Tuyển chọn và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để các chủng lactobacillus plantarum (r7, r8, r12, t12t1) có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharides cao

MỤC LỤC
MỤC LỤC........................................................................................................1
DANH MỤC CÁC HÌNH...............................................................................4
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................3
1.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic....................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic....................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic...................................................3
1.1.3. Phân loại các chủng vi khuẩn lactic [9]..............................................................4
1.1.3.1. Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus................................................4
1.1.3.2. Aerococcus, Pediococcus...........................................................................5
1.1.3.3. Leuconostoc, Oenococcus..........................................................................5
1.1.3.4. Lactobacillus...............................................................................................6
1.1.4. Lactobacillus plantarum.....................................................................................7
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysaccharide ở vi khuẩn
Lactobacillus................................................................................................................ 7
1.1.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon [4]...............................................................7
1.1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ [25]..................................................................8
1.1.5.3. Ảnh hưởng của các muối vô cơ và các chất kích thích sinh trưởng............8
1.1.5.4. Nhiệt độ nuôi cấy........................................................................................9
1.1.5.5. pH của môi trường nuôi cấy........................................................................9
1.2. Tổng quan về exopolysaccharides...........................................................................9
1.2.1. Khái niệm về exopolysaccharides....................................................................10
1.2.2. Phân loại..........................................................................................................10
1.2.3. Cấu trúc của EPS............................................................................................11
1.2.4. Qúa trình sinh tổng hợp EPS [10]....................................................................13
1.2.5.Ứng dụng của EPS...........................................................................................15
1.2.5.1. Trong công nghệ thực phẩm.....................................................................15
1.2.5.2.Trong y học................................................................................................15

1.2.5.3. Một số EPS điển hình...............................................................................16

PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............19
2.1.Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................19
2.2. Thiết bị và hóa chất sử dụng..................................................................................19
2.2.1. Thiết bị sử dụng...............................................................................................19
2.2.2. Hóa chất.......................................................................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................20
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh.....................................................................20
2.2.1.1. Nguyên tắc................................................................................................20
2.2.2.2. Tiến hành..................................................................................................20
2.2.2 Phương pháp thu nhận EPS.............................................................................21
2.2.2.1. Quy trình...................................................................................................21
2.2.2.2. Thuyết minh quy trình................................................................................22
2.2.3. Phương pháp xác định mật độ tế bào..............................................................22
2.2.3.1. Nguyên tắc................................................................................................22
2.2.3.2. Tiến hành..................................................................................................22
2.2.4. Phương pháp xác định pH...............................................................................23
2.2.5. Phương pháp định lượng EPS........................................................................23
2.2.5.1. Nguyên tắc................................................................................................23
2.2.5.2. Cách tiến hành..........................................................................................23
2.2.6. Phương pháp toán học....................................................................................24

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................24
3.1. Khảo sát tìm chủng có khả năng sinh EPS cao nhất trong môi trường MRS.........24
3.2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng Lactobacillus plantarum R8 ở
các môi trường thay thế................................................................................................26
3.2.1.Môi trường thay thế glucose bằng saccharose.................................................26
3.2.2. Môi trường thay thế glucose bằng lactose.......................................................28
3.2.3. Môi trường thay thế glucose bằng đường trong nước dừa..............................29

3.3. So sánh giữa các môi trường.................................................................................31


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................33
I.Kết luận....................................................................................................................... 33
II.Kiến nghị.................................................................................................................... 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................34
PHỤ LỤC.......................................................................................................39


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cơ chế tổng hợp EPS....................................................................13
Hình 3.1..........................................................................................................25
Hình 3.2. Hàm lượng EPS của 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum
R7, R8, R12, T12T1 trong môi trường MRS..............................................25
Hình 3.2. Hàm lượng EPS của chủng Lactobacillus plantarum R8 ở môi
trường thay thế glucose bằng saccharose....................................................27
Hình 3.3. Hàm lượng EPS của chủng R8 ở môi trường thay thế glucose
bằng lactose....................................................................................................28
Hình 3.4. Hàm lượng EPS của chủng R8 ở môi trường thay thế glucose
bằng đường trong nước dừa.........................................................................30
Hình 3.5. Hàm lượng EPS của chủng R8 ở 4 môi trường..........................31


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, con người ngày càng
tiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều hơn về thế giới sinh vật nói chung và hệ vi
sinh vật nói riêng. Với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiên

cứu thành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, góp
phần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất, trong y học, trong xử lý môi
trường. Một trong những sản phẩm quan trọng đó là exopolysaccharides [32].
Exopolysaccharides là những polymer trọng lượng phân tử cao, được tiết
ra bởi một số vi khuẩn và nấm vào môi trường xung quanh [5]. Việc sinh tổng
hợp exopolysaccharides còn phụ thuộc vào chủng vi khuẩn, điều kiện vật lý,
thành phần môi trường sử dụng trong nuôi cấy... Trong số nhiều loại
exoplysaccharides được sản xuất bởi vi sinh vật, vi khuẩn Lactic (LAB) được
sử dụng nhiều vào thời gian gần đây nhất và được quan tâm nhất bởi những
lợi ích của exopolysaccharides từ vi khuẩn này đã được nghiên cứu và cho
thấy những thuộc tính an toàn đối với sức khỏe [10]. Hơn nữa, việc sản xuất
exopolysaccharides từ vi khuẩn dễ dàng hơn và có thể tạo ra một lượng lớn
trong thời gian ngắn so với polysaccharides được sản xuất từ thực vật và tảo.
Exoplysaccharides từ Lactobacillus plantarum C88 (Li Zhanga và cộng
sự, 2013)[40] đã được báo cáo trên tạp chí quốc tế sinh học phân tử có tác
dụng chống oxy hóa, giảm cholesterol trong máu … exoplysaccharides từ
Lactobacillus plantarum 70810 (Kun Wang và cộng sự)[38] được xem là chế
phẩm sinh học: giảm cholesterol, bảo vệ gan, có tiềm năng probiotic cũng như
hoàn thiện cấu trúc cho sản phẩm thực phẩm. Exoplysaccharides từ
Lactobacillus debrueckii subsp.bulgaricus (Junko Nishimura, 2014) [8] góp
phần vào chức năng vật lý và sinh học của các sản phẩm sữa, ngoài ra, giúp
tăng cường hệ thống miễn dịch và giảm cholesterol. Theo báo cáo của
K.Czaczyk và cộng sự (2007) [6] cho thấy rằng hầu hết các polysaccharides
ngoại bào đều có vai trò quan trọng trong việc hình thành màng sinh học.
Việc phát hiện và phát triển các exopolysaccharides vi sinh vật đã mang
lại lợi ích to lớn trong nền công nghiệp. Trong công nghiệp thực phẩm nó góp
phần vào việc tạo hương vị, kết cấu, và thời hạn sử dụng của thực phẩm lên
men (De Vuyst and Degeest 1999). Exopolysaccharides cũng có một vai trò
quan trọng trong các bệnh nhiễm trùng nội nha. Màng sinh học
1

exopolysaccharides còn được ứng dụng làm màng lọc sinh học trong xử lý
môi trường và màng trị bỏng trong y học [29-32]
Xuất phát từ những vấn đề trên nên tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và
xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để các chủng Lactobacillus
plantarum (R7, R8, R12, T12T1) có khả năng sinh tổng hợp
exopolysaccharides cao’’ với mục đích :
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Exopolysaccharides của 4 chủng
Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) trên môi trường MRS để chọn
chủng sinh tổng hợp EPS cao nhất.
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng cao nhất trong các
môi trường : thay thế glucose bằng saccharose, thay thế glucose bằng lactose,
thay thế glucose bằng hàm lượng đường có trong nước dừa.

2


PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.1.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn gram dương, hình cầu hoặc que,
catalase và oxidase âm tính, không hình thành bào tử, không di động, nhiều
loài trong chúng là những vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí và có khả năng
tồn tại cả hiếu khí cũng như kỵ khí.catalase âm tính, sống trong điều kiện từ
vi hiếu khí đến kị khí nghiêm ngặt. Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải
hydratcacbon và sản xuất số lượng lớn axit lactic và một số nhỏ các hợp chất
khác là sản phẩm của quá trình chuyển hóa carbonhydrate của chúng [9]
Các nhóm chủ yếu của vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Ngoài ra còn có các nhóm khác

là Tetragenococcus và Vagococcus [9].
Các vi khuẩn lactic được tìm thấy trong thực phẩm (sản phẩm từ sữa, thịt
lên men, bột chua, rau lên men, đồ uống, thức ăn ủ rượu…), trên cây, trong
nước thải, nhưng cũng có thể là trong đường sinh dục, đường ruột và hô hấp
của con người và động vật [2].
Trong ngành công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn lactic hoạt động như là
sinh vật có lợi và đồng thời cũng là các sinh vật gây hư hỏng. Chúng được sử
dụng trong sản xuất các sản phẩm sữa lên men như sữa chua, pho mát, bơ,
trong sản xuất xúc xích, dưa chua, dưa cải bắp… Kết quả của những quá trình
lên men là ổn định chất lượng và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Tuy
nhiên, nếu sự phát triển của vi khuẩn lactic không được kiểm soát thì chúng
có thể là một nguyên nhân chính gây hư hỏng thực phẩm. Các chi thường
được sử dụng trong các quá trình công nghiệp là Lactococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc, Pediococcus, Oenocococcus và Streptocococcus.
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là loài lên men bắt buộc, chúng không có
cytochrome.Tuy nhiên, chúng có thể sinh trưởng trong điều kiện có oxy
không khí là nhờ có peroxydase giúp phân giải H 2O2 thành H2O và O2 . Vì
vậy, người ta thường gọi những vi sinh vật này là những sinh vật hiếu khí tùy
ý hoặc kị khí không bắt buộc [2].
Khả năng sinh tổng hợp những hợp chất cần cho sự sống là rất yếu, nên

3


chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, nhiều
loại vitamin…, không có khả năng tổng hợp nhân hem của porphyrine.
Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất sinh trưởng rất phức tạp. Không một
đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trong môi trường muối khoáng
thuần khiết chứa glucose. Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin,

tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin) và các amino acid .
Vi khuẩn lactic có các nhóm chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus và Streptococcus. Theo phân loại thì vi khuẩn lactic có khoản 20
chi, tuy nhiên trong công nghệ thực phẩm chỉ sử dụng các chi sau :
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Oenococc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus, và Weissella [9].
1.1.3. Phân loại các chủng vi khuẩn lactic [9]
1.1.3.1. Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus
Mặc dù có sự phân tách và hình thành các chi mới nhưng chi
Streptococcus vẫn là một chi lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo. Chi
này được phân thành ba nhóm: trùng sinh mủ, đường uống và liên cầu khuẩn
streptococci khác. Nhóm sinh mủ có chứa một số tác nhân gây bênh nổi bật
như Streptococcus pyogenes và Streptococcus agalactiae. Một tác nhân khác
là Streptococcus pneumonia trước đây thuộc nhóm này nhưng đã được
chuyển qua nhóm đường uống, trong đó chủ yếu là loài liên quan đến khoang
miệng của người và động vật. Một số liên cầu khuẩn đường miệng, ví dụ
như . Streptococcus mutans có thể là tác nhân sâu răng và nhiễm trùng khác.
Loài được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là Streptococcus
thermophilus, được sử dụng trong sản xuất sữa chua và một số loại phô mai.
Loài này được xếp vào nhóm Streptococcus “khác”. Chúng có khả năng chịu
nhiệt cao, có thể phát triển ở cả nhiệt độ 52oC .
Lactococcus có liên hệ chặt chẽ với công nghệ chế biến sữa, nhưng trong
số năm loài được công nhận chỉ có Lactococcus lactic là thực sự được sử
dụng trong công nghệ sản xuất sữa. Ba phân loài của Lactococcus lactic có
thể được phân biệt: Lactococcus lactic subsp. lactic, Lactococcus lactic
subsp. cremoris, và Lactococcus lactic subsp. hordniae. Có hai loài đầu tiên
rất quan trọng trong chế biến sữa. Lactococcus. lactic subsp. lactic được phân
biệt với Lactococcus. lactic subsp. Cremoris không có khả năng phát triển ở
40oC, phát triển ở nồng độ NaCl 4%, thủy phân arginine, và lên men ribose.

4


Đặc điểm phân biệt giữa Lactococcus, Enterococcus và Streptococcus chủ
yếu dựa vào khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau và nồng độ NaCl
khác nhau. Trong khi các chủng Lactococcus không thể phát triển ở 45 oC,
NaCl 6,5% và pH 9,6 thì các chủng Enterococcus lại phát triển được trong cả
ba điều kiện trên, không có quy luật chung cho nhóm Streptococcus.
Một số loài Enterococcus, đặc biệt là Enterococcus faecalis là những tác
nhân gây bệnh cơ hội, vì thế chúng không mong muốn có trong thực phẩm.
Tuy nhiên hiện nay, các chế phẩm của Enterococcus faecium và
Enterococcus faecalis được sử dụng như là probiotic. Enterococcus cũng đã
được chứng minh là có mặt trong một số loại phô mai địa phương ở châu Âu
và một số sản phẩm từ thịt.
1.1.3.2. Aerococcus, Pediococcus
Chi Aerococcus hiện nay có năm loài. Nhìn chung chi này ít có vai trò
trong công nghệ thực phẩm.
Pediococcus là dạng vi khuẩn lactic di động, catalase và oxydase âm
tính, Gram dương, lên men đồng hình, chịu axit. Pedicoccus đóng vai trò rất
quan trọng trong công nghệ thực phẩm.
Pediococcus damnosus, Pediococcus claussenii và Pediococcus
inopinatus, được phân lập từ bia hoặc tìm thấy tại nhà máy bia. Pediococcus
damnosus là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của chúng có
thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl và acetoin, gây đục bia, tạo mùi chua, làm
cho bia có vị giống bơ và làm cho bia rất nhớt. Pediococcus acidilactici và
Pediococcus pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi cấy khởi đầu trong
sản xuất xúc xích, chúng còn có vai trò quan trọng trong sự chín của phô mai.
Trong chăn nuôi gia cầm Pediococcus acidilactici được sử dụng để làm chế
phẩm sinh học thúc đẩy tăng trưởng và bảo vệ vật chủ. Các đặc tính chính để
phân biệt giữa các loài là các loại đường lên men, thủy phân arginine, tăng

trưởng ở mức pH khác nhau (7,0 và 4,5).
1.1.3.3. Leuconostoc, Oenococcus
Các nghiên cứu phát sinh loài cũng tiết lộ rằng Leuconostocs ở rượu
vang còn được gọi là Leuconostocs oenos, chỉ có họ hàng xa với
Leuconostocs khác và loài này vì vậy đã được tách ra và tạo thành một chi
mới. Chi này được gọi là Oenococcus. Chi này có khả năng chịu được nồng
độ rượu và axit cao.
5


Leuconostoc được phát hiện trong rau xanh và rễ cây, trong các sản
phẩm lên men từ thực vật như dưa chuột, kim chi, củ cải và cũng có trong
nguyên liệu sữa, các sản phẩm từ sữa, thịt gia cầm, cá. Đáng chú ý là nó được
phân lập từ ruột cá.
Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum và Leuconostoc
gelidum liên quan đến việc làm hư hỏng thực phẩm, nó làm biến đổi không
khí trong các sản phẩm đóng gói, làm phồng gói và thay đổi màu sắc, mùi vị.
1.1.3.4. Lactobacillus
Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic. Chúng là
những vi khuẩn gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵ
khí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí. Chi này gồm khoản 80 loài và nó không
đồng nhất về hình thái, đặc điểm sinh hóa, sinh lý.
Tế bào Lactobacillus hình que và thường có đường kính (0,5 -1,2)× (1,0 –
10,0)µm, kết thành chuỗi ngắn nhưng thỉnh thoảng có dạng gần giống hình cầu.
Khuẩn lạc trên môi trường agar có kích thước 2-5nm, dạng lồi, mờ đục, và
không nhuộm màu. Những tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp và
giàu dinh dưỡng, có khả năng lên men và thủy phân 1 số loại đường, ít nhất 1
nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactate. Không khử được nitrat,
không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochorme. Các loài trong
chi Lactobacillus có thể tiến hành cả lên men lactic đồng hình thông qua con

đường Embden-Meyerhof hoặc dị hình thông qua con đường pentosephosphate. Chúng phát triển mạnh trong môi trường có tính axit, tùy loài mà
pH dao động từ 4,5 đến 6,4. Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 30-400C.
Lactobacillus tồn tại trong tự nhiên ở thực vật và đất, trong cơ thể người
ở đường tiêu hóa, niệu sinh dục, khoang miệng. Lactobacillus tồn tại trong
nhiều loại thực phẩm khác nhau và rất an toàn, chúng được sử dụng làm khởi
điểm cho quá trình lên men thực phẩm và sử dụng làm chế phẩm sinh học.
Được tìm thấy trong nhiều sản phẩm như sữa chua, phomat, sữa lên men. Các
sản phẩm truyền thống như kim chi Hàn Quốc và sữa chua kerfi. Vì chúng có
thể sống sót trong môi trường axit nên thường được dùng trong ủ chua thức
ăn và lên men rau quả. Các chủng sử dụng trong ủ chua thức ăn gia súc là
Lactobacillus plantarum và Lactobacillus buchneri. Chi Lactobacillus cũng
được tìm thấy trong các loại thịt, như Lactobacillus sakei được tìm thấy trong
thịt lên men. Trong đồ uống cồn như bia, rượu vang, đóng vai trò vào việc tạo
hương vị cho sản phẩm. Tuy nhiên, đôi khi chúng cũng có thể làm hỏng thực
6


phẩm do một số sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng làm cho thực
phẩm như bia, sữa, thịt có mùi khó chịu.
1.1.4. Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum là những vi khuẩn gram dương, trực khuẩn nhỏ,
thường kết đôi hoặc chuỗi, tế bào hình que. Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 15450C và ở mức độ pH thấp là 3,2. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 300C.
Nó thường được tìm thấy trong con người và động vật có vú khác qua dạ
dày, nước bọt, và các sản phẩm thực phẩm khác nhau: bắp cải muối, dưa
chua, kim chi Hàn Quốc, bột làm bánh, nguyên liệu thực vật lên men, một số
loại pho mát, xúc xích lên men, và cá hồi phơi khô không có muối.
Lactobacillus plantarum được quan tâm hiện nay bởi các nhà nghiên cứu
và các ngành công nghiệp thực phẩm vì nó được coi là một probiotic an toàn.
Nó có thể giúp hạn chế số lượng vi khuẩn gây bệnh hoặc bệnh có thể có một
tác động tiêu cực đối với con người. Có vai trò quan trọng trong việc tạo nên

kết cấu cho các sản phẩm thực phẩm. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây chỉ ra
rằng Lactobacillus plantarum có thể được sử dụng như một phương tiện
vaccine, giảm cholesterol trong máu, bảo vệ gan.
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysaccharide ở vi
khuẩn Lactobacillus
Trong công nghiệp, vật liệu dể làm môi trường cho vi sinh vật phát triển
cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu
suất thu hồi lớn nhất và giá thành rẻ nhất. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp
không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy
mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm
sinh khối sau này.
1.1.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon [4]
Cacbon là thành phần chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ
thể của mọi loài vi sinh vật. Vì vậy, sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon
thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá
trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại cacbonhydrat, từ các hexose
(glucose, fructose, mantose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose,
maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin).
Glucose ở dạng D-glucose, là loại monosaccharide dễ hấp thụ nhất.
7


chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hóa
hơn. Vì vậy, trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này
cho vi sinh vật dễ hấp thụ.
Lactose là disaccharide, nó là đường có trong sữa người và động vật.
Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vì
chúng có khả năng sinh enzyme β-galactosidase. Enzyme này thủy phân
lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vi

khuẩn được dễ dàng hơn.
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là
monosaccharide và disaccharide. Các nguồn cacbon này được dùng để cung
cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào.
1.1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ [25]
Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của vi sinh vật. Vật
chất cơ bản của tế bào (protein, acid nuleic…) đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng
một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi
khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều acid amin khác nhau do đó chúng
cần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo cho sự phát triển của mình.
Acid amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptid nhờ và tác dụng của enzym
protease nội bào hay ngoại bào.
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau.
Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức
tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để sinh
trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin,
vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ quan trọng như các sản phẩm
thủy phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, dịch nấm men thủy phân,
dịch chiết thịt …Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng cho quá
trình nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp cần nghiên cứu những nguồn
nitơ thích hợp để sản xuất giúp làm giảm giá thành mà nâng cao được hiệu quả
sản xuất. Trong đó, dịch nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều.
1.1.5.3. Ảnh hưởng của các muối vô cơ và các chất kích thích sinh trưởng
Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng lại
có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối
với Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn
lactic, hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzyme protese thủy phân một số
8

protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào . Nhìn chung mangan và magie là
những chất đóng vai trò chủ yếu sau:
+ Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme
+ Giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy
+ Ổn định cấu trúc tế bào
Mangan là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp
vi khuẩn lactic sử dụng tốt hơn các loại đường.
Các chất chứa acid béo có mặt trong môi trường cũng có ảnh hưởng
không nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chúng không
những kích thích sinh trưởng mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông
sau này. Ví dụ Tween 80 sẽ làm thay đổi một số acid béo trong tế bào vi
khuẩn lactic [6].
1.1.5.4. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của vi sinh vật nói chung
và của vi khuẩn nói riêng. Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt
độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật được chia
làm 3 nhóm: nhóm ưa lạnh và chịu lạnh, nhóm ưa ấm và nhóm chịu nhiệt.
Một nghiên cứu điều tra các điều kiện nôi cấy tối ưu cho sản xuất EPS
bởi Lactobacillus delbrueckii subsp, bugaricus đã xác định được nhiệt độ tối
ưu cho sản xuất EPS là khoảng 36 – 39 oC. Nhiệt độ tối ưu cho sản xuất EPS
là khoảng 40oC cho các chủng LAB ưa nhiệt, và khoảng 25 oC cho LAB
mensophilic. Những ảnh hưởng nhiệt độ đối với sản xuất EPS trong whey đã
được nghiên cứu trong Lactobacillus plantarum là 37oC [8].
1.1.5.5. pH của môi trường nuôi cấy
ở pH: 6,2. pH ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp của EPS
của vi sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho
việc sinh tổng hợp EPS. pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, kiềm hay
trung tính [6-8]
Trong một nghiên cứu được tiến hành với Lactobacillus sake, pH tối ưu
cho sản xuất EPS là 5,8 nhưng con số di động đã đạt được

1.2. Tổng quan về exopolysaccharides
Lịch sử của exopolysaccharides vi khuẩn bắt đầu trong giữa thế kỷ 19
9


với sự phát hiện của một exopolysaccharide trong rượu vang, mà sau này
được biết đến như dextran và prokaryote chịu trách nhiệm cho việc sản xuất
được xác định bởi Leuconostoc mesenteriodes. Trong suốt thời gian sau này,
exopolysaccharides khác phát hiện bao gồm cellulose, alginate và xanthan.
Những tiến bộ trong khoa học dẫn đến việc nghiên cứu sâu sắc hơn về bản
chất, cấu trúc của chúng cũng như những thành tựu đáng kể mà
exopolysaccharide mang lại cho nền công nghiệp nói chung và thực phẩm nói
riêng [32].
1.2.1. Khái niệm về exopolysaccharides
Exopolysaccharide là những polymer có trọng lượng phân tử cao, được
tiết ra bởi một loại vi sinh vật vào môi trường xung quanh, là polysaccharides
chuỗi dài phân nhánh, bao gồm các đơn vị đường hoặc dẫn xuất đường lặp đi
lặp lại. Những đơn vị đường chủ yếu là glucose, galactose và rhamnose, tỷ lệ
khác nhau [5]. Chúng được bài tiết vào môi trường xung quanh trong quá
trình tăng trưởng và không được gắn vĩnh viễn vào bề mặt của tế bào vi sinh
vật [. Điều này phân biệt chúng với các polysaccharides cấu trúc tương tự
(CPSs), mà chúng vẫn gắn vĩnh viễn vào bề mặt của các tế bào.
Vi sinh vật tổng hợp nhiều loại polysaccharides đa chức năng bao gồm
polysaccharides nội bào, polysaccharides cấu trúc, polysaccharides ngoại bào
hay còn gọi là exopolysaccharides (EPS).
Độ dày thông thường của lớp EPS là từ 0,2-1,0µm. Trong một số loại vi
khuẩn độ dày của lớp EPS không vượt quá giá trị từ 10-30 nm [6]. Cấu trúc hóa
học của các chất polyme được tiết ra bởi tế bào vào môi trường rất đa dạng.
1.2.2. Phân loại
Dựa vào thành phần hóa học, exopolysaccharides có thể được xem xét

dựa trên thành phần monomeric và được chia làm 2 nhóm (Sutherland 1997):
homopolysaccharides và heteropolysaccharides.
Homopolysaccharides chỉ chứa một loại monosaccharide (ví dụ như
cellulose, dextran, mutan, alternan, pullulan, levan và curdlan)
Homopolysaccharides có bốn nhóm chính: α-D-glucans, β-D-glucans,
fructans và polygalactan. α-D-glucans sản xuất bởi Leuconostoc mesenteroides, liên kết chủ yếu là α–D-1,6 -glucosyl. Mức độ liên quan đến việc phân
nhánh thể hiện ở liên kết α-1,3 -glucosyl, ít khi thể hiện liên kết α -1,2 và α
-1,4 glucosyl. β-D-glucans được tổng hợp bởi Pediococcus spp,
10


Streptococcus spp. Các phân tử được liên kết với nhau bởi liên kết β-1,3
glucosyl. Fructans sản xuất bởi Streptococcus salivarius liên kết với nhau bởi
liên kết β-2,6 fructosyl [8]. Homopolysaccharide được phân thành hai
loại:polymer mạch thẳng và polymer mạch nhánh. Một ví dụ của một
homopolysaccharide mạch thẳng là cellulose vi khuẩn (polyglucose).
Homopolysaccharides mạch nhánh được đại diện bởi levans (polyfructoses)
và dextrans (polyglucose) [6-13-19].
Homopolysaccharides EPS được tổng hợp bằng các enzyme
glycosyltransferase
(GTF)
hoặc
fructosyltransferase
(FTF).
Homopolysaccharides EPS sản xuất từ LAB cũng sử dụng enzyme GTF để
tổng hợp polymer cao phân tử α-glucans từ sucrose. Quá trình này sử dụng
sucrose, năng lượng cần thiết cho quá trình này đến từ việc thủy phân sucrose.
Dextran sản xuất từ Leuconostoc mesenteroides là một homopolysaccharide.
Leuconostoc mesenteroides có khả năng tiết glucansucrase và tổng hợp αglucan polymer từ glucose được giải phóng. Glucansucrase thường hình thành
mối nhiều mối liên kết glucosyl, do đó dextran sản xuất từ Leuconostoc

mesenteroides không chỉ chứa liên kết α-1,6 glucosyl mà còn cả liên kết α2,3,4 glucosyl. Dextran được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp y
tế và sinh hóa. Các dẫn xuất dextran đã được phát triển và được sử dụng rộng
rãi và có giá trị thương mại cao [13-19].
Heteropolysaccharides bao gồm các đơn vị lặp đi lặp lại của D-glucose,
D-galactose, L-rhamnose và trong một một số trường hợp, có Nacetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc) hoặc axít
glucuronic (GlcA). Các mối liên kết giữa các đơn vị monosaccharide và các
nhánh của chuỗi xác định tính chất vật lý của heteropolysaccharides [7-13].
Heteropolysaccharide được tổng hợp bởi các enzyme transferases
glycosyl nội bào [2]. Cụ thể, saccharides đưa vào tế bào được sử dụng như một
nguồn năng lượng của Embden-Meyerhof (EM), heteropolysaccharide được
tổng hợp qua trung gian của con đường glycolysis trong các tế bào. EPS được
thực hiện bằng cách trùng hợp của các đơn vị lặp đi lặp lại, và các đơn vị lặp lại
được xây dựng bởi sự bổ sung các đường nucleotide ở màng tế bào chất [6].
1.2.3. Cấu trúc của EPS
Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xác định thành phần đường của
EPS, mặc dù cấu trúc hóa học không được phân tích [13] [26] - [31]. Trong

11


những nghiên cứu, glucose (GLC), galactose (Gal), rhamnose (Rha) được tìm
thấy là những loại đường chính, và các đườngkhác, chẳng hạn như mannose
(Man), fructose (FRU) cũng có mặt [22].
Bảng 1.1. Các thành phần chung của exopolysaccharides [17]
Components
Example
Pentose sugars
D-arabinose
D-ribose
D-xylose

Hexose sugars
D-glucose
D-galactose
D-mannose
D-allose
L-rhamnose
L-fucose
Amino sugars
D-glucosamine
D-galactosamine
Uronic acids
D-glucuronic acids
D-galacturonic acids
D-mannuronic acid
Organic substituents
Acetate,
Succinate
Pyruvate
Glycerate
Hydroxybutanoate
Inorganic substituents
Sulfate
Phosphate

12


1.2.4. Qúa trình sinh tổng hợp EPS [10]

Hình 1.1. Cơ chế tổng hợp EPS

13


Thuyết minh cơ chế tổng hợp EPS như sau :
(Hình 1.1a): Cơ chất đi vào tế bào thông qua những con đường vận
chuyển riêng biệt. Ví dụ, glycerol đi qua màng tế bào nhờ quá trình khuếch tán
do sự giảm nồng độ của nó; trong khi đó, sự vận chuyển của hầu hết các loại
đường gắn với động lực proton thông qua hệ thống vận chuyển ATP (ví dụ, các
nhóm vận chuyển các loại đường), theo đó quá trình thủy phân ATP cung cấp
năng lượng để vận chuyển cơ chất ngược dòng gradient nồng độ của chúng.
(Hình 1.1b): Cơ chất đi vào tế bào trước tiên được chuyển hóa bởi con
đường glycolysis tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí, sau đó pyruvate
được chuyển hóa thành Acetyl-CoA và tiếp đó đi vào chu trình Tricarboxylic
acid. Những chất chuyển hóa cấp 1 tạo ra từ những con đường chuyển hóa
này là tiền thân của quá trình tổng hợp sinh học của những phân tử sinh học
nhỏ (ví dụ aminoacids, ribonucleotides và hexoamines).
(Hình 1.1c): Đường phosphoryl hóa được chuyển hóa thành những
monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu là đường nucleoside diphosphate
(NDP). Những tiền chất này (ví dụ như UDP-Glc, UDP-Gal and GDP-Man)
được chuyển hóa tương tác qua thông qua những phản ứng đồng phân hóa,
phản ứng oxi hóa, phản ứng decarboxy hóa, phản ứng khử, và phản ứng
chuyển vị.
(Hình 1.1d) Quá trình tổng hợp polysaccharide và polyme hóa xảy ra qua
một trong hai cơ chế sau:
(i): Trong hệ thống phụ thuộc Wzx-Wzy (trái), đơn vị lặp lại được tổng
hợp bởi quá trình chuyển tuần tự các monosaccharides từ đường NDP thành
chất mang polyprenylphosphate lipid. Những đơn vị lặp lại trưởng thành được
vận chuyển qua màng bên trong bởi một enzyme flippase giả định (Wzy) đến
bề mặt bào chất nơi mà quá trình polymer hóa diễn ra do hoạt động của một

polymerase (Wzy giả định). Đối với nhiều loại vi sinh vật, phương thức (con
đường) chuyển vị mở rộng vỏ tế bào được hình thành do enzyme
polysaccharide copolymerase (PCP) quyết định chiều dài chuỗi polymer, và
một protein giải phóng màng tế bào polysaccharide bên ngoài (OPX) dẫn đến
sự hình thành các kênh.
(ii): Trong hệ thống vận chuyển phụ thuộc ABC (phải), polysaccharide
được polymer hóa ở bề mặt tế bào chất của màng tế bào bên trong thông qua
14


việc bổ sung liên tục các đơn vị đường đến đầu không khử của chuỗi polymer.
Polymer được giải phóng qua màng tế bào bên trong thông qua hệ thống vận
chuyển ABC, tiếp đến là sự chuyển vị của nó trên toàn bào chất và màng tế
bào bên ngoài thông qua PCP và OPX protein.
1.2.5.Ứng dụng của EPS
1.2.5.1. Trong công nghệ thực phẩm
Exopolysaccharides được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic (LAB) đã
được báo cáo với các đặc tính độc đáo để tạo điều kiện ứng dụng trong ngành
công nghiệp thực phẩm như ổn định, keo, hoặc chất nhũ hoá. EPS sản xuất từ
LAB đã được sử dụng rộng rãi để cải thiện tính lưu biến, kết cấu, trạng thái
các sản phẩm sữa lên men như sữa chua và pho mát. Vì vậy, EPS từ LAB có
tiềm năng phát triển như các chất phụ gia thực phẩm hoặc các thành phần
thực phẩm chức năng với cả sức khỏe và các lợi ích kinh tế [17-25].
Đối với ngành công nghệ thực phẩm nói riêng, sự hình thành các màng
sinh học trên bề mặt giúp thực phẩm hạn chế được nguy cơ tiếp xúc với các vi
sinh vật gây hỏng cũng như bảo vệ sản phẩm trước tác hại của một số yếu tố
về môi trường [6].
1.2.5.2.Trong y học
Do có tính chất miễn dịch, một số thấp exopolysaccharides được sử dụng
như là thành phần không thể thiếu vắc xin, tá dược, hoặc các protein kháng

nguyên. Gần đây một số chủng Lactobacillus plantarum được coi là chế phẩm
sinh học do một số tính chất có lợi của nó (làm giảm cholesterol, bảo vệ
gan…) [14-16].
Một ứng dụng quan trọng của màng sinh học chính là làm màng trị bỏng.
Người ta dùng màng trị bỏng để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết
thương bỏng, tạo điều kiện che phủ vết thương. Qua đó, rút ngắn thời gian
điều trị và giảm thiểu thẹo xấu trên vùng da bỏng sâu. Chế phẩm này có khả
năng thấm nước cao, kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò
như màng sinh học.Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ra
nhiễm trùng các vết thương hở. Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và không
cần sử dụng thêm bất cứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thời
làm vết thương mau lành do quá trình thúc đẩy tái tạo mô da [29].

15


1.2.5.3. Một số EPS điển hình
a. Xanthan
Xathan có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực đa dạng như phục hồi
dầu thô, sơn công nghiệp, thuốc trừ sâu và chất tẩy rửa công thức, mỹ phẩm,
dược phẩm, mực in, và thực phẩm (Vandamme và Soetaert 1995; Sutherland
1997; 1998; Năm 1999; Kumar et al. 2007; Kumar và Mody 2009). Xanthan
là một polysaccharide ngoại bào được sản xuất bởi các vi khuẩn
Xanthomonas campestris gồm homopolysaccharide D-glucose với mạch phân
nhánh là trisaccharide [13-17]
Xanthan có độ nhớt thay không đổi đáng kể khi tăng nhiệt độ, ổn định ở
cả axit và pH kiềm. Nó tạo thành các chất phân tán trong nước và cũng có thể
hình thành gel trong dung dịch. Xanthan gum có nhiều ứng dụng và nhận
GRAS (thường được coi là an toàn) niêm yết cho mục đích ăn được. Trong lĩnh
vực thực phẩm, xathan được dùng để làm mát và gói giấy bọc thực phẩm, phô

mai nhũ tương. Ngoài ra, nó còn được dùng làm chất ổn định kem đánh răng,
thức ăn gia súc bổ sung. Giải pháp của nó cũng được sử dụng như chất bôi trơn
cho khoan máy được sử dụng trong bùn khoan tại giếng khoan dầu [17]
b. Gellan
Gellan là một sản phẩm của vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis
(Sutherland 2002). Các tính chất hóa lý của gellan đáng quan tâm là nó có độ
nhớt cao và ổn định ở nhiệt độ cao (Banik et al. 2000). Nó là một chất gel
tuyệt vời, gel giòn ở nồng độ thấp hơn so với agar (Lin và Casida 1984).
Gellan được sử dụng cho mục đích thương mại và có sẵn dưới tên thương mại
của gelrite hoặc phytogel (Banik et al. 2000). Nó được sử dụng rộng rãi như
là thay thế agar trong môi trường nuôi cấy, là một gel đàn hồi, nó giữ các hạt
lơ lửng mà không thay đổi độ nhớt của dung dịch (Kumar và Mody 2009).
Hơn nữa, nó ổn định nhiệt và acid, có độ đàn hồi và độ cứng (Sutherland
1998; Banik et al., 2000; Kumar và Mody 2009). Gellan cũng được sử dụng
trong dược phẩm như là một phương tiện cho các loại thuốc nhỏ mắt
(Carlforset al. 1998) [ 17-25].
c. Dextran
Dextran là một polysaccharide ngoại bào của vi khuẩn quan trọng sử

16


dụng rộng rãi như một rây phân tử cho lọc và tách các protein, axit nucleic, và
polysaccharides, (ví dụ, SephadexTM), loại trừ sắc ký (Naessens et al. 2005).
Dextran cũng được sử dụng trong nghiên cứu lâm sàng như '' dextran lâm
sàng, '' thay thế huyết tương, làm giảm bớt tình trạng thiếu máu thiếu sắt, và
trong ngành bánh kẹo để cải thiện duy trì độ ẩm, độ nhớt, và ức chế sự kết
tinh đường (Sutherland 1997, 1998, 1999; Kumar et al 2007;. Kumar và
Mody 2009) [13-17]
d. Alginate hoặc axit alginic

Alginate hoặc axit alginic là một sản phẩm thương mại nổi tiếng thu
được từ tảo nâu. Nó cũng được tiết ra bởi Pseudomonas aeruginosa và
Azotobacter vinelandii (Remminghorst và Rehm 2009). Ứng dụng của
alginate vi khuẩn bao gồm việc sử dụng nó như là một chất ổn định nhũ
tương, tác nhân keo, chất làm đặc, bọt ổn định, giữ nước, và trong ngành công
nghiệp dược phẩm dùng như băng vết thương và nha khoa vật liệu. Trong lĩnh
vực nông nghiệp, nó được sử dụng như một lớp phủ cho rễ cây giống và cây
trồng để ngăn ngừa sự khô hạn, làm phân bón, thuốc trừ sâu, chất dinh
dưỡng… (Vandamme và Soetaert 1995; Sutherland năm 1998; Kumar và
Mody 2009) [17].
e. Hyaluronan hay axit hyaluronic (HA)
Hyaluronan hay axit hyaluronic (HA) là một polymer mạch thẳng. Một
số ứng dụng của HA có thể kể đến trong mỹ phẩm và các lĩnh vực dược liệu
như kem dưỡng ẩm da, trong nước mắt nhân tạo, điều trị viêm xương khớp,
như thay thế các chất lỏng mắt trong mắt phẫu thuật, chất bôi trơn cho khớp
xương, phòng chống nhiễm trùng trong phẫu thuật bụng, chữa lành vết
thương (Vandamme và Soetaert 1995; Yamada và Kawasaki năm 2005;
Widner et al. 2005) [17].
f. Curdlan
Exopolysaccharide curdlan có khả năng tạo thành một gel đàn hồi
(gelatin) trong dung dịch nước (Dumitriu 2004) và được sử dụng trong ngành
công nghiệp thực phẩm và dược phẩm để cải thiện kết cấu và độ ổn định của
các loại thực phẩm (nhiệt được xử lý thực phẩm) và phát hành các loại thuốc,
tương ứng (Gummadi và Kumar năm 2005; Kumar và Mody 2009).
Succinoglucan là một glucosegalactose heteropolymer, trong đó có chứa
17


succinate và pyruvate moieties với các ứng dụng tương tự như curdlan
(Vandamme và Soetaert 1995). Curdlan không có giá trị calo, nó rất hữu ích

trong ít calo thực phẩm (mứt và thạch)[17]
g. Cellulose
Cellulose là polymer tinh khiết cao, được sử dụng như chất xơ được bổ
sung vào trong thực phẩm (Sutherland 1998). Bên cạnh đó, nó được sử dụng
như là một làn da nhân tạo tạm thời bỏng và vết thương phẫu thuật cho người
bệnh (Vandamme và Soetaert 1995). Ứng dụng trong tương lai của cellulose
vi khuẩn trong công nghệ phân tách như màng hoặc sợi rỗng và như một
nguồn giấy đặc biệt (Vandamme và Soetaert 1995)[13-17-25].
h. Kefiran
Kefiran được biết đến với hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u
đã được báo cáo cho các vi khuẩn EPS, (Micheli et al,1999; Kumar và Mody
2009). Kefiran được tiêu thụ truyền thống và được sử dụng trong việc xây
dựng khí ga, hơi cồn sữa lên men (Duboc và Mollet 2001). Ngoài ra, nó được
sử dụng để tăng cường độ nhớt của các sản phẩm từ sữa [17]
i. Levans
Levans gây sự chú ý của các nhà nghiên cứu do các tính chất prebiotic
của nó và phạm vi rộng rãi trong ngành công nghiệp sữa. Một tác dụng gây
độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư ở người đã được báo cáo cho
một exopolysaccharide thu được từ Pseudomonas sp. (Matsuda et al. 2003).
Ứng dụng của nó hiện đang được mở rộng về hướng phát triển các loại thuốc
mới sẽ được sử dụng cho các mục đích dược phẩm (Laurienzo 2010) [13-17].

18


PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tượng nghiên cứu
Các chủng Lactobacillus plantarum được phân lập từ ruột cá nục, kí hiệu (R)
- Lactobacillus plantarum R7
- Lactobacillus plantarum R8

- Lactobacillus plantarum R12
- Lactobacilus plantarum T12T1
2.2. Thiết bị và hóa chất sử dụng
2.2.1. Thiết bị sử dụng
- Cân điện tử T/R 200
- Tủ sấy Memmert C513.0126
- Tủ ấm Memmert E512.0950
- Tủ an toàn sinh học LABtech
- Tủ lạnh Sany
- Nồi hấp khử trùng
- Máy đo pH Hana
- Máy đo quang phổ kế UV/VIS – nhật
- Máy ly tâm ống fancol để bàn K241R
Và một số thiết bị thông dụng của phòng thí nghiệm.
2.2.2. Hóa chất
- Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS nuôi cấy và giữ giống vi
khuẩn lactic: pepton, cao thịt, cao nấm, glucose, sorbitan monooleate (Tween),
K2HPO4, MgSO4, NH4, MnSO4, CH3COONa, agar, glycerol, NaCl.
- Các hóa chất để điều chỉnh pH: NaOH, HCl.

19


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh
2.2.1.1. Nguyên tắc
Trong môi trường lỏng vi khuẩn có khả năng tiếp xúc với các chất dinh
dưỡng dễ dàng hơn, khả năng phát triển ổn định và từ đó thu được sinh khối
sử dụng cho các công đoạn nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.2. Tiến hành

Chủng ban đầu được bảo quản trong môi trường MRS lỏng có chứa 30%
glycerol. Lấy 100 µl chủng ban đầu cho vào eppendoft có chứa 900 µl môi
trường MRS lỏng. Thành phần môi trường MRS lỏng ở bảng 2.1, nuôi trong
tủ ấm ở 370C trong vòng 24 – 48 giờ.
Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS lỏng
Thành phần

Khối lượng

Pepton

10g

Cao thịt

8g

Cao nấm

4g

Glucose

20g

K2HPO4

2,62g

MgSO4

0,2g

MnSO4

0,038g

NH4

2g

CH3COONa

5g

Tween

1ml

Nước cất

1l

Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH môi trường về 6 - 6,2.
Môi trường được tiệt trùng ở 1210C, 20 phút.

20


2.2.2 Phương pháp thu nhận EPS

2.2.2.1. Quy trình
Chủng vi khuẩn lactic gốc
Dàn trên MRS agar để chọn khuẩn lạc đơn
Nuôi cấy tăng sinh trong MRS botth (24h, 370C)
Ly tâm thu sinh khối, rửa 2 lần trong dung dịch 1%
pepton và 0,85% NaCl và tái huyền phù
Đưa về OD 600nm = 1
Nuôi cấy trong môi trường 1],[2],[3] 370C, 420C, 48h
Ly tâm (1000 vòng, 10 phút, 40C) thu dịch nổi
Kết tủa protein bởi 30% TCA
Ly tâm (1000 vòng, 10 phút, 40C) thu dịch nổi
Kết tủa EPS bởi ethanol lạnh, tỷ lệ dịch nổi: ethanol = 1:2
2222222
Ly tâm ( 1000 vòng, 10 phút, 40C) thu tủa
Hòa tan trong nước cất 500C
1ml dung dịch trên + 1ml dung dịch pphenol 5% + 5ml
dung dịch H2SO4 đđ, vortex và cho vào nước sôi 2 phút
Làm nguội ở nhiệt độ phòng 30 phút
Đo OD 490nm
Tính hàm lượng EPS dựa trên đường chuẩn glucose
21