Tiểu luận môn hóa sinh thực phẩm phương pháp thu nhận tách chiết xác định hoạt hóa và ứng dụng enzyme amylase trong ngành công nghệ thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN, TÁCH CHIẾT, XÁC ĐỊNH HOẠT HÓA
VẢ ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE TRONG NGÀNH CÔNG
NGHỆ THỰC PHẨM

NHÓM SINH VIÊN THỰC HIỆN: NHÓM 1
1. NGUYỄN THANH DIỆU

14085431

2. TRẦN NGỌC DUYÊN

14071141

3. TRẦN VĂN HOAN

14027061

4. LÊ THỊ BẢO NGÂN

14087681

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : NGUYỄN THỊ TRANG
MÃ HP: 210543202

Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase

Page 1


LỜI CẢM ƠN
Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể Quý thầy cô Viện Công
nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Thành Phố Hồ Chí
Minh và thư viện trường đã tạo điều kiện, giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập
và nghiên cứu.

Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Trang, người đã
nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp những thắc mắc cho chúng em trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành bài tiểu luận này.

Tập thể nhóm 1

Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase

Page 2


MỤC LỤC
1. GIỚI THIỆU, TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE:
1.1. ENZYME:
1.2. ENZYME AMYLASE:
1.2.1. Khái niệm:
1.2.2. Đặc tính:
1.3. LỊCH SỬ ENZYME AMYLASE:
2. PHÂN LOẠI:
2.1. ENDOAMYLASE (Nội bào):
2.1.1. α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)

2.1.2. Nhóm Enzyme khử nhánh
2.2. EXOAMYLASE( Ngoại bào):
2.2.1. β-Amylase (EC 3.2.1.2):
2.2.2. γ-Amylase (EC 3.2.1.3):
3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE:
3.1. Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật:
3.1.1. Malt đại mạch
3.1.2. Lúa
3.2. Thu nhận enzym từ nguồn động vật:
3.2.1 Thu nhận enzyme amylase từ tuyến tụy gà:
3.3. Thu nhận enzym từ nguồn vi sinh vật:
3.3.1. Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
3.3.2. Sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae:
3.3.3 Sản xuất amylase từ Bacillus subtilis:
4. TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ ENZYME AMYLASE:
Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase

Page 3


4.1. Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký
4.2. Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE)
5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE:
5.1. Đơn vị đo hoạt độ:
5.2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva:
5.3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase)
5.3.1. Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
5.3.2. Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase:
5.4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao

5.4.1. Chủng giống vi sinh vật:
5.4.2. Môi trường dinh dưỡng:
5.4.3. Điều kiện nuôi cấy
6. ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE:
6.1. Ứng dụng Enzyme amylase trong y học và dược phẩm :
6.2. Ứng dụng Enzyme amylase trong công nghiệp :
6.2.1. Ứng dụng trong công nghiệp dệt
6.2.2. Ứng dụng trong công nghiệp tẩy trắng giấy
6.2.3. Ứng dụng trong sản xuất cồn
6.3. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm:
6.3.1.Ứng dụng Enzyme amylase trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa
đường
6.3.2. Ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất bánh mì
6.3.3. Ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất bánh kẹo
6.3.4. Ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất bột ngọt
6.3.5. Ứng dụng enzyme trong công nghệ sản xuất bia
TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase

Page 4


Thu nhận, tách chiết, xác định hoạt hóa Enzyme Amylase

Page 5


1. GIỚI THIỆU, TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE:
1.1. ENZYME:

Enzyme hay còn gọi là men là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là
protein, không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó
còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ
thuật phân tích, trong công nghệ gen và trong bảo vệ môi trường.
Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, với một hiệu suất rất
cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH. Sở dĩ như vậy vì nó có sự
hiện diện của chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzym.
Như vậy, enzym là các protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các phản ứng
này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzym sẽ biến đổi chúng
thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym có
tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó.
1.2. ENZYME AMYLASE:
1.2.1. Khái niệm:
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm
polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH

RH + R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose,…


1.2.2. Đặc tính:
- Thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose,mantose và dextrin hạn
chế.
- Enzyme Amylase có trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật,
trong hạt nảy mầm,nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn.
- Dễ tan trong nước, dung dịch muối và rượu loãng.
1.3. LỊCH SỬ ENZYME AMYLASE:

1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng
chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C.
1833: Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả
năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp,
diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme
phân giải tinh bột được gọi là Amylase.
1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành
đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và
động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm
nghiên cứu.
1862: Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ
chọn lọc.
1949: Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000.
1950: Englard và Singer cho biết số chu chuyển của b-Amylase là 250000.
1952: người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme
α-Amylase.
1971: Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã
xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canh
trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và
transglucosilase.
2. PHÂN LOẠI:
Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm:
•
•

Endoamylase ( Enzyme nội bào )
Exoamylase ( Enzyme ngoại bào )


2.1. ENDOAMYLASE (Nội bào):

Gồm có
- α-Amylase (EC 3.2.1.1)
+ Nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm này được chia thành hai loại:
•
•

Khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41);
Khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và
amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên
trong của chuỗi polysaccharide.


2.1.1. α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)

Amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4-glucoside của cơ chất một cách
ngẫu nhiên. α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng
phân hủy các hạt tinh bột còn nguyên vẹn.
2.1.1.1. Cấu tạo Enzyme α-Amylase:
Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn
Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ
các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là takaAmylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể
không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid
amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme αAmylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.


2.1.1.2. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột

dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin

tetra và trimaltose

di & monosaccharide

Amylase

oligosacharide

poliglucose

Maltose

maltotriose

maltotetrose

2.1.1.3. Đặc tính α-Amylase:
α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại
α-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu
tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm
khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:
•
•

α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.

Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;

•
•

Fisher, Stein, 1960 ).
Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.


2.1.2. Nhóm Enzyme khử nhánh
2.1.2.1. Khử trực tiếp:
α-dextrin 6-glucanohydrolase (EC 3.2.1.41)
Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và
các dextrin tới hạn. Điều đáng chú ý là sự định
vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến
tác động của Enzyme. Đặc biệt là sự có mặt
của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết
α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân
cắt liên kết này
Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6
glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết
α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những
dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc
maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase và
pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn.

2.1.2.2. Khử gián tiếp:
Oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20)
Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân

maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là
một Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các
glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu.
Amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10)
Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose
và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở VSV nhưng
đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ). Ngoài oligo–1,6–
glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–
glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay
dextrin-6-glucocanhydrolase. Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn αAmylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn .


2.2. EXOAMYLASE( Ngoại bào):
Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi
polysaccharide. Nhóm này gồm có:
•
•

β-Amylase (EC 3.2.1.2)
Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)

2.2.1. β-Amylase (EC 3.2.1.2):
2.2.1.1 Cấu tạo β-Amylase:
β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các hạt
ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh
bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của
mạch . Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β.
Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải

của tinh

bột trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở lúa, βAmylase được tổng hợp trong suốt quá trình của
hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô. Ở
lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được

tích lũy

trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng

liên kết,

Enzyme này là một phân tử có trọng lượng phân tử là

64.000 Da và

khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng
phân tử là 59.000 Da
2.2.1.2. Cơ chế tác dụng β-Amylase:
β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu từ
đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất . β-Amylase phân cắt các liên kết α1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside
thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất
nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin.
Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột :
β-Amylase
Tinh bột

maltose (54-58%) + β-dextrin(42-46%)


(glucogen)

Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ
phân tới 95%.
2.2.1.3. Đặc tính β-Amylase:
β-Amylase là một albumin , tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH và
vòng imidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme )
β-Amylase không bền khi có Ca2+, β-Amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea,
iodineoacetamide, iodine, ozon…
β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid.

β-Amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C. Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C , pH 5,1 – 5,5.
Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm caboxyl thể
hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron. Sự nghịch đảo
hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị
trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động. Sau
đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải
phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme.
2.2.2. γ-Amylase (EC 3.2.1.3):
2.2.2.1. Cấu tạo γ-Amylase:
Gluco amylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-glucoside, ngoài ra còn
có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3-glucoside.
Gluco amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột,glucogen, amylopectin,
dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác.

γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4là những Enzyme có thể thuỷ phân được cả hai

glucan-glucohydrolase )
kiểu liên kết của các

mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β. Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được
tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus.
Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao
động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme


Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một
nửa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt
động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc
đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid
glucose mannose, galactose và glucosamin
Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở
khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I
tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có
cả hai tinh chất này .
2.2.2.2.Cơ chế hoạt động γ-Amylase:
Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại
nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân
được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng
phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân ,
cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là với các α-glucan mạch
dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các
oligosaccharit.

2.2.2.3.Tính chất γ-Amylase:
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi
thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt
từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose.
Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4 ; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase;
glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase…

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ
phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside .
Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin ,
dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả
các loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh


hơn so với các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh như amylopectin,
glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C
. Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được
bảo vệ bởi Ca2+.
3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE:
Có 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận enzym: các mô và cơ quan
động vật, các mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
3.1. Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật:
Người ta đã biết cách chiết xuất enzyme amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng trong
ngành công nghiệp chế biên thực phẩm. Vd như kẹo mạch nha, bia..khi đó, hạt ngũ cốc
được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp và khi đó ta thu
được malt.
3.1.1. Malt đại mạch
Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà chủ yếu là
α-amylase và β-amylase, quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa
enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp thêm
hàng loạt các enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của
hạt, tạo độ thông thoáng bằng cách đảo trộn. hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt
lực của enzyme α-amylase, khi hạt trải qua 3-4 ngày trong giai đoạn nảy mầm thì hoạt lực
đạt tới mức cực đại vào ngày thứ 7. Sau đó giảm xuống
3.1.2. Lúa
Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình nảy

mầm, hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và
quá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ
phản ứng.
Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở dạng liên kết. khi hạt nảy mầm, chúng lại
chuyển sang hoạt động.


3.2. Thu nhận enzym từ nguồn động vật:
Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật.
3.2.1 Thu nhận enzyme amylase từ tuyến tụy gà:
Tụy gà là một cơ quan tham gia nhiều vào quá trình tiêu hóa và là nguồn phụ phẩm
có thể tận dụng để ly trích enzyme. Ở Việt Nam, các loại enzyme amylase và protease đã
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Hiện nay, enzyme vẫn phải được nhập từ
nước ngoài với giá thành tương đối cao. Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích tìm
ra phương pháp hiệu quả để ly trích enzyme amylase từ tụy gà.
Kết quả cho thấy phương pháp ly trích enzyme bằng dung dịch đệm phosphate có
pH 7 rồi kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 60% bão hòa, sau đó đem đi thẩm tích và đông
khô chân không đã cho hiệu quả ly trích enzyme tốt nhất.
Amylase được trích từ tụy gà hoạt động tốt ởnhiệt độ 50oC với pH 7,5. Việc thêm
NaCl 0,1% và CaCl2 0,05% đều làm tăng hoạt tính của amylase.
Protease được trích từ tụy gà hoạt động tốt ở nhiệt độ 50oC với pH 7,6. Việc thêm
cysteine 0,01% và CaCl2 0,1 ppm đã làm tăng hoạt tính protease. Phân tích điện di SDSPAGE cho thấy sự hiện diện của enzyme amylase, trypsin và chymotrypsin trong mẫu
protein trích được. Sản phẩm sau khi bảo quản 90 ngày ở 20oC vẫn duy trì hoạt tính xúc
tác.
Qua các nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiếtxuất các chế
phẩm enzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu nàykhông thể dùng để sản xuất
các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm sau đây:
•
•
•

Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài
Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được.
Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng
làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm
thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân.
Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm

enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với
nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn
và hạn chế ở trên. Cơ bản là do các lí do sau:
•
•

Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn
khác.


•
•
•
•

Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú.
Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền.
Tốc độ sinh sản rất nhanh.
Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp

3.3. Thu nhận enzym từ nguồn vi sinh vật:
Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vsv trở thành nguồn thu enzyme amylase chủ

đạo. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự
nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,giả nấm men và vi
khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus.
Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase.
Nhiều vi khuản có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa,
Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng
nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vsv khác.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có
một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng
nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác.
3.3.1. Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
•
•
•
•
•

Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính
enzyme).
Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm.

3.3.2. Sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae:
Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae .Trong đất có nhiều loài vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp
cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ

đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này
là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được bảo đảm chắc
chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý
nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm.


Quá trình lấy mẫu : có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát
đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rửa sạch
cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nylon và mang về phòng thí
nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
•
•

Nghiền mẫu đối với mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hay mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô

trùng sau đó đảo mẫu.
• Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyền sang 1 ống nghiệm khác có
chứa 90ml nước cất vô trùng.
• Tiếp tục pha loãng ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.
• Hút 0.1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc
phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar )
• Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ
phòng trong vòng 3 ngày.
• Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện
những quầng sánh xung quanh khuẩn lạc.
• Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường nước khi cấy. Có tác
dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.
• Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng

với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong
•
•
•
•

máy làm đông.
Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (quy mô nhỏ ).
Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi
trường sinh trưởng của nấm.

KH2PO4

1,4 mg

NH4NO3

10mg

KCl

0,5 mg

MnSO4.7H2O

0,1 mg

FeSO4.7H2O

0,01 mg

Hồ tinh bột

20 g

pH

6,5


Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi
Autoclave ở 73 – 121oC trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem
ủ ở 25 – 30oC trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng / phút. Sau khi nhân giống thành
công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ. Để có hiệu quả cao cho nấm
mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.
3.3.3 Sản xuất amylase từ Bacillus subtilis:
-Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ đất vườn qua trung gian cỏ khô.
Lấy một ít đất vườn (10g) cho vào bình tam giác và thêm 90ml nước cất vô trùng
lắc đều để tạo huyền phù, gia nhiệt tới 85oC trong 20-25 phút. Cắt nhỏ một ít cỏ khô, rắc
xung quanh cỏ ít bột CaCO3 rồi cho vào bình tam giác trên sao cho nước vừa ngập cỏ, để
từ 1-2 ngày ở nhiệt độ phòng. Đổ 10ml môi trường phân lập vào đĩa petri vô trùng, để
nguội và cấy một lần que cấy vòng từ màng vi sinh vật mọc trên mặt lớp cỏ khô lên bề
mặt môi trường đặc, dùng que gạt gạt đều, sau đó gói đĩa petri và cho vào tủ ấm 25-35oC.
Sau 2-3 ngày thấy xuất hiện các khuẩn lạc riêng biệt trên mặt môi trường thạch.
-Phương pháp giữ giống cấy truyền:
Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm. Tiếp theo,
dùng que cấy vô trùng lấy dịch vi khuẩn phân lập đã được pha loãng bằng nước cất vô
trùng, và cấy zic zăc trên bề mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại đặt vào tủ ấm 34 oC,

sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 4oC để giữ giống.
Giống được cấy truyền hàng tháng và hoạt hóa trước khi nhân giống.
-Phương pháp thu dịch chiết -amylase thô từ môi trường nuôi cấy:
Sau khi thu nhận được dịch nuôi cấy vi khuẩn, đem ly tâm 5000 vòng/phút trong
15 phút để loại bỏ sinh khối, thu nhận phần dịch bên trên, dung dịch này được sử dụng
như dịch enzym -amylase thô và được bảo quản ở 4oC.
-Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym (CPE) -amylase từ dịch chiết enzym thô
bằng các tác nhân tủa:
Các tác nhân tạo tủa enzym thường được sử dụng là các dung môi hữu cơ: etanol
96o, aceton, muối trung tính (NH4)2SO4 để thu nhận chế phẩm enzym từ dịch chiết thô. Từ
đó so sánh và chọn tác nhân gây tủa thích hợp.
Yêu cầu đối với giống vi sinh vật


Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản
xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần
phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
•

Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số lượng
và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để
chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình
trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do
đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản
xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số

lượng và chất lượng.
• Giống phải cho năng suất sinh học cao.
• Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản
xuất công nghiệp.

• Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa
•

phương nơi nhà máy đang hoạt động.
Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần khiết,

có tốc độ sinh sản nhanh.
• Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách sản
phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
• Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.Để tạo thuận lợi nhất về
chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân
lập giống VSV thuần khiết. Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao
cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động
mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi
trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp
Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truy ền của VSV mà còn
phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học
(thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có
một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase.Trong các yếu tố ảnh
hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành
phần môi trường, tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ
thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản quan trọng
nhất.


4. TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ ENZYME AMYLASE:
Enzyme amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt
thóc và ngô. Có hai phương pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp điện di trên
gel polyacrylamide
4.1. Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký

Hạt lúc được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được
đồng hóa trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl
50mM (pH 8,5) (dung dịch đệm A). Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon
và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên
được xem như dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4) 2SO4 (2560%). Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc
độ 15.000 vòng trong 20 phút.
Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A
thì sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A;
enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0-0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được lôi
cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn
amylase.Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose.
Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2. Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide
(polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE)
Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay
nhuyễn với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích).
Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 1 phút ở nhiệt độ
40C . Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch
enzyme.
Gel được chuẩn bị sẵn sang và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V.
Sau khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để
xác định sự hiện diện của amylase.


5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE:
5.1. Đơn vị đo hoạt độ:
Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thông tin quan trọng về lượng Enzyme trong
đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ
với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng. Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được
biểu diễn bằng đơn vị Enzyme. Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme có khả

năng xúc tác chuyển hóa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
Trong những điều kiện xác định ( bão hòa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme
xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng
Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm
Enzyme.
Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên
kết bị phân giải ) được chuyển hóa bởi 1 phân tử Enzyme sau 1 phút.
Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các
liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút.
Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc
lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn.
Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản
ứng ta có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme. Có 3 nhóm phương pháp:
•

Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian

•

nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản

phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định.
• Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến
thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
* Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme có rất nhiều. Ở mỗi nước và mỗi phòng thí
nghiệm có thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và
thói quen. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo
phương pháp thống nhất.

5.2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế
phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo
thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang
điện sẽ tính được hoạt độ Enzyme
Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành
các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH cho Amylase
của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …)

5.3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase)
5.3.1. Phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong
chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan
pH= 4,7 ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ giải phóng được 1 mg glucose.
5.3.2. Phương pháp sử dụng Enzyme glucosidase:
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme glucoamylase có trong
dịch chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành qua phản ứng xúc tác đặc
hiệu của Enzyme glucosidase sẽ xác định được hoạt độ Enzyme.
Đơn vị hoạt độ glucoamylase là lượng Enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan
pH = 4,7 ở nhiệt độ 300C trong thời gian 1 phút giải phóng được 1 μmol glucose.
5.4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận chế phẩm Amylase có hoạt lực cao
5.4.1. Chủng giống vi sinh vật:
Muốn nhận chế phẩm Amylase có hoạt độ cao, trước hết phải tuyển chọn, nghiên
cứu xem chủng, giống nào có khả năng tích tụ nhiều Amylase.
Khi đã tuyển chọn được giống tốt tức là đã có được điều kiện cần thiết để tạo ra
chế phẩm Amylase có hoạt độ cao. Nhưng giống tốt chỉ có tính chất tương đối với thời
gian và điều kiện nhất định nào đó. Loài người luôn tìm cách phân lập và tạo ra các giống
mới có hoạt lực ngày càng cao hơn bằng nhiều biện pháp khác nhau như lai tạo, gây đột

biến, tách và cấy gen.


Bằng con đường kết hợp giữa etylenimin và tia tử ngoại Ghendina đã tạo được
chủng Asp.awamori 78 - 2 và Asp.awamori 22 có hoạt lực Amylase cao hơn 2 - 3 lần so
với ban đầu.
5.4.2. Môi trường dinh dưỡng:
Trong sản xuất chế phẩm Amylase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt trên canh
trường rắn người ta hay dùng nhất là cám lúa mì. Đây là môi trường tự nhiên tốt nhất để
sinh tổng hợp Amylase.
Cám lúa mì thường chứa khoảng 20 - 30% tinh bột, 10 - 12% protit. Ngoài ra còn
chứa muối khoáng, các nguyên tố vi lượng, vitamin...
Để tiết kiệm cám người ta còn trộn thêm các nguyên liệu khác vào môi trường như
trấu, mùn cưa, bã khoai tây, bã bia...
Ở nước ta do không có cám lúa mì nên trong sản xuất người ta hay dùng nhất là
bột ngô vàng, cám gạo và trấu đem trộn lẫn với nhau.
Thành phần tối ưu để thu được chế phẩm Amylase có hoạt độ cao từ Asp.awamori
là cám 75% ( hàm lượng tinh bột 29% ) bột ngô 6% ( hàm lượng tinh bột 55% ) và 19%
trấu. Hàm lượng tinh bột chung là 25%. Điều kiện tối ưu khi nuôi cấy là: to 32OC, độ ẩm
57% và nuôi trong 42 giờ.
Ngoài tinh bột, môi trường cần chứa maltose và dextrin. Sự có mặt của glucose,
fructose và saccarose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc nhưng lại hạn chế
sự tích tụ Amylase. Ngược lại khi thêm lactose và MgO vào môi trường lỏng thì nấm
mốc phát triển kém nhưng lại tạo nhiều Amylase.
Ngoài gluxit, để tổng hợp Enzyme, vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng đều
cần đến chất chứa nitơ. Nguồn nitơ có thể có sẵn trong cám, bột ngô, khi cần thiết có thể
bổ sung thêm từ khô lạc, khô đậu tương hoặc từ các muối amin hoặc ure. Theo kết quả
nghiên cứu của giáo sư Phenicxôva, nấm mốc Asp.awamori có thể phát triển tốt trong
môi trường chứa 0,05% đạm vô cơ nhưng để tạo α-Amylose thì cần tăng nồng độ tới
0,15%; để tạo glucoamylase cần tăng tới 0,4%. Nhiều nguồn đạm hữu cơ cũng có tác

dụng tốt đến sinh trưởng và phát triển của nấm mốc nhưng ít có hiệu quả về phương diện
tích tụ Enzyme. Ví dụ khi bổ sung gelatin casein và ngay cả cao ngô vào canh trường thì
việc tích tụ Enzyme vẫn thua kém so với nguồn đạm vô cơ. Ngược lại, nếu ta thêm mầm,
rễ của hạt ươm mầm vào canh trường lại có tác dụng tốt đến tích tụ Enzyme.


Sự tạo thành và tích tụ Amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+ và
photpho, đặc biệt là magie. Trong môi trường thiếu MgSO4, Amylase hầu như không đc
tạo thành, hàm lượng chỉ vào khoảng 0,05% - Sau magie là photpho, ion P đóng vai trò
quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng
0,1 - 0,2%.
Canxi có trong thành phần của α-Amylase. Một phân tử α-Amylase có tới 2 hoặc 3
ion canxi. Người ta cho rằng tính chịu nhiệt của Enzyme này phụ thuộc số ion canxi có
trong phân tử; nhưng cũng có ý kiến cho rằng tính bền nhiệt của Enzyme này còn phụ
thuộc vào thành phần acid amin, nhất là hàm lượng của acid glutamic.
Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ Amylase gắn liền
với sự có mặt của nhóm –SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu
tạo thành Enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0,04g/100ml đảm bảo
cho hoạt độ Amylase đạt cực đại và bằng 360 đv/100ml. Nếu giảm tới 0,004% hoạt độ
Amylase của Asp.orysee chỉ còn 50% và bằng 180 đv/100ml.
Hoạt độ của một số chủng nuôi trên môi trường cám lúa mì theo phương pháp bề mặt
Hoạt độ dv/g chất khô
Chủng Vi sinh vật
Hoạt độ Amylase

Hoạt độ D

Hoạt độ Glu

Hoạt độ Pr

Asp.oryae KC

70.0

450.0

30.0

50.0

Asp.oryae U476

85.0

665.0

80.0

40.0

Asp.niger S4-10111

0.65

437.0

70.0

0.5

Asp.awamori

14.5

850.0

30.0

0

5.4.3. Điều kiện nuôi cấy
Chủng giống và môi trường nuôi cấy là tiền đề quan trọng, bên cạnh đó ta còn phải
chú ý đến những điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển và tích tụ Enzyme. Bao gồm: