Nghiên cứu khai thác các gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối coptotermes gestroi

MỞ ĐẦU
1. L‎ý do chọn đề tài
Trong bối cảnh nền kinh tế thế giới đang bước vào toàn cầu hóa, mỗi
một biến động trên thế giới đều ảnh hưởng tới các quốc gia, trong đó có Việt
Nam. Trong vài năm trở lại đây thị trường xăng dầu luôn biến động, tăng giá
liên tục, đã ảnh hưởng không nhỏ tới nền kinh tế nước ta. Theo dự đoán của
các nhà khoa học, trữ lượng của các loại nhiên liệu hóa thạch trên thế giới
đang cạn kiệt dần trong vòng vài chục năm tới. Thế giới hiện đang bị lệ thuộc
rất nhiều vào dầu khí, vì vậy nhiều nước trên thế giới đang tìm cách phát triển
các nguồn nhiên liệu thay thế, trong đó phải kể đến nhiên liệu sinh học. Cũng
như nhiều quốc gia khác, việc sử dụng năng lượng gió, năng lượng mặt trời,
năng lượng từ các nguồn sinh khối đang là những giải pháp được xem xét áp
dụng tại Việt Nam. Và trong số những nhiên liệu thay thế đó, cồn sinh học
(bio - ethanol) nổi lên như một ứng cử viên sáng giá nhất, đáp ứng được các
tiêu chuẩn như dễ sản xuất, giá rẻ và “thân thiện” với môi trường.
Cồn sinh học được sản xuất bằng phương pháp lên men các sản phẩm
hữu cơ có chứa hàm lượng carbonhydrate cao như các loại ngũ cốc chứa tinh
bột có thể chuyển hóa thành đường đơn (ngô, lúa mì, lúa mạch, gạo,... ) hay
các loại cây cỏ chứa lignocellulose ( rơm, rạ, bã mía, gỗ, trấu,...).
Là một nước nông nghiệp, Việt Nam đứng hai trên thế giới về xuất
khẩu gạo và chất thải nông nghiệp như rơm rạ, cỏ, lá,vv... là nguyên liệu tự
nhiên có sẵn trong các cánh đồng hoa màu. Ước tính hàng năm có khoảng 3040 triệu tấn rơm rạ, 3 triệu tấn trấu bị bỏ. Gần đây, Thủ Tướng Chính Phủ ra
một quyết định số 177/2007/QD-TTg phê duyệt một kế hoạch cho phát triển
nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025. Trong đó, các
nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các nhiên liệu sinh học đã được nhấn mạnh.
Tuy nhiên, giá thành sản xuất cồn sinh học từ phế phụ phẩm nông nghiệp còn

Nguyễn Thu Phương

1

Lớp K35C – Sinh


rất cao, nguyên nhân được cho là chưa có nguồn enzyme chuyển hóa nhanh,
hiệu quả lignocellulose thành đường đơn dùng lên men cồn. Vì vậy, mục tiêu
trước mắt là phải tìm được nguồn enzyme có đặc điểm tốt để dùng cho
chuyển hóa lignocellulose.
Mối là động vật chân khớp có ở khắp nơi và tiêu hóa lignocellulose
hiệu quả. Ngoài các enzyme phân giải hemicellulose có từ bản thân mối, các
vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối cũng đóng vai trò đáng kể làm tăng hiệu
quả chuyển hóa lignocellulose. Do đó, ruột mối được xem là nguyên liệu tiềm
năng để khai thác các gen mã hóa enzyme phân giải lignocellulose cho các
định hướng nghiên cứu ứng dụng [9].
Metagenomic là phương pháp nghiên cứu về metagenom – vật liệu di
truyền tồn tại ở mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm các genom của nhiều cá
thế sống trong môi trường đó [9]. Metagenomic đã được sử dụng rộng rãi và
thành công trên thế giới gần 40 năm qua [23]. Một số tác giả đã sử dụng kỹ
thuật metagenomic xây dựng thư viện DNA và tách chiết thành công một số
dòng hemicellulose mới bằng phương pháp metagenomic từ các môi trường
khác nhau như mẫu đất [10], dạ cỏ trâu bò [6] hay phân thỏ [8]. Dựa vào lợi
thế trên của metagenomic, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khai thác
các gen mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh
trong ruột mối Coptotermes gestroi”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tách chiết, tinh sạch thành công DNA metaganome của hệ vi sinh vật
trong ruột mối dùng cho giải trình tự metagenome và khai thác được các gen
mã hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột
mối Coptotermes gestroi.

Nguyễn Thu Phương

2

Lớp K35C – Sinh


Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI L‎IỆU
1.1. Sơ lược về các loài mối
Mối thuộc bộ Cánh đều (Isoptera), lớp Côn trùng (Insecta), là loài côn
trùng có đời sống xã hội, mối sống thành tập đoàn, khi hình thành có thể từ
hàng trăm cho đến hàng triệu thành viên [14]. Mối có khả năng tiêu hóa được
lignocellulose, trong đó có hemicellulose làm nguồn năng lượng có ích. Khả
năng này có được là nhờ một phần vào các sinh vật cộng sinh trong ruột mối,
những sinh vật này tiết ra các enzyme cellulase, hemicellulase thủy phân hoàn
toàn lignocellulose thành đường [12].
Có khoảng hơn 2600 loài mối trên thế giới, chúng thường phân bố ở
các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo kết quả nghiên cứu về các loài mối
ở Việt Nam do “Viện phòng trừ Mối và bảo vệ công trình” (2009) có tổng số
141 loài mối thuộc 4 họ, 8 phân họ và 38 giống mối được tìm thấy ở Việt
Nam, 120 loài trong số chúng đã được định danh đầy đủ tên khoa học, 21 loài
chưa được định danh.
1.2. Sơ lược về loài mối Coptortermes gestroi
Coptotermes gestroi (Isoptera: Rhinotermitidae ) là loài đặc hữu của khu
vực Đông Nam Á, phổ biến nhất ở những nơi ấm áp, lượng mưa cao, độ cao
thấp và các khu vực đông dân. Hiện tại khu vực phân bố của chúng đã lan
rộng đến nhiều nơi khác trên thế giới [15].
Giống như các loài mối mọt khác, loài C. gestroi chia làm 3 cấp chính:
mối chúa, mối lính và mối thợ. Mối thợ có trách nhiệm nuôi dưỡng tổ và
chăm sóc các mối khác. Mối lính có trách nhiệm bảo vệ an ninh cho tổ. Bề
ngoài, mối lính của C. gestroi có một thóp trên trán, có một cặp lông gần mép

của thóp. Mối lính lớn hơn mối thợ, màu trắng đục, đầu hình trứng, các phân
đoạn trước bụng có màu nâu đậm. Cơ thể của mối thợ nhỏ hơn, mập hơn và

Nguyễn Thu Phương

3

Lớp K35C – Sinh


màu trắng đục. Mối chúa có chức năng chính là sinh sản liên tục do vậy cơ
thể lớn hơn rất nhiều so với các mối khác.
Coptotermes gestroi là một loài mối nguy hiểm, gây hại. Chúng tiêu thụ
tất cả các vật liệu có chứa liglocellulose, từ gỗ, giấy và đôi khi là vải. Chúng
khoan lỗ trong các vật liệu như cao su, nhựa và xốp để tìm kiếm thức ăn.
Chúng tấn công các cây sống bằng cách tiêu thụ tâm gỗ và làm suy yếu, đổ
cây. Chúng sống dưới lòng đất và xây dựng tổ của mình thông qua các khe,
vết nứt của đất. Chúng ăn gỗ từ bên trong ra bên ngoài, để lại một lớp màng
mỏng trên bề mặt sàn những mảng phồng rộp [25].
Theo một số nghiên cứu, chiết xuất protein thô từ C. gestroi thu được
hiệu quả một lượng enzyme trên một khoảng pH rộng và enzyme có hoạt tính
ở nhiều loại polysaccharides tự nhiên chứa nhiều liên kết glycosidic. Phương
pháp phân tích protein này đã xác định thành công 55 loại protein khác nhau
và đã được phân loại thành 29 họ CAZy. Dựa trên tổng số peptide xác định,
phần lớn các thành phần được tìm thấy trong C. gestroi digestome là enzyme
cellulose , enzyme thủy phân xylan, mannan, pectin và enzyme phân hủy tinh
bột. Phân tích proteomic toàn diện đã chỉ ra bộ sưu tập đầy đủ các enzym thủy
phân từ mối bao gồm cellulase (GH1, GH3, GH5, GH7, GH9 và CBM 6),
hemicellulases (GH2, GH10, GH11, GH16, GH43 và CBM 27) và pectinaza
(GH28 và GH29 ) [25].

Hình 1.1 : Loài mối Coptotermes gestroi

Nguyễn Thu Phương

4

Lớp K35C – Sinh


1.3. Sơ lược về Metagenomics
Metagenomics là phương pháp nghiên cứu về metagenom - vật liệu di
truyền tồn tại ở mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm các genom của nhiều cá
thế sống trong môi trường đó [9]. Đây là lĩnh vực tương đối mới của nghiên
cứu di truyền cho phép nghiên cứu về vi sinh vật không qua nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh lí và di truyền của
các vi sinh vật trong môi trường tự nhiên.
1.4. Tổng quan về lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các
thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy
lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các
chất thải rắn trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là
cellulose (38-50%), hemicellulose (20-32%) và lignin (15-25%) [2, 23].

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc của thành tế bào thực vật
1.4.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, và là
thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Cellulose là glucan không phân
nhánh, cấu tạo bởi các đơn phân β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết

Nguyễn Thu Phương

5

Lớp K35C – Sinh


β-1,4-glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử
carbohydrate phức tạp khác [1] (Hình 1.3).

Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết
van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình.
Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và
glycogen. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động
vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được
cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ
thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và
động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose.
Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng
cellulose làm thức ăn.
1.4.2. Lignin
Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ
mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin
là một đại phân tử, có khối lượng phân tử lớn hơn 10.000 đvC, cấu trúc không
gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, có cấu trúc nhiều vòng thơm, có đặc tính
không ưa nước do đó rất khó phân hủy. Vì vậy, các enzyme phân giải lignin
có vai trò quan trọng trong chu trình vận chuyện cacbon trên trái đất [3].

Nguyễn Thu Phương

6

Lớp K35C – Sinh


Trong các enzyme oxidase phân hủy lignin, enzyme có hoạt tính rất mạnh là
ligninase và manganese peroxidase [3], [10].
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở, được cấu thành từ các đơn vị
phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl
alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-pcourmary alcohol (Hình 1.4).

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin
Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose.
Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết, cấu
trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên kết. Cấu trúc hóa học
của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều
kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn
200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose
[2].
Trong dinh dưỡng động vật, lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị
tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ. Lignin còn liên kết với nhiều
polysaccharide và protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp
chất gỗ [25].

Nguyễn Thu Phương

7

Lớp K35C – Sinh


1.4.3. Hemicellulose
Hemicellulose chiếm khoảng 20-32% tổng sinh khối lignocellulose
thực vật. Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng
hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon
gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose.
Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D xylopyranose, liên kết với
nhau bằng liên kết β -(14).

Hình 1.5: Một số thành phần cấu tạo nên hemicellulose
Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên
liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm:
- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(14).
- Xylose là thành phần quan trọng nhất.
- Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.
- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là
disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với
các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này.
Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định
hình và vì thế dễ bị thủy phân.

Nguyễn Thu Phương

8

Lớp K35C – Sinh

Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch
kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên
chính. Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững
chắc ở thực vật. Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose,
D-galactose, D-mannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần
khác và nằm trong liên kết glycoside [1]. Hemicellulose còn chứa cả axit 4-Omethylglucuronic, axit D-galacturonic và axit glucuronic. Trong đó, đường Dxylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ
và ngũ cốc. Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực
vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào
các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi
của mô đó.
Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide
nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan.
Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất
phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ
quan khác nhau như gỗ, rơm rạ,…
Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế
bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết
β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa
số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay
thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và
glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và
không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác
Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là
khác nhau. Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây
gỗ cứng (Hình 1.6), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm

Nguyễn Thu Phương

9

Lớp K35C – Sinh


(Hình 1.7) , hay thành phần cấu tạo xylan là axit D-glucuronic, có hoặc không
có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc [5].

Hình 1.6: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng

Hình 1.7: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm
1.5. Tổng quan về enzyme thủy phân hemicellulose
Hemicellulase là enzyme thủy phân, xúc tác phân giải hemicellulose,
được cấu tạo từ các đường khác nhau, các gốc này được nối với nhau bằng
liên kết β-1,3; β-1,4; β-1,6 glycoside. Hemicellulase thường tồn tại ở dạng

Nguyễn Thu Phương

10

Lớp K35C – Sinh


mạch ngắn, phân nhánh. Hemicellulase được thủy phân thành các
monosacchride như manose, galactose, xylose hay arabinose. Hemicellulase
thường được phân chia thành các nhóm cơ bản sau [21]: Xylanase, βMannanase, α-L-Arabinofuranosidase, α -D-Glucurnonidase.

Hình 1.8: Các nhóm enzyme thuộc hemicellulase

Nguyễn Thu Phương

11

Lớp K35C – Sinh


1.5.1. Xylanase
Enzyme Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với
nhau, giải phóng các phân tử ngắn xylooligomer.

Hình 1.9: Cấu tạo các phân tư xylan và các vị trí bị các enzyme hemicellulase
cắt hoặc thủy phân

Nguyễn Thu Phương

12

Lớp K35C – Sinh


1.5.2. β-Mannanase
β-Mannanase tham gia thủy phân galacto-glucomannan và giải phóng
các tiểu phần β-1,4-manno-oligomers, sau đó các tiểu phần này có thể bị thủy
phân thành các đơn phân mannose bởi enzyme β-man-nosidase [17, 18].

α - Galactosidase

Endo-mannanase
Hình 1.10: Sơ đồ cấu trúc của phân tử galacto-glucomannan và các vị trí bị
thủy phân bởi enzyme mannanase
1.5.3. α-L-Arabinofuranosidase
Enzyme α-L-Arabinofuranosidase tham gia thủy phân nhánh bên của

phân tử xylan và giải phóng các phân tử α-1,5-L-Arabinan [20]. Sau đó α-LArabinanase tiếp tục thủy phân α-1,5-L-Arabinan thành các phân tử nhỏ hơn
[7] (hình 1.8).
1.5.4. α -D-Glucuronidase
α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2- glycosidic của phân tử 4O-metyl-D-glucuronic ở nhánh bên của phân tử xylan (hình 1.8). Tính đặc
hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme
[4], [16].

Nguyễn Thu Phương

13

Lớp K35C – Sinh


Chương 2 - VẬT L‎IỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu vật
Mối thuộc loài Coptortermes Gestroi do Viện phòng trừ mối và bảo vệ
công trình cung cấp.
2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc, thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều được đặt mua từ các công ty
đạt tiêu chuẩn quốc tế như Bio-rad (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ),
Merck (Đức) gồm có: CTAB, SDS, Tris-HCL, EDTA, d-NTPs, TAE,
glycogen, phenol, methanol, isoamylalcohol, ethidum bromine, ethanol,
dH2O, acetic acid, chloroform, agarose, glass beads, PEG 8000 (polyethylen
glycol 8000), QIAamp DNA mini kit (QIAGEN).
2.1.2.2. Enzyme
Lysozyme, RNAse, protease K.
2.1.2.3. Máy móc và thiết bị

Máy ly tâm lạnh bé (Sorvall RC5B, Mỹ), máy ly tâm lạnh lớn (Sorvall
RC5B, Mỹ), máy PCR (MJ Reseacher Mỹ), máy điện di (Bio-Rad, Mỹ), máy
UV (Bio-Rad, Mỹ), máy hút chân không speed vac (Savant, Mỹ), cân phân
tích (Precisa, Thụy Sĩ), cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ), tủ cấy vô trùng (EscoSingapore), tủ hút khí độc.
2.1.3. Dung dịch và môi trường sử dụng
2.1.3.1. Dung dịch sử dụng trong tách chiết và tinh sạch DNA metagenome
- Dung dịch PBS: 1,72 g Na 2HPO4.12H2O, 0,254 g KH2PO4, 8,5 g NaCl
(pha trong 100 ml).
- Dung dịch phenol/chloroform/isomylalcohol với tỷ lệ 25:24:1.

Nguyễn Thu Phương

14

Lớp K35C – Sinh


- Dung dịch chloroform/isomylalcohol với tỷ lệ 24:1.
- Dung dịch TE 0,01M, pH 8,0; 0,1 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,01 mM
EDTA, pH 8,0.
2.1.3.2. Dung dịch được sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
- Dung dịch đệm TAE 1x pha từ dung dịch TAE 50x (100 ml): 24,2 g
Tris-base; 5,71 ml glacial acetic acid; 10ml EDTA 0,5 M, pH 8,0
- Điện tra mẫu (loading dye 6x): 0,25% bromophenol blue; 0,25%
xylen cyanol FF; 30% glycerol.
- Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 ɱg/ɱl.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết AND metagenome của hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột
mối
Cơ sở lý thuyết

•

Phá vỡ tế bào:
Dùng phương pháp ly tâm để phá vỡ màng tế bào và phóng thích DNA

trong nhân. Ngoài ra, màng tế bào và màng nhân còn được phá vở bằng hỗn
hợp chất tẩy (SDS – sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) và proteinase. Các
DNA sẽ được giải phóng ra môi trường. Các protein liên kết với DNA cũng tự
bị phân hủy.
• Cố định mô:
Dung dịch PBS (137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 Mm
KH2PO4)
•

Hòa tan DNA:
Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cất khử trùng hoặc dung

dịch TE. Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn, nếu nó được hoà tan trong
dung dịch TE, vì dung dịch này chứa Tris và EDTA.
•

Loại bỏ các thành phần không phải là DNA:

Nguyễn Thu Phương

15

Lớp K35C – Sinh

- Proteinase K: loại bỏ thành phần protein.
- Phenol có tác dụng kết tủa protein, còn chloroform và isoamyalcohol
có tác dụng phá hủy lipid và các chất béo. Do vậy, phenol được dùng trước để
kết tủa protein, sau khi ly tâm, loại thải phần đã kết tủa, thu nhận phần trong
bên trên có chứa ADN, và tiếp tục dùng chloroform để phá hủy lipit và các
hợp chất béo còn lại.
•

Tủa DNA:
- Sử dụng ethanol 100% ủ ở – 20 0C để tủa DNA trong dung dịch. Mục

đích là thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc và bảo vệ chúng khỏi sự phân
hủy của các enzyme.
•

Rửa DNA:
- DNA được rửa lại bằng ethanol 70% để loại bỏ các muối.

•

Làm khô:
- DNA sau khi rửa được làm khô bằng cách sấy khô. Mục đích là tránh

để mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.
•

Trữ DNA:
– Trữ ADN ở - 200C giúp ADN không bị biến tính.
Quy trình 1
- Lấy 300 ruột mối thợ bằng cách dùng kẹp giữ thân mối và đuôi mối,

kéo ruột mối ra nhẹ nhàng và đưa vào eppendorf (E1) chứa 500 ul PBS đã
khử trùng.
- Bổ sung 0,34g hạt thủy tinh vào E1, lắc nhẹ (khoảng 3000 rpm) và hút
dịch ra 1 ống eppendorf (E2) để nghiền mẫu bằng chày 15 – 20 phút.
- Lấy lại dịch ở E2 +500 ul PBS cho vào E1. Lắc nhẹ và ly tâm nhẹ
dung dịch E1 (600 – 700 rpm), hút dịch trên cho vào E3. Chú ý không hút
kiệt.

Nguyễn Thu Phương

16

Lớp K35C – Sinh


- Ly tâm nhẹ E1 (khoảng 3000 rpm), hút dịch ra E2 để nghiền tiếp mẫu
khoảng 2 phút.
- Lấy lại dịch ở E2 +500 ul PBS cho vào E1. Lắc và ly tâm nhẹ E1 (600
– 700 rpm), hút dịch trên ra E3. Chú ý không hút kiệt.
- Ly tâm nhẹ E1 (khoảng 3000 rpm), hút dịch ra E2 để nghiền tiếp mẫu
khoảng 2 phút.
- Lấy lại dịch ở E2 +500 ul PBS cho vào E1. Lắc và ly tâm nhẹ E1 (600
– 700 rpm), hút dịch trên ra E3. Chú ý không hút kiệt.
- Ly tâm E3 600 rpm/10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi sang
eppendorf mới E4 còn kết tủa cho vào E1.
- Ly tâm E4 700 rpm/10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi còn kết
tủa cho vào E1.
- Nghiền tiếp E1, bổ sung 500 ul PBS, ly tâm 600 rpm/10 phút ở nhiệt
độ phòng để thu dịch nổi. Dịch nổi này cho vào dịch nổi vừa thu được ở trên.

- Ly tâm hỗn hợp dịch nổi trên để thu tế bào vi sinh vật 5000 rpm/5
phút. Loại bỏ dịch nổi bằng cách hút thật nhẹ nhàng, tránh vi sinh vật tan ra
và đi vào đầu tip hút mẫu.
- Rửa lại tế bào nhiều lần bằng PBS cho thật sạch, ly tâm thu tế bào với
tốc độ 2 lần đầu: 2000 rpm/5 phút; lần 3:3000 rpm/3 phút; lần 4: 4000 rpm/3
phút; lần 5: dồn TB các ống lại, ly tâm 4000 rpm/3 phút.
- Hòa TB vào 352,5 ul TE, bổ sung 2,5 ul lysozyme (100 mg/ml), 2 ul
RNase A (1%), ủ 37oC trong 10 phút.
- Bổ sung 3 ul protease K (20 mg/ml), 30 ul SDS 10%, ủ 37 oC trong 30
phút.
- Bổ sung 140 ul TE, 180 ul NaCl 5M, đảo đều, lắc nhẹ và ủ tiếp ở 65oC
trong 10 phút.

Nguyễn Thu Phương

17

Lớp K35C – Sinh


- Bổ sung tiếp 500µl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Sau
đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lúc này mẫu hình thành 3 lớp: lớp
trên cùng có DNA metagenome, lớp giữa là protein không có khả năng hoà
tan và lớp dưới cùng là phenol/chlorofom có chứa protein tạp.
- Bổ sung tiếp 500µl cholorofom/isoamylalcohol (24:1), ly tâm với tốc
độ 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Lặp lại 2 lần.
- Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% để tủa plasmid DNA. Ly tâm thu
tủa ở 13000 vòng/phút trong 20 phút.
- Bổ sung 500µl ethanol 70%, ly tâm với tốc độ 1300 vòng/phút trong
10 phút, thu tủa.

- Tủa được làm khô và hoà tan vào 30µl H2O cất khử trùng.
- Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8%.
Quy trình 2
L‎ấy ruột mối:
− Dùng một tờ giấy trắng đặt trên hộp nuôi mối để mối bám lên trên mặt
giấy, không bị lẫn các tạp chất khác. Mối thợ đầu trắng được nhặt riêng ra đĩa
petri vô khuẩn và cân. Cứ 0,95 g mối thợ tương đương với khoảng 300 mối.
− Nhỏ một giọt PBS vô khuẩn vào đĩa petri. Dùng kẹp đã được khử trùng
giữ thân mối và đuôi mối, kéo ruột mối ra nhẹ nhàng (lấy đủ cả ba phần ruột
mối).
− Giữ ruột mối trong ống eppendorff có dung dịch PBS 1X (300 ruột mối
trong 500 µl PBS).
Thu tế bào vi sinh vật:
− Ruột mối sau khi tách cho lên rây (đã khử trùng). Kích thước lỗ rây 0,2
mm, phía dưới rây là đĩa petri sạch.

Nguyễn Thu Phương

18

Lớp K35C – Sinh


− Dùng thìa (đã khử trùng) chà nhẹ để ruột mối vỡ ra tránh làm vỡ tế bào
ruột mối.
− Dùng PBS 1X rửa sạch tế bào trên rây.
− Hút dịch từ đĩa petri cho vào ống falcon 50 ml rồi đem ly tâm 600
vòng/phút, 10 phút, thu dịch, loại tế bào.
− Ly tâm dịch 700 v/ph, 10 phút, thu dịch, loại tế bào. Các bước ly tâm
này sẽ loại được tế bào ruột mối có lẫn trong mẫu.

− Ly tâm thu dịch tế bào 5000 v/ph, 5 phút (thực hiện 2 lần để lấy hết tế
bào vi khuẩn trong dịch).
− Rửa tế bào vi khuẩn nhiều lần bằng PBS 1X cho thật sạch, ly tâm thu tế
bào với tốc độ 2 lần đầu: 2000 v/ph 5 phút, lần 3: 3000 v/ph 3 phút, lần 4:
4000 v/ph 3 phút.
− Từ bước này, DNA metagenome của vi khuẩn được tách chiết theo như
qui trình 1.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose
Cơ sở lý thuyết :
Trong môi trường có pH trung tính, DNA mang điện tích âm. Do đó,
khi được đặt trong một điện trường đều, DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang
cực dương. Trong môi trường chứa agarose, các đoạn DNA có kích thước
khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (đoạn DNA có kích thước lớn
hơn sẽ di chuyển chậm hơn) và sẽ tách biệt trong quá trình chạy.
Quy trình:
 Chuẩn bị gel agarose :
+ Cân bột agarose hoà tan vào đệm TAE 1X sao cho được nồng độ
0,8%.

Nguyễn Thu Phương

19

Lớp K35C – Sinh


+ Đun sôi dịch agarose cho đến khi tan hết và để dịch nguội đến
khoảng 50ºC thì đổ vào khuôn có cài sẵn răng lược.
+ Gel sẽ đông và ổn định hoàn toàn trong 30 phút.
+ Rút lược nhẹ nhàng ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X

tới khi ngập mặt gel.
 Tra mẫu DNA vào giếng
+ Tuỳ vào mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng độ
gel cao hoặc thấp.
+ Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TAE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel.
Mẫu được trộn với loading dye 6X với tỷ lệ mẫu: loading dye là 5:1 và được
đưa vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100V
trong khoảng 30 phút.
+ Trong quá trình chạy cần quan sát sự di chuyển của bromophenol để
biết lúc nào cần dừng điện di.
 Nhuộm DNA bằng ethidium bromide
Quá trình điện di kết thúc khi bằng màu bromophenol chạy được 2/3
bản gel, bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ
0,5µl/ml trong khoảng 15 phút rồi rủa lại bằng nước.
 Quan sát và chụp ảnh
Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại
với bước sóng λ = 302nm.
2.2.3. Tinh sạch DNA metagenome bằng phương pháp troughing
Quy trình:
- Đổ một lớp gel agarose 0.8% lên khay đã cài lược và đợi gel đông.
- Tra mẫu 50-100 ul, chạy điện di 100V trong 20-25 phút.
- Soi gel, cắt giếng ngay phía dưới DNA, hút hết sạch TAE trong giếng.
- Bổ sung PEG 8000 30% vào giếng vừa cắt và điện di tiếp 10 phút.

Nguyễn Thu Phương

20

Lớp K35C – Sinh

- Hút hỗn hợp PEG 8000 và DNA ra eppendorf . Soi gel kiểm tra xem
DNA còn không, nếu còn thì bổ sung PEG 8000 30%, chạy điện di tiếp để thu
DNA triệt để.
- Bổ sung nước đầy ion (dH2O) vào dịch DNA- PEG 8000 với lượng
thể tích gấp đôi (2:1). Chia đều ra các ống eppendorf tùy vào lượng mẫu thu
được (mỗi ống khoảng 600 ul).
- Bổ sung tiếp Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1) với thể
tích 1:1, trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi.
- Bổ sung tiếp Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1) với thể
tích 1:1, trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi.
- Bổ sung tiếp Cholorofom:Isoamylalcohol (24:1) thể tích 1:1, trộn đều,
ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- DNA được tủa lại bằng 2,5 lần thể tích cồn 100%+2ul Glycogen
(10mg/ml)+50 ul Natri axetat 3M, để mẫu ở -80 o-C trong 25 phút, ly tâm
13000 rpm/15 phút, thu tủa.
- Rửa DNA lại bằng cồn 70%, ly tâm 13000rpm/5 phút.
- Tủa được làm khô nhờ máy Speed vac và hoà DNA vào 10 µl TE Ph 8,0.
- Hút 3µl mẫu để kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.4. Tinh sạch DNA bằng QIAGEN-QIAquick Gel Extraction kit
Quy trình:
- Điện di sản phẩm DNA cần được tinh sạch trên gel agarose 0.8%.
- Thu lấy phần gel agarose có DNA mong muốn.
- Bổ sung QG (thể tích QG=3 lần thể tích gel) và làm tan gel ở 50oC.
- Chuyển dịch mẫu sang cột QIAquick Spin (mỗi lần tối đa 800 µl), ly
tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút).
- Bổ sung 750 µl PE để rửa mẫu, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút, ly
tâm tiếp để loại hết cồn khỏi mẫu với tốc độ13000 vòng/phút.

Nguyễn Thu Phương

21

Lớp K35C – Sinh


- Chuyển cột qua ống eppendorf 1.5ml mới, bổ sung 30 µl nước deion
khử trùng, ủ trong 1 phút, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút, thu dịch (giữ ở
-80oC).
- Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8

Nguyễn Thu Phương

22

Lớp K35C – Sinh


Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO L‎UẬN
Mối có khả năng tiêu hóa được lignocellulose nói chung hay
hemicellulose nói riêng làm nguồn năng lượng có ích. Khả năng này có được
là nhờ một phần vào các vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối. Những sinh vật
này tiết ra các enzyme thủy phân lignocellulose thành đường, trong đó có
enzyme hemicellulase. Mặt khác, Việt Nam chúng ta lại là một nước nông
nghiệp, sản lượng phụ phẩm nông nghiệp chứa hemicellulose rất phong phú
như rơm, rạ, bã mía, gỗ, trấu,… Vì vậy, việc đi sâu nghiên cứu khả năng sử
dụng sinh khối hemicellulose để chuyển hóa thành các chất giá trị hơn như
nhiên liệu sinh học nhờ các enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật
cộng sinh trong ruột mối có một ý nghĩa rất lớn. Do đó, việc khai thác gen mã
hóa enzyme thủy phân hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột

mối là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, DNA metagenome của các sinh
vật trong ruột mối được tách chiết và tinh sạch thành công nhờ sự kết hợp các
phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại. Sau đó, sản phẩm DNA
metagenome này được giải trình tự và so sánh trình tự gen với các trình tự
gen ngân hàng quốc tế và từ đó sẽ khai thác gen.
Để nghiên cứu việc khai thác gen mã hóa enzyme thủy phân
hemicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối C. gestroi chúng tôi
đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau:
1. Tách DNA metagenome của vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối.
2. Tinh sạch DNA metagenome của vi sinh vật cộng sinh trong ruột
mối đủ tiêu chuẩn cho giải trình tự DNA metagenome bằng máy giải trình tự
thế hệ mới Ilumina.
3. Khai thác gen mã hóa hemicellulase.

Nguyễn Thu Phương

23

Lớp K35C – Sinh


3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome
3.1. 1. Thu ruột mối từ mối thợ thuộc loài Coptotermes gestroi
Để thu ruột chúng tôi sử dụng mối thợ vì đây là nhóm giữ chức năng
kiếm ăn cho cả tổ mối nên có hệ tiêu hóa phát triển đồng thời với hệ vi sinh
vật trong trong ruột phong phú để phân giải được các vật chất hữu cơ có
nguồn gốc hemicellulose mà mối ăn vào [22]. Trong tổ mối ta gặp nhiều nhất
là mối thợ và mối lính, đặc điểm phân biệt chúng là mối lính có đầu đen,
mình thuôn nhọn còn mối thợ thì đầu thường trắng hơn và mình tròn hơn [22]
(Hình 1.1).

Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi dùng một phương pháp để thu
mẫu ruột mối đó là: trước tiên phải làm ướt cả cơ thể mối để hạn chế chuyển
động của mối từ đó ta có thể bắt và giữ nó rễ ràng hơn. Sau đó, dùng một kẹp
giữ ngang phần thân mối, một kẹp rút phần mấu nằm ở cuối thân ra. Lúc này
cả đoạn ruột nối liền với phần mấu cũng sẽ ra theo. Ruột được ngâm trong
đệm PBS trong suốt quá trình mổ.

Hình 3.1: Hình ảnh ruột mối thu được dưới kính hiển vi
3.1.2.Tách chiết DNA metagenome của phức hệ vi sinh vật ruột mối
Vi sinh vật trong ruột mối có tới 99% là các vi sinh vật không nuôi cấy
được. Do đó để phân lập được gen từ các vi sinh vật này đặc biệt là các gen từ

Nguyễn Thu Phương

24

Lớp K35C – Sinh


vi khuẩn, đề tài đã tiếp cận phương pháp mới đó là metagenomics. Phương
pháp này cho phép tách hệ gen tổng số (metagenome) của hệ vi sinh vật trực
tiếp từ môi trường sống của nó mà không thông qua nuôi cấy do đó sẽ giảm
thiểu được sự mất mát nguồn gen quý trong quá trình thu mẫu. Tuy nhiên, do
tính không đồng nhất của tập hợp các tế bào vi sinh vật từ mỗi mẫu môi
trường (cấu trúc tế bào của các loài vi sinh vật khác nhau, nằm ở các pha sinh
trưởng khác nhau) và khả năng lớn là lẫn tạp chất từ vật chủ và môi trường
sống, nên không có một phương pháp chung nào hiệu quả cho việc tách
metagenome từ mọi loại môi trường. Bằng cột QIAamp, DNA metagenome
tách chiết được bị đứt gãy rất nhiều, tạo thành một dải trên điện di đồ (Hình
3.2). Như vậy DNA này không đủ chất lượng để giải trình tự metagenome.

M

1

2

Hình 3.2: Ảnh điện di DNA metagenome được tách từ hệ vi sinh vật trong ruột mối
bằng QIAamp DNA mini kit (Qiagen) trên gel agarose.

1:

DNA metagenome tách từ ruột mối đã xử lý cồn 100% qua đêm.

2:

DNA metagenome tách từ ruột mối (giữ trong TE).

M:

Thang chuẩn 1 kb.

Nguyễn Thu Phương

25

Lớp K35C – Sinh