Đề cương ôn tập kĩ thuật di truyền nguyên lí và ứng dụng..

Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

ĐỀ CƯƠNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Câu 1: Trình bày định nghĩa genome?
Genome là một khái niệm dùng để chỉ toàn bộ các gen có trong một giao tử đơn bội, có nghĩa là
trong giao tử của một loài, mỗi nhiễm sắc thể tương đương có mặt một chiếc.
Câu 2: Gen là gì? Trình bày một cấu trúc của một gen điển hình ở Eukaryote.
•
•

-

-

-

Gen là một đơn vị di truyền, mỗi gen là một đoạn của chuỗi DNA mang thông tin di truyền cho
phân tử RNA hoặc một chuỗi polypeptide nhất định.
cấu trúc của một gen điển hình ở sinh vật nhân chuẩn:
+ thành phần của gen ở sinh vật nhân chuẩn gồm:
+ vùng điều khiển ( promoter): điều khiển hoạt đôngj của gen. promoter là trình tự nhận biết và
vị trí tiếp cận với gen của enzyme RNA polymerase và các nhân tố phiên mã, promoter có chức
năng kiểm soát hoạt đọng của gen.
Promoter của sinh vật eukaryote được chia làm 3 nhóm chủ yếu:
Promoter có vai trò quyết định:
sợi DNA được làm khuôn.
Khi nào thì tổng hợp mRNA
Vị trí bắt đầu phiên mã mRNA
Khi nào thì dừng quá trình phiên mã.1

+ Exon: là vùng DNA được phiên mã thành mRNA, mỗi exon có chứa các trình tự mã hóa
protein được gọi là khung đọc mở (ORF). Mỗi bộ 3 nu của khung đọc mở tương ứng với một
codon mã hóa cho một aa. Khung đọc mở được đọc từ đầu 5’ đến 3’dọc theo phân tử mRNA.
Khung đọc mở bắt đầu bằng một mã khởi động (AUG) và kết thúc bởi mã kết thúc
( UAA/UAG/UGA).
Exon gồm 3 phần - vùng mã hóa được phiên mã thành các mRNA, các mRNA có thể được dịch
mã tạo nên các sản phẩm protein.
Vùng không dịch mã 5’
Vùng không dịch mã 3’.
+ Intron: intron hay còn gọi là các trình tự xen kẽ không mang mã di truyền. chúng sẽ được
phiên mã nhưng không được dịch mã. Các intron này sẽ bị cắt bỏ trong quá trình biến đổi tiền
,RNA thành mRNA hoàn chỉnh.
+ các vùng UTR: vùng không dịch mã 5’ có liên quan đến sự vận chuyển mRNA, khởi động sự
dịch mã. Vùng này không được dịch mã thành protein.
Vùng 3’ đầu cuối gồm 2 phần:
3’ UTR không được dịch mã. Tuy nhiên có chức năng ổn định mRNA. Đồng thời cũng là vị trí
gắn đuôi polyA của mRNA.
Trình tự kết thúc nằm phía sau chuỗi polyA và môtj trình tự lặp ngắn chưa rõ chức năng.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

+ enhancer và silencer có thể nằm ở vị trí trong vùng promoter nằm trong vùng mang mã di
truyền của gen hoặc nằm trong các đoạn intergenic ở phía trước hoặc ở phía sau gen.
Hoạt động của các trình tự enhancer và silencer làm thay đổi cường độ hoạt động của gen, hoặc
làm ngừng hoạt động phiên mã của gen.

-

Câu3: Trình bày cấu trúc gen nhân của sinh vật eukaryote.
Độ lớn tùy thuộc vào sinh vật biến động từ 10Mb đến 100000Mb thường tương quan thuận với
tính phức tạp của tổ chức cơ thể. Genome của sinh vật bậc cao thường lớn hơn genome sinh vật
bậc thấp về số lượng gen; lượng DNA lặp lại.
Genome của nhân được cấu trúc nên từ một bộ cặp NST tương đồng, mỗi NST thường chỉ chứa
mội phân tử DNA, trừ NST khổng lồ của ruồi dấmvaf mội số NST của vi khuẩn, genome nhân
của các loài khác nhau chứa hàm lượng DNA khác nhau, bộ NST trong nhân có số lượng, kích
thước và hình dạng xác định khác nhau đặc trưng cho từng loài.
Các loại DNA trong genome nhân gồm:
Loại DNA lặp lại ở mức độ cao: chiếm khoảng 10% DNA của tế bào. là các trình tự ngắn dưới
10bp và có từ 105 đến 107 bản sao cho mỗi genome.
Loại DNA có trình tự lặp lại thấp hoặc trung bình: chiếm khoảng 20%. là các đoạn lặp lại có
kích thước lớn hơn100bp và thường xen kẽ với các trình tự lặp lại mội lần dọc theo NST.
Loại DNA chúa trình tự duy nhất: chiếm khoảng 70% và là loại chỉ có một bản sao và chỉ lặp lại
đôi lần.
Câu 4: Trình bày cấu trúc genome ty thể của eukaryote
Độ lớn rất biến động mà không tương ứng với tính phức tạp của sinh vật. genome ty thể của
động vật thường nhỏ với tổ chức di truyền được gói gọn, các gen sắp xếp sát nhau với ít khoảng
trống ở giữa. genome ty thể ở động vật thường lớn hơn genome ty thể của động vật có vú và nấm
men.
Kích thước genome ty thể cũng khác nhau tùy thuộc từng loài. VD: genome ty thể của brassica
campestris có độ lớn 218kb còn của cucumis melo là 2400 kb, nhỏ hơn nhiều so với genome
nhân.
Tổ chức di truyền của genome cũng ít gói gọn, nhiều gen có chứa intron.
Số lượng bản sao từ 5 đến 10 genome/ty thể.
DNA ty thể tồn tại chủ yếu dưới dạng mạch vòng kép, đôi khi có xuất hiện mạch thẳng như: nấm
men, Pẩmecium..
Thông tin di truyền trong genome ty thể: genome ty thể chứa các gen mã hóa cho rRNA của ty
thể và một số enzyme tham ra vào chuỗi hô hấp.

Ngoài ra ty thể còn chứa các gen mã hóa tRNA, protein ribosome và một số protein khác liên
quan đến quá trình phiên mã. Dịch mã và vận chuyển các protein khác vào ty thể từ tế bào chất.
Câu 5: Trình bày cấu trúc genome lạp thể ở eukaryote?
Lục lạp cũng chứa DNA ở đạng các phân tử kép có cấu trúc vòng. Mỗi lục lạp và ty thể đều chứa
nhiều DNA, tuy nhiên mỗi chúng đều chứa các gen giống nhau.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Thong tin di truyền chứa trong genome lục lạp: genome lục lạp có khoảng 200 gen. các gen này
mã hóa cho các rRNA và tRNA đồng thời mã hóa cho các protein của ribosome và các protein
cần cho hoạt động quang hợp.
Câu 6: Cấu trúc hệ gen của virus?
Virus thường có lượng thông tin di truyền it hơn nhiều so với sinh vật eukaryote. Genome của
virus có thể là DNA hoặc RNA. DNA của virus có thể là chuỗi đơn( thực khuẩn thể) hay chuỗi
kép. DNA của virus có cấu trúc đặc biệt ở dạng vòng: hai chuỗi DNA nối cộng hóa trị với nhau
tạo thành hình vong khép kín liên tục, không có đầu 3’ và 5’. DNA của virus gồm hàng ngàn đến
hàng chục ngàn nu.

-

-

Câu 7: Trình bày cấu trúc genome của vi khuẩn?
DNA của vi khuẩn được nằm trong NST sơ khai. Phần lớn các khuẩn chỉ có một NST/tế bào.
DNA của vi khuẩn cũng ở dạng vòng, chuỗi kép. Trên DNA có chứa các gen mã hóa cho một
protein đặc thù. Ngoài NST chính vi khuẩn còn chứa dạng DNA khác gợi là plasmid có kích
thước bé hơn, dạng vòng. Có khả năng tự nhân bản, các plasmid thường có nhũng gen có tính

đặc thù cao.
+ các dạng plasmid
F- plasmidmang thong tin di truyền về giới tính của vi khuẩn, và có thể được chuyển từ tb VK nà
sang tb VK khác qua tiếp hợp.
R plasmid: là plamid mang đặc tính chống chịu một hoặc nhiều kháng sinh. Chúng bao gồm 2
thành phần: yếu tố tính kháng: cần để chuyển plasmid giữa các VK và yếu tố sác định r: là những
gen quy định tính kháng kháng sinh.
Degradative plasmid: là các plasmid phân rã mang các gen đặc hiệu có khả năng sử dụng các
chất chao đổi bất thường.
Cryp plasmid là các plasmid tinh thể không mang gen mã hóa bất kì chức năng nào.
Câu 8: Khái niệm về các enzyme giới hạn? Cách đặt tên? Các kiểu cắt, cơ chế hoạt động?
Ứng dụng enzyme giới hạn trong công nghệ gen?
+ Enzym cắt giới hạn là enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và
cắt AND ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận.
VD: Eco RI
5’ GAATTC 3’
3’ C TTAAG 5’
+ Cách đặt tên: tên enzyme cắt giới hạn được ghép bởi chữ cái đầu tiên viết hoa là tên chi vi
khuẩn mà enzyme được phát hiện. tiếp theo là hai chữ đầu của loài không viết hoa, sau đó là một
chữ hoa chỉ tên chủng vi khuẩn và cuối cùng là chữ sô la mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được
phát hiện.
VD: HpaI và HpaII là enzyme giới hạn thứ nhất và thứ hai cùng được tách ra từ Haemophilus
parainflenzae.
+ các kiểu cắt: gồm cắt đầu bằng và cắt đầu sole.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

-

-

-

-

Cắt đầu bằng: là enzyme cắt giới hạn cắt cả hai mạch AND cùng một vị trí, các đoạn cắt theo
kiểu này không có khả năng tự kết hợp với nhau. Để nối lại đòi hỏi các enzyme gắn ligase hoặc
các adaptor đặc dụng.
Cắt tạo đầu sole: các enzyme giớ hạn cắt hai mạch của AND ở hai vị trí lệch nhau. Kết quả tạo
nên các đoạn AND có các đầu sole có trình tự nu hoàn toàn bổ sung cho nhau nên có thể tự nối
với nhau, nên đầu so le này còn được gọi là đầu dính.
+ ứng dụng: người ta thường sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt tạo đầu sole 5’ hoặc 3’ trong công
nghệ di truyền do có khả năng tự nối lại với nhau hoặc các đoạn DNA khác có đầu tương tự, khi
sử dụng các enzyme cắt giới hạn cần có các điều kiện nhiệt độ, độ ph, dung môi thích hợp.
VD: Eco RI
5’ GAATTC 3’ => 5’ G
+ AATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
3’ CTTAA
G 5’
Câu 9: Vector nhân dòng là gì? Nêu tiêu chuẩn của một vector nhân dòng?
+ vecter nhân dòng là các phân tử được dung để mang các đoạn DNA/gen phục vụ cho việc
nhân, tách dòng và biến nạp gen.
+ tiêu chuẩn của một vecter nhân dòng:
Có điểm khởi đầu sao chép ori để tự sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào.
Có các đoạn trình tự nhật biết cho enzyme cắt giới hạn.
Có đoạn trình tự khởi điểm

Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện chúng trong tế bào chủ nhận. thông thường
dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu.
Câu 10; Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector plasmid sử dụng
trong công nghê gen?
+ plasmid là những phân tử nhỏ có cấu trúc mạch vòng, nằm ngoài NST của tế bào vi khuẩn và
có khả năng tự nhân bản
+ cấu trúc di truyền của một plamid gồm 3 phần chính:
Vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn.
Có các gen chỉ thị chọn lọc.
Có gốc tái bản ori.

+ một số plasmid thường dung trong công nghệ di truyền:
 Plasmid pBR 322


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

PBR 322 có mang 2 gen kháng kháng sinh Ampiciline và tetracycline, plasmid này có điểm cắt
cho các enzyme giới hạn bam HI, Hin III, Sal I,nằm trong vùng kháng tetracycline, một điểm cắt
cho enzyme Pst I ở vùng kháng Ampicilin và một điểm cắt cho Eco RI nămg ở vùng mã hóa của
DNA. Plasmid này có một gốc tái bản và chỉ hoạt động trong E.coli.
Khi nuôi cấy trong môi trường chọn lọc ampicillin và tetracycline thì những vi khuẩn có chứa
plasmid sẽ sống còn các tế bào vi khuẩn ko chứa plasmid sẽ chết.
 Plasmid PUC 19.

Đây là nhóm plasmid được phát triển từ nhóm plasmid pBR 322. Phần chứa gen khang
tetracycline được cắt bỏ còn phần gen kháng Ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại,
ngoài ra các vị trí nhân dòng và các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn được phân bố tập trung vào

một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (MCS). Các plasmid này có gen αlacZ, gen này mã hóa cho
sự hình thành enzyme β-glactosidase, là enzyme xúc tác cho phản ứng biến đổi màu của chất
Xgal là một hợp chất không màu thành hợp chất X+glactose. Chất X màu xanh chàm, nên khi bị
chèn đoạn DNA ngoại lai vào vị trí nhân dòng làm ko sản sinh ra βgalactosidase nên chất Xgal
trong môi trường nuôi cấy ko bị biến màu. Và các vi khuẩn chứa plasmid này sẽ cho khuẩn lạc
đơn màu trắng, trong khi các vi khuẩn chứa plasmid nguyên vẹn sẽ cho khuẩn lạc đơn màu xanh
chàm.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 11: Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector bacteriophage sử
dụng trong công nghệ gene?
Cấu trúc di truyền của vector bacteriophage:
Phage là một virus mang AND sợi đôi có kích thước khoảng 50bp, DNA của nó có dạng phân tử
mạch thẳng có 2 đầu bổ sung sợi đơn dài 12 nu( được dùng làm sợi cos). Sau khi xâm nhập vào
vi khuẩn vào vi khuẩn vật chủ, DNA tạo vòng ngay lập tức bằng cách ghép 2 đầu dính cos nhờ
enzyme ligase của vật chủ. Các giai đoạn tiếp đó có thể dẫn đến việc làm tan tế bào vật chủ hoặc
gây ra hiện tượng tiềm tan( trong giai đoạn này λ AND hop nhất vào trong chromosome của tế
bào vật chủ.)
Các phage có khả năng thực hiện tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn
nhận. Vector phage λ này được sử dụng rộng rãi để xây dựng thư viện genome vì nó mang được
đoạn AND ngoại lai lớn hơn từ 15-23kp sp với plasmid, dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích. Ưu
điểm nổi bật của là chúng có hệ thống tự động xâm nhập và nhân đôi trong tế bào vi khuẩn hiệu
quả hơn so với việc biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên , những thao tác ban đầu có
phức tạp hơn.

Đặc điểm của bacteriophage λ:

Ở giữa AND của phage λ có một vùng đệm hay vùng trung tâm có chiều dài bằng 1/3 chiều dài
của phage , vùng này không quan trọng, nếu cắt vùng đi cũng không ảnh hưởng đến khả năng
sinh sản của phage trong tế bào vật chủ và khả năng làm tan tế bào chủ. Vì thế có thể cắt bỏ đoạn
đó đi để chèn đoạn AND ngoại lai vào. Do AND của phage có mạch thẳng nên khi bị cắt bỏ đoạn
ở giữa sẽ bị tách làm 2 nhánh: Trái. Phải. Đoạn gen ngoại lai được gắn vào sao cho đoạn AND
tái tổ hop không lớn quá 105% hoặc nhỏ hơn 78% bộ gen bình thường của phage . Khả năng có
thể mang một đoạn AND ngoại lai dài hơn là ưu thế của phage so với plasmid. Điều đó có nghĩa


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

rằng lấy đoạn đệm ra ( chiếm 60% chiều dài) thì đoạn còn lại quá ngắn để lắp ráp vào đầu, nó chỉ
được lắp ráp khi có AND ngoại lai gắn vào. Nhờ vậy dễ xác định AND ngoại lai đã được gắn
vào phage hay chưa, loại ỏ những phage mà chưa có đoạn AND ngoại lai gắn vào.
Trên phage người ta đã chọn được vị trí cắt cho enzyme cắt hạn chế và xây dựng phương pháp
đóng gói để đưa đoạn AND ngoại lai vào phage.
Tạo dòng trong bacteriophage λ:
Bacteriophage λ có genome phức tạp và được dùng như một vector. AND của nó chứa một số vị
trí cần thiết cho enzyme cắt giới hạn cần thiết để tạo dòng. Các bước tạo dòng được tóm tắt:
-Tinh sạch AND vector bằng ly tâm gradien tốc độ hoặc điện di gel sau khi đã cắt bằng RE.
-Các nhánh trái và phải sau đó được liên kết với AND ngoại lai có kích thước khoảng 20kbp có
đầu kết thúc tương ứng với các đầu nhánh.
-Kết quả các AND tái tổ hop được đóng gói trong các phageλ
-Các phage tái tổ hop mang các đoạn AND ngoại lai mong muốn được xác định bằng phương
pháp lai acidnucleic.
-Tinh sạch và chọn tế bào vật chủ để cho nó sinh sản để duy trì và phân tích các đoạn AND
ngoại lai
Chọn lọc các vector λ thích hop:

Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc là enzyme giới hạn được sử dụng và kích thước của
AND ngoại lai. Chỉ khoảng 60% genome nhánh trái và nhánh phải là cần thiết cho sự sinh tan
của phage. Khả năng sống sót của phage sẽ giảm khi kích thước AND tái tổ hợp dài hơn
105%genome phage và ngắn hơn 78%genome của phage. Như vậy, điều quan trọng là chọn
vector và AND ngoại lai thế nào để kích thước phage tái tổ hop nằm trong giới hạn cho phép.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Nó trở thành đoạn dây thẳng, hình thành các đoạn AND chồng lớp lên nhau với độ dài khoảng
50kb.
Một số vector được thiết kế thuận lợi cho sự sinh trưởng thuận lợi của chúng trong E.coli mang
prophage , phenotype này được Spi+. Các chủng λ thiếu 2 gen cần thiết trong tái tổ hợp được gọi


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

là Spi- sẽ sinh trưởng tốt trong các thể tiềm tan P2 chừng nào chúng còn mang chuỗi chi( chi là
cơ chất cho sự tái tổ hop xúc tác bởi recA.)

Tạo dòng ở các vector λ L47.1 , λ1059, BF101 đã tiến hành bằng cách loại bỏ các đoạn đệm giữa
rec và gram . Kết quả thu được phage tái tổ hop Spi_ , chúng có thể nhận biết hoặc chọn lọc bằng
khả năng sinh trưởng của chúng trên các thể tiềm tan P2 recA+ của E.coli.
Hầu hết các vector thay thế mất gram khi đoạn đệm bị loại bỏ. Các thể tái tổ hop được tạo thành
bởi những vector như thế phải được sinh sản trong vi khuẩn rec A+. Phage1-sep6-lac5 mang red
và gram trong nhánh phải của nó và các thể tái tổ hop được tạo thành phenotype Spi+ có thể

được nhân lên trong những vi khuẩn đột biến rec A-.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 12: Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector YAC sử dụng
trong công nghệ gene?
Một nghiên cứu cho thấy một NST muốn nhân đôi và phân ly tốt cần có:
- các telomere:
- một khởi điểm tái bản (ARS 1),
-một tâm động (CEN 4),
Dựa vào đó người ta đã cấu tạo các NST nhân tạo có đủ 3 trình tự nói trên với cấu tạo gồm 2
cánh tay, giữa 2 cánh tay, người ta có thể cài một đoạn AND cần tách dòng với kích thươc
khoảng từ 150-1000kp. Trên mỗi cánh tay , gồm các gene đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế
bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST.
Một trong 2 cánh tay mang một mảnh AND hoạt động như một tâm động và một gốc tái bản Ori.
Việc cài AND lạ vào gene mã hóa ức chế tRNA chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc khuẩn
lạc từ màu đỏ sang trắng . Đây là dấu hiện của sự tái tổ hop YAC trong tế bào nấm men.
Các NST này được đưa vào tế bào chủ, được nhân lên như các NST khác trong tế bào nấm men
và ta có được các gene mong muốn.
Vector này tương đối ngắn và dễ thao tác. Sở dĩ như vậy là do khởi điểm tái bản và tâm động
ngắn. Khởi điểm tái bản của nấm men Saccharomyces cerrevisae được tập trung trong một vùng
genome ngắn trong khi ở Saccharomyces pombe khởi điểm tái bản dài đến trên vài nghìn base.
Vector YAC có thể mang các đoạn DNA dài 150- 1000kb và chúng có thể được thiết kế trong
nấm men bằng tái tổ hợp tương đồng. Hạn chế chủ yếu của vector YAC là không ổn định .


Hồ Thị Thương

Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 13:Trình bày cấu trúc di truyền và nguyên tắc hoạt động của vector BAC sử dụng
trong công nghệ gene.
Hệ thống NST nhân tạo của vi khuẩn( Bacterium Artifical Chromosome- BAC) dựa trên
Plasmid F-factor, nó có thể tái bản trong Ecloi với các đoạn chèn lên tới 300 kb. Thể tái tổ hợp
BAC được biến nạp vào trong tế bào vi khuẩn bằng xung điện. Các BAC thuận lợi cho việc xây
dựng thư viện, lập bản đồ gen, phân tích genome. Chúng có hiệu suất tạo dòng cao, các đoạn
AND được chèn vào dễ dàng thao tác, duy trì ổn định.
Một plasmid F cơ bản gồm 4 vùng cần thiết, có chức năng ổn định plasmid, quyết định số lượng
bản sao. Đó là parA, parB, oriS, repF.
Cả parA và parB đầu cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid, ngoài ra parB còn cần cho việc
kết hợp với các F-factor khác, oriS là gốc tái bản, repF mang tín hiệu protein E cần thiết cho sự
tái bản từ oriS và kiểm soát số lượng bản sao. Trên F-plasmid còn có vùng mang gen kháng
kháng sinh chloramphenicol và gen L để làm maker chọn lọc các thể biến nạp. Chủng E.coli
được sử dụng cho việc tạo dòng BAC là DH10B, đặc điểm chính của nó là mang những đột biến
ngăn cản:
-Sự phân cắt AND lạ bởi hệ enzyme nội sinh(hsd/RMS)
-Sự phân cắt AND có gốc methyl(mcrA, mcrB, mcrC, mcrR)
-Sự tái tổ hợp(recA1)
Nhìn chung BAC có những đặc điểm giống như các plasmid vector tiêu chuẩn của E.coli như:
-Có vùng ori cần thiết cho sự tái bản plasmid
-Có nguồn gốc từ một plasmid lớn trong tự nhiên F-Plasmid.
-Có số lượng bản sao thấp(1-2 bản sao/tế bào).
-Hiệu suất biến nạp thấp. Đã khắc phục được bằng phương pháp xung điện để biến nạp AND tái
tổ hợp vào E.coli.
Một số ưu điểm của BAC so với YAC là:
-Dễ biến nạp
-Ổn định

-Tốc độ sinh sản của tế bào vật chủ E.coli nhanh hơn
-Dễ tinh sạch.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 14: Cloning gen là gì? Công thức tính số dòng cần tập hợp trong thư viện mẫu đã
nhân dòng.
-Clonging gen(nhân dòng gen) là quá trình nhân bản từng dòng AND từ một hỗn hợp các đoạn
AND vốn là sản phẩm của quá trình cắt bằng enzyme giới hạn. Việc tập hợp các đoạn AND đã
nhân bản được gọi là quá trình tạo thư viện mẫu đã nhân dòng.
-Cấu trúc của thư viện AND đã nhân dòng:
Thư viện AND là tập hop các dòng AND trong vector.
+ Thư viện AND genome.
+ Thư viện cDNA.
Thư viện genome có thể được thanh lọc để chứa các trình tự mong muốn.
Thư viện AND genome:
-

Công thức tính số dòng cần thiết tập hop đủ để đại diện cho 1 bộ Genome.
N=ln(1-P)/ln(1-a/b)
N: là số dòng cần thiết
P: là xác suất đại diện mong muốn của một đoạn trình tự cụ thể.(thường gặp bằng 0,95 hoặc
0,99)
a: kích thước trung bình của các đoạn cần tách.
b: kích thước của genome.
Câu 15: Trình bày kĩ thuật nhân dòng gen bằng plasmid.

Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Kỹ thuật nhân dòng gen bằng plasmid- vector trong E.coli(cho phép nhân các đoạn có kích
thước<=10kb)
-Cắt AND bằng enzyme cắt hạn chế.
-Chọn plasmid để gắn mẫu đã cắt. Plasmid phải có những đặc tính sau:
+ Có gen chịu trách nhiệm kháng kháng sinh(ampicilin, tetracylin) và 1 gen khác chịu trách
nhiệm sinh màu( mã hóa cho β- galoctosidase, enzyme này khi tác dụng với X-gal sẽ có màu
xanh) thường dùng là plasmid pUC. Cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn cùng loại với
enzyme đã cắt AND nghiên cứu.
-Gắn các đoạn cắt AND vào plasmid(vector nhân dòng):
Trộn các đoạn cắt AND với các plasmid đã chọn và đã được cắt bởi cùng loại enzyme cắt giới
hạn.) theo một tỷ lệ nhất định.. Ủ hổn hợp nhiệt độ từ 10-150C trong 6h với sự có mặt của
enzyme ligase.
-Chuyển nạp các plasmid đã gắn AND vào tế bào vi khuẩn E.coli:
+Xử lý vỏ ngoài của vi khuẩn bằng Cacl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận plasmid.
+Tạo hổn hop vi khuẩn với AND plasmid trong diều kiện lạnh(đặt trên nước đá 30phút).. Sau đó
đưa hỗn hop này vào tình trạng nhiệt độ cao 420C( trong bếp cách thủy) 90giây. Sự phân chia tế
bào vi khuẩn xảy ra, plasmid tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa vào hỗn hop lạnh,
ở sốc lạnh các plasmid sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn.
-Hỗn hợp trên sẽ được nuôi cấy trên các đĩa peptri có chứa mội trường LB cùng chất kháng
kháng sinh và X-gal trong một đêm ở 370C.. Khi đó sẽ mọc lên các khuẩn lạc màu xanh và màu
trắng.
-Chọn các khuẩn lạc vi khuẩn có chứa ADN ngoại lai:
+Chỉ vi khuẩn nào có chứa Plasmid đã chuyển nạp mới có khả năng sống sót trên môi trường và
sinh khuẩn lạc( vì plasmid chuyển nạp mới có gen kháng kháng sinh)
+Do cấu trúc của plasmid , vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hóa cho βgalactosidase) sẽ là vùng bị cắt để gắn AND ngoại bào, cho nên các khuẩn lạc có màu xanh là

khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn AND ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng là
khuẩn lạc có chứa đoạn AND cần nhân dòng được ghép vào.
-Nhân dòng:
+Nhân nhanh các khuẩn lạc thực chất là nhân nhanh các mẫu AND. Mỗi khuẩn lạc đơn phát
triển từ một tế bào vi khuẩn, chúng là một tập hop các tế bào đồng nhất chứa một đoạn AND đã
gắn.
+Từ một tập đoàn vi khuẩn chứa AND này, có thể chiết xuất ra một loại AND cần thiết từ một
dòng.
Khi cần tách đoạn AND nào đó, cần nhân dòng vi khuẩn chứa plasmid mang đoạn AND mong
muốn sau đó tách chiết AND từ plasmid của dòng vi khuẩn này. Một plasmid có thể tạo được từ
20-50 bản sao trong 1 tế bào vi khuẩn, như vậy số AND được nhân lên rất lởn mỗi khuẩn lạc
đơn.
Câu 16:Trình bày kĩ thuật nhân dòng gen bằng vector BAC?


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Hệ thống NST nhân tạo của vi khuẩn( Bacterium Artifical Chromosome- BAC) dựa trên
Plasmid F-factor, nó có thể tái bản trong Ecloi với các đoạn chèn lên tới 300 kb.
Kỹ thuật nhân dòng gen bằng vector BAC gồm những bước cơ bản sau:
-Tách chiết AND từ mẫu nghiên cứu, cắt AND bằng enzyme cắt giới hạn để tạo ra AND làm
nguyên liệu cho cho quá trình nhân dòng.
-Chọn vector BAC để gắn mẫu đã cắt. Vector phải có những đặc tính sau:
Một plasmid F cơ bản gồm 4 vùng cần thiết, có chức năng ổn định plasmid, quyết định số lượng
bản sao. Đó là parA, parB, oriS, repF.

Cả parA và parB đầu cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid, ngoài ra parB còn cần cho việc
kết hợp với các F-factor khác, oriS là gốc tái bản, repF mang tín hiệu protein E cần thiết cho sự

tái bản từ oriS và kiểm soát số lượng bản sao.
Trên F-plasmid còn có vùng mang gen kháng kháng sinh chloramphenicol và gen L để làm
maker chọn lọc các thể biến nạp.
-Gắn các đoạn cắt vào vector BAC ( kích thước AND chèn vào có thể lên tới 300kb)
Trộn các đoạn cắt AND với vector BAC đã chọn và đã được cắt bởi cùng loại enzyme cắt giới
hạn.) theo một tỷ lệ nhất định.. Ủ hổn hop nhiệt độ từ 10-150C trong 6h với sự có mặt của
enzyme ligase.
-Chuyển nạp các vector BAC sau phản ứng gắn vào vi khuẩn E.coli để nhân bản các đoạn AND
đã được gắn cùng với vector.
+Xử lý vỏ ngoài của vi khuẩn bằng Cacl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận vector BAC.
Do hiệu suất biến nạp thấp nên khắc phục bằng phương pháp xung điện để biến nạp AND tái tổ
hợp vào E.coli.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

-Hỗn hợp trên sẽ được nuôi cấy trên các đĩa peptri có chứa mội trường LB cùng chất kháng
kháng sinhchloramphenicol và X-gal trong một đêm ở 370C.. Khi đó sẽ mọc lên các khuẩn lạc
màu xanh và màu trắng.
-Chọn các khuẩn lạc vi khuẩn có chứa ADN ngoại lai:
+Chỉ vi khuẩn nào có chứa BAC đã chuyển nạp mới có khả năng sống sót trên môi trường và
sinh khuẩn lạc( vì plasmid chuyển nạp mới có gen kháng kháng sinh)
+Do cấu trúc của BAC , vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hóa cho β- galactosidase)
sẽ là vùng bị cắt để gắn AND ngoại bào, cho nên các khuẩn lạc có màu xanh là khuẩn lạc có
chứa plasmid nhưng không gắn AND ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc có chứa
đoạn AND cần nhân dòng được ghép vào.
-Tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng.Từ đây có
thể chọn lọc ra thư viện mẫu mà mình quan tâm.

+Nhân nhanh các khuẩn lạc thực chất là nhân nhanh các mẫu AND. Mỗi khuẩn lạc đơn phát
triển từ một tế bào vi khuẩn, chúng là một tập hop các tế bào đồng nhất chứa một đoạn AND đã
gắn.
+Từ một tập đoàn vi khuẩn chứa AND này, có thể chiết xuất ra một loại AND cần thiết từ một
dòng.
Câu 17: Kĩ thuật RFLP và ứng dụng?
RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism)
Nguyên lý: Kỹ thuật RFLP dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài của các phân
đoạn bị cắt bởi enzyme giới hạn.
+số đoạn cắt của một phân tử AND trên một enzyme cắt hạn chế là đặc hiệu cho từng phân tử
AND.
+Khi có sự thay đổi về trình tự nucleotide, sẽ làm thay đổi vị trí của enzyme giới hạn dẫn đến sự
thay đổi độ dài của các đoạn.
+Khi xử lý các mẫu AND bằng cùng một cặp enzyme giới hạn thì các hệ genome có cấu trúc
khác nhau sẽ tạo nên các đoạn cắt có chiều dài khác nhau. Ngược lại, nếu các hệ genome có cấu
trúc giống nhau sẽ tạo nên các đoạn cắt giống nhau thể hiện giống nhau trên điện di đồ.
Trong thực tế, điều này chỉ đúng với AND có kích thước nhỏ (AND lục lạp, AND ty thể ) 200kb.
Đối với AND có kích thước lớn của nhân:
Số lượng tạo ra khi cắt bởi RE lớn nên việc đánh giá các băng điện di các sản phẩm cắt AND
genome của các mẫu nghiên cứu khác nhau là không thể thực hiện được. Dù các băng là tách
biệt, nhưng hiện hình băng điện di bằng Ethidium Bromide cho kết quả là một dải màu, không
phải các băng riêng biệt.
Sử dụng mẫu dò: Trình tự AND cụ thể ( ngẫu nhiên hoặc xác định) phát hiện ra sự hiện diện của
một trình tự bổ sung tương ứng. Từ đó có thể sử dụng kết quả hiện diện băng lai mà đánh giá sự
đa hình tương ứng bổ sung với mẫu dò.
Quy trình chung gồm các bước:
-Thu mẫu nghiên cứu
-Tách chiết AND của mẫu nghiên cứu

Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

-Cắt AND bằng enzyme cắt giới hạn
-Chạy điện di sản phẩm cắt
-Thực hiện phản ứng Sourthern Blot( Chuyển băng điện di vào giấy lọc, lai mẫu dò đã được đánh
dấu từ đó phát hiện sản phẩm lai).
Đây là kỹ thuật kinh điển , rất chính xác.
Ứng dụng:
RFLP cho phép phát hiện các đoạn AND có độ dài khác nhau được tạo ra khi bị cắt bởi các
enzyme cắt hạn chế sau khi điện di hỗn hợp đoạn cắt trên agaroza hay gel polyacrylamid. Các
đoạn AND do có chứ phosphat nên trong môi trường trung tính, chúng sẽ mang điện tích âm.
Do đó khi điện di, các đoạn AND sẽ chạy về cực dương trong điện trường với tốc độ khác nhau
tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng.
RFLP mở ra nhiều hướng ứng dụng mới cho nhiều lĩnh vực của di truyền và chọn giống. +Sử
dụng kỹ thuật RFLP nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật, động vật.
+Kỹ thuật này cho phép phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome nghiên cứu;
+ phát hiện sự đa dạng AND qua các cá thể khác nhau của một loài; phát hiện các thể đột biến
gene.
-Kỹ thuật này còn cho phép phát hiện các thể lai soma, lập bản đồ giới hạn của một gene. còn có
nhiều ứng dụng:
+Chỉ thị đồng trội
+Marker phân tử
+Phát hiện nguồn gốc
+Phát hiện con lai.
+Phát hiện bệnh.
Câu 18: Kỹ thuật xác định trình tự AND theo Sanger? Cho một số ví dụ minh họa?
-Phương pháp enzyme.
-Nguyên tắc hoạt động:

+Dựa vào hoạt động của enzyme AND polymerase trong quá trình tổng hop AND.
+ Enzyme này xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hop ở vị trí 3’OH, khi gặp các
nucleotide không có nhóm 3’OH , phản ứng bị dừng lại.
-Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide( phương pháp
dideoxynucleotide).
Quy trình dideoxynucleotide để giải trình tự AND
Dideoxynucleotide là một phân tử nhân tạo, nó thiếu nhóm OH ở cả 2 vị trí 2’ và 3’ carbon của
phân tử đường. Nếu một dideoxynucleotide được gắn vào đầu chuỗi đang tổng hop, sự tổng hop
AND sẽ dừng lại do không hình thành liên kết photphodieste với nucleotide đến tiếp theo. Việc
kết thúc tổng hợp AND là tính chất hoàn hảo của phương pháp giải trình tự AND
dideoxynucleotide , mặc dù các điều kiện thí nghiệm khác cần phải được thỏa mãn trước khi một
trình tự AND có thể được xác định.
Bước đầu tiên theo nguyên tắc là Ủ ghép một nucleotide tổng hợp ( 17-24nu: mồi) với một phân
đoạn đã xác định một sợi của vector nhân dòng gần vị trí chèn của AND nhân dòng.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Oligonucleotide hoạt động như một trình tự mồi bằng cách cung cấp một nhóm 3’OH cho sự
khởi đầu tổng hợp AND.
Mỗi ống chứa 4 deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , một trong 4 deoxynucleotide này
được đánh dấu phóng xạ và một trong bốn dideoxynucleotide(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).
Nồng độ của mỗi dideoxynucleotide trong mỗi ống nghiệm được điều chỉnh thận trọng để đảm
bảo sự gắn hỗn hop các chuỗi đang tổng hợp tại mỗi vị trí có thể và không gắn ở vị trí đầu tiên
của nucleotide bổ trợ của khuôn. Sự tổng hợp của chuỗi sẽ dừng lại khi một dideoxynucleotide
được gắn vào, như vậy mỗi chuỗi đang tổng hop sẽ thật sự chứa một dideoxynucleotide ở đầu 3’.
Điều kiện thí nghiệm này xảy ra trong cả 4 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa một bộ duy nhất
các oligonucleotide, mỗi một trong chúng chứa trình tự mồi.

Các phản ứng tổng hợp bị dừng lại bằng cách bổ sung formamit , ngăn không cho các sơi AND
bắt cặp bazo với nhau, và các phân tử AND mới tổng hợp được tách nhau bằng điện di trên gel
polyacryamit. Phương pháp này phân giải các đoạn AND khác biệt nhau về kích thước ít nhất
một nucleotide đơn. Phép tự chụp ảnh bằng phóng xạ của gel cho thấy chỉ các đoạn AND được
đánh dấu phóng xạ được tổng hop trong bước tổng hop AND có enzyme xúc tác .Mỗi một trong
bốn làn trên gel và ảnh tự chụp bằng phóng xạ tương ứng với một ống nghiệm có chưa một trong
4 dideoxynucleotide.
Trình tự phân đoạn của một đoạn AND nhân dòng được xác định bằng cách ghi lại thứ tự các
băng, chính xác tối đa có thể được, từ đáy tới đỉnh của ảnh bằng phóng xạ.
Khoảng 250-350 băng có thể được phân giải rõ ràng trên ảnh tự chụp bằng phóng xạ. Thông
thường trình tự mồi được bố trí cách điểm chèn của AND được nhân dòng khoảng 10-20nu, như
vậy các nhà nghiên cứu có thể nhận biết được trình tự đã biết ở điểm khởi đầu của ảnh tự chụp
bằng phóng xạ và nhận biết chính xác được AND đầu tiên nhân dòng.
Ví dụ: Lấy ví dụ mà Thầy đã cho vào.

Câu 19: Nguyên lý và kĩ thuật xác định trình tự AND tự động?
Phương pháp xác định trình tự AND tự động dựa trên cơ sở của phương pháp Sanger. Tuy nhiên
mồi sử dụng ở đây cho mỗi phản ứng của 4 loại dNTP là các phân tử có khả năng huỳnh quang
khác nhau. Sản phẩm của mỗi ống nghiệm sẽ phát ra một màu đặc trưng khác nhau khi bị ánh
sáng chiếu vào.
Sau khi diễn ra phản ứng một cách hoàn hảo, sản phẩm của 4 ống được trộn lẫn và cho điện di
trong cùng 1 ‘giếng’ trên gel ( sẽ cho các băng cùng dẫy). Gần phần đỉnh gel là một máy phân
tích, nó sẽ kích thích huỳnh quang của các oligonucleotit bởi tia lase khi di chuyển qua. Màu ánh


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

sáng huỳnh quang của từng oligo nucleotit sẽ được phát hiện qua các thiết bị điện tử. Thông tin

này được kết nối với máy tính đã có phần mềm chương trình hóa biến đổi thông tin màu về trình
tự base.
Thí dụ: Màu xanh là màu của chuỗi oligonucleotit thu được từ phản ứng dideoxy C, như vậy kết
thúc sẽ là base ddC, xanh lá cây là A, da cam G và đỏ T. Máy tính sẽ in ra sơ đồ xác định trình tự
vừa nêu và xác định các thông số đó.
Đối với hệ thống này, mỗi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra một bước sóng khác nhau, và thứ
tự của các phản xạ quang phổ trong một làn đơn tương ứng với một trình tự nucleotide. Nói cách
khác , mỗi thuốc nhuộm đại hiện cho một nucleotide đặc trưng. Các tín hiệu huỳnh quang từ các
phân đoạn kết thúc dideoxynucleotide được ghi lại theo chuỗi qua cả 4 làn . Thứ tự toàn bộ các
tín hiệu huỳnh quang là một hàm số của mỗi làn tương ứng với một trình tự nucleotide.
Hệ thống giải trình tự có thể đọc với độ chính xác cao khoảng 500bazo mỗi lần chạy; dưới các
điều kiện tối ưu, một máy có thể phân giải khoảng 20000 bazo mỗi giờ.
Câu 20: Nguyên lí và kỹ thuật PCR? Vẽ chu trình PCR?
PCR là một phương pháp invitro cho phép nhân nhanh một đoạn AND nào đó mà chỉ cần một
số lượng mẫu ban đầu nhỏ. Một đoạn AND bất kỳ( thường<= 10kb) có thể được nhân lên thành
hàng triệu bản sao chỉ trong vài giờ.
Phương pháp này có độ nhạy rất cao, ngày nay trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong
phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và AND thuộc các lĩnh vực khoa học, sinh học..
Nhờ phương pháp này chúng ta có thể phân lập, xác định, giải mã trình tự các gen, và đi sâu
nghiên cứu chức năng, cũng như biểu hiện của gen trong quá trình phát triển và trong việc phản
ứng với các điều kiện môi trường.
Nguyên tắc của phản ứng PCR:
Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của AND polymerase để nhân bản một đoạn AND nhờ 2 đoạn
mồi oligonucleotit (primer) tương hop với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn AND.
Một chu trình phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn chính:
1. Giãn xoắn: Hai sợi của chu kỳ xoắn kép được tách ra nhờ nhiệt độ cao( 94-950C).
2. Gắn Primer: nhiệt độ phản ứng giãm xuống (55-600C)để các primer gắn vào sơi tương ứng theo

nguyên tắc bổ sung của các bazo.
3. Kéo dài mạch bổ sung AND. Phản ứng trùng hợp phân tử được thực hiện nhờ enzyme AND

Polymerase để kéo dài sợi bổ sung theo nguyên tắc tương trợ với sợi khuôn.
*Giai đoạn 1: Giãn xoắn AND:


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

-Các thành phần phản ứng gồm có trình tự AND đích, các mồi AND, dNTP, tag AND
polymerase.
-Trình tự đích: thông thường <= 3000 bp
+ trình tự được xác định bởi 1 cặp mồi đặc hiệu, thường 1 chuỗi oligonucleotit có khoảng 20
nucleotit( trình tự càng dài, tính đặc hiệu càng cao, thường >=16nu)
-Nhiệt độ phản ứng được tăng lên 950C để làm giãn sợi AND đích, mạch kép( kéo dài khoảng
0,5 đến 2 phút)
+ Thời gian giai đoạn này càng dài, hiệu quả dãn xoắn càng cao, tuy nhiên làm giảm hoạt tính
của enzyme và có thể gây biến tính sợi khuôn.
-Mg2+ là yếu tố cần bổ sung vào phản ứng PCR.
+ Việc bổ sung Mg2+ vào phản ứng PCR giúp làm ổn định mối tương tác giữa oligonucleotit và
sợi AND khuôn. AND polymerase và sợi khuôn.
+Nhiệt độ cao gây biến tính phan tử AND và giãn xoắn sợi đơn.
*Giai đoạn 2: Gắn primer.
-Nhiệt độ giảm đi 15-250C
-Các đoạn mồi gắn vào đầu 5’ của sợi đơn AND.
-Quá trình kéo dài khoảng 0,5-2 phút.
-THời gian càng ngắn, tính gắn đặc hiệu càng cao nhưng làm giảm hiệu suất của quá trình tổng
hop AND.
_Cần phải biết trình tự ở đầu 5’ của primer( tương ứng với đầu 3’ của sợi khuôn)
*Giai đoạn 3: polymere hóa các phân tử AND.

Do tag polymerase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 750C( nhiệt độ ở suối nước nóng của vi khuẩn
Thermus aquaticus là loài vi khuẩn phát hiện ra Tag polymerase, nhiệt độ phản ứng ở giai đoạn
này thường được nâng lên 72-750C.
Enzyme AND polymerase nhận ra các đoạn mồi đã được gắn vào sợi khuôn và xúc tác cho phản
ứng trùng hop phân tử AND mới theo nguyên tắc bổ sung các baso nito , với nguồn baso nito tự
do là dNTP.
Với sợi khuôn là sợi đơn đã được giãn xoắn ở giai đoạn 1.
Tốc độ trùng hop đạt khoảng 150nu/giây.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Chu trình PCR:

Câu 21. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả PCR. Công thức tính nhiệt độ gắn mồi cho các
mồi có kích thước khác nhau. VD minh họa.
Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả PCR:
- DNA khuôn: DNA khuôn phản ứng có độ nguyên vẹn cao, tránh tạp chất, lượng DNA khuôn
20-30ng.
- Mồi: Đoạn nu dài 6-70 nu, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự 2 đầu mạch khuôn.
+ Mồi càng dài thì độ chính xác của phản ứng tổng hợp càng cao. Mồi ngắn bắt cặp dễ nhưng
kết qủa kém chính xác.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

+ Phải có sự bổ sung giữa 2 mồi xuôi và ngược. mồi xuôi bắt cặp gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn
5’-3’, mồi ngược bắt cặp ở mạch khuôn 3’-5’.
+ Để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của phản ứng, đuôi 3’ của mồi là G hoặc C để
bắt cặp chắc hơn với 3 LK H.
Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai thích hợp
+ Nhiệt độ gắn mồi có ý nghĩa rất quan trọng: nhiệt độ bao nhiêu, thời gian bao lâu phụ thuộc
vào trình tự các đoạn cần nhân.
Công thức tính nhiệt độ gắn mồi cho các mồi có kích thước khác nhau:
Đối với mồi ≤ base thì nhiệt độ gắn mồi là:
Tm = [2 (tổng số A+T) + 4 (tổng số C+G)] oC.
Đối với mồi ≥ 20 – 35 base thì nhiệt độ gắn mồi là:
Tm = 22+ 1,46 [ 2 (tổng số G+C) + (tổng số A+T)]
Đối với mồi > 35 – 70 base thì nhiệt độ gắn mồi là:
Tm = 81,5 + 16,6 LgC + 0,41 (% tổng số G+C) – 600/ l
C: Nồng độ cation hóa trị 1 (Na+) tính theo M.
l: chiều dài mồi.
Cần xác định Tm lý thuyết rồi thử nghiệm tìm Tm tối ưu.
+ Nồng độ mồi: khoảng 100-500nM.
Nếu nồng độ mồi thấp sẽ không đủ cho phản ứng PCR.
Nếu nồng độ cao sẽ ức chế phản ứng gây sai lệch phản ứng.
+ Thời gian gắn mồi: tứ 30-60s, nếu thời gian dài sẽ gây sai lệch phản ứng, suy giảm hoạt động
của enzyme taq polymerase.
- dNTP: Nồng độ nguyên liệu thường dung là 200MM.
Nồng độ cao sẽ lien kết với Mg2+ ảnh hưởng tới PƯ.
Sau 35 chu kỳ, dNTP bị suy giảm, môi trường acid làm dNTP biến đổi thành dNDP hoặc dNMP.
- Enzyme taq polymerase:


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang

Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

+ Thể tích PCR 25Ml cần 1-2 đơn vị enzyme. Nồng độ enzyme nhiều hay ít ảnh hưởng đến chất
lượng PCR.
+ Dung dịch đệm PCR:
KCl: tăng hiệu quả của phản ứng. Mồi lớn cần nồng độ muối thấp và ngược lại.
MgCl: cần cho hoạt động của taqpolymerase.
Tris: giúp ổn định PH.
- Thể tích phản ứng: từ 5-100Ml.
Cùng lượng DNA khuôn, thể tích PCR nhỏ cho nồng độ sản phẩm cao hơn.
Chu kỳ phản ứng: 25-30 là đủ, nếu kéo dài them thì sản phẩm không tăng đáng kể mà còn dễ
xảy ra sai sót.
Câu 22. Phương pháp Real time PCR. Vì sao có thể dùng phương pháp này xác định lượng
sản phẩm PCR sau từng thời gian phản ứng.
Phương pháp PCR định lượng (RT-PCR) khắc phục được một số hạn chế của phương pháp
PCR thông thường như:
-

Không cần chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR.
Có thể định lượng chính xác được sản phẩm mà không cần điện di sản phẩm.
Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, Thời gian phát hiện kết quả phản ứng ngắn.
Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng một lúc trong cùng 1 ống nghiệm nên giảm khả năng
nhiễm mẫu.
Có thể dùng phương pháp này xác định lượng sản phẩm PCR sau từng thời gian phản ứng
dựa vào cường độ huỳnh quang của bình phản ứng:

-

-

Hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dẫn đến chu kỳ PCR tỉ lệ thuận với sản phẩm được
nhân bản. Cường độ phát huỳnh quang phụ thuộc vào hàm lượng chất phát huỳnh quang, qua đó
có thể theo dõi được quá trình PCR và định lượng sản phẩm.
RT-PCR sử dụng mẫu dò có thể phát huỳnh quang. Mẫu dò là một oligonucleotide, trong đó một
đầu được gắn với chất nhuộm phát huỳnh quang (R), đầu kia được gắn với chất nhuộm có vai trò
làm tắt sự phát huỳnh quang(Q). Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA
khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5’. Ở trạng thái này, không có hiện tượng phát huỳnh
quang. Khi bắt đầu tiến hành quá trình với sự hoạt động của enzyme taq polymerase, mồi được
kéo dài cho đến khi gặp mẫu dò thì mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính 5’nuclease
của taq-DNA polymerase và không ngăn cản quá trình PCR..
Sự phân giải mẫu dò sẽ giải phóng chất nhuộm màu có khả năng phát huỳnh quang (R) khỏi ảnh
hưởng kìm hãm của Q. Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết được.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Các phân tử chất mẫu được bổ sung vào sẽ sẽ được giải phóng khỏi mẫu dò ở từng chu kỳ PCR.
Như vậy hàm lượng chất phát huỳnh quang sẽ tăng dần theo chu kỳ PCR và tỉ lệ thuận với sản
phẩm được nhân bản. Cường độ chất phát huỳnh quang cũng phụ thuộc vào hàm lượng chất
mẫu, qua đó hoàn toàn có thể theo dõi được quá trình PCR và định lượng được sản phẩm.
Câu 23. Chỉ thị RAPD. Nguyên lý và ứng dụng.
Phương pháp RAPD: (Randomly Amplified Polymorphic ò DNA) là quá trình nhân bản các
đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR có sử dụng mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi có kích thước
khoảng 10 nu này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở vị trí bất kì mà nó có trình
tự bổ sung. Quá trình nhân bản một đoạn DNA nào đó sẽ xảy ra khi 2 mồi bắt cặp đúng chiều
vào đầu 3’ mỗi sợi và khoảng cách giữa 2 mồi là không quá 1-3kb.
Quá trình nhân bản xảy ra đồng thời ở nhiều vị trí và cho các đoạn DNA có kích thước khác
nhau. Đem điện di sẽ cho kết quả các băng khác biệt, từ đó dánh giá về sự đa hình (khác biệt) về

DNA giữa các mẫu nghiên cứu. đồng thời cho thấy sự đồng dạng DNA giữa các cá thể phân tích.
Đây là phương pháp đánh giá độ đồng dạng di truyền trên cơ sở sử dụng nhiều mồi chạy
nhiều lần, có phần mềm để đánh giá.
Nguyên tắc chung dựa theo công thức:
Sij = 2 Nij/ (Ni + Nj)
Sij : Độ đồng dạng của cá thế i, j.

Nij : Số băng DNA trùng lặp.

Ni : số băng của giống i.

Nj : số băng của giống j.

Nguyên lý chung 2 giống tạo ưu thế lai: Sự khác biệt di truyền bố mẹ: từ 40-60%.
Nếu < 40% không có ưu thế lai; > 60% sẽ không hữu thụ.
Nhược điểm:
Độ lặp lại thấp.
Đây là chỉ thị trội, không phân biệt được thể đồng hợp tử và dị hợp tử.
Có thể cùng kích thước băng nhưng có trình tự khác nhau. Cần phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần
trên cùng 1 thiết bị.
Câu 24. Chỉ thị AFLP. Nguyên lý và ứng dụng.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

-

Bản chất của phương pháp: Sử dụng kỹ thuật PCR đề nhân lên các đoạn DNA đã được cắt bởi

enzyme giới hạn. Khâu then chốt của kỹ thuật này là việc thiết kế các mồi đặc trưng.
Để thiết kế được mồi đặc trưng, trước hết DNA của mẫu nghiên cứu được cắt bởi các enzyme
giới hạn, thường dùng đồng thời 2 enzyme giới hạn là:
EcoRI có trình tự nhận biết -G,AATT C-C TTAA,GMseI có trình tự nhận biết -A’AT T-T TA’ASau khi xử lý với enzyme, dựa vào trình tự đã biết ở 2 đầu đoạn cắt có thể thiết kế các
đoạn gắn (adaptor) và gắn chúng vào các đầu cắt. Trình tự các adaptor phải có vùng trình tự bổ
sung với đầu cắt và vùng trình tự tùy ý để thiết kế mồi.
Mồi được thiết kế dựa trên trình tự adaptor, từ đó ta nhân được đoạn gen ở giữa 2 đầu đoạn
cắt.
Thiết kế mồi mới bằng trình tự mồi cũ bổ sung 1-3 nu ngẫu nhiên (bổ sung về phía bên
trong 2 đầu adaptor).
Quy trình :
+Chiết tách AND
+Cắt đoạn AND bằng enzyme giới hạn ( Phức hệ enzyme giới hạn)
+Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi được thiết kế dựa vào trình tự 2 adaptor được gắn vào 2
đầu dính của đoạn cắt.
+Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi dò thiết kế trên cơ sở bổ sung vào mỗi mồi 1 nu mới( A,
T, G, C)
+Tương tự các bước trên nhưng với mồi bổ sung từng nu, thứ 2, thứ 3
+Chạy điện di sản phẩm và hiện hình
+ Băng đa hình rất lơn, thuận lợi.

-

Ưu điểm:
+ Đơn giản.
+ Ổn định.
+ Dễ thiết kế.
+ Khả năng ứng dụng cao.
Câu 25. Chỉ thị STS. Nguyên lý và ứng dụng.

-

-

STS là một đoạn DNA ngắn khoảng 200-500 bp có thể phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật
STS cho phép xác định những vị trí cần biết bằng các trình tự DNA biết trước.
Nguyên lý: Nhân trực tiếp những đoạn locus đã biết (gen, cDNA) bởi mồi PCR được thiết kế từ
trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này.
Tiến hành: Xác định trình tự nu ở 2 đầu của các đoạn sử dụng mẫu dò trong kỹ thật RFLP và sản
phẩm RAPD. Sau đó dựa vào trình tự đã xác định thiết kế mồi PCR có chiều dài 18-20 nu. Kết
quả chạy PCR cho các đoạn DNA nằm trong cùng sản phẩm RAPD và RFLP. Các dòng cDNA
đã xác định trình tự được sử dụng như các mẫu dò RFLP để tạo ra một lượng lớn các STS.
Ứng dụng: Các STS thường được xác định rõ rệt ở 1 vị trí đã biết trên NST.
Điều kiện để thực hiện chỉ thị STS: Phải biết được trình tự nu của đoạn cần tìm để thiết kế mồi.


Hồ Thị Thương
Trần Thị Huyền Trang
Lớp CNSHA-K54.Đặng Minh Linh

Câu 26. Giới thiệu các chỉ thị SSR, STR, VNTR.
-

-

-

SSR (simple sequence repeat) - microsatellite: DNA vệ tinh có đơn vị lặp lại ngắn< 25bp,
thường là 4bp, chiều dài đoạn DNA < 150 bp.
Do có sự sai khác về kích thước giữa các đoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho

nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen.
Dùng để phân biệt cá thể người, động vật, giống cây trồng vật nuôi.
KT SRR đơn giản, không tốn kém,là chỉ thị đồng trội nên được dùng để phát hiện cá thể dị
hợp tử.
Các bước tiến hành: Tách chiết, tinh sạch DNA nghiên cứu.
Thực hiện PCR với mồi đặc trưng cho các đoạn lặp.
Điện di sản phẩm PCR, tính toán số liệu, so sánh sự sai khác.
Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng.
STR (short tandem repeat) - minisatellite: DNA vệ tinh có đơn vị lặp lại < 25 bp, chiều dài < 20
kb.
Dùng để phân biệt nhóm cá thể.
VNTR (variable number tandem repeat): Số lần lặp lại liền kề khác nhau. Mỗi đơn vị lặp lại lên
tới hàng trăm bp.
Câu 27. cDNA. Nguyên lý thiết lập ngân hàng cDNA.

-

cDNA là các phân tử DNA được tổng hợp từ khuôn mRNA qua quá trình sao chép ngược. cDNA
được thu thập và lưu trữ trong các ngân hàng cDNA.
Nguyên lý thiết lập ngân hàng gen cDNA:
+Để tạo cDNA trước hết cần tách được mRNA. Do các mRNA đều chứa ở đầu 3’ một chuối các
polyA, người ta có thể tách riêng các m RNA nhờ các tổ hợp oligonucleotide chỉ chứa
deoxythimine (oligodT). Người ta gắn các oligodT với các cellulose và đặt trong các phễu chiết.
Sau đó chiết xuất toàn bộ RNA của tế bào gồm rRNA, tRNA, mRNA rồi cho hốn hợp này chảy
qua phễu có gắn cellulose-oligodT.
+ Các mRNA sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành lien kết bổ sung A-T.
+ Dùng dung dịch muối NaCl để đẩy các tRNA và rRNA ra khỏi phễu.
+ Dùng dung dịch đệm Tris EDTA cho chảy qua phễu giải phóng các mRNA do lien kết A-T
bị phân giải. Dùng các mRNA này làm khuôn với sự có mặt của Enzyme sao chép ngược cùng
với các nguyên liệu dNTP, quá trình tổng hơp DNA sẽ xảy ra, kết quả thu được cDNA.

+Các cDNA sẽ tiếp tục được nhân dòng và tập hợp thành các thư viện cDNA. Để tìm ra các
cDNA cần thiết, người ta có thể sử dụng các phương pháp lai DNA hoặc PƯ của protein kháng
thể.
Câu 28. Sơ đồ tạo cDNA cải tiến:
-

Gắn vào chuỗi poly A một trình tự cho enzyme RE( gọi chung vùng này là primer
Adaptot_