh sau:
I.4.1. Thu thp mu t 1 ti Cỏt B thỏng 11/2006
- Thi gian thu mu: t ngy 5 n 15/11 nm 2006
- Cỏc im ó thu: Cỏt Da, Vn Bi, Ba Trỏi o, ...
- S mu thu: 6 mu.
I.4.2. Thu mu t 2, Cn C thỏng 11/2006
- Thi gian thu mu: t ngy 5 - 20/11/2006
- Cỏc im ó thu: o Cn C - Qung Tr
- S mu thu: 9 mu
I.4.3. Thu mu t 3 Trng Sa thỏng 3-4/2007
- Thi gian thu mu: t 20 thỏng 3 n 20 thỏng 4/2007
- Cỏc im ó thu: Trng Sa Ln, Nam Yt, Tc Tan
- S mu thu: 6 mu
I.4.4. Thu mu t 4 ti Cụn o thỏng 6/2007
- Thi gian thu mu: t 20 thỏng 5 n 10 thỏng 6/2007
- Cỏc im ó thu: Hũn Tre, Hũn By Cnh, Hũn Trc, Vnh Cụn Sn.
- S mu thu: 17 mu
I.4.5. Thu mu t 5 ti Vnh H Long thỏng 7/2007
- Thi gian thu mu: T ngy 3 - 15 thỏng 7/2007
- Cỏc im ó thu: u Bờ, Hang Trai, Hang Dự (Ang Dự), Cng
- S mu thu: 16 mu
I.4.6. Thu mu t 6 ti Cỏt B thỏng 8/2007
- Thi gian thu mu: T ngy 1 - 10 thỏng 8/2007
- Cỏc im ó thu: Cỏt Da, Vn Bi, Ba Trỏi o, ...
- S mu thu: 17 mu
I.4.7. Thu mu t 7 ti Cn C t 6 n 10/6/2008

- Thi gian thu mu: T ngy 6 - 10 thỏng 6/2008
- Cỏc im ó thu: Bc Cn C
- S mu thu: 9 mu
I.4.8. Thu mu t 8 ti Cỏt B t 27/ 6 n 5/7/2008
- Thi gian thu mu: T ngy 27/6 5/7/2008
- Cỏc im ó thu: Vn Bi, Ba Trỏi o, Hang Trai, u Bờ,..
- S mu thu: 7 mu
I.4.9. Thu mu t 9 ti Vnh H Long t 9/9 n 16/9/2008
- Thi gian thu mu: T ngy 9/9 16/9/2008
- Cỏc im ó thu: Vn H, ng Dự, Cng , Bự Xỏm, Cc 8, Cc 6
- S mu thu: 14 mu
Trong số 101 mẫu thu đợc có 41 mẫu hải miên, chiếm 40,6 % tổng số mẫu thu
đợc, 31 mẫu san hô mềm (30,7 %) và 29 mẫu da gai (28,7 %). Trong số đó:
Hải Miên
+ Số lợng: 41 mẫu
18


+ Ví dụ về sự phân bố các mẫu hải miên tại các điểm thu mẫu:
- Các kết quả phân tích của chúng tôi đã xác định đợc 6 mẫu tại khu vực đông
nam đảo Cát Bà (Gellius varius, Dysidea cinerea, Haliclona sp, Mycale plumosa,
Ircinia echinata, Amorphinopsis excavans)
- 4 mẫu cũng đã tìm thấy ở đảo Trờng Sa (Petrosia nigricans, Janthella sp,
Xestospongia testudinaria, Ircinia sp)
- 7 mẫu Hải miên tại vùng biển Côn Đảo (Clathria vulpina, Petrosia nigricans,
Xestospongia testudinaria, Niphates sp, Spongia sp, Stylissa flabelliformis, Gellius var
fibrosa)
- Tại Vịnh Hạ Long cũng đã thu đợc 7 mẫu (Haliclona subarmigera, Dysidea
cinerea, Ircinia echinata, Biemna cf. nudelringna, Xestospongea testudinaria, Gelliodes
fibulata, Aka mucosa)

San hô mềm
+ Số lợng: 31 mẫu
+ Ví dụ về sự phân bố các mẫu san hô mềm tại các điểm thu mẫu:
- Tại Cồn Cỏ đã tìm thấy 7 mẫu: Cladiella sp, Sarcophyton trocheliophorum,
Lobophytum crassum, Lobophytum sp, Lobophytum compactum, Sinularia abrupta,
Klyxum sp
- Tại đảo Nam Yết thuộc Trờng Sa đã thu đợc 1 mẫu san hô Lobophytum
compactum
- Tại Côn Đảo đã thu đợc 5 mẫu: Sarcophyton elegans, Sarcophyton mililatensis,
Lobophytum compactum, Sinularia sp, Dendronephthya klunzeringi
- Tại Hạ Long mới chỉ thu đợc 3 mẫu nằm trong hai giống Sarcophyton và giống
Cladiella
- Tại Cát bà thu đợc 3 mẫu thuộc hai giống Sarcophyton và giống Cladiella.
Da Gai
+ Số lợng: 29 mẫu
+ Ví dụ về sự phân bố các mẫu da gai tại các điểm thu mẫu:
- Tại Côn Đảo: đã thu đợc 3 mẫu gồm: Hải sâm đen (Holothuria atra), đuôi rắn
(Macrophiothrix sp), cầu gai hình trứng (Echinocardium cordatum)
- Vịnh Hạ Long: Số lợng mẫu thu đợc nhiều hơn khu vực Côn Đảo, tổng số 5
mẫu gồm: Sao biển 5 cánh màu tím rêu (Asterope carinifera), sao biển cánh ngắn
(Anthenea pentagonala), sao biển 5 cánh màu tím đỏ (Asterope carinifera), sao biển 5
cánh màu hồng (Protoreaster nodusus), cà gim gai dài (Diadema setosum)
- Vùng biển Cát Bà : Trong đợt thu mẫu tháng 8/2007 đã thu đợc 6 mẫu Chúng
bao gồm hải sâm gai (Holothuria spinifera), sao biển rãnh nông (Astropecten
polyacanthus), da chuột biển màu hồng không gai (Thyone bicornis), da chuột biển
màu hồng có gai (Stichopus sp), sao biển 5 cánh màu tím rêu (Asterope sp) và sao biển
cánh ngắn.
Kết quả: thời gian, địa điểm thu thập mẫu và giám định tên khoa học đợc trình
bày chi tiết dới dạng bảng trong báo cáo chính.
1.5. Mô tả các loài sinh vật biển điển hình có khả năng chứa

dợc liệu
Mục này đa ra một số đặc điểm nhận dạng của một số đối tợng sinh vật biển
điển hình thuộc các nhóm san hô mềm, da gai và hải miên. Do khuôn khổ của báo cáo
có hạn, chúng tôi chỉ trình bày dới đây ảnh mẫu lu và mô tả của một số loài sinh vật
biển điển hình:
19


I.5.1. Các loài san hô mềm
1. Loài Lobophytum compactum, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn có dạng phủ
dày, trên polyparium có các thuỳ
mọc gần nhau, dài 3-5cm hầu nh
không phân nhánh. Polyp có ở bề
mặt trên của tập đoàn và trên các
thuỳ
Màu sắc: có màu nâu nhạt, xanh
nâu, phớt hồng

2. Loài Lobophytum crassum, thuộc họ Alcyoniidae
Đặc điểm: Tập đoàn có thân ngắn
và to hoặc dạng phủ. Polyparium
phân nhánh thành các thuỳ hoặc
dạng mào, rất hiếm khi có dạng
phẳng. Polyp lỡng hình. Gai
xơng trên bề mặt có dạng dùi cui,
gai xơng trong dạng hình con suốt
Màu sắc: có màu vàng sáng, nâu
hoặc xanh lục.

3. Loài Sarcophyton elegans, thuộc họ Alcyoniidae
Đặc điểm: Tập đoàn có một thân
lớn, phía trên dạng đĩa mang polyp
gọi là polyparium. ở giữa
polyparium có dạng lòng chảo,
phía ngoài gợn sóng hoặc gấp khúc.
ở môi trờng sóng mạnh thân ngắn
và mập, ở môi trờng yên tĩnh thân
dài và mảnh hơn
Màu sắc: có màu nâu sẫm, vàng
nâu hoặc xanh nâu

20


4. Loài Sarcophyton mililatensis, thuộc họ Alcyoniidae
Đặc điểm: Tập đoàn có thân lớn,
polyparium có dạng lòng chảo, phía
ngoài gơn sóng hoặc gấp khúc. Bề mặt
tập đoàn nhẵm, polyp nhỏ. ở môi trờng
sóng mạnh thân ngắn và mập, ở môi
trờng đợc bảo vệ thân dài và mảnh hơn
Màu sắc: có màu vàng xanh, nâu hoặc
nâu vàng
5. Loài Sarcophyton trocheliophorum, thuộc họ Alcyoniidae
Đặc điểm: Tập đoàn có dạng nấm, thân
lớn. Bề mặt polyparium thờng gấp khúc.
Polyp lỡng hình. Gai xơng trong có hình
dạng con suốt với các mấu lồi, gai xơng

ngoài hình dùi cui
Màu sắc: có màu vàng, nâu nhạt hoặc
xanh nhạt
6. Loài Sinularia abrupta, thuộc họ Alcyoniidae
Đặc điểm: Tập đoàn dạng phủ hoặc có
thân phân biệt. Polyparium nhẵn, phân
thuỳ dạng ngón hoặc dạng mào. Polyp đơn
hình. Gai xơng trong có dạng con suốt lớn
có mấu nhỏ, chiều dài lớn hơn 2mm. Gai
xơng ngoài dạng dùi cui hoặc con suốt
nhỏ.
Màu sắc: hơi trắng, vàng nhạt, nâu sáng
I.5.2. Các loài hải miên
1. Loài Gellius varius, thuộc họ Chalinidae

Mô tả: dạng cành, màu xanh lục đậm khi
còn sống, khi chết hoặc khi cố định bằng
hoá chất thì chuyển màu xanh đen,
chúng tạo thành khóm sống trên các khối
san hô hoặc bám trên nền đáy cứng

21


2. Loài Dysidea cinerea, thuộc họ Dysideidae

Mô tả: mọc thành dạng khối trên rạn san
hô, màu sắc thany đổi rất nhiều phụ
thuộc vào môi trờng sống, từ màu nâu
nhạt cho tới màu xám hoặc, mềm và dai,

thờng lẫn cả cát hoặc sạn bên trong cơ
thể.

3. Loài Haliclona sp, thuộc họ Chalinidae

Mô tả: thờng có dạng cành, cấu trúc
thay đổi tuỳ loài có thể mềm hoặc hơi
cứng, màu sắc thay đổi rất nhiều, từ màu
xám nhạt, hồng, tím hoặc xanh đậm, với
lỗ mở trên bề mặt tơng đối lớn

4. Loài Mycale plumosa, thuộc họ Mycalidae

Mô tả: có dạng cành đắc trng và
thờng nối với nhau, màu sắc từ đỏ đậm
cho tới màu tím nhạt, thờng bị mất màu
rất nhanh sau khi lấy ra khỏi môi trờng
sống, cấu trúc tơng đối mềm

22


5. Loài Ircinia echinata, thuộc họ Irciniidae

Mô tả: thờng sống dạng khối có xẻ
thuỳ, bề mặt đợc bao phủ bởi các mấu
nhỏ, thờng có màu nâu đen cho tới màu
đen, cơ thể dẻo và đàn hồi giống nh cao
su

6. Loài Amorphinopsis excavans, thuộc họ Halichondriidae

Mô tả: đây là loài đục lỗ vào trong các
khối san hô hoặc nền đáy và chiếm cứ
gần hết không gian bên trong, màu sắc
thay đổi từ vàng cho tới vàng đậm, có lỗ
mở trên bề mặt khá lớn. Khi để khô
thờng chuyển màu trắng ngà

7. Loài Clathria vulpina, thuộc họ Microcionidae

Mô tả: cơ thể dạng cành, có màu vàng
cam, bề mặt xù xì đợc tạo nên bởi nhiều
núm gai nhỏ

23