Nghiên Cứu Biến Đổi Sinh Học Đậu Hũ Bằng Bacillus Subtilis Dùng Trong Chế Biến Thực Phẩm

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
***000***

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SINH HỌC ĐẬU HŨ BẰNG Bacillus
subtilis DÙNG TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD: TS. LÊ CHIẾN PHƯƠNG

Tp. Hồ Chí Minh – 2009
1


MỤC LỤC
DANH MỤC

TRANG

Trang tựa ..................................................................................................................... i
Lời cảm tạ................................................................................................................... ii
Mục lục .....................................................................................................................iii
Danh sách các hình .................................................................................................... iv
Danh sách các bảng .................................................................................................... v
Danh sách đồ thị ........................................................................................................ vi
Danh sách chữ viết tắt ............................................................................................... vii
Chương 1 Mở đầu .................................................................................................... 1
Chương 2 Tổng quan tài liệu .................................................................................... 2

2. 1. Giới thiệu về đậu tương....................................................................................... 2
2. 1. 1. Phân loại đậu tương......................................................................................... 2
2. 1. 2. Đặc điểm thực vật ........................................................................................... 2
2. 1. 3. Giá trị dinh dưỡng ........................................................................................... 2
2. 1. 4. Công dụng y học của đậu nành ........................................................................ 5
2. 1. 5. Các sản phẩm về đậu nành .............................................................................. 6
2. 1. 5. 1. Đậu phụ....................................................................................................... 6
2. 1. 5. 2. Chao............................................................................................................ 7
2. 1. 5. 3. Tương ......................................................................................................... 8
2. 1. 5. 4. Miso ............................................................................................................ 9
2. 1. 5. 5. Natto ........................................................................................................... 9
2. 1. 5. 6. Tempeh ..................................................................................................... 10
2. 2. Giới thiệu về Bacillus subtilis ........................................................................... 11
2. 2. 1. Đặc điểm của Bacillus subtilis....................................................................... 11
2. 2. 2. Phân bố trong tự nhiên .................................................................................. 12
2. 2. 3. Tác hại .......................................................................................................... 12
2. 2. 4. Lợi ích .......................................................................................................... 13
2. 2. 4. 1. Tạo kháng sinh .......................................................................................... 13
2. 2. 4. 2. Sinh tổng hợp enzyme ............................................................................... 13
4


Chương 3 Vật liệu và phương pháp ....................................................................... 15
3. 1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 15
3. 2. Vật liệu ............................................................................................................. 15
3. 2. 1. Nguyên liệu................................................................................................... 15
3. 2. 2. Chủng vi sinh vật .......................................................................................... 16
3. 2. 3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ...................................................................... 16
3. 2. 4. Môi trường dùng trong thực nghiệm .............................................................. 16
3. 3. Phương pháp ..................................................................................................... 17

3. 3. 1. Phương pháp nhuộm Gram ............................................................................ 17
3. 3. 2. Phương pháp nhuộm bào tử ........................................................................... 17
3. 3. 3. Phương pháp nhuộm tiêm mao ...................................................................... 19
3. 3. 4. Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng ........................................... 19
3. 3. 5. Phương pháp xác định thời gian thế hệ .......................................................... 21
3. 3. 6. Phương pháp xác định thời gian sinh khối max trong môi trường CP lỏng .... 21
3. 3. 7. Phương pháp xác định thời gian tạo sinh khối tối đa trong môi trường sữa đậu
nành .......................................................................................................................... 21
3. 3. 8. Phương pháp định tính enzyme ..................................................................... 22
3. 3. 9. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme amylase ..................................... 22
3. 3. 10. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme protease ................................... 23
3. 3. 11. Phương pháp xác định độ ẩm ...................................................................... 24
3. 3. 12. Phương pháp xác định hàm lượng đạm tổng số ........................................... 25
3. 3. 13. Phương pháp định lượng đạm formol .......................................................... 27
3. 3. 14. Phương pháp định lượng đạm amoniac........................................................ 28
3. 3. 15. Phương pháp định lượng đường tổng .......................................................... 29
3. 3. 16. Phương pháp định lượng đường khử ........................................................... 30
3. 3. 17. Phương pháp định lượng lipid thô ............................................................... 31
3. 3. 18. Phương pháp xác định chỉ số peroxyde ....................................................... 32
3. 3. 19. Phương pháp xây dựng quy trình chế biến thực phẩm từ đậu hũ thuỷ phân.. 33
Chương 4 Kết quả và thảo luận ............................................................................. 34
4. 1. Kết quả khảo sát nguồn giống ........................................................................... 34
4. 1. 1. Hình thái đại thể và vi thể của Bacillus subtilis ............................................. 34
4. 1. 2. Kết quả giữ giống. ......................................................................................... 34
5


4. 1. 3. Kết quả nhuộm bào tử ................................................................................... 35
4. 1. 4. Kết quả nhuộm Gram .................................................................................... 35
4. 1. 5. Kết quả xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường CP lỏng ............. 36

4. 1. 6. Kết quả xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường sữa đậu nành ..... 38
4. 1. 7. Kết quả xác định thời gian thế hệ .................................................................. 38
4. 1. 8. Kết quả định tính enzyme.............................................................................. 39
4. 1. 9. Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase của Bacillus subtilis .................. 40
4. 1. 10. Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease của Bacillus subtilis ................ 41
4. 2. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu của đậu hũ thuỷ phân ........................................... 42
4. 2. 1. Độ ẩm ........................................................................................................... 42
4. 2. 1. Đạm tổng số .................................................................................................. 43
4. 2. 2. Đạm formol................................................................................................... 44
4. 2. 3. Đạm amoniac ................................................................................................ 45
4. 2. 4. Đường tổng ................................................................................................... 46
4. 2. 5. Đường khử .................................................................................................... 47
4. 2. 6. Lipid thô ....................................................................................................... 48
4. 2. 7. Peroxyde ....................................................................................................... 49
Chương 5 Kết luận và đề nghị................................................................................ 51
Phụ lục..................................................................................................................... 52
Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 55

6


DANH MỤC CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2. 1. Cây đậu nành.............................................................................................. 2
Hình 2. 2. Hình sản phẩm đậu hủ ................................................................................ 7
Hình 2. 3. Hình sản phẩm chao ................................................................................... 8
Hình 2. 4. Hình sản phẩm nước tương......................................................................... 8

Hình 2. 5. Hình các loại Miso ..................................................................................... 9
Hình 2. 6. Hình sản phẩm Natto ................................................................................ 10
Hình 2. 7. Hình sản phẩm tempeh ............................................................................. 11
Hình 2. 8. Hình ảnh của Bacillus subtilis .................................................................. 12
Hình 3. 1. Hình đậu hũ Vina Tofu ............................................................................. 15
Hình 3. 2. Hình chai nước mắm Hưng Thịnh ............................................................ 15
Hình 3. 3. Hình sữa đậu nành không đường .............................................................. 16
Hình 4. 1. Hình thái đại thể và vi thể của Baccillus subtilis ...................................... 34
Hình 4. 2. Hình thái khuẩn lạc trong ống nghiệm giữ giống ...................................... 34
Hình 4. 3. Hình kết quả nhuộm bào tử ..................................................................... 35
Hình 4. 4. Hình kết quả nhuộm gram ....................................................................... 35
Hình 4. 5. Hình kết quả vòng phân giải tinh bột của Bacillus subtilis sau 3 ngày cấy39
Hình 4. 6. Hình kết quả vòng phân giải casein của Bacillus subtilis sau 3 ngày cấy . 39

7


DANH MỤC CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2. 1. Thành phần acid amin trong protein đậu nành ............................................ 4
Bảng 2. 2. Thành phần khoáng trong đậu nành ........................................................... 4
Bảng 2. 3. Thành phần vitamin của đậu nành .............................................................. 5
Bảng 4. 1. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian ........................................................ 36
Bảng 4. 2. Kết quả OD610nm theo thời gian ................................................................ 37
Bảng 4. 3. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian trên môi trường sữa đậu nành ......... 38
Bảng 4. 4. Kết quả hoạt tính enzyme amylase của Bacillus subtilis theo thời gian..... 40
Bảng 4. 5. Kết quả hoạt tính enzyme protease của Bacillus subtilis theo thời gian .... 41

Bảng 4. 6. Kết quả độ ẩm của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ...................... 42
Bảng 4. 7. Kết quả đạm tổng số của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân............. 43
Bảng 4. 8. Kết quả đạm formol của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ............. 44
Bảng 4. 9. Kết quả đạm amoniac của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ........... 45
Bảng 4. 10. Kết quả đường tổng của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ............ 46
Bảng 4. 11. Kết quả đường khử của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ............. 47
Bảng 4. 12. Kết quả lipid thô của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân................. 48
Bảng 4. 13. Kết quả peroxyde của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ............... 49
Bảng 4. 14. Bảng tổng kết kết quả các chỉ tiêu của đậu hũ thủy phân theo thời gian.. 50

8


DANH MỤC ĐỒ THỊ
TRANG

ĐỒ THỊ

Đồ thị 4. 1. Đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis theo CFU ........................ 36
Đồ thị 4. 2. Đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis theo OD610nm ................... 37
Đồ thị 4. 3 Đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis theo CFU. ....................... 38
Đồ thị 4. 4. Đồ thị biễu diễn hoạt tính amylase của Bacillus subtilis theo thời gian ... 40
Đồ thị 4. 5. Đồ thị biễu diễn hoạt tính protease của Bacillus subtilis theo thời gian ... 41
Đồ thị 4. 6. Đồ thị biễu diễn độ ẩm của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân ....... 42
Đồ thị 4. 7. Đồ thị biễu diễn % đạm tổng số của nguyên liệu và các giai đoạn thủy
phân .......................................................................................................................... 43
Đồ thị 4. 8. Đồ thị biễu diễn đạm formol của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân44
Đồ thị 4. 9. Đồ thị biễu diễn đạm amoniac của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân
................................................................................................................................. 45
Đồ thị 4. 10. Đồ thị biễu diễn đường tổng của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân

................................................................................................................................. 46
Đồ thị 4. 11. Đồ thị biễu diễn đường khử của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân47
Đồ thị 4. 12. Đồ thị biễu diễn lipid thô của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân .. 48
Đồ thị 4. 13. Đồ thị biễu diễn peroxyde của nguyên liệu và các giai đoạn thủy phân . 49

9


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
LDL:

Low-density lipoprotein

HDL:

High-density lipoprotein

FDA:

Food and Drug Administration

AOAC:

Association of Analytical Communities

FAO:

Food and Agriculture Organization

OD:

Optical Density

10


Chương 1 MỞ ĐẦU
Từ rất xa xưa có thể từ hơn hai nghìn năm trước, đậu nành đã được sử dụng
dùng làm thực phẩm cho con người. Theo thời gian các kỹ thuật chế biến đậu nành đã
trở nên tinh vi và phức tạp hơn, đã thực hành rộng rãi ở phương Đông và khu vực
Đông Nam Á hàng trăm năm nay. Sản phẩm phổ biến nhất là đậu phụ (đậu hũ). Các
sản phẩm lên men từ đậu nành có giá trị dinh dưỡng cao như nước chấm lên men,
tương, chao (Việt Nam), đậu phụ, sáng sáu, xì dầu (Trung Quốc), Natto, Miso, xoin
(Nhật), sữa đậu nành…Tuy nhiên ở nước ta đậu tương lại nằm trong nhóm sản phẩm
và dịch vụ có sức cạnh tranh thấp trong nền kinh tế quốc dân do các nguyên nhân:
 Ít có sản phẩm từ đậu nành có giá trị công nghiệp.
 Các phụ phế phẩm ít được tận dụng.
 Các sản phẩm được sản xuất với quy mô công nghiệp của đậu nành chỉ được dùng
với một lượng nhỏ trong khẩu phần ăn hàng ngày.
Hầu hết các sản phẩm lên men từ đậu tương chủ yếu sử dụng nấm mốc, bên cạnh
đó có một vài sản phẩm từ vi khuẩn và việc sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis đã trở
thành những món ăn truyền thống của nhiều nước Châu Á như Natto của Nhật, thua
nao của Thái Lan… Tuy nhiên cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa phổ biến. Vì các lý
do trên và vì tính độc đáo của Bacillus subtilis: hệ enzyme nhiều, phát triển mạnh trên
môi trường sữa đậu nành cho nên chúng tôi đã tuyển chọn chủng Bacillus subtilis và
nghiên cứu chế biến thực phẩm từ đậu hũ đã thủy phân bởi Bacillus subtilis nhằm tạo
ra một loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao đồng thời hỗ trợ tiêu hóa cho người sử
dụng.

11

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2. 1. Giới thiệu về đậu tương
2. 1. 1. Phân loại đậu tương
 Đậu nành có tên khoa học là Glycine max merrill, có đặc điểm phân loại khoa học
như sau:
Giới: plantae
Bộ: fabales
Họ: fabaceae
Phân họ: faboideae
Chi: glycine
Loài: G.max
2. 1. 2. Đặc điểm thực vật
 Đậu nành là cây thường niên, dạng bụi, xẻ lá chét lông chim, phiến lá có hình oval.
Chùm hoa có cuốn ngắn, hoa màu tím hoặc màu trắng, quả thường cong và có lông.
Mỗi quả có ba hạt hình cầu hay hình tròn. Vỏ hạt có màu từ vàng sáng cho đến nâu,
đen, xanh. Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau nhưng loại có màu vàng là loại tốt
nhất nên được trồng và sử dụng nhiều nhất. (Nguồn Nguyễn Đức Lượng, 2006)
Hình 2. 1. Cây đậu nành

2. 1. 3. Giá trị dinh dưỡng
 Kể từ đầu thế kỷ 20, Hoa Kỳ đã tổ hợp các thực phẩm theo các thành phần dinh
dưỡng và khuyến cáo người dân dựa theo đó mà thiết lập chương trình ăn uống cho có
đầy đủ sức khỏe. Khuyến cáo đầu tiên được ban hành vào năm 1916, chỉ dẫn lượng và

12


loại thực phẩm cần thiết đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho protein, chất béo,

cacbohydrate, sinh tố và chất khoáng.
 Thực phẩm thế kỷ 21 là thực phẩm có chứa các chất phytochemicals. Trước khi
trình bày về phytochemicals có trong đậu nành, ta nói sơ bộ về thành phần dinh dưỡng
chính của đậu nành (Nguồn Dương Thanh Liêm, 2008).
 Protein
 Giá trị của protein trong bất kỳ thực phẩm nào cũng tùy thuộc vào hai yếu tố:
lượng và phẩm. Lượng protein được diễn tả bằng bách phân của trọng lượng thực
phẩm, còn phẩm chất được xác định bởi hai yếu tố: khả năng tiêu hóa và đầy đủ thành
phần acid amin thiết yếu. Nếu thực phẩm nào hội đủ hai yếu tố này thì được đánh giá
cao về phẩm.
 Phần lớn thực phẩm của đậu nành đều thuộc loại dễ dàng tiêu hóa. Đậu nành là loại
đậu duy nhất hội tụ đủ 2 yếu tố này, có nghĩa là nó chứa đựng tất cả các loại thiết yếu
cùng với hàm lượng cần thiết tương đương với protein động vật và được tiêu hóa dễ
dàng.
 Protein là những chuỗi phân tử dài được tạo thành bởi những phân tử nhỏ hơn gọi
là acid amin. Những acid amin này là những khối kiến trúc của những bộ phận sống
cần thiết để bão dưỡng các mô tế bào, xương cốt, răng, tóc, chiến đấu chống lại sự
nhiễm trùng và đảm nhiệm vai trò quan trọng trong tiến trình chuyển hóa năng lượng.
Mặc dù có khoảng 20 loại acid amin nhưng trong số đó chỉ có khoảng 8 acid amin là
không thể tự tạo từ cơ thể con người mà cần phải hấp thụ từ nguồn thực phẩm bên
ngoài, 8 acid amin này là: trytophan, threonine, isoleucine, valine, lysine, methyonine,
phenylalanine và leucine.
 Cơ thể chúng ta cần tất cả 8 loại acid amin này để cho đồng bộ và điều chỉnh tỷ lệ
phù hợp với nhau. Nếu một trong 8 acid amin này thiếu, những thứ khác không thể tác
hợp và vận hành được, có nghĩa là tất cả 8 loại acid amin phải được hấp thu vào trong
cơ thể cùng lúc để có thể làm việc điều hòa.
 Đậu nành là nguồn giàu protein, cung cấp từ 35 – 38 % calo so với các loại rau,
đậu khác.

13

Bảng 2. 1. Thành phần acid amin trong protein đậu nành.
Thành phần

Tỷ lệ (%)

Thành phần

Tỷ lệ (%)

Isoleucine

1.1 %

Phenylalanine

5.0 %

Leucine

7.7 %

Threonine

4.3 %

Lysine

5.9 %

Tryptophan

1.3 %

Methionine

1.6 %

Valin

5.4 %

Cystine

1.3 %

Histidin

2.6 %

 Ngoài ra trong đậu nành sống còn chứa hàm lượng đáng kể các chất kháng enzyme
proteinase. Thành phần các chất này gồm:
 Glycin: chất này có tác dụng ức chế thải tiết của tuyến tụy, giảm hoạt động của
dịch tuyến, giảm hoạt động của men trypsin, chymotrypsin và amylase. Làm cho tuyến
tụy bội triển.
 Lectin: làm kết dính hồng cầu.
 Soyin: ở trong ruột, ức chế hoạt động của men trypsin và lipase làm giảm sự tiêu
hóa đạm và mỡ.
 Tuy nhiên các chất trên bị tiêu diệt ở nhiệt độ 105 – 1100C trong thời gian 10 – 30

phút. Do đó chúng ta nên sử dụng đậu nành sau khi đã xử lý ở mức độ thích hợp để
vừa diệt được men kháng dinh dưỡng vừa giữ được các chất dinh dưỡng của đậu nành.
(Nguồn Dương Thanh Liêm, 2008).
 Sinh tố và chất khoáng
 Đậu nành nhiều protein hơn bất cứ loại thực phẩm nào kể cả thịt động vật. Ngoài
ra, đậu nành cũng rất giàu chất khoáng và sinh tố như vitamin B1, B2, B3, B6, niacine,
canxi, sắt, kẽm…Đậu nành cũng chứa nhiều chất xơ.
Bảng 2. 2. Thành phần khoáng trong đậu nành.
Thành phần

Tỷ lệ (%)

Canxi

0.16 – 0.47

Phospho

0.41 – 0.82

Mangan

0.22 – 0.24

Kẽm

0.37 g/kg

Sắt

90 – 150 g/kg
14


Bảng 2. 3. Thành phần vitamin của đậu nành.
Thành phần

Tỷ lệ (%)

Thành phần

Tỷ lệ (%)

Thianin

11 – 17.5 %

Inoziton

Riboflavin

3.4 – 3.6 %

Vitamin A

0.18 – 2.43 %

Niacin

21.4 – 23 mg/g

Vitamin E

1.4 mg%

Pyridoxin

7.1 – 12 mg/g

Vitamin K

1.9 mg%

0.8 mg/g

Vitamin B1

0.54 mg%

13 – 21.5 mg/g

Vitamin B2

0.29 mg%

1.9 mg/g

Vitamin PP

2.3 mg%

Biotin
Pantothenic acid
Folic acid

2300 mg%

(Nguồn: Dương Thanh Liêm, 2008).
2. 1. 4. Công dụng y học của đậu nành
 Như chúng ta đã biết đậu nành chứa rất nhiều protein, 8 loại acid amin thiết yếu và
là nguồn cung cấp canxi, sắt, vitamin, chất xơ. Các hợp chất isoflavon và các chất thảo
mộc khác trong đậu nành có khả năng phòng ngừa và trị liệu một số bệnh như: đau
tim, ung thư vú, tai biến mạch máu não, ung thư kết tràng (Theo Viện ung thư Quốc
Gia Hoa Kỳ, Viện Đại học Havard, Viện Đại học Alabama. Minesota Iowa và
Hensinki, Phần Lan). Những chất có trong đậu nành có tinh thảo dược gồm có:
protease inhibitor, sphytases, phytosterols, saponins, phenolic acid, lecithin, ω3 va
isoflavones (phytoestrogens).
 Protease inhibitors: vốn là chất kháng dinh dưỡng, có khả năng ngăn ngừa sự phát
triển của bệnh ung thư nhờ protease inhibitors có khả năng ngăn ngừa sự tác động của
một số gen di truyền gây nên chứng ung thư. Bảo vệ tế bào cơ thể khỏi tác hại của môi
trường xung quanh như tia nắng mặt trời và các chất ô nhiễm trong không khí. Tuy
nhiên protease inhibitors bị giảm sau khi đậu nành được chế biến qua phương pháp
làm nóng.
 Phytates: là hợp chất ngăn cản sự hấp thu canxi và sắt trong ruột. Thông thường thì
những thực phẩm giàu phytates cũng thường có nhiều chất xơ và những thực phẩm
này bảo vệ chúng ta khỏi bị bệnh ung thư kết tràng.
 Phenolic acid: là một antioxidant và phòng ngừa các nhiễm sắc thể DNA khỏi bị
tấn công bởi các tế bào ung thư.

15

 Saponins: hoạt động như chất chống oxy hóa để bảo vệ cơ thể khỏi các tác hại của
các gốc tự do. Nó cũng có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng
và làm giảm lượng cholesterol trong máu.
 Lecithin: là một hóa chất thực vật quan trọng, đóng vai trò quan trọng trong việc
kích thích sự biến dưỡng ở khắp các tế bào cơ thể, có khả năng cải thiện hệ thống tuần
hoàn, bổ xương, và tăng cường sức đề kháng.
 Phytosterol: phytosterol ngăn cản sự hấp thu cholesterol trong thức ăn vào máu và
ngăn cản sự tái hấp thu cholesterol từ acid mật vào ống tiêu hóa, do đó làm giảm lượng
cholesterol vào máu nên giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch.
 Trong đậu nành có chứa chất insoflavones tương tự kích thích tố nữ estrogen. Vì
thế nó được mệnh danh là “estrogen thảo mộc”. Nhiều nghiên cứu cho thấy,
insoflavones của cây đậu nành có tác dụng ngăn ngừa các bệnh tim mạch.
 Theo Lames W. Anderson, một chuyên gia về bệnh nội tiết và dinh dưỡng, cho
rằng chỉ cần trong chế độ ăn mỗi ngày 30g đậu nành là có thể làm cholesterol giảm
12%, LDL giảm 13%, HDL không thay đổi mấy. Đó là do các amino acid có trong đậu
nành đặc biệt là glycine và arginine. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn chứng minh rằng
insoflavones đậu nành còn có tác dụng trong việc giảm bệnh ung thư và bệnh thận.
 Do có nhiều hữu ích nên các chuyên gia dinh dưỡng khuyến cáo nên tiêu thụ nhiều
các sản phẩm từ đậu nành trong khẩu phần ăn hàng ngày.
(Nguồn:

/>
insoflavones-dau-nanh-htm)
2. 1. 5. Các sản phẩm từ đậu nành
2. 1. 5. 1. Đậu phụ
 Đậu phụ là một sản phẩm được làm từ sữa đậu nành, được cho thêm tác nhân làm
đông và ép thành miếng. Là sản phẩm rất phổ biến ở các nước Châu Á đặc biệt là Việt
Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Đại Hàn….

 Tên chung: Soybean curd.
 Tên Việt Nam: Đậu Phụ (đậu hủ).
 Đậu phụ là sản phẩm dễ tiêu hóa hơn đậu nành, được mệnh danh là thịt không
xương ở Trung Quốc. Có nhiều dạng đậu phụ khác nhau nhưng cơ bản được chia làm
ba loại:
16


 Loại cứng: là loại đậu phụ được ép hết nước trong quá trình chế biến.
 Loại mềm: không ép nước hoặc ép nước rất nhẹ.
 Loại đậu phụ lụa: mềm hơn loại đậu phụ mềm, được làm theo phương pháp khác
hai loại kia. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Hình 2. 2. Hình sản phẩm đậu hủ.

2. 1. 5. 2. Chao
 Là sản phẩm được lên men từ đậu phụ và có hệ số tiêu hóa cao hơn đậu phụ. Đó là
do quá trình lên men sinh ra nhiều amin, acid béo…dễ hấp thu.
 Tên chung: Soya cheese
 Tên Việt Nam: Chao
 Các vi sinh vật trong chao là các loài nấm mốc: Actinormucor elegans,
M.Hiemalis, M.sivticus, M.Subtilis. Các loài này có enzyme protease, lipase,
amylase….thủy phân cơ chất đậu hũ thành các chất dinh dưỡng có cấu tạo đơn giản,
dễ hấp thu vào cơ thể. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006).

17


Hình 2. 3. Hình sản phẩm chao

2. 1. 5. 3. Tương

 Tương là một loại sản phẩm thủy phân từ các nguồn nguyên liệu từ glucid và giàu
đạm. Đây là một là một dạng nước chấm cổ truyền của Việt Nam.
 Các vi sinh vật dùng trong sản xuất tương thường thấy là các loại nấm mốc như:
Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillium motatum, các tài liệu nghiên cứu về
tương cho thấy rằng nấm mốc có ý nghĩa lớn nhất trong sản xuất tương là loại nấm
mốc A.oryzae. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Hình 2. 4. Hình sản phẩm nước tương

18


2. 1. 5. 4. Miso
 Miso là sản phẩm lên men truyền thống từ Nhật Bản. Hiện nay Nhật là nước sản
xuất và tiêu thụ Miso nhiều nhất.
 Có rất nhiều Miso khác nhau nhưng có 3 loại chủ yếu là Miso gạo, Miso đại mạch
và Miso đậu nành. Tùy mỗi loại, tùy theo hương vị và màu sắc mà người ta lại chia
thành nhiều loại khác nhau như Miso ngọt, Miso mặn, Miso trắng, Miso đỏ, Miso dinh
dưỡng.
 Tùy theo nguyên liệu sử dụng mà giá trị dinh dưỡng của mỗi loại khác nhau. Miso
đậu nành có hàm lượng protein và lipid cao hơn Miso gạo và Miso đại mạch. Nhưng
lượng đường khử lại thấp hơn. Tất cả các loại Miso đều có chứa nhiều vitamin (B1, B2,
niacin), và khoáng chất (Ca, P, Fe, Na, K).
 Các vi sinh vật dùng trong sản xuất Miso hầu hết thuộc các giống Aspergillus. Loại
nấm mốc khác đôi khi cũng được dùng như: Rhizopus. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng,
2006).
Hình 2. 5. Hình các loại Miso

19

2. 1. 5. 5. Natto
 Natto trong tiếng Nhật có nghĩa là đậu lên men. Giống như Miso, Natto cũng là
một loại thực phẩm lên men truyền thống của người Nhật Bản đã được lưu truyền từ
rất nhiều đời.
 Natto chia thành hai loại: Natto sợi và Natto muối. Điểm khác biệt giữa hai loại
này là Natto sợi sử dụng vi khuẩn để lên men, còn Natto muối sử dụng nấm mốc để lên
men.
 Natto là những hạt đậu nành đã luộc chín được ủ với enzyme (Bacillus Natto) ở
môi trường 40oC trong vòng 14 – 18 giờ để ủ men thành những hạt đậu có màu nâu, độ
nhờn nhớt cao và bền (chứa nhiều acid glutamic), có mùi nồng rất khó chịu với người
không quen. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất cho biết khi độ nhớt càng cao thì chất
lượng Natto càng tốt và vị càng ngọt. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Hình 2. 6. Hình sản phẩm Natto

2. 1. 5. 6. Tempeh
 Tempeh là loại thực phẩm cổ truyền của người Indonesia. Tempeh làm từ đậu nành
lên men, nó là một loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và dễ tiêu hóa.
 Tempeh không chỉ là món ăn đơn thuần của người Indonesia mà còn được người
Phương Tây quan tâm đến nhiều vì giá trị dinh dưỡng và hương vị hấp dẫn của nó.
 Tempeh được sản xuất bởi giống Rhizopus trong thời gian ngắn nhất. (Nguồn:
Nguyễn Đức Lượng, 2006).

20


Hình 2. 7. Hình sản phẩm tempeh

2. 2. Giới thiệu về Bacillus subtilis
2. 2. 1. Đặc điểm của Bacillus subtilis
 Theo phân loại của Bergey Bacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae Fisher 1895, 139,

giống Bacillus, chủng Bacillus subtilis họ Bacillaceae có những đặc điểm sau:
 Trực khuẩn (tế bào hình que), không tạo chuỗi, có nội bào tử (nha bào) khác và tế
bào dinh dưỡng bị sự khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu hơn, bền hơn đối
với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác. Bào tử có chứa acid dipicolinic (5 – 10% so với
chất khô), được bao bọc bởi vỏ trong cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài.
 Phần lớn Gram (+), chuyển động nhờ tiêm mao vị trí bên cạnh hay xung quanh
hoặc bất động. Hiếu khí hay yếm khí tùy ý. Thường tạo các trực khuẩn thẳng hoặc hầu
như thẳng, 0.3 – 2.2 x 1.2 x 7.0 micro, phần lớn di động. Tạo một bào tử bền nhiệt
trong mỗi tế bào. Dị dưỡng cần cacbon hữu cơ, trao đổi chất thuộc loại hô hấp tuyệt
đối, lên men tuyệt đối hoặc vừa hô hấp lên men, sử dụng các cơ chất lên men khác
nhau. Nhân tố cuối cùng tách điện tử trao đổi chất hô hấp là oxy phân tử ở một số
chủng được thay bằng nitrat. Hiếu khí bắt buộc hoặc hiếu khí tùy ý. Lượng G + X
trong AND của các dòng được nghiên cứu từ 32 – 62 mol%
 Chủng đại diện là B. subtilis (Ihrenberg) có một số đặc điểm sau:
 Là trực khuẩn Gram (+), hiếu khí, hình que ngắn, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay
dính lại với nhau tạo thành chuỗi ngắn.

21


 Khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, về sau tiêm mao rụng khi tế bào
già nên vi khuẩn mất khả năng di động trong môi trường.
 Khi gặp điều kiện không thuận lợi của môi trường sống, tế bào sẽ thành bào tử.
Kích thước của bào tử không lớn hơn kích thước của tế bào nên vi khuẩn giữ nguyên
hình dạng khi hình thành bào tử.
Hình 2. 8. Hình ảnh của Bacillus subtilis

2. 2. 2. Phân bố trong tự nhiên
 B. subtilis có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ (cho
gia súc ăn) nên có tên gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”, chúng còn phân bố rộng rãi trên bề

mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì B.
subtilis chiếm khoảng 75 – 95% vi khuẩn tạo bào tử.
 Người ta nhận thấy rằng vi khuẩn B. subtilis có mặt khắp nơi và dường như có vai
trò đáng kể (mặt lợi cũng như mặt hại) trong quá trình biến đổi sinh học. Các nguyên
vật liệu dùng để sản xuất như bột mì, bột gạo, muối bột… tới các sản phẩm thực phẩm
truyền thống như các loại nấm, tương, mẻ (cơm lên men chua), chao…
2. 2. 3. Tác hại
 Do có bào tử chịu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm
hộp. Đồ hộp lúc đó có mùi thối chua rất khó chịu không tạo hoặc gas trong môi trường
có đường.
 B. subtilis là thủ phạm gây hư hỏng sản phẩm sữa, bánh ngọt, sôcola, kẹo có nhân.
Nhất là các sản phẩm nói trên được bảo quản ở khí hậu nóng. B. subtilis gây bệnh
“chảy nhớt khoai tây” và bệnh “chảy nhớt bánh mì” do Laurent phát hiện đầu tiên năm
1885 nên cũng từ đó chúng có tên gọi là “trực khuẩn khoai tây”.
22


2. 2. 4. Lợi ích
2. 2. 4. 1. Tạo kháng sinh
 Từ B. subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh có ích đối với nhiều loại vi trùng
gây bệnh như: Subtilin (Humfeld và Feustel, 1943), Eumycin (Johnson và Burdon,
1946), Bacillin (Foster và Woodruff, 1946), Bacillomin (Shtikell và Poplavskii, 1955).
 Ngoài Subtilin, từ dịch nuôi cấy B. subtilis còn có thể thu được nhiều kháng sinh
khác nữa.
2. 2. 4. 2. Sinh tổng hợp enzyme
 Amylase

 Amylase là hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc
nhóm enzyme thủy phân xúc tác các liên kết nội phân tử trong polysaccarid với sự
tham gia của nước.

R.R’ + RH

RH + R’OH

 B. subtilis có khả năng tạo một lượng lớn α – amylase ngoại bào. Tuy nhiên,
amylase của B. subtilis được tạo thành ở vi khuẩn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh
trưởng. Cả hai môi trường nuôi cấy lẫn trong thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm
thấy amylase.
 Amylase B. subtilis không có liên kết sulfihidril và có khả năng phân giải tinh bột
2 – 2.5 lần nhanh hơn so với α – amylase nấm mốc.
 α – amylase của vi khuẩn B. subtilis có tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có
mạch dài khoảng 6 – 8 glucose (G6, G7, G8). Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục
theo sơ đồ sau:
G6
G8

G1 + G5 ; G7

G1 + G6 hay G2 + G5

G2 + G6 hay G2 + G5

 Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân của amylase là glucose và mantose. Ở vi
khuẩn tỉ lệ này là 1: 3.
 Với α – amylase vi khuẩn, tinh bột bị thủy phân thành glucose và mantose đến 70
– 75%.

23

 Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α – amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn α –
amylase của Asp.Oryzae tới 25% và giảm mạnh khi đạt được 30 – 32% sự thủy phân
(Dell weg, Jonh, 1972).
 pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của α – amylase B. subtilis là
từ 5.6 – 6.2.
 Độ bền đối với tác dụng của acid kém hơn α – amylase của nấm mốc.
 Trong dung dịch hồ tinh bột, α – amylase vi khuẩn chỉ bắt đầu bị vô hoạt nhanh
khi nhiệt độ cao hơn 770C. Ở 700C α – amylase của nấm mốc đã bị mất đi 50% hoạt
lực.
 α – amylase B. subtilis có pH tối thích là 6.0, bị vô hoạt hoàn toàn ở pH = 4.0 và bị
vô hoạt một nửa ở pH = 8.0.
 Sinh tổng hợp α – amylase ở B. subtilis không có chất cảm ứng đặc hiệu.
 Protease

 Các enzyme protease (peptid – hydrolase) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết
peptid trong các peptid hoặc protein.
 B. subtilis có khả năng tổng hợp protease trung tính và kiềm (subtilzin).
 Protease do B. subtilis tổng hợp ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao
phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh
vật có thể dễ dàng hấp thụ. Đây là chức năng rõ ràng nhất của các protease ngoại bào.
 Theo Otrosko và tập thể (1977) thì glucose, sacarose, mantose, fructose, socbit là
nguồn

cacbon

tốt

nhất

cho

quá

trình

var.amylolyquefaciens 795.

24

tổng

hợp

protease

ở

B.Natto


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chương 3
3. 1. Thời gian và địa điểm
3. 1. 1. Thời gian

 Đề tài được thực hiện từ ngày 21 tháng 09 năm 2009 đến ngày 10 tháng 01 năm
2010.
3. 1. 2. Địa điểm
 Phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm (P 219) – Viện Sinh Học Nhiệt Đới.

3. 2. Vật liệu
3. 2. 1. Nguyên liệu
 Nguồn nguyên liệu dùng làm cơ chất thử nghiệm là đậu hũ Vina Tofu.
Hình 3. 1. Hình đậu hũ Vina Tofu

 Nước mắm Hưng Thịnh.
Hình 3. 2. Hình chai nước mắm Hưng Thịnh

25


 Sữa đậu nành không đường.
Hình 3. 3. Hình sữa đậu nành không đường

3. 2. 2. Chủng vi sinh vật
 Nguồn giống vi sinh vật được cung cấp từ Viện Sinh Học Nhiệt Đới: Bacillus
subtilis
3. 2. 3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
 Dụng cụ thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, becher, erlen, ống đong, pipet, đĩa
petri, buret, ….
 Thiết bị thí nghiệm như tủ cấy, kính hiển vi, máy lắc, tủ hấp, cân phân tích, …
3. 2. 4. Môi trường dùng trong thực nghiệm

 Môi trường giữ giống Bacillus subtilis.


Môi trường thạch nước mắm (CP: cá peptone).

 Môi trường nhân giống Bacillus subtilis.


Môi trường dịch nước mắm (CP: cá peptone).



Môi trường sữa đậu nành.

 Môi trường định tính enzyme.
 Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% tinh bột để định tính enzyme amylase.
 Môi trường thạch Czapek – Dox + 1% casein để định tính enzyme protease.

26


3. 3. Phương pháp
3. 3. 1. Phương pháp nhuộm Gram [6]
 Nguyên tắc
 Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím
kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau là:


Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên thuốc

nhuộm không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc Gram
dương.


Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm khi xử lý bằng

cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram

âm.
 Thao tác
 Dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi khuẩn lên phiến kính và cố định mẫu bằng
cách hơ phiến kính có chứa mẫu trên ngọn lửa đèn cồn.
 Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau
nhựa.
 Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính, nhỏ dung dịch tím kết tinh thấm ướt hết
giấy lọc, để 1 – 2 phút (nếu vi khuẩn từ canh lỏng thì để 2 phút, nếu vi khuẩn từ thạch
dinh dưỡng thì để 1 phút). Rửa nước, thấm khô.
 Nhỏ dung dịch Lugol, để 1 phút, thấm khô.
 Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây (vi khuẩn từ canh lỏng tẩy 15 giây, vi khuẩn từ thạch
dinh dưỡng tẩy 30 giây). Rửa nước, thấm khô.
 Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuchin kiềm loãng (hoặc Safranin
O), để 1 phút, rửa nước thấm khô.
 Quan sát bằng vật kính dầu độ phóng đại 100 lần.
 Kết quả nếu là vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn Gram
âm bắt màu hồng Fuchin (Safranin O).
3. 3. 2. Phương pháp nhuộm bào tử [6]
 Nguyên tắc
 Khác với bào tử nấm sợi hay nấm mốc, bào tử vi khuẩn (nha bào) không phải là cơ
quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục. Khi tế bào vi khuẩn
27