Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân

Luận văn cao học

Hoàng Anh

MỞ ĐẦU
Hiện nay, bệnh dịch AIDS là một trong những mối nguy hiểm lớn nhất của
thế giới. Ước tính đã có khoảng 20 triệu người chết vì AIDS, và hiện đang có 39
triệu người trên thế giới đang mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (theo
UNAIDS, 2007). Bệnh dịch làm tăng nhanh sự nghèo đói và hủy hoại tương lai của
những người mắc bệnh do đó là mối đe dọa lớn đến tình hình kinh tế, xã hội và
chính trị đối với rất nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam [1].
Trong những năm gần đây, tình hình lây nhiễm HIV/AIDS ở Việt Nam diễn
biết rất phức tạp, số người phát hiện nhiễm tiếp tục tăng. Hầu hết những người
nhiễm HIV là do tiêm chính ma tuý và đang ở độ tuổi thanh thiếu niên. Tính đến
ngày 16/7/2007, cả nước đã phát hiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó
25.470 người chuyển sang AIDS, 14.195 người đã tử vong do HIV/AIDS. Theo các
chuyên gia y tế, số người được phát hiện nhiễm HIV/AIDS là thấp hơn nhiều so với
thực tế. Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợp
nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp
tử vong vì HIV/AIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 20-30 ngàn trường hợp
nhiễm mới. Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIV/AIDS ở
nước ta [2,3,5].
Hiện chưa có biện pháp nào có thể tiêu diệt hoàn toàn được HIV. Các loại
vắcxin phòng chống HIV chưa thực sự có hiệu lực cộng với sự kháng các loại thuốc
kháng virut và những hoạt động tiêm chích, mại dâm làm cho sự lây lan dịch bệnh
này càng ngày càng nhanh chóng và trở nên khó kiểm soát Phương pháp hay được
sử dụng để điều trị HIV/AIDS hiện nay là phương pháp HAART (highly active
antiretroviral therapy) có tác dụng kéo dài tuổi thọ của những người nhiễm HIV.
Tuy nhiên, để sử dụng các phác đồ trị liệu một cách có hiệu quả nhất thì việc chẩn
đoán sớm và chính xác là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu.
Các phương pháp chẩn đoán HIV rất đa dạng, nhưng việc tạo ra các kít chẩn

đoán HIV sớm, nhanh và có độ nhạy cao vẫn thu hút được nhiều mối quan tâm của
các nhà nghiên cứu. Một trong các phương pháp chẩn đoán sớm và có độ chính xác
cao là dựa vào việc phát hiện kháng nguyên lõi P24 của HIV và sự có mặt của
kháng thể kháng kháng nguyên này trong huyết thanh bệnh nhân. Trên thị trường
1


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Việt Nam đã xuất hiện nhiều loại kit chẩn đoán HIV sớm nhập ngoại dựa vào kháng
nguyên P24 và kháng thể của nó. Tuy nhiên, những khó khăn trong việc bảo quản
cộng với giá thành cao của các loại kit này làm hạn chế việc phổ biến hóa việc xét
nghiệm đối với các đối tượng có nguy cơ lây nhiễm cao. Trước tình hình đó, chúng
tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: ‘Nghiên cứu biểu hiện gen p24 của HIV và kiểm
tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh
bệnh nhân” với mục đích:
 Tách dòng và đọc trình tự gen p24 của HIV
 Bước đầu nghiên cứu sự biểu hiện gen p24 trong E. coli
 Kiểm tra phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV tự nhiên
trong huyết thanh bệnh nhân HIV
Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ
Sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của
PGS.TS. Đinh Duy Kháng.

2


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 HIV
1.1.1 Khái niệm HIV
Virut gây suy giảm miễn dịch ở người, viết tắt theo tiếng Anh là HIV
(Human Immunodeficiency Virus) là loại virut khi xâm nhập vào cơ thể gây hội
chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), trạng thái mà tại đó, hệ thống miễn
dịch của người bị suy yếu, dẫn đến nguy cơ nhiễm các bệnh cơ hội và làm cho bệnh
nhân dễ mắc các bệnh ung thư và phải chịu những tổn thương do chính HIV gây ra.
Sự nhiễm HIV thông qua việc chuyển các chất dịch như máu, dịch âm đạo,
tinh dịch hoặc sữa từ người bệnh. Trong cơ thể người bệnh, HIV tồn tại ở cả dạng
hạt virut tự do lẫn dạng virut đã bị nhiễm vào các tế bào của hệ thống miễn dịch [13,
14, 55].
1.1.2 Đặc điểm của HIV
1.1.2.1 Đặc điểm phân loại HIV
HIV là một thành viên của chi Lentivirus và thuộc họ Retroviridae [23,24].
Retrovirus là loại virut có genom là ARN sợi đơn dương nhưng trong chu
trình sống có giai đoạn tồn tại ở dạng ADN kép do có enzym phiên mã ngược mà
bản chất là ADN polymeraza phụ thuộc ARN. ADN mới được tạo ra đều có những
đoạn trình tự lặp lại có kích thước khác nhau ở 2 đầu được gọi là đoạn lặp lại đầu
cuối (LTR), nhờ đoạn này mà ADN của virut có thể gắn ổn định trong nhiễm sắc
thể của tế bào nhiễm và trở thành dạng tiền virut (provirus) [24].
Các Lentivirrus đều có đặc điểm hình thái và sinh học giống nhau. Chúng
đều là virut ARN sợi đơn dương có vỏ ngoài. Rất nhiều động vật bị gây nhiễm bởi
lentivirus, Đặc tính của nó là có thời gian mắc bệnh và ủ bệnh dài [23].
HIV gồm 2 loại là HIV-1 và HIV-2, cả 2 loại đều bắt nguồn từ vùng phía
Nam Camerun sau khi truyền từ tinh tinh sang người trong thế kỉ 20. Trước đây,
HIV

được

gọi

là

human

T-lymphotropic

virus-III

(HTLV-III)

hoặc

lymphadenopathy-associated virus (LAV), hoặc AIDS-associated retrovirus (ARV).

3


Luận văn cao học

Hoàng Anh

HIV- 1 được phát hiện năm 1983, đầu tiên nó được gọi là LAV. HIV -1 có độc tính
mạnh và dễ dàng lan truyền trong cộng đồng, do đó là nguyên nhân chính của đại
địch HIV bùng phát trên khắp thế giới [18, 25].
HIV-2 phát hiện năm 1985, có độc lực yếu và khả năng truyền nhiễm ít hơn,

điều này giải thích tại sao loại virut này chỉ lưu hành ở Tây Phi.
Trong giới hạn của luận văn này, chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu HIV-1 loại virut gây đại dịch thế giới và cũng là loại chủ yếu thường gặp ở Việt Nam.
1.1.2.2 Đặc điểm hình thái của HIV
Virut HIV có cấu trúc hình cầu, đường kính 80-120nm. Hạt virion có dạng
hình khối đa diện với cấu trúc đối xứng gồm 20 mặt tam giác đều [12, 20, 46].

Hình 1: Hình thái hạt virion của virut HIV
1.1.2.3 Đặc điểm về cấu trúc của HIV
Từ ngoài vào trong có 3 lớp [55, 57].
Lớp vỏ: Lớp áo ngoài của virut, gọi là vỏ virut, bao gồm 2 lớp, được lấy từ
màng tế bào của người khi hạt virut mới nảy chồi từ tế bào. Các nghiên cứu gần đây
chỉ ra rằng HIV có thể đi vào và đi ra khỏi tế bào thông qua một vùng đặc biệt của
màng tế bào gọi là thảm lipid (Lipid raft). Thảm này có hàm lượng cholesterol và
glycolipid cao và có thể là một điểm đích mới trong việc nghiên cứu các loại thuốc
kháng virut HIV.

4


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Bao quanh lớp vỏ virut là khoảng 72 bản copy của phức hệ protein gai của
HIV (thường gọi là spickes). Phức hệ này được cấu tạo từ các protein vỏ của
virut gọi là protein Env, bao gồm một mũ được tạo thành từ 3 phân tử
glycoprotein có độ dài 9-10 nm và chiều rộng 14 nm có trọng lượng phân tử là
120 kDa và được gắn trên một gốc gồm 3 phân tử glycoprotein GP41 xuyên
màng có trong lượng phân tử 41 kDa neo vào cấu trúc vỏ của virut. Rất nhiều
nghiên cứu để phát triển vacxin HIV tập trung vào các protein vỏ này [21, 54,

55].

Hình 2: Cấu trúc phân tử của HIV
Protein nền (matrix protein) Ngay sát lớp vỏ có một lớp protein nền được
tạo thành từ các phân tử protein P17. Bên cạnh việc làm ổn định cấu trúc lõi virut
bên trong, các nghiên cứu gần đây cho thấy protein này còn có vai trò quan trọng
trong sự tạo thành hạt virut mới [16].
Lõi virut: Bên trong lớp vỏ của HIV trưởng thành có một lõi hình viên đạn
gọi là capsit, được tạo thành bởi 2000 bản copy của protein P24. Lõi capsit bao
quanh 2 chuỗi ARN đơn dương có gắn enzym phiêm mã ngược. Ngoài ra còn có
các enzym tích hợp integraza, enzym proteaza và một phân tử ARN thông tin.
1.1.2.4 Cấu trúc gen của HIV

5


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Hình 3: Sơ đồ cấu trúc gen của HIV
Vật chất di truyền của HIV là sợi ARN đơn dương, mỗi sợi có khoảng 9200
cặp bazơ mang 9 bản copy của 9 gen, được chia thành 2 nhóm gen chính: nhóm gen
cấu trúc và nhóm gen điều hòa sinh trưởng [37, 39, 57].
• Nhóm gen cấu trúc: chứa các thông tin cần thiết để tạo nên protein cấu
trúc cho hạt virut mới.
- Gag: là gen mã hóa cho kháng nguyên đặc hiệu nhóm, gồm các gen P17,
P24, P7 và P6.
- Pol: mã hóa cho enzym ADN polymeraza phụ thuộc ARN hay còn gọi là
enzym phiên mã ngược và các enzym khác như integraza và proteaza.

- Env: mã hoá cho các protein vỏ là gp120 và gp41.
• Nhóm gen điều hòa: chứa thông tin cần thiết cho các protein điều khiển
sự xâm nhập của HIV vào tế bào vật chủ, tạo ra virut mới và gây bệnh.
- Tat (transactivator) là gen khởi động hoạt động của các gen virut khác.
- Rev: (trans-regulator protein) có chức năng điểu hòa, tạo ra một protein
Rev có 2 đầu, một đầu làm nhiệm vụ ức chế (CRS), một đầu làm nhiệm vụ giải ức
chế (CAR).
- Nef: (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm chu trình sống
của virut trong trạng thái tiềm tan.
- Vif: (virion infectivity factor) mã hóa cho protein kích thích sự xâm nhập
của virut vào tế bào cảm nhiễm.
6


Luận văn cao học

Hoàng Anh

- Vpu: mã hóa cho protein điều khiển quá trình giải phóng các hạt virut mới
từ tế bào bị nhiễm.
- Vpr: cần thiết cho sự nhân lên của virut trong các tế bào không phân chia
như các đại thực bào.
Cuối mỗi chuỗi ARN của HIV có một trật tự ARN gọi là đoạn lặp lại dài ở
cuối (LTR). Các vùng trong LTR hoạt động như các công tắc để khởi động quá
trình tạo thành virut mới và có thể được khởi động nhờ protein của virut và protein
của vật chủ.

7

Luận văn cao học

Hoàng Anh

1.1.3 Gen p24 và protein P24
1.1.3.1 Gen mã hóa cho protein p24
Gen mã hóa cho protein nucleocapsit có kích thước khoảng 660 bp, nằm ở vị
trí trung tâm trong hệ thống gen cấu trúc gag. Nó mã hóa cho một protein có chiều
dài 231 axit amin, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 24 kDa, do đó được gọi tắt là gen
p24 và protein tạo ra là protein P24 [57] .
1.1.3.2 Protein P24 và vai trò của nó trong chu trình sống của HIV
Khi mới được tổng hợp, P24 nằm ở vùng trung tâm của polyprotein Gag hay
còn gọi là P55 dài 55 kDa, Trong quá trình trưởng thành của hạt virut mới,
polyprotein P55 bị enzym proteaza của virut cắt thành các protein có kích thước
khác nhau là P24, P17, P6 và P7 (Hình 3).

Hình 4 Cấu trúc không gian của phân tử
protein p24 [9]

Hình 5: Cấu trúc không gian của đầu C –
146-231 của protein p24 [17]

Protein p24 có dạng dime và bị photphoryl hóa. Trong mỗi đơn phân tử có
7 xoắn α, 5 trong số đó được sắp xếp tạo thành cấu trúc dạng ống

[9, 29] (hình 4). Xoắn dài nhất trong lõi ống được tách biệt bởi một đoạn
peptit dài và có tính kháng nguyên cao, đó là vị trí liên kết của các phân
đoạn của kháng thể với tinh thể Capsit (CA). Vùng đầu C của protein capsit

nằm ở vị trí từ axit amin thứ 146 đến 231 gồm một đoạn chứa 20 axit amin, gọi là

vùng tương đồng chính (MHR- major homology region) (Hình 5). Đây là vùng bảo
thủ giữa các retrovirut khác nhau và cần thiết cho sự đóng gói, trưởng thành và sự
gây nhiễm của virut [17]. Vùng đầu N của p24 có cấu trúc kẹp tóc beta N-terminal
beta-hairpin. Sự săp xếp của dime CA (146-231) với cấu trúc của vùng đầu N hình

8


Luận văn cao học

Hoàng Anh

thành cấu trúc không gian của protein capsit và tạo điều kiện liên kết kéo về 2 phía
của protein để tạo thành một lõi hình viên đạn của HIV-1.
Vai trò của protein P24
HIV muốn nhân lên được trong tế bào chủ phải trải qua các bước khác nhau.
Protein nucleocapsit có vai trò quan trọng ở các giai đoạn khác nhau trong chu trình
sống của virut.
Trước tiên, P24 tham gia vào quá trình cởi áo sau khi virut xâm nhập vào tế
bào. Sau khi HIV xâm nhập vào tế bào chất của tế bào chủ, các protein trong lõi
capsit tự động tách nhau ra, làm tan rã cấu trúc của lõi capsit, giải phóng ARN
genom vào trong tế bào chất [13].
Sau đó, P24 cũng tham gia vào quá trình sao chép ngược của virut ở chỗ nó
có ảnh hưởng đến mối liên kết giữa ARN và ADN trong giai đoạn đầu của quá trình
nhiễm và hoạt động như là cofactor cho enzym phiên mã ngược.
Protein P24 còn tham gia vào quá trình đóng gói ARN genom với các thành
phần khác của virut. Nó có vai trò đặc biệt trong viêc nhận ra các dấu hiệu đóng gói
của HIV và làm nhiệm vụ trung gian cho sự kết hợp giữa 2 phân tử ARN khác nhau
để hình thành genom của hạt virion HIV-1 mới. Dấu hiệu đóng gói bao gồm các cấu
trúc gồm 4 phần loop được định vị ở gần đầu 5  của ARN genom của virut.

NC liên kết với dấu hiệu đóng gói thông qua một liên kết trung gian bởi 2 motif
mang Zn. Qua nghiên cứu, người ta thấy chỉ với 2 domain liên kết với Zn thì chưa
đủ để đóng gói ARN của HIV mà nó còn phụ thuộc vào protein nền (matrix) [15].
1.1.4 Chu trình sống của virut HIV
Sự xâm nhập và nhân lên của virut HIV có thể chia lam ba giai đoạn quan
trọng: giai đoạn xâm nhiễm và cởi áo, giai đoạn sao chép và dịch mã, giai đoạn lắp
ráp và tạo thành virut hoàn chỉnh [6, 13,14, 53, 55, 56].
1.1.4.1 Sự xâm nhập và cởi áo của HIV
Quá trình xâm nhiễm được bắt đầu khi một hạt HIV mang 2 bản copy ARN
của HIV tiếp xúc với tế bào thông qua một phân tử CD4 trên bề mặt tế bào chủ
(cluster designation 4). Các tế bào mang phân tử này được gọi là tế bào CD4+(CD4
posititve). Một hoặc nhiều phân tử gp120 liên kết lỏng lẻo với phân tử CD4 trên bề
9


Luận văn cao học

Hoàng Anh

mặt tế bào. Sự liên kết giữa CD4 và gp120 làm biến đổi cấu trúc của gp120 cho
phép nó liên kết với phân tử thứ 2 trên bề mặt tế bào gọi là đồng thụ thể
(coreceptor). Gp41 của vỏ tạo điều kiện cho quá trình dung nạp. Vỏ của virut và
màng tế bào sau đó dung nạp với nhau, đẩy virut vào bên trong tế bào. Các thuốc
điều trị HIV/AIDS làm cản trở quá trình liên kết và quá trình dung nạp đều đang
được nghiên cứu và kiểm tra để có tác dụng ngay từ giai đoạn lâm sàng.

Hình 6: Chu trình nhân lên của HIV
Các nghiên cứu đã xác định được rất nhiều đồng thụ thể khác nhau cho các
chủng HIV khác nhau. Ở giai đoạn đầu tiên của quá trình nhiễm, hầu hết HIV đều
sử dụng thụ thể CD4 và đồng thụ thể CCR5 để xâm nhập vào tế bào đích. Khi bệnh

phát triển, xấp xỉ 50% bệnh nhân mở rộng sự sử dụng đồng thụ thể, đáng kể là thụ
thể CXCR4. Virut sử dụng đồng thụ thể CCR5 gọi là R5 HIV và virut sử dụng đồng
thụ thể CXCR4 gọi là X4 HIV [45].
Mặc dù các tế bào TCD4+ là đích chính của HIV, các tế bào khác trong hệ
miễn dịch có hoặc không có CD4 trên bề mặt đều cũng bị nhiễm. Trong số này, các
tế bào có đời sống dài như tế bào đơn nhân (monocyte) và đại thực bào
(Macrophage) có thể mang một lượng lớn HIV mà không bị tiêu diệt. Vì vậy, đây
được coi là chỗ trú ẩn an toàn của HIV. Các tế bào T CD4 + cũng có chức năng chứa
HIV, một lượng nhỏ các tế bào này lưu giữ HIV ở dạng tiềm tan, không hoạt dộng.
10


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Sự đáp ứng miễn dịch thông thường có thể hoạt hóa các tế bào này, gây ra sự tạo ra
các hạt virion mới [48].
Sau khi virut HIV được đẩy vào tế bào chất của vật chủ, nó sẽ thực hiện quá
trình cởi áo, phá vỡ cấu trúc lõi capsit để đẩy ARN genom của virut vào tế bào chất.
1.1.4.2 Sự sao chép và dịch mã
Khi vào trong cơ thể vật chủ, ARN genom sẽ chuyển thành sợi ADN kép nhờ
enzym phiên mã ngược được mang theo virut trong quá trình xâm nhập vào tế bào.
ADN này của virut sẽ được tích hợp vào trong ADN của tế bào bằng enzym tich
hợp của virut. Lúc này, virut có thể thực hiện 1 trong 2 con đường. Con đường thứ
nhất là virut trở thành trạng thái tiềm tan và tế bào nhiễm tiếp tục hoạt động và thực
hiện chức năng của mình. Con đường thứ 2 là virut hoạt động, nhân lên, giải phóng
một lượng lớn virut và tiêu diệt tế bào chủ.
Con đường tiềm tan: ADN mới được tạo ra của HIV được vận chuyển vào
trong nhân của tế bào chủ. Nhờ sự xúc tác của enzym tích hợp intergraza, ADN của

virut gắn với ADN của tế bào chủ và sẽ duy trì ở trạng thái đó cho đến khi có tác
nhân kích thích sự hoạt động của nó. Trạng thái này gọi là trạng thái tiềm tan và
virut được gọi là provirus. Trạng thái này có thể kéo dài từ 3 đến 12 năm, phụ thuộc
vào tình hình sức khỏe của bệnh nhân và các chế độ chăm sóc và điều trị. Để tạo ra
virut hoạt động, phải có mặt một số các nhân tố dịch mã của tế bào, nhân tố quan
trọng nhất là NF-kB ((NF kappa B) - được điều khiển khi các tế bào T được hoạt
hóa. Các phân tử như yếu tố tiêu diệt ung thư (tumor necrosis factor- TNF- anpha và
Interleukin IL 6, được tiết ra với một mức độ cao từ các tế bào bị nhiễm HIV có thể
giúp hoạt hóa provirut [21].
Tạo thành virut mới: Để một provirus tạo ra virut mới, chúng phải sử dụng
bộ máy di truyền của tế bào chủ để thực hiện quá trình phiên mã tạo ARNtt. Gen
của virut điều khiển sự sử dụng bộ máy này của vật chủ là gen tat, mã hóa cho
protein kích thích quá trình phiên mã. ARN genom cũng được tạo ra bằng quá trình
phiên mã để tạo thành hạt virion mới sau này.
Sau khi ARNtt được tạo ra trong nhân tế bào, nó sẽ được vận chuyển ra tế
bào chất. Protein của HIV tham gia chủ yếu vào quá trình này. Ví dụ, protein Rev
11


Luận văn cao học

Hoàng Anh

cho phép mARN mang mã của protein cấu trúc được vận chuyển ra ngoài tế bào
chất, nếu không có protein Rev, các protein cấu trúc không được tạo ra.
Trong tế bào chất, ARNtt của virut bám vào bộ máy tổng hợp protein như
ribosom của vật chủ để tạo ra môt chuỗi dài polyprotein virut là các protein cấu trúc
Gag, Env và các enzym cần thiết cho sự hình thành virut mới sau này. ARN này
chính là genom của virut.
Các gen điều hòa tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng của HIV. Nếu tat hoạt

động mạnh, nef hoạt động yếu thì virut ở trạng thái provirus và ngược lại, tat hoạt
động yếu, nef hoạt động mạnh thì virut sẽ ở trạng thái tiềm ẩn. Gen rev điều hòa
hoạt động của 2 gen tat và nef.
Sự tồn tại ở trạng thái tiền virut còn do tác động đến các nhân tố khác, Ví dụ,
các tế bào lympho bị nhiễm HIV sẽ thúc đẩy sự sinh trưởng của HIV bằng các yếu
tố hoại tử khối u (TNF), hoặc do sự nhiễm các tác nhân gây bệnh như
Cytomegalovirus, virut Epstein Barr. Các tác nhân này được gọi chung là yếu tố
kích hoạt sự sinh trưởng của HIV.
1.1.4.3 Lắp ráp và tạo thành virut hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn cuối cùng của chu trình tái tạo virut – tạo thành hạt virut
HIV hoàn chỉnh. Quá trình này bắt đầu tại màng sinh chất của tế bào chủ. Protein
Env (gp160) đi qua màng lưới nội chất và được vận chuyển tới phức hệ Golgi, nơi
mà chúng sẽ bị enzym proteaza phân cắt thành 2 phân tử glycoprotein vỏ là gp41 và
gp120. Các protein này được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào vật chủ, tại
đó, gp41 và gp120 gắn lên màng của tế bào xâm nhiễm. Các polyprotein Gag 55 và
Gag-Pol (gp160) cũng liên kết với bề mặt bên trong của màng sinh chất cùng với
ARN genom của HIV khi hạt virion bắt đầu định hình và nhú ra từ tế bào vật chủ.
Lúc này, hạt virion chưa có khả năng gây nhiễm. Chỉ khi có sự hoạt động của
proteaza của HIV làm phân cắt các polyprotein thành các enzym và các protein cấu
trúc thi hạt virion mới bước sang giai đoạn thành thục. Sự thành thục của hạt virut
xảy ra từ lúc hạt virion mới bắt đầu nhú ra khỏi màng tế cho đến lúc hạt virut trưởng
thành và tách khỏi màng tế bào. Giai đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi các chất có
khả năng ức chế hoạt động của proteaza, HIV-1 và HIV-2 có cách đóng gói khác
nhau. HIV- 1 sẽ đóng gói ARN bất kì nào, trong khi đó, HIV-2 chỉ ưu tiên gắn các
12


Luận văn cao học

Hoàng Anh

ARN mà được sử dụng để tạo ra chính protein Gag của chúng. Điều này cho thấy
HIV-1 dễ biến đổi hơn do đó, khả năng lây nhiễm cao hơn.
1.1 Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải AIDS
1.2.1 Khái niệm về hội chứng AIDS
Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) là hội chứng của các bệnh
nhiễm trùng của người do hệ thống miễn dịch bị phá hủy do nhiễm HIV, và các
virut tương tự ở các động vật khác như SIV, FIV. Trạng thái cuối cùng của quá trình
mắc bệnh là nhiễm các bệnh cơ hội và ung thư [20, 47, 54].
1.2.2 Nguồn gốc của AIDS
Tháng 6/1981 trung tâm kiểm soát các bệnh truyền nhiễm ở Atlanta (Mỹ) xác
định những trường hợp mắc hội chứng suy giảm miễn dịch đầu tiên trên cơ sở phát
hiện của bác sĩ Michal Gotlieb về 5 người đồng tính luyến ái nam giới bị nhiễm
trùng Pneumocystis carinii ở Los Angeles (Mỹ) và bác sỹ Friedman Alvin thấy 1
bệnh nhân bị ung thư (sarcoma Kaposi) vốn lành tính mà chết. Sau đó nhiều nơi
cũng lần lượt công bố những ca đầu tiên trên người bệnh ưa chảy máu đã truyền
máu nhiều lần, chích ma tuý..
Hội nghị định danh quốc tế năm 1986 gọi loại virut này là virut gây bệnh suy
giảm miễn dịch trên người viết tắt là HIV1.
Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được loại virut HIV thứ 2 đặt tên là HIV
- 2 tại Tây Phi. Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học thì HIV2 có thể đã có ở Tây Phi
từ năm 1966. Như vậy có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm 60 của thế kỉ
này hoặc trước đó vài chục năm, nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại dịch
AIDS/SIDA.
1.1.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
Theo đánh giá mới đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), HIV/AIDS được
xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử vong (chiếm 7,5%) ở các nước đang
phát triển, trong đó có Việt Nam. Những năm gần đây các nỗ lực toàn cầu trong
việc ứng phó với đại dịch AIDS đã có nhiều tiến triển khả quan, bao gồm việc gia
tăng các chương trình dự phòng và tăng số lượng bệnh nhân được tiếp cận với các

phương pháp điều trị có hiệu quả. Tuy nhiên cả số người sống với HIV và số người
13


Luận văn cao học

Hoàng Anh

tử vong do AIDS vẫn đang tiếp tục tăng lên. Tổng cộng hiện có 39,5 triệu người
đang sống với HIV trong năm 2006, là tăng hơn 2,6 triệu so với năm 2004. Con số
này bao gồm cả số ước tính 4,3 triệu người lớn và trẻ em mới nhiễm HIV trong năm
2006, so với năm 2004 số này tăng hơn 400.000 người. Ở nhiều khu vực trên thế
giới, số mới nhiễm chủ yếu tập trung trong đối tượng thanh niên (15–24 tuổi) [47].
Tính riêng trong số những người từ 15 tuổi trở lên, thanh niên chiếm 40% số người
mới bị nhiễm HIV trong năm 2006 [38].
Bảng 1: Tóm tắt tình hình dịch AIDS toàn cầu (Tháng 12, 2006 )
Số người sống với HIV
năm 2006

Số ca mới nhiễm HIV
trong năm 2006
Số tử vong do AIDS trong
năm 2006

Tổng số
Người lớn
Phụ nữ
Trẻ em dưới 15 tuổi
Tổng số
Người lớn

Trẻ em dưới 15 tuổi
Tổng số
Người lớn
Trẻ em dưới 15 tuổi

39,5 triệu
37,2 triệu
17,7 triệu
2,3 triệu
4,3 triệu
3,8 triệu
530.000
2,9 triệu
2,6 triệu
380.000

HIV xâm nhập vào Việt Nam do người nước ngoài sau đó nhanh chóng lan
truyền trong các cộng đồng dân cư của Việt Nam qua các hình thức khác nhau. Qua
điều tra, Bộ Y tế và Trung tâm dự phòng và Kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ nhận định,
khoảng 60% người nhiễm HIV ở Việt Nam là do tiêm chích ma túy, số còn lại là
phát sinh từ gái mại dâm và truyền từ mẹ sang con. Những năm qua, mặc dù đã có
nhiều dự án phòng chống HIV/AIDS được triển khai xuống từng địa phương, nhưng
đại dịch vẫn ngày một lan nhanh, hiện đã xuất hiện ở 64 tỉnh thành phố trên cả
nước. Hiện nay, 100% thành phố, huyện, thị xã trên toàn quốc đã phát hiện có người
có HIV. Điều đáng nói là các đối tượng nhiễm HIV còn rất trẻ, tới 90% trong độ
tuổi 20-30. Đây là lực lượng lao động chính, do vậy ảnh hưởng rất lớn đến sự phát
triển kinh tế đất nước và gây ra nhiều vấn đề phức tạp cho xã hội. [2, 4, 5].
Kể từ trường hợp nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện vào năm 1990 đến thời
điểm thống kê gần đây nhất của Bộ Y tế tính đến ngày 16/7/2007, cả nước đã phát
hiện được 129.110 người nhiễm HIV; trong đó 25.470 người chuyển sang AIDS,

14


Luận văn cao học

Hoàng Anh

14.195 người đã tử vong do HIV/AIDS. Theo các chuyên gia y tế, số người được
phát hiện nhiễm HIV/AIDS là thấp hơn nhiều so với thực tế [5].
Theo dự đoán, đến năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 350.970 trường hợp
nhiễm HIV, 112.227 trường hợp chuyển sang giai đoạn AIDS, 101.701 trường hợp
tử vong vì HIV/AIDS; trung bình mỗi năm sẽ có khoảng 20-30 ngàn trường hợp
nhiễm mới. Đây sẽ là thách thức lớn đối với công tác phòng, chống HIV/AIDS ở
nước ta, bởi vì sự gia tăng số lượng người nhiễm HIV/AIDS sẽ làm tăng nhu cầu về
điều trị, chăm sóc và hàng loạt các vấn đề khác về phục vụ người bệnh.
1.2.4 Dịch tễ học
1.2.4.1 Con đường lây nhiễm
Có 3 con đường chính của quá trình lây nhiễm là quan hệ tình dục không
lành mạnh, chuyền qua con đường máu và truyền từ mẹ sang con [13, 47, 54, 55].
•

Truyền qua đường tình dục. Đây là con đường lây truyền chính. Nhiễm
HIV qua quan hệ tình dục có thể xảy ra khi người bệnh tiếp xúc với người
kia thông qua tinh dịch, dịch âm đạo hoặc qua các màng nhày.

•

Máu và con đường truyền qua máu. Con đường truyền bệnh này có thể
tính đến việc nhiễm do dùng chung kim tiêm, những người bị bệnh máu khó

đông, truyên máu và các sản phẩm của máu, Những người chăm sóc sức
khỏe như các y tá, người làm việc trong phòng thí nghiệm, bác sĩ cũng có thể
bị nhiễm, mặc dù trường hợp này là rất hiếm.

•

Truyền từ mẹ sang con. Truyền HIV từ mẹ sang con có thể xảy ra trong tử
cung trong những tuần cuối của thời kỳ mang thai, lúc sinh con và cho con
bú. Nếu không được xử lý, tỉ lệ lây nhiễm có thể lên đến 25%. Tuy nhiên,
nếu được sử lý với thuốc và các phương pháp phù hợp, con số này có thể
giảm xuống 1%. Sự truyền HIV từ mẹ sang con chủ yếu xảy ra ở HIV- 1,
hiếm gặp ở HIV-2.

15


Luận văn cao học

Hoàng Anh

1.2.4.2 Sự hoạt động của HIV trong cơ thể bệnh nhân
Khi vào cơ thể, HIV gây nhiễm trên một lượng lớn các tế bào T CD4 + và
nhân lên rất nhanh. Trong giai đoạn cấp tính hay giai đoạn đầu của quá trình nhiễm,
trong máu bệnh nhân mang rất nhiều các hạt virut và lan truyền rất nhanh trong cơ
thể, thâm nhập vào các cơ quan, đặc biệt là trong các cơ quan lympho bao gồm các
hạch bạch huyết, lá lách, amidan, vòm họng [6, 13].
Khoảng 2 đến 4 tuần sau khi phơi nhiễm virut, 70% người nhiễm HIV sẽ có
các triệu chứng như cúm liên quan đến quá trình nhiễm cấp tính. Hệ thống miễn
dịch của bệnh nhân chống lại HIV bằng các tế bào Lympho T gây độc (cytotoxic T
hoặc T CD8+) và kháng thể của tế bào Lympho B tạo ra. Kháng thể đầu tiên do

HIV kích thích sinh ra là kháng thể kháng protein p24. Quá trình này làm giảm một
lượng đáng kể HIV. Lượng tế bào T CD4+ có thể được tái tạo lại một lượng nào đó
hoặc thậm chí bằng lượng tế bào ban đầu. Sau đó, bệnh nhân không thể hiện một
triệu chứng nào trong vài năm mặc dù HIV vẫn tiếp tục nhân lên trong các cơ quan
lympho [6].
Một đặc điểm chỉ thấy ở HIV là mặc dù có đáp ứng miễn dịch rất mạnh của
cơ thể, có thể đủ để tiêu diệt hầu hết sự nhiễm các loại virut khác, một số HIV vẫn
có thể trốn thoát. Điều này là do một phần lớn của sự đột biến với tốc độ cao xảy ra
trong quá trình sao chép HIV. Thậm chí khi virut không tránh được hệ thống miễn
dịch bằng quá trình đột biến, các thành phần của cơ thể chống lại HIV như các
subset hoặc các tế bào T gây độc nhận ra HIV có thể bị suy yếu và trở nên mất chức
năng.
Thêm vào đó, trong giai đoạn sớm của quá trình nhiễm bệnh, các bệnh nhân
có thể mất các tế bào đáp ứng đặc hiệu HIV là T CD4 + có vai trò tiết interferon và
các yếu tố chống virut khác và sự phối hợp của các tế bào T CD8 +. Các đáp ứng này
bình thường có tác dụng làm chậm quá trình nhân lên của HIV.
Mặt khác, provirut trốn trong các nhiễm sắc thể của tế bào nhiễm và bảo vệ
khỏi sự tấn công của hệ thống miễn dịch. Các tế bào như vậy là nơi trú ngụ an toàn
của virut HIV[26, 47, 54, 55].

16


Luận văn cao học

Hoàng Anh

1.2.4.3 Cơ chế phát sinh bệnh
Sự nhiễm HIV dẫn đến việc giảm lượng tế bào T CD4+ thông qua 3 cơ chế:
• Trực tiếp tiêu diệt các tế bào bị nhiễm

• Làm tăng tốc độ chết theo chu trình của các tế bào nhiễm
• Giết các tế bào T CD4+ nhiễm HIV bằng các tế bào gây độc (T CD8+ )
Khi lượng tế bào TCD4+ giảm đến một mức dưới mức quy định, các đáp ứng
miễn dịch qua trung gian tế bào sẽ bị mất, do đó dẫn đến suy giảm hệ thống miễn
dịch, bao gồm cả miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch. Các rối loạn chính trong
đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân HIV/AIDS gồm:
• Giảm tế bào lympho T toàn phần, đặc biệt là TCD4+.
• Giảm chức năng các tế bào miễn dịch: giảm hoặc mất các đáp ứng miễn
dịch dưới da, khả năng sinh tế bào đối với các chất gây phân bào, giảm
đáp ứng gây độc tế bào do giảm tế bào TCD8+ và tế bào giết tự nhiên NK
• Tăng gamma globulin
• Tăng phức hợp miễn dịch, tăng các tự kháng thể và một số protein chống
lại tế bào trong huyết thanh.
• Giảm đáp ứng kháng thể nguyên phát đối với các kháng nguyên mới tiếp
xúc lần đầu.
• Giảm gamma interferon.
Hậu quả của các rối loạn đáp ứng miễn dịch ở bênh nhân nhiễm HIV/AIDS là
bệnh nhân dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội (thường do vi khuẩn, virut, nấm,
kí sinh trùng) hoặc sẽ dễ mắc các bệnh ung thư. Nếu không được chữa trị, hầu hết
các bệnh nhân nhiễm HIV cuối cùng đều dẫn đến giai đoạn AIDS và chết. Tuy
nhiên, 1/10 trong số đó vẫn có thể khỏe mạnh trong một thời gian dài mà không
biểu hiện triệu chứng nào cụ thể. Nếu được chữa trị với các thuốc kháng virut, có
thể kéo dài thời gian sống của người bệnh [25, 51, 52, 53, 56].
1.2 Phương pháp chẩn đoán phát hiện virut HIV và cách phòng bệnh
1.3.1 Chẩn đoán sinh học nhiễm HIV
Sự xác định sớm sự nhiễm HIV là điều rất quan trọng vì ở giai đoạn đầu của
pha mắc bệnh không biểu hiện triệu chứng nào cụ thể. Các xét nghiệm xác định gần
17

Luận văn cao học

Hoàng Anh

đây đã được sử dụng có thể phát hiện sự nhiễm HIV trong vòng 2 đến 6 tuần sau khi
nhiễm là khoảng 80% và sau 12 tuần là 100%, chỉ có một số ít các trường hợp chi
phát hiện ra sau 3 đến 6 tháng [33].
Phát hiện người nhiễm HIV là một trong những điều kiện cần thiết để có thể
có một phương pháp trị liệu phù hợp nhất, ví dụ bắt đầu dùng HAART đúng lúc có
thể kéo dài thời gian sống và làm cho người bệnh khỏe mạnh hơn. Vì thế, những
người có nguy cơ mắc bệnh nên được tư vấn và kiểm tra HIV ngay sau khi phơi
nhiễm với nguồn bệnh [31]. Trong nhiều trường hợp, sự chẩn đoán một bệnh nhân
có HIV thường được diễn ra nhiều lần (thường xuyên qua các năm).
Bên cạnh sự chẩn đoán cho từng cá nhân, xét nghiệm HIV còn được thực
hiện với một lượng lớn các mẫu máu và các sản phẩm của máu hoặc các cơ quan
ghép để đảm bảo an toàn cho người nhận cũng như để làm giảm nguy cơ bùng phát
thành dịch (UNAIDS, 1997 và 2001) [33, 34].
Trong tình trạng hiểu biết hiện nay, nhiễm HIV coi như là suốt đời mang
HIV. Phát hiện HIV dựa trên 3 nguyên tắc [50, 51, 52].
• Nuôi cấy và phân lập virut
• Phát hiện kháng thể kháng HIV
• Phát hiện trực tiếp kháng nguyên, acid nucleic hoặc protein của virut
1.3.1.1 Phương pháp phân lập và nuôi cấy virut HIV
HIV- 1 có thể được cấy từ huyết tương hoặc từ tiểu cầu đơn nhân của bệnh
nhân. Nếu kết quả cấy là dương tính thì khẳng định ngay là nhiễm HIV. Nhược
điểm của phương pháp này là môi trường nuôi HIV rất phức tạp. Do đó, hầu hết
nuôi cấy virut chỉ sử dụng với mục đích nghiên cứu chứ ít được ứng dụng trong
chẩn đoán.
1.3.1.2 Phương pháp định tính xác định ADN của provirut của HIV-1
bằng kỹ thuật PCR

Mặc dù chỉ có một lượng nhỏ phần của các tế bào tiểu cầu đơn nhân (PBMCperipheral blood mononuclear cells) của bệnh nhân mang ADN của provirut, nó
thường được dùng để xác định virut bằng phản ứng PCR. Qua đó, sự chẩn đoán
HIV- 1 thông qua việc xác định sự có mặt của ADN của provirut trong PBMC bằng
18


Luận văn cao học

Hoàng Anh

cách khuếch đại gen gag hoặc gen pol. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR
là 100%. Tuy nhiên, trên thực tế, độ nhạy của phương pháp xác định ADN của
HIV-1 trong chẩn đoán chỉ là 96-97%. Để tránh kết quả dương tính giả, cần chú ý
đến các thành phần và thao tác trong khi làm phản ứng PCR [23].
Ưu điểm của phương pháp này là không cần phòng thí nghiệm có độ an toàn
cao, và nó nhạy hơn việc xác đinh kháng nguyên với lượng mẫu rất ít. Tuy nhiên,
nó chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nhất định, ví dụ như ở giai đoạn đầu
của quá trình nhiễm hoặc trong trường hợp trẻ sơ sinh của người mẹ đã nhiễm HIV.
Vì ở những bệnh nhân có nồng độ tế bào CD4 cao dẫn đến việc giảm sự di chuyển
của các PBMC nhiễm virut trong máu [23,43].
Hiện nay, bằng phương pháp RT - PCR (Reverse Transcriptase PCR) có thể
xác định sự có mặt ARN của virut trong huyết thanh bệnh nhân và phương pháp
Real-time PCR có thể xác định được nồng độ virut trong cơ thể thông qua việc xác
định lượng AND trong tế bào [7]. Đây là những phương pháp có giá trị lớn trong
việc xác định trạng thái của bệnh nhân và ứng dụng trong việc điều trị bằng các
thuốc kháng virut thích hợp.
1.3.1.3 Phương pháp xác định kháng nguyên p24 bằng kỹ thuật ELISA
hoặc Western Blot
Một phương pháp cải biến để chẩn đoán HIV-1 là xác định sự có mặt của
kháng nguyên virut trong máu bệnh nhân. Kháng nguyên tốt nhất được sử dụng cho

mục đích này là kháng nguyên lõi capsit p24 – một protein cấu trúc là thành phần
chính của hạt virut. Kháng nguyên này xuất hiện sau khoảng 2 đến 6 tuần với nồng
độ cao trong máu. Do đó, việc kiểm tra kháng nguyên này là phương pháp tối ưu
trong việc chuẩn đoán sớm sự nhiễm HIV-1 [7, 16, 50].
Sau giai đoạn này, nồng độ kháng nguyên giảm do liên kết với kháng thể đặc
hiệu kháng p24 nên không xác định được kháng nguyên trong hầu hết các bệnh
nhân. Vì lí do này mà phương pháp kiểm tra kháng nguyên p24 là không phù hợp để
chẩn đoán sự nhiễm HIV-1 ở người đang ở trạng thái khỏe mạnh nhưng mang HIV1. Trong trường hợp này, người ta phải dùng các biện pháp xét nghiệm khác như
RT- PCR và bADN [35].
Theo dõi kháng nguyên p24 có thể dự đoán được thời kỳ của bệnh do:
19


Luận văn cao học

Hoàng Anh

• Kháng nguyên p24 xuất hiện sớm trong giai đoạn sơ nhiễm ở 50-70%
bệnh nhân
• Khi đến giai đoạn tiềm tan thì p24 giảm dần theo thời gian
• Khi đến giai đoạn AIDS thì lượng p24 tăng trở lại [52]
Các kháng nguyên của HIV thường được xác định bằng các phương pháp
như phương pháp enzym liên kết miễn dịch (ELISA hoặc EIA). Các phiến plastic
được phủ bằng protein của virut (kháng nguyên). Huyết thanh bệnh nhân được đưa
vào giếng. Nếu trong huyếtt thanhh có kháng thể kháng HIV, các kháng nguyên
HIV sẽ liên kết với các kháng thể đặc hiệu trong các phiến. Sau khi rửa huyết thanh,
các kháng thể gắn kết được xác định bằng kháng thể thứ 2, kháng thể này liên kết
với một enzym như alkalin phophataza, hoặc peroxidaza. Sự liên kết giữa kháng thể
thứ 2 với kháng thể kháng HIV có thể xác định được bằng phản ứng của đĩa với cơ
chất của alkalin phophataza hoặc peroxidaza làm chuyển màu khi được phân cắt

bằng enzym [35].
1.3.1.4 Phương pháp xác định kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân
bằng kỹ thuật ELISA hoặc Western Blot
Các phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng HIV đang sử dụng hiện nay là
cực kỳ chính xác đối với việc xác định sự nhiễm cấp tính, về cả độ nhạy (khả năng
của phương pháp để đưa ra kết quả dương tính khi đối tượng thực sự đã nhiễm HIV)
và độ đặc hiệu (khả năng đưa ra kết quả dương tính khi đối tượng thực sự không
nhiễm HIV) (theo NIAID và WHO).
Một trong những vấn đề của việc xác định kháng thể kháng HIV là giai đoạn
cửa sổ. Đây là khoảng thời gian từ lúc bắt đầu nhiễm cho đến khi xác định được sự
có mặt của kháng thể. Giai đoạn chuyển từ kết quả âm tính kháng thể sang dương
tính được gọi là giai đoạn chuyển đổi huyết thanh [36, 49].
Ở giai đoạn đầu của sự biến đổi huyết thanh, kháng thể kháng protein p24
xuất hiện đầu tiên. Sự có mặt của kháng thể kháng p24 đánh dấu sự giảm sự lưu
hành kháng nguyên p24 trong cơ thể bệnh nhân. Kháng thể kháng p24 vẫn tiếp tục
hạn chế lưu hành của p24 cho đến khi kháng thể chống lại glycolprotein vỏ gp41 và
gp120 bắt đầu xuất hiện.

20


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Glycoprotein vỏ của HIV-1 và HIV-2 được bảo tồn lớn và là các epitope ưu
thế miễn dịch. Sự xác định các kháng thể chống lại protein vỏ tạo ra sơ sở cho các
kit chẩn đoán miễn dịch để xác định HIV. Tuy nhiên, các loại kit này không thể sử
dụng để xác định sớm với mẫu huyết thanh vì tại đó kháng thể chống lại kháng
nguyên p24 của protein lõi mới là kháng thể xuât hiện đầu tiên. Vì vậy, các loại kit

này chỉ được sử dụng ở giai đoạn sau của quá trình nhiễm [22]. Do vậy, việc xác
định kháng thể kháng p24 trong giai đoạn này là một lựa chọn để xác định sớm sự
nhiễm HIV [9, 41].
Chẩn đoán kháng thể kháng HIV nhờ phương pháp ELISA có độ nhạy hơn
99%, tuy nhiên cũng có trường hợp dương tính giả. Vì thế, tất cả các mẫu dương
tính trong phản ứng ELISA đều được xác định lần thứ 2 nhờ phương pháp Western
blot. Mặc dù không nhạy như ELISA, phương pháp Western blot đặc hiệu hơn và
cho phép xác định tại phòng thí nghiệm protein đặc hiệu virut phản ứng với kháng
thể [17]. Chỉ có các xét nghiệm dương tính ở cả 2 phản ứng với ELISA và Western
blot mới được kết luận là nhiễm HIV [41, 52].
1.3.1.5 Chẩn đoán nhanh HIV bằng Rapid HIV Test
Bên cạnh phương pháp chuẩn xác định HIV bằng các phương pháp kiểm tra
đã biết, hiện nay đã có phương pháp chẩn đoán nhanh để xác định sự nhiễm HIV
trong phòng thí nghiệm đối với phụ nữ mang thai hoặc đối với bệnh nhân bị thương
(Abbott Laboratories).
Phương pháp này đã được áp dụng trong chẩn đoán nhanh ở các quốc gia
phát triển và nay đã được đưa vào Việt Nam thông qua các hoạt động của các tổ
chức phòng chống AIDS toàn cầu. Chỉ trong 10 phút, sử dụng các hạt latex được
bọc bởi kháng nguyên HIV-1, sau đó được ủ cùng với huyết thanh của bệnh nhân để
cho ra kết quả. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này là hơn 99%. Hiện nay,
phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi và liên tục có sự cải tiến để làm giảm
thời gian xác định bệnh và làm tăng độ nhạy cũng như độ đặc hiệu [48, 51].

1.3.1.6 Chẩn đoán sinh học có suy giảm và rối loạn miễn dịch
- Dấu hiệu trực tiếp và thường xuyên được sử dụng nhất là sự giảm TCD4 +.
Bình thường lượng tế bào này trong máu là 450- 1280/ mm 3; còn với TCD8+ là 258800/mm3.
21


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Nếu lượng TCD4+ nhỏ hơn 400 tế bào/ ml, chứng tỏ đã suy giảm miễn dịch.
Nếu lượng TCD4+ nhỏ hơn 200 tế bào/ml cho thấy có sự suy giảm miễn dịch
nghiêm trọng.
- Dấu hiệu gián tiếp và cũng thường xuyên được sử dụng là tỷ lệ
TCD4+/TCD8+ giảm, dạng bình thường, tỉ lệ này là 1,4- 2,2.
- Ngoài ra còn căn cứ vào lượng tế bào lympho B, nếu lượng tế bào này nhỏ
hơn 25- 280/mm3 thì cũng kết luận là có suy giảm miễn dịch.
1.3.2 Phương pháp phòng chống và điều trị bệnh
Hiện tại chưa có vacxin để phòng ngừa lây nhiễm HIV, và cũng không có
một liệu pháp nào có thể loại bỏ hoàn toàn virut HIV ra khỏi cơ thể. Tuy nhiên,
những người sống chung với AIDS hiện nay có thể kéo dài và cải thiện chất lượng
cuộc sống bằng liệu pháp điều trị kháng virut. Lựa chọn điều trị lý tưởng bao gồm
các điều trị kết hợp (“cocktail”) hai hay nhiều loại thuốc kháng retrovirus như
HAART. Có 2 loại chất ức chế là reverse transcriptase giống nucleoside (nucleoside
analogue reverse transcriptase inhibitor, NRTI) chất ức chế protease hoặc một chất
thuốc ức chế reverse transcriptase non-nucleoside (non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitor, NNRTI) có thể kéo dài thời gian phát triển bệnh từ giai đoạn
HIV sang giai đoạn AIDS, do đó kéo dài thời gian sống của bệnh nhân [41, 42].
Để có được biện pháp điều trị có hiệu quả tốt nhất cho bệnh nhân phụ thuộc
rất nhiều vào sự xét nghiệm phát hiện bệnh sớm và theo dõi tiến triển của bệnh
thông qua các phương pháp xét nghiệm phù hợp với từng giai đoạn. Do đó, việc
nghiên cứu và phát triển các loại kit phát hiện nhanh HIV, trong đó việc phát hiện
HIV dựa vào kháng nguyên và kháng thể kháng P24 đang được rất nhiều các nhà
nghiên cứu và các hãng sản xuất quan tâm.

22

Luận văn cao học

Hoàng Anh

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein P24 tái tổ hợp
Trước vai trò to lớn của việc sử dụng kháng nguyên P24 trong chẩn đoán và
chế tạo vacxin, việc nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp P24 đang thu hút được
nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và cũng thu được những thành tựu đáng kể
[28, 32, 43, 48]. Các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất protein P24 tái tổ hợp để
dùng trong chẩn đoán HIV bằng ELISA hoặc Western blot. Rất nhiều loại kit được
lưu hành trên thị trường để kiểm tra sự nhiễm HIV như kit HIV-1 P24 Extended
Range Kit của hãng Gentaur [44], Bio Rad. Thành công từ việc tối ưu hóa sản xuất
protein tải tổ hợp P24 trong Mycobacterium bovis [27] và trong E. coli [19]. Việc
chuyển gen p24 vào trong cây thuốc là một trong những thành tựu quan trong để
hướng tới việc chế tạo vacxin cho người nhiễm HIV [30]. Có nghiên cứu đã tạo
được gen p24 tái tổ hợp từ nấm men và đã gây miễn dịch thành công cho những
người tình nguyện khỏe mạnh [40]. Ngoài ra, protein P24 tái tổ hợp còn được ứng
dụng trong việc chế tạo kháng thể đơn dòng để dùng trong việc chế tạo các kit chẩn
đoán HIV [36].
Trong giới hạn luận văn này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu việc sản xuất
protein P24 tái tổ hợp dùng trong mục địch phát hiện kháng thể kháng HIV trong
huyết thanh bệnh nhân.
1.5 Vectơ
Một vectơ được sử dụng cho mục đích tách dòng cần có những đặc điểm sau:
• Vectơ phải có khả năng sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc
vào sự sao chép hệ gen tế bào chủ.
• Vectơ phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lượng
ADN tối đa. Hơn nữa, kích thước vectơ càng nhỏ thì càng dễ dàng xâm nhập
vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và đạt hiệu quả.

• Vectơ phải có các đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa
vectơ, các đặc tính này được mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thường đó là
các đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vectơ sống được trên
môi trường có chất kháng sinh, hoặc có khả năng sản sinh một enzyme chuyển
hoá một cơ chất tạo mầu, dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch.

23


Luận văn cao học

Hoàng Anh

• Vectơ phải tồn tại được trong vi khuẩn qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn
nhất cho tế bào chủ.
• Vectơ phải mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số lượng tối đa
enzym giới hạn. Điều này phát triển khả năng xây dựng các vectơ tái tổ hợp.
Hơn nữa các vị trí nhận biết này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc. Nhờ
vậy mà khi trình tự ADN gắn xen vào một vị trí cũng sẽ gắn xen vào chính
giữa gen và làm bất hoạt gen đấy. Cho đến nay đã có nhiều thế hệ plasmid
khác nhau ra đời, thế hệ sau là cải tiến của thế hệ trước và ngày càng mang
nhiều đặc tính quý báu cho việc tạo dòng.
Có nhiều loại vectơ: tách dòng như plasmid, phage, cosmid, YAC. Người ta
chọn sử dụng vectơ dựa vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích
tạo dòng. Về chức năng, người ta chia vectơ thành hai loại lớn là vectơ tạo dòng
(cloning vector) và vectơ biểu hiện (expression vector). Để tách dòng và biểu hiện
đoạn gen p24, chúng tôi sử dụng vectơ pCR 2.1 để tách dòng và vectơ pVFT2S để
biểu hiện đoạn gen p24 của HIV.
5.1.1 Vectơ pCR 2.1
Để tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá protein P24 của HIV, chúng

tôi sử dụng vectơ pCR 2.1 của hãng Introgen làm vectơ tách dòng. Đây là một trong
các vectơ đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp
sản phẩm PCR vào vectơ đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có
một bazơ Thimin. Vectơ pCR 2.1 có kích thước 3,9 kb, được thiết kế có gắn một
operon chuyển hoá đường lactoza là operon-lac. Tại vùng ranh giới giữa promotơ
của operon này là gen cấu trúc mã hoá cho β- galactosidase có vùng cắt đa vị với
17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn như EcoRI, HindIII, NsiI, KpnI, SacI, BamHI,
SpeI, BstXI, EcoRV, NotI, AvaI, PaeR7I, XhoI, XbaI, ApaI. Trong đó EcoRI và
BstXI có hai vị trí cắt, các enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt. Với vị trí của vùng
cắt gắn đa vị như vậy, sản phẩm β-galactosidase có thể được tạo ra (nếu vectơ
không được đính đoạn ngoại lai) hoặc không được tạo ra (nếu vectơ được đính đoạn
ngoại lai). Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn được những tế bào mang
vectơ tái tổ hợp với tần suất cao. Ngoài ra, vectơ pCR 2.1 có chứa gen kháng kháng
sinh là ampicillin, nhờ đó có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa
ampicillin với nồng độ ức chế tối thiểu.
24


Luận văn cao học

Hoàng Anh

Hình 7. Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của Vectơ pCR 2.1
1.5.2 Vecto biểu hiện pVFT2S

Hình 8: Sơ
đồ cấu trúc và
vị trí vắt giới
hạn của vector
pVFT2S

25