Tiểu luận môn hóa sinh thực phẩm Đề tài Pectinase

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM
o0o
MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM 1

ĐỀ TÀI:

PECTINASE

Nhóm thực hiên: 3
Lớp: DHTP10B/ 210543202
Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm
GVHD: Nguyễn Thị Trang


TpHCM, tháng 9 năm 2015


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM
o0o
MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM 1

ĐỀ TÀI: PECTINASE

Nhóm thực hiên: 3
Lớp: DHTP10B/ 210543202
Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm
GVHD: Nguyễn Thị Trang

STT
1

HỌ VÀ TÊN
Nguyễn Thị Giang

MSSV
14061771

2

Phạm Thị Bích Hằng

14062241

3

Trần Thị Thúy Quyên

14066461

4

Trần Phương Thảo

14063881

TpHCM, tháng 9, năm 2015

LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ
trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp. Trong suốt quá trình học tập
bộ môn Hóa Sinh Thực Phẩm 1 nói riêng và các môn trong Viện Sinh Học & Thực
Phẩm của trường Đại Học Công Nghiệp TPHCM nói chung, chúng em đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhà trường, Thầy Cô, gia đình & bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc, chúng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô ở
Viện Sinh Học & Thực Phẩm - Trường Đại Học Công Nghiệp TPHCM đã cùng
với tri thức & tâm huyết của mình đã truyền dạy cho chúng em những bài học quý
báu nhất.
Chúng em xin chân thành cám ơn Cô Nguyễn Thị Trang đã tận tâm hướng
dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp & bài tập tiểu luận về nhà. Nếu không có
những lời hướng dẫn, dạy bảo của Cô thì chúng em nghĩ bài Tiểu luận này khó có
thể hoàn thiện được. Một lần nữa, chúng em xin chân thành cám ơn Cô.
Bên cạnh sự những sự giúp đỡ trên, còn có sự trợ giúp đắc lực là trang
mạng www.google.com.vn đã giúp chúng em tìm ra những thông tin quý giá, góp
phần rất quan trọng vào việc hoàn thành bài tiều luận.
Bài tiểu luận được thực hiện trong khoảng 6 tuần, các bạn trong nhóm với
lịch học khác nhau do vậy thời gian gặp nhau, trao đổi còn ít và kiến thức của
nhóm vẫn còn nhiều hạn chế. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót, chúng em
rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Thầy Cô & các bạn cùng lớp để
bài Tiểu Luận của nhóm sẽ được hoàn thiện hơn & tiến bộ hơn trong các bài Tiểu
Luận trong thời gian tới.


MỤC LỤC


LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay nước ta đang trong thời kì phát triển mạnh, cùng với xu thế hội
nhập nền kinh tế quốc tế, thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày càng
phát triển, theo đó ngành công nghệ thực phẩm cũng từng bước được cải tiến để
cung cấp các sản phẩm đầy đủ chất dinh dưỡng, đẹp mắt, tiện lợi đáp ứng những
nhu cầu ngày càng cao của con người.
Sử dụng enzym trong sản xuất và đời sống đã trở thành phổ biến trong
ngành sản xuất thực phẩm và mang lại lợi ích khá lớn.
Trước đây, nguồn enzym chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày
nay, người ta nghiên cứu tìm ra nguồn enzym từ vi sinh vật phong phú, đa dạng &
rẻ tiền, được ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất khác nhau.
Để hiểu sâu hơn về nguồn enzym này, nhóm em xin thực hiện để tài tiểu
luận về enzym PECTINASE.
Vì thời gian hoàn thành bài tiểu luận không nhiều, cũng như kiến thức còn
hạn chế nên không tránh khỏi những sai sót, chúng em kính mong nhận được sự
đóng góp ý kiến của Cô, các bạn để bài báo cáo của chúng em được hoàn thiện
hơn và giúp chúng em tiến bộ hơn trong những bài tiểu luận sắp tới.

6


I. GIỚI THIỆU CHUNG
1.

Khái niệm

Enzym Pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm
tạo thành là acid galacturonic, galactose, metanol,... Đây là một nhóm enzym được
ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau enzym Amylase và Protease.
Enzym này đầu tiên được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà chua, cà
rốt hay đại mạch. Đầu tiên phải kể đến phát hiện của E.fremi trên đối tượng cà rốt

(1840).
Enzym Pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polime pectin, làm
giảm độ nhớt và giảm khối lượng phân tử của các sản phẩm tạo thành.
Enzym Pectinase được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm,
đặc biệt là khả năng làm trong nước quả.
2.

Phân loại

Theo quan điểm hiện đại, enzym Pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác
dụng của chúng, được phân thành 3 nhóm:
 Pectinesterase (PE): phân cắt liên kết este giữa methnol và nhóm cacboxyl

của axit galacturonic.
 Polygalacturonase (PG): thủy phân liên kết gắn với nhóm -COOH tự do ở

đầu hay mỗi mạch, tức là thủy phân liên kết

α

-1,4-D- galacturoside giữa

các axit galacturonic trong pectin và trong các axit polygalacturonic khác.
 Transeliminase (TE): đây là nhóm enzym được tìm ra gần đây (1960-

1961), bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan ra
khỏi protopectin để tạo thành pectin hòa tan và enzym Transeliminase
7

phân cắt phi thủy phân ( không có sự tham gia của nước) pectin để tạo ra

các gốc galacturonic có nối kép giữa các nguyên tử C4 và C5. Phản ứng xảy
ra dễ dàng ở môi trường trung tính và kiềm.


3. Pectin
3.1. Cấu tạo
- Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid
galacturonic qua các liên kết -1,4-glucoside. Tuỳ thuộc vào nguồn pectin mà
pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 - 200.000.
- Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectin rất phổ biến trong thực vật, là
hợp chất polimer tự nhiên tồn tại có 3 dạng: protopectin, pectin và acid pectinic.
Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau,
trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu.
- Pectin có nhiều trong các loại quả (1 – 1,5%). Các vỏ, cùi cam, chanh, dứa có
nhiều pectin. Trong rau cũng có pectin như cà rốt, bắp cải, bí.
- Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc
polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Trong quả xanh,
pectin ở dạng không hoà tan gọi là protopectin làm cho quả rất cứng. Protopectin
tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp.
Protopectin tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường ở dạng liên kết với
polysaccharide khác như arabin, tinh bột, cellulose… Khi quả chín, dưới tác dụng
của enzyme protopectinase cũng như acid hữu cơ có trong quả làm cho protopectin
chuyển thành pectin hoà tan, làm mềm quả.
Tính chất quan trọng nhất của pectin là dễ tạo gel. Pectin được ester hoá cao sẽ tạo
gel đặc trong môi trường acid 1% và trong dung dịch đường có nồng độ 65%.
- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hoá bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid.
Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy,
tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic
acid.

8

-


3.2 Tính chất của pectin
- Pectin là chất bột trắng xám nhạt hat có màu nâu.
- Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác, không thử oxy.
Pectin hòa tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, cacbonate natri và trong
glycerine nóng.
+ Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá
trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm. Khi đó, độ
nhớt của dung dịch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ.
+ Pectin dễ bị kết tủa bởi ethanol, isopropanol, acetone, sulfat amon,
chlorua nhôm, các muối đồng, muối canxi va acid.
- Độ bền vững của pectin trước các enzym pectinase sẽ được tăng lên khi có mặt
của các cation, nhất là Al3+ và Fe3+
- Pectin hòa tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzyme pectinase sẽ giải phóng
nhóm methoxy tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do.
- Khi có đường và acid, pectin có tính chất làm đông. Pectin của quả có khả năng
đông tốt hơn pectin của rau vì cấu tạo có nhiều nhóm methoxy hơn
+ Khi nhóm methoxy chiếm 11%, pectin đông tốt ở pH = 3,5
+ Khi nhóm methoxy chiếm 5%, pectin đông tốt ở pH = 2,9
+ Khi hàm lượng pectin khoảng 1%, độ acid từ 1 – 1,3%, pH = 2,8 – 3,2 ;
độ đường 65 – 70% thì sản phẩm có thể đông tốt.
- Pectin thường được sản xuất từ táo, cà rốt, vỏ bưởi, lúa mạch nha…

9

II. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ


Trong số các enzym thuộc hệ pectinase, polygalacturonase là enzym được
quan tâm nhiều nhất và có phạm vi ứng dụng rộng lớn không những trong công
nghiệp thực phẩm mà còn trong lĩnh vực công nghệ sinh học
Vì vậy, ta xác định hoạt độ của một loại enzym cụ thể trong hệ enzym
Pectinase là Polygalacturonase (PG). Enzym này thường ít gặp trong thực vật, chủ
yếu có trong vi khuẩn và nấm mốc. Polygalacturonase là một phức hệ enzym gồm
nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất.

Hoạt độ polygalacturonase
1. Phương pháp chuẩn độ iot
1.1. Nguyên tắc
Trên cơ sở gia tăng các nhóm anđêhit ở cuối mạch do thủy phân các liên kết
glucozit, tính toán số lượng các liên kết bị thủy phân. Đơn vị hoạt độ
polygalacturonase là lượng enzym xúc tác thủy phân được một micro đương lượng
các liên kết glucozit trong phân tử axit pectic ở 300C trong thời gian một phút.

1.2. Hóa chất và dịch chiết enzym.
•

Dung dịch axit pectic 1%: hòa tan 10g polygalacturonat natri bằng dung
dịch đệm axetat 0,05N, pH= 5,25 trong bình định mức 1000ml, bổ sung

dung dịch đệm tới vạch mức.
• Dung dịch enzym:
o Đối với môi trường nuôi cấy rắn: cân 5g môi trường rắn đã nghiền
nhỏ cho vào cốc 200ml. Bổ sung 100ml dung dịch toluene 0.33%,
khuấy trộn đều và tiến hành tách chiết ở 40C trong thời gian 1 giờ.

Sau đó, lọc thu nhận dịch chiết enzym qua giấy lọc.
o Đối với tế bào vi khuẩn: khối tế bào được làm lạnh đông trong thời

gian 12 giờ, sau đó được nhả lạnh đông và bổ sung dung dịch đệm
10
axetat 0,2M, pH=7,9 với
tỷ lệ 1:2,5. Hỗn hợp được tiến hành đồng

hóa trên máy và được giữ trong tủ lạnh trong thời gian 24 giờ, sau đó
được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 40 phút. Bổ


sung amoni sunfat vào dịch trong nhận được để đạt nồng độ 40% để
kết tủa và loại protein nhiễm tạp bằng ly tâm với tốc độ 4500
vòng/phút trong thời gian 30 phút. Sau đó, bổ sung amoni sunfat
một lần nữa để đạt độ bão hòa 70% kết tủa enzym, cuối cùng thu
nhận enzym bằng ly tâm với tốc độ 4500 vòng/phút trong thời gian
30 phút. Hòa tan kết tủa enzym bằng 5 ml dung dịch đệm photphat
0,1M, pH= 7.
o Đối với chế phẩm enzym kỹ thuật: Cân 1 gam chế phẩm nghiên cứu
đã nghiền nhỏ cho vào cốc 200 ml. Bổ sung 100 ml nước cất, khuấy
trộn đều và giữ nguyên 1 giờ. Sau đó, lọc thu nhận enzym qua giấy
lọc.
Hoặc
o Đối với chế phẩm enzym thuần khiết: Cân 0,1g chế phẩm nghiên cứu đã

nghiền nhỏ cho vào cốc 20-25 ml. Chà cẩn thận bằng đũa thủy tinh, sau
đó chuyển tòan bộ vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất tới vạch
•
•

•
•

mức, khuấy trộn đều, nếu cần thì tiến hành lọc.
Dung dịch natri cacbonat 1M
Dung dịch axit sunfuric 2M
Dung dịch iot 0,1N
Dung dịch hyposunfit 0,05N: Hòa tan 12,5 gam Na2S2O3 với nước cất
không chứa CO2 trong bình định mức 1000 ml. Dung dịch phải được bảo
quản trong bình thủy tinh màu nâu có ống xi phông và buret với ống canxi
clorua nạp đầy vôi. Trước khi sử dụng xác định lại nồng độ chuẩn xác của

dung dịch.
• Dung dịch tinh bột tan 1% trong dung dịch natri clorua bão hòa: Cho 1 gam
tinh bột tan vào bình định mức vào nồi cách thủy sôi, lắc liên tục cho tới
khi hòa tan hoàn toàn tinh bột. Tiếp đó làm nguội bình và bổ sung 10ml
dung dịch đệm (dung dịch đệm axetat pH 4,7 hoặc dung dịch đệm photphat
11

pH 6). định mức tới vạch ngấn NaCl.
Kiểm tra mật độ quang của dung dịch: Phối trộn 10 ml dung dịch với 5 ml nước
cất, trộn đều. Hút 0,5 ml dung dịch nhận được cho vào 50 ml dung dịch iot, lắc


đều và đo cường độ màu của dung dịch ở bước song là 656 nm với cuvet 10nm đối
ngược với mẫu trắng là nước cất. Giá trị mật độ quang nhận được phải lớn hơn
0,690.

1.3. Tiến hành:
•

Mẫu thí nghiệm: lấy 10 ml dung dịch axit pectic 1% cho vào bình nón nút
mài 100 ml và đặt vào bình điều nhiệt có nhiệt độ 30 +- 0,20C, sau 10 phút
bổ sung 5 ml dung dịch enzym. Sau một thời gian nhất định (10, 20, 30
hoặc 60 phút tùy thuộc hoạt độ enzym), thêm vào bình phản ứng mỗi bình
1,8 ml dung dịch Na2CO3 1M và 10 ml dung dịch iot 0,1N. Lắc đều và đậy
nút thủy tinh, để yên đúng 29 phút trong chỗ tối. Cuối cùng bổ sung thêm
2ml H2SO4 2M và định phân lượng iot dư bằng dung dịch hyposunfit
0,05N với sự có mặt của tinh bột tan. Kết quả chuẩn độ được biểu thị bằng

•

số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N.
Mẫu kiểm chứng: Mẫu kiểm chứng được tiến hành như mẫu thí nghiệm,
chỉ khác là dung dịch enzym được bổ sung vào sau khi bổ sung NaCO3 và
trước khi bổ sung dung dịch iot.

1.4 Kết quả:
Họat độ polygalacturonase (HđPg) tính bằng đv/g được xác định theo công thức:
51,3 * e
HđPg = t * m , đv/g

Trong đó:
- 51,3 là số micro đương lượng các nhóm anđêhit tương ứng với 1ml
dung dịch iot 0,1N (hoặc 1 ml hyposunfit)
- e là lượng dung dịch iot 0,1N tiêu tốn để oxy hóa các nhóm anđêhit
được tạo thành, ml.
- t là thời gian thủy phân, phút.
- m là lượng chế phẩm 12enzym sử dụng, g.

2. Xác định hoạt độ theo độ nhớt của dung dịch phản ứng


2.1 Nguyên tắc :
Trên cơ sở sự giảm độ nhớt của dung dịch pectin do thủy phân các liên kết
glucozit bởi enzym.
Đơn vị hoạt độ polygalacturonase là lượng enzym xúc tác thủy phân các liên kết
glucozit có thể làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch pectin 0,2-2% ở 370C, pH=
5,25 trong thời gian 10 phút.

2.2 Hóa chất :
Dung dịch natri polygalacturonat 0,2-2% : Hòa tan 2g-20g natri
polygalacturonat bằng dung dịch đệm axetat 0,05N, pH = 5,25 trong bình định
mức 1000 ml, bổ sung dung dịch đệm tới vạch mức.

2.3 Tiến hành :
Hút 10 ml dung dịch natri polygalacturonat 0,2-2%, bổ sung 1 ml dung dịch
enzym, lắc đều và đặt vào máy điều nhiệt có nhiệt độ từ 30-370C, giữ nguyên ở
nhiệt độ này trong thời gian đúng 10 phút. Đo độ nhớt của dung dịch phản ứng
bằng nhớt kế Ostwald.

2.4 Kết quả : Hoạt độ enzym được xác định thông qua sự giảm độ nhớt
của dung dịch phản ứng nhận được.

3. Phương pháp so màu :
3.1 Nguyên tắc
Trên cơ sở thủy phân các axit galacturonic bởi enzym giải phóng các nhóm
khử. Các nhóm khử tạo thành sẽ tham gia vào phản ứng với 2-cyanoaxetamit.
Đơn vị đo hoạt độ polygalacturonase là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải
phóng 1 nhóm khử ở 450C trong thời gian 1 phút.

3.2 Tiến hành:
13

Hút 0,5 ml dung dịch hỗn hợp phản ứng chuẩn có chứa 0,5 mg axit
polygalacturonic hòa tan trong dung dịch đệm axerat pH= 3-5 cho vào ống
nghiệm. Phản ứng được khởi động bằng cách bổ sung 20 dich chiết enzym, lắc


đều và đặt vào máy điều nhiệt có nhiệt độ là 450C, giữ nguyên ở nhiệt độ này
trong thời gian đúng 20 phút. Bổ sung 1,2ml dung dịch chất phản ứng TBC (natri
tetraborat 100 mM, axit boric 100 mM và 2-cyanoaxetamit 0,1%), đun sôi trong
thời gian 10 phút để dừng phản ứng, sau đó làm nguội. Màu của dung dịch sau
phản ứng được đo bằng máy quang phổ ở bước song là 270 nm.
Xây dựng đường chuẩn: đường chuẩn được xây dựng trong khoảng nồng độ
0-0,4 mol/l axit polygalacturonic mỗi khi thí nghiệm.

3.3 Kết quả:
Hoạt độ enzym được xác định thông qua đường chuẩn vừa mới được xây
dựng.

III. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT
Hiện nay, pectinase được tách chiết chủ yếu từ Vi sinh vật, có 2 phương pháp.

1.

14
Tách chiết chế phẩm Pectinase
bằng biện pháp canh trường bề

mặt:


Môi trường dùng để nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận pectinase thường là môi
trường cám gạo, cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung
thường là các muối ammonium, photphoric,... Độ ẩm môi trường phải nằm trong
khoảng 60%. Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C và trong thời
gian 40giờ, sau đó giảm xuống 240C và nuôi trong 48-52 giờ. Sản phẩm lên men
được sấy khô thành chế phẩm enzym thô và đem tinh chế.
Để thu được chế phẩm Pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải được
trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium
sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzym pectinase có sunfat sử dụng có
độ bão hòa 0,79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu được có độ
tinh khiết khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%.
Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn
càng tốt. Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị
sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.
2.

Tách chiết chế phẩm enzym pectinase từ canh trường bề sâu:
2.1 Phương pháp hiếu khí:
Sự tích tụ enzym trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi
sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị axit hóa mạnh và lượng
phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH của môi trường nuôi cấy thường
đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy
enzym pectinase. Khi pH dịch về phía axit, ngay cả khi pH nằm trong khoảng
4,5-5, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành
enzym pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các môi trường nuôi cấy
A.niger và A.awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể nấm 24, 32 và 48 giờ tuổi và với hàm lượng từ 210%. Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ

15

trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ
sơ bộ thường là 38-42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong


quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm
từ 6% xuống còn 1,5-1,8%.
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc
chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy
khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào
phải đạt 165-1800C và đi ra đạt 60-700C. Thời gian lưu của chế phẩm enzym
trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi
sấy phải không quá 400C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để
tránh hút ẩm. Có thể thu chế phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa
enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ
lệ 2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sunfate. Nếu
kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so
với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium
sulfat, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương pháp thẩm tích (với nước
hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5
thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25%
trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1.0 thì sẽ
kết tủa được chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao.

2.2 Phương pháp yếm khí
Môi trường: bã củ cải 2%
(NH4)2HPO4 0,75%
KH2PO4 0,1%
CaCO3 0,3%

Nước chiết ngô 0,5%
Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hơp pectinase một cách
mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích
16

lũy sinh khối. Sự tích lũy enzym sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh
trưởng qua 55-60 giờ. pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6,5-7. Vật liệu


gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với
lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 350C.
Cl.Felsieum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần
môi trường gồm có: Lactose 2%
Pectin củ cải 1%
(NH4)2HPO4 0,4%
K2HPO4 0,7%
KH2PO4 0,3%
NaCl 0,1%
MgSO4 0,025%
FeSO4 dạng vết
CaCO3 0,5%
Dịch nấm men tự phân 0,05%
Ascorbic acid 0,5%
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa
enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng
dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lí là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể
tích aceton thì hoạt độ của enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được
chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintraseliminase, khi độ bão hòa là 0,9-a
thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintraseliminase và exopolygalacturonase.

Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thường theo
các bước cơ bản sau đây:
 Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Bioger P100)
 Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion ( DEAE Biogel A),

hay trao đổi cation (CM Biogel A)
17

 Tách enzym pectinnase bằng alginate liên kết ngang
 Tinh sạch bằng FPLC


Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh
điện và thay thế pectate liên kết ngang.

IV. ỨNG DỤNG
Từ khi phát hiện ra enzym và khả
18 năng chuyển hóa của enzym, loài người đã
tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzym trong công nghiệp. Số lượng
enzym phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzym được ứng dụng vào công


nghiệp cũng ngày càng nhiều.
Trong số các enzym được sản xuất và ứng dụng trên thế giới, các nước châu
Âu sản xuất và bán ra thị trường thế giới số lượng nhiều nhất.
Stt

Loại enzym

Giá trị buôn bán enzym (triệu USD)

1

Carbohydrase

83.2

2

Protease

187.2

3

Lipase

31.6

4

Pectinase

41.6

5

Những loại enzym đặc biệt

20.8

6

Các loại enzym khác

41.6

Bảng 1: Thị trường enzym châu Âu
Riêng trong công nghệ thực phẩm, lượng enzym được tiêu thụ nhiều nhất. Số
lượng enzym được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu ở các nước
chây Mỹ, châu Âu.
Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase
dưới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng nấm mốc sấy khô.
Tỉ lượng chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào
khoảng 0.03-0.05 đên 0.1%
Pectinase thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm sau:
 Sản xuất rượu vang
 Sản xuất nước quả và nước uống không có cồn
 Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cô đặc, mứt nhừ, mứt đông,...
19

 Sản xuất nước giải khát
 Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan.


Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống
không cồn, đều có thể sử dụng pectinase một cách rất hiệu quả. Nhờ tác dụng của
pectinase mà các quá trình ép, làm trong và lọc dịch quả rất dễ dàng, do đó làm
tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm
tăng hiệu suất nước suất nước quả sau khi ép lên tới 15-25%. Bởi lẽ khi có pectin

thì khối lượng quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do đó khi ép dịch quả không thoát
ra được. Nhờ pectinase phân giải các chất pectin đi mà dịch quả trong suốt không
bị vẩn đục và lọc dễ dàng. Không những vậy, enzym pectinase còn góp phần chiết
rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan nữa, do đó làm tăng thêm chất
lượng của thành phẩm.
Trong sản xuất mặt hàng từ quả (mứt nhừ, mứt đông,...) pectinase cũng có vai
trò quan trọng. Nhờ pectinase mà có thể thu được dịch quả có nồng độ đậm đặc.
Ví dụ như dịch táo cô đặc đến 72 độ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên chứa
trong đó đi thì sản phẩm sẽ bị keo tụ một cách mạnh mẽ và không thể cô đặc hơn
nữa. Đa số trường hợp, người ta khử pectinase đi, sau đó mới lọc rồi cô đặc, nhưng
đôi khi người ta cho pectinase tác dụng trong suốt thời gian cô đặc.
Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinase để tách lớp keo ở trên bề mặt
của hạt cà phê. Trước đây người ta dùng ngay vi sinh vật để làm việc này, nhưng
thường quá trình xảy ra không đồng đều và khó kiểm tra. Hiện nay, người ta
thường dùng các chế phẩm pectinase.
Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzym là một tiến bộ
khoa học rất lớn. Các chế phẩm enzym được sử dụng trong sản xuất nước quả và
rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều loại enzym riêng biệt phụ thuộc vào
nguyên liệu và sản phẩm cần đạt tới. Ngoài ra, việc sử dụng các loại chế phẩm
enzym còn phụ thuộc vào công nghệ sản xuất.
20

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong các
nhóm enzym sau:


 Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích là

làm tăng hiệu suất trích ly để thu được lượng sản phẩm lớn.


Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin.
Mục đích là làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phân hoàn toàn các chất
protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước
quả.
 Nhóm chế phẩm enzym dùng để làm tăng khả năng đồng hóa nước quả

và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
 Nhóm chế phẩm enzym dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu vang,

nhằm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
 Nhóm chế phẩm enzym dùng đế ngăn cản quá trình oxy hóa và làm cản

trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả,
trong rượu vang.
 Nhóm chế phẩm enzym dùng vào mục đích chống lại sự lại đường

trong sản xuất siro thành phần.
Việc sử dụng các chế phẩm enzym phải được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở
đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái cây, người ta
quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phầm. Trong nhiều
trường hợp, việc sử dụng enzym phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu
hoặc tạo ra những màu sắc theo ý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng
enzym.
Ví dụ:
 Trong sản xuất nước táo người ta sử dụng chế phẩm peptin cho hiệu quả tách

nước cao.
21

Ở 50⁰C trong 2 giờ hiệu suất tách nước là 80% - 20%.
Ở 37-40⁰C trong 2 -4 giờ , hiệu suất tách nước là 20%-25%




Trong sản xuất nước nho: Nho cho nhiều dịch quả và chứa nhiều đường. Tuy
nhiên, nước nho thường chứa nhiều thịt quả (peptin). Người ta xử lý nước nho
bằng chế phẩm peptin làm nước nho trong.

Ứng dụng trong sản xuất rươu vang.
Quy trình sản xuất rượu vang
Dịch ép
Nho

Bổ sung pectinase 0,03%

Rửa sạch
Dịch tự chảy

Lên men

Điều chỉnh pH, nồng độ đường

Thu dịch

Kết tủa lạnh

Ứng dụng trong sản xuất bia.
Enzim xúc tác cho sự phân giải protein.

Ứng dụng trong việc lên men cà phê, ca cao.
Trong quá trình lên men, lớp nhầy xung quanh các hạt bị phân hủy nhanh hơn và
bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô.
Ứng dụng trong việc tạo hương cho các sản phẩm rượu.
Do các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc nhiễm vào trái nho chín có hàm lượng
đường cao bằng cách đâm thủng vỏ làm cho nước trong trái nho bay hơi -> nho bị
nhiễm nấm.

22

Ứng dụng trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường.


Trong sản xuất các loại mứt, pectinase cũng đống vai trò quan trọng . Nhờ
pectinase mà có thể thu được dịch quả có nồng độ đậm dặc
Ví dụ: Dịch táo cô đặc nếu không tách peptin thì sẽ bị keo tụ một cách mạnh mẽ.
Do đó người ta phải khử peptin sau đó mới lọc rồi cô đặc.
Ngoài ra pectinase còn được ứng dụng trong chăn nuôi , y hoc, sản xuất dầu……

TÀI LIỆU THAM KHẢO

23

1. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men


2. www.google.com.vn

24