Phân lập, tạo ñột biến ñiểm ở gen P5CS liên quan ñến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây ñậu tương Việt Nam

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ABA

Abcisis acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

ATP

Adenozin triphosphata

ATP-ase

Enzym phân giải ATP

cDNA

Sợi DNA bổ sung ñược tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym
phiên mã ngược (Complementary DNA)

AS
A. tumefaciens
BAP

bar
bp
CCM
DEPC

Acetosyringone
Agrobacterium tumefaciens
6-benzyladenine
gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase
Base pair
Cocultivation medium Diethyl pyrocarbonate

ñtg

ñồng tác giả

dNTP
EDTA
E. coli
GA3
GM
GUS
HSP
IAA
IBA
IPTG
kb
LB
LSD
LEA

MES
MS
NAA
nptII
OD
P5CS
P5CDH
P5CR
PDH

deoxynucleoside triphosphate
Ethylene diamine tetraacetic acid
Escherichia coli
Gibberellic acid
Germination medium – môi trường nảy mầm hạt
β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)
Indoleacetic acid
Indole-3-butyric acid
Isopropylthio-beta-D-galactoside
kilo base
Luria Bertani
Least significant difference = ñộ lệch chuẩn
Late embryogenesis abundant
2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid
Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
α-Naphthaleneacetic acid
Neomycin phosphotransferase gene
Optical density
pyroline-5-carboxylate synthetase

Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase
Pyrroline 5 carboxylate reductase
Pyrroline dehydrogenase

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

rd29A
PCR
RM
SDS
SIM
SEM
Taq
T-DNA
Ti- plasmid
TBE

Responsive Dehydration
Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase
Rooting medium – môi trường ra rễ
Sodium dodecylsulfat
Shoot induction medium – môi trường tạo ña chồi
Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi
Thermus aquaticus DNA
Transfer –DNA = ñoạn ADN ñược chuyển
Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u
Tris - Boric acid - EDTA

TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

v/p
X-gluc
X-gal

vòng/phút
5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

YEP

Yeast extract peptone

1

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỤC LỤC
MỞ ðẦU................................................................................................................ 0

1. ðặt vấn ñề........................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 4
1.1. CÂY ðẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ
GIÁ TRỊ SỬ DỤNG ............................................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại................................................................................. 4
1.1.2. ðặc ñiểm sinh học ......................................................................................... 4
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây ñậu tương ....................................... 5
1.1.4. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới và ở Việt Nam............................. 6
1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ðẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA
CÂY ðẬU TƯƠNG ............................................................................................. 10
1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong ñiều kiện hạn ...................................... 11
1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ............................................................................... 11
1.2.1.2. Khả năng cố ñịnh nitơ của cây ñậu tương trong ñiều kiện hạn .................. 13
1.2.2. Các tính trạng liên quan ñến sự thích ứng của lá cây ñậu tương trong ñiều kiện
hạn ........................................................................................................................ 14
1.2.2.1. Cường ñộ thoát hơi nước của khí khổng ................................................... 14
1.2.2.2. Cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì ........................................................ 15
1.2.2.3. Mật ñộ lông tơ của lá................................................................................ 16
1.2.2.4. Hiệu quả sử dụng nước............................................................................. 17
1.2.3. ðáp ứng về phương diện hóa sinh của cây ñậu tương trong ñiều kiện hạn ... 18
1.2.4. Một số gen liên quan ñến tính chịu hạn ................................................................... 19

1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ðƯỜNG SINH
TỔNG HỢP PROLIN ........................................................................................... 21
1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp prolin..................................................................... 21
1.3.2. ðiều hòa quá trình trao ñổi prolin ở thực vật ............................................... 23
1.3.3. Vai trò của sự tích lũy prolin ñối với tính chống chịu của cây...................... 25
1.3.4. Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase ñối với tính chống chịu của cây trồng

.............................................................................................................................. 27
1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ðIỀU KHIỂN HOẠT ðỘNG CỦA GEN
DƯỚI ðIỀU KIỆN KHÔ HẠN
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

29
29


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học
30
1.4.3. Promoter rd29A
32
1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ðẬU
TƯƠNG................................................................................................................ 32
1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây ñậu tương bằng phương pháp ñột biến thực
nghiệm .................................................................................................................. 32
1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng ñậu tương chịu hạn ..... 33
1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen ñể nâng cao khả năng chịu hạn của cây ñậu tương
.............................................................................................................................. 35
1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .................................................. 35
1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây
ñậu tương chịu hạn................................................................................................ 37
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 38
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ............................................................. 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 39

2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh ..................................................................... 39
2.2.1.1. ðánh giá nhanh khả năng chịu hạn ........................................................... 39
2.2.1.2. ðịnh lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt .... 39
2.2.1.3. Xác ñịnh hàm lượng prolin ....................................................................... 40
2.2.1.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ..................................................... 40
2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro................................................. 40
2.2.2.1. Arabidopsis ............................................................................................. 40
2.2.2.2. Thuốc lá .................................................................................................. 40
2.2.2.3. ðậu tương ............................................................................................... 41
2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 44
2.2.3.1. Thiết kế mồi ............................................................................................. 44
2.2.3.2. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA...................................... 44
2.2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA................................................................... 45
2.2.3.4. Phản ứng PCR ......................................................................................... 45
2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention)........................................... 46
2.2.3.6. Phương pháp tách dòng ............................................................................ 46
2.2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ........................... 49
2.2.2.8. Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ..……………49
2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây biến nạp.................................................. 52
1

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 53
3.1. KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ðÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ðẬU TƯƠNG ðỊA
PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA ........................................................................... 53
3.1.1. ðặc ñiểm hình thái, hóa sinh của hạt ñậu tương........................................... 53

3.1.2. Kết quả ñánh giá khả năng chịu hạn của các giống ñậu tương nghiên cứu ... 55
3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ðỘT BIẾN ðIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC ..... 58
3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS ......................................................................... 58
3.2.2. Kết quả khuếch ñại, tách dòng và xác ñịnh trình tự gen P5CS ..................... 58
3.2.3. Tạo ñột biến ñiểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây ñậu tương..... 69
3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ðỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG
KHÔ HẠN rd29A ................................................................................................. 72
3.3.1. Phân lập promoter rd29A............................................................................. 72
3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A ............................................................... 73
3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A ........................................ 75
3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS.......................... 75
3.4. KẾT QUẢ ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ
CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM .......................................... 78
3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM.......................... 78
3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM ....................... 81
3.4.3. ðánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen ................... 82
3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ðẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN.................................. 84
3.5.1. Kết quả tái sinh tạo ña chồi ở giống ñậu tương DT84 .................................. 84
3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt .................................................................. 84
3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP ñến khả năng tạo ña chồi từ lá mầm hạt chín ........... 87
3.5.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA3 tới khả năng kéo dài chồi ................... 89
3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA ñến hiệu quả tạo rễ ................................................... 91
3.5.1.5. Xác ñịnh giá thể thích hợp cho ra cây in vitro.......................................... 93
3.5.2. Kết quả bước ñầu chuyển gen GUS vào cây ñậu tương DT84...................... 94
3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào ñậu tương .................................. 96
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 102

2

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Diện tích sản xuất ñậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

7

Bảng 1.2

Sản lượng ñậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

7

Bảng 1.3

Năng suất ñậu tương ở một số quốc gia trên thế giới

8

Bảng 1.4

Sản lượng ñậu tương tại các tỉnh và thành phố

9

Bảng 1.5

Cây chuyển gen mang gen P5CS

29

Bảng 2.1

Thành phần dung dịch ñệm tách chiết

45

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng PCR

46

Bảng 2.3

Thành phần phản ứng OE -PCR

46

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng

47

Bảng 2.5

Thành phần hoá chất tách plasmid

48

Bảng 2.6

Thành phần phản ứng colony - PCR

49

Bảng 2.7

Thành phần phản ứng cắt rd29A và vector pBI 101 bằng

50

BamHI và HindII
Bảng 2.8

Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101

50

Bảng 2.9

Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM bằng BamHI và SacI

50

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101

51

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM

52

Bảng 3.1

Các giống ñậu tương ñịa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La

53

Bảng 3.2

Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống ñậu

57

tương nghiên cứu
Bảng 3.3

Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi ñặc hiệu gen P5CS

58

Bảng 3.4

Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống

64

ñậu tương
Bảng 3.5

Vị trí sai khác trong trình tự axit amin của gen P5CS ở 3 giống

65

ñậu tương
Bảng 3.6

Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi ñặc hiệu gen P5CS

69

Bảng 3.7

Hàm lượng prolin tích lũy trong các dòng thuốc lá nghiên cứu

82

(µmol/g)
3

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Bảng 3.8

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen ñến khả năng

85

nảy mầm ñậu tương DT84
Bảng 3.9

Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo ñến khả năng

86

nảy mầm ñậu tương DT84
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo ña chồi

88

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của GA3 ñến khả năng kéo dài chồi

90

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA ñến khả năng tạo rễ

92

Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn

97

4

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1

Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao

22

Hình 1.2

Cơ chế và các tác nhân ñiều hòa quá trình trao ñổi prolin ở

23

thực vật
Hình 1.3

Vai trò của prolin ñối với tính chống chịu của cây

25

Hình 2.1

Sơ ñồ thí nghiệm tái sinh cây ñậu tương

42

Hình 2.2 Sơ ñồ chuyển gen vào cây ñậu tương qua nách lá mầm

43

Hình 2.3

Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A

49

Hình 3.1

ðồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương ñối của một số giống

56

ñậu tương ñịa phương và giống DT84
Hình 3.2

Sản phẩm tách RNA

59

Hình 3.3

Kết quả nhân hai ñoạn gen P5CS từ 2 giống ñậu tương DT84

59

và SL5
Hình 3.4

Kết quả PCR ghép nối hai ñoạn gen P5CS từ 2 giống ñậu

60

tương DT84 và SL5
Hình 3.5

Kết quả tách dòng gen P5CS từ 2 giống ñậu tương DT84 và

62

SL5
Hình 3.6

Trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống ñậu tương

64

Hình 3.7

Trình tự axit amin của Protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống

67

ñậu tương
Hình 3.8

Mức ñộ tương ñồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của

68

các giống ñậu tương.
Hình 3.9

Sơ ñồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức ñộ tương ñồng

68

của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống ñậu
Hình 3.10 ðiện di sản phẩm PCR

70

Hình 3.11 Phản ứng nối hai ñoạn gen theo phương pháp OE-PCR với

70

cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS
Hình 3.12 ðiện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới

71

hạn BamHI
Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện ñột biến tại
vị trí nucleotid 374 của gen P5CS
5

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

71


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hình 3.14 Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana

72

Hình 3.15 ðiện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBT/rd29A

73

Hình 3.16 Phân tích trình tự promoter rd29A

74

Hình 3.17 Sơ ñồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A

75

Hình 3.18 ðiện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBI101/rd29A

75

Hình 3.19 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc lá

76

Hình 3.20 Biểu hiện gen GUS trên cây chuyển gen

77

Hình 2.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen
mang promoter rd29A dưới ñiều kiện hạn nhân tạo

78

Hình 3.22 Các sản phẩm cắt ñồng thời bằng enzym BamHI và SacI

79

Hình 3.23 ðiện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT

80

rd29A::/P5CSM
Hình 3.24 Kết quả colny PCR chọn dòng trong A. tumefaciens

81

Hình 3.25 Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A

82

for/rd29Arev
Hình 3.26 Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo

83

Hình 3.27 Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau

84

phục hồi (B)
Hình 3.28 Hạt nảy mầm bằng các phương pháp khử trùng khác nhau

87

Hình 3.29 Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng ñộ BAP khác nhau

89

Hình 3.30 Chồi kéo dài trên môi trường có nồng ñộ GA3 khác nhau

90

Hình 3.31 Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro

93

Hình 3.32 Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả

94

Hình 3.33 Biểu hiện của gen GUS

95

Hình 3.34 Sơ ñồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây ñậu tương qua nách lá

96

mầm
Hình 3.35 Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen

97

Hình 3.36 Kiểm tra cây ñậu tương T0 chuyển gen bằng PCR

98

Hình 3.37 Cây ñậu tương T0 chuyển gen

98

6

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỞ ðẦU
1. ðặt vấn ñề
Cây ñậu tương (Glycine max L. Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng
không chỉ ở Việt Nam mà còn ñối với nhiều quốc gia trên thế giới. Hạt ñậu tương có
thể ñược dùng làm nguồn thức ăn giàu ñạm cho con người và là nguồn nguyên liệu
quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến. ðậu tương là loại cây trồng ngắn
ngày, có giá trị kinh tế cao khi sử dụng làm thương phẩm, và ñược sử dụng cho mục
ñích cải tạo ñất. Bên cạnh ñó, ñậu tương rất dễ canh tác, có khả năng thích nghi với
nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác nhau và ñược trồng ở nhiều vùng quốc gia và vùng
lãnh thổ với sản lượng năm 2009 là trên 222 triệu tấn [107].
Tại Việt Nam, cây ñậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây
trồng ở nhiều ñịa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 là 239,1 nghìn tấn.
Theo thống kê năm 2009 cho thấy, cây ñậu tương ñược canh tác có hệ thống trên diện
tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải ñều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ
yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [107]. Trong khu
vực ASEAN, năng suất ñậu tương năm 2009 của Việt Nam ñứng thứ 3 trong số 6 nước
trồng ñậu tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Việt Nam. Tuy
nhiên so với các trung tâm sản xuất ñậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa
Kỳ thì sản lượng ñậu tương của nước ta còn khá thấp [107]. Vì thế, ñể ñáp ứng ñủ nhu
cầu trong nước nên chúng ta phải nhập khẩu ñậu tương với số lượng lớn từ các quốc
gia bên ngoài ñặc biệt là Hoa Kỳ.
Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất ñậu tương không chỉ ở
Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất ñậu tương hàng ñầu thế giới như
Argentina. Thống kê cho thấy, sản lượng ñậu tương của Argentina vào vụ mùa năm
2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời ñiểm năm 2008 là 46,2 triệu tấn. Ở Việt
Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các ñịa phương làm cho sản lượng ñậu tương
của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn
và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [106]. ðậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả
1

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

năng chịu hạn kém. Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống ñậu tương có khả năng sống
trong ñiều kiện bất lợi về nước ñang là hướng nghiên cứu rất ñược quan tâm của các
nhà chọn giống. Ở Việt Nam, nhiều giống ñậu tương có khả năng chống chịu hạn ñã
ñược chọn tạo thành công và ñang ñược triển khai canh tác ở một số ñịa phương. Có
thể kể ñến các giống DT96, DT2008 do các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông
nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo. Dòng ñậu tương ML48,
ML61 do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo có khả năng chịu hạn cao [15]. Tuy nhiên
các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có
quần thể ñủ lớn và không ổn ñịnh. Những nhược ñiểm của phương pháp truyền thống
có thể ñược khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học. Kỹ
thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ñã ñược
các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng và ñạt ñược những kết quả rất có triển vọng
trên cây ñậu tương. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện
nghiên cứu lúa ðồng bằng sông Cửu Long ñã thành công trong việc tạo ra các giống
ñậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh [9]. Tuy nhiên, cho ñến nay công trình
nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây ñậu tương vẫn chưa ñược quan tâm ñúng
mức. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành ñề tài luận án tiến sĩ là: “Phân
lập, tạo ñột biến ñiểm ở gen P5CS liên quan ñến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây ñậu tương Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của giống ñịa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt
và giống ñậu tương DT84. Tạo ñược ñột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi
prolin.
2.2. Tạo ñược vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan ñến tính chịu hạn ở cây ñậu

tương.
2.3. Tạo cây ñậu tương mang cấu trúc gen liên quan ñến ñặc tính chịu hạn.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân tích ñặc ñiểm sinh lý, hóa sinh của một số giống ñậu tương trồng tại khu vực
miền Bắc.
2

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

3.2. Phân lập và xác ñịnh trình tự gen mã hóa enzyme pyroline-5 carboxylate synthetase
(P5CS).
3.3. Tạo ñột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) bởi prolin
bằng phương pháp tạo ñột biến ñiểm.
3.4. Phân lập promoter cảm ứng dưới ñiều kiện khô hạn rd29A từ cây Arabidopsis
thaliana. Phân tích hoạt ñộng của promoter dựa vào hoạt ñộng của gen GUS ở các
dòng cây thuốc lá chuyển gen.
3.5. Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS ñột biến ñược ñiều khiển bởi promoter rd29A và
chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá.
3.6. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh và khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá
trong ñiều kiện gây hạn nhân tạo.
3.7. Biến nạp cấu trúc mang gen P5CS vào cây ñậu tương thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Phân tích sự có mặt của gen biến nạp.

3

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ðẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L. MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ
VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây ñậu tương là một trong những loài cây trồng ñược biết ñến từ rất sớm.
Các bằng chứng về lịch sử, ñịa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng ñậu tương có nguồn
gốc từ Trung Quốc. Cây ñậu tương ñược thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở
Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước công nguyên. Cây ñậu tương ñược
truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ VIII, du nhập vào nhiều nước Châu
Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn ðộ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau ñó.
Cây ñậu tương ñược trồng ở Châu Âu vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ thế kỷ XVIII .
Cây ñậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ ñậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm
Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill. Tuy nhiên
theo Hymowit và Newell (1984) thì ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja. Chi
Glycine ñược chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong ñó có loài
ñậu tương trồng Glycine max L. Merrill (Ngô Thế Dân và ñtg, 1999) [6], (Trần Văn
ðiền, 2007) [8].
1.1.2. ðặc ñiểm sinh học
ðậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn
non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây
cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân
có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím ñỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo
giống.
Cây ñậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá ñơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3
thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của lá thay

ñổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp,
những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn.
4

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hoa ñậu tương ñược phát sinh từ nách lá, ñầu cành hoặc ñầu thân. Hoa mọc
thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên ñậu tương là cây tự
thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%.
Quả ñậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3
hạt. Hạt ñậu tương có hình tròn, bầu dục…, những giống có hạt màu vàng có giá trị
thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao ñộng trung bình từ 100 - 200g. Hình dạng
và màu sắc của rốn hạt ñặc trưng cho mỗi giống.
Bộ rễ ñậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, ñó là kết
quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài
1cm, ñường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt
nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng ñất có ñộ sâu từ 0 - 20cm, có
vai trò quan trọng trong việc cố ñịnh ñạm từ nitơ không khí, với lượng ñạm cung cấp
cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha.
Dựa vào thời gian sinh trưởng, ñậu tương ñược chia thành các loại: chín rất
sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung
bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120
ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 150 ngày (Ngô Thế Dân và ñtg, 1999) [6], (Trần Văn ðiền, 2007) [8].
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây ñậu tương
ðậu tương là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó ñược
dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp,
làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo ñất trồng rất tốt. ðậu tương ñược xem là ông

hoàng trong các cây họ ñậu vì giá trị rất toàn diện của nó (Trần Văn ðiền, 2007) [8].
Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong ñậu tương cao hơn trong cá, thịt và
cao gấp 2 lần các loại ñậu ñỗ khác, protein trong hạt ñậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ
thuộc vào giống và ñiều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần
tạo cholesteron. ðậu tương còn ñược xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng,
lipit ñậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm
khoảng 18%. Trong hạt ñậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, ñáng kể là các vitamin
5

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và
các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa.
Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, ñậu tương là cây ñứng ñầu về cung
cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu ñậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu ñậu tương
khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt ñộ ngưng tụ -15 ñến -180C và từ dầu người ta
có thể làm nến, xà phòng, nilon,…ðậu tương còn là nguyên liệu của nhiều ngành công
nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất ñốt
lỏng,…
Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây ñậu tương cả khi tươi và khô ñều có thể dùng
làm thức ăn cho gia súc. ðậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo ñất trồng, một ha
ñậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ ñể lại trong ñất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá
với hàm lượng ñạm cao có thể dùng ñể bón cho ñất thay cho phân hữu cơ. Việc luân
canh ñậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo ñất trồng hữu hiệu.
1.1.4. Tình hình sản xuất ñậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
Trên thế giới: Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây ñậu tương nên ñây ñược
xem là một trong những loại cây trồng chiến lược ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ ñứng

sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng với các ñiều kiện khí hậu và
sinh thái khác nhau nên ñậu tương ñược trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung
nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp ñến là Châu Á. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên hiệp quốc, diện tích gieo trồng ñậu tương trên thế giới tăng khoảng
3,6 triệu ha trong vòng 4 năm trở lại ñây (năm 2006 là 95,2 triệu ha và năm 2009 là
98,8 triệu ha) [107].
Trong ñó, Hoa Kỳ là quốc gia có diện tích gieo trồng cây ñậu tương lớn nhất là
30,91 triệu ha tiếp ñến là quốc gia Brazil (21,76 triệu ha) và Argentina (16,77 triệu ha)
vào năm 2009 (Bảng 1.1) trong khi ñó Việt Nam chỉ có 0,15 triệu ha.
Mặc dù diện tích gieo trồng cây ñậu tương tăng lên ñáng kể trong các năm trở
lại ñây tuy nhiên sản lượng ñậu tương của cả thế giới lại có những biến ñộng khác
nhau giữa các năm. Năm 2006 sản xuất ñậu tương của cả thế giới ñạt 221,9 triệu tấn,
năm 2007 giảm xuống còn 219,5 triệu tấn, tăng lên vào năm 2008 là 230,5 triệu tấn
nhưng năm 2009 chỉ còn 222,2 triệu tấn.
6

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Bảng 1.1. Diện tích sản xuất ñậu tương ở một số quốc gia trên thế giới
Quốc gia
Argentina
Brazil
Trung Quốc
Ấn ðộ
Indonesia
Thái Lan
Hoa Kỳ

Việt Nam

Năm 2006
15,13
22,05
9,30
8,33
0,58
0,14
30,19
0,19

Diện tích gieo trồng (triệu ha)*
Năm 2007
Năm 2008
15,98
16,39
20,57
21,06
8,75
9,13
8,88
9,52
0,46
0,59
0,13
0,12
25,96
30,22
0,19

0,19

Năm 2009
16,77
21,76
8,80
9,60
0,72
0,11
30,91
0,15

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

[107].
Năm 2009, Hoa Kỳ là quốc gia sản xuất ñậu tương nhiều nhất thế giới với 91,42 triệu tấn,
tiếp theo là Brazil với 56,96 triệu tấn và Argentina là 30,99 triệu tấn [107] (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Sản lượng ñậu tương ở một số quốc gia trên thế giới
Quốc gia

Sản lượng (triệu tấn)*
Năm 2006

Năm 2007

Năm 2008

Năm 2009

Argentina

40,54

47,48

46,24

30,99

Brazil

52,46

57,86

59,24

56,96

Trung Quốc

15,50

12,73

15.55

14,50

Ấn ðộ

8,86

10,97

9,91

10,22

Indonesia

0,75

0,59

0,78

0,97

Thái Lan

0,21

0,20

0,19

0,19

Hoa Kỳ

87,00

72,86

80,75

91,42

Việt Nam

0,26

0,28

0,27

0,21

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

[107].
Trong bốn năm trở lại ñây năng suất cao nhất ñạt ñược vào năm 2007 là 24,3 tạ/ha
và thấp nhất là năm 2009 là 22,4 tạ/ha. Trong số các quốc gia trồng cây ñậu tương hàng
ñầu thế giới chỉ duy nhất Hoa Kỳ vẫn duy trì ñược năng suất cây ñậu tương thậm chí có
7

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

phần tăng vào năm 2009 so với các năm 2006, 2007 và 2008 (Bảng 1.3). Argentina là
nước có năng suất ñậu tương giảm mạnh nhất vào năm 2009 chỉ còn 18,48 tạ/ha so với
các năm trước trung bình ñạt khoảng 27 tạ/ha (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Năng suất ñậu tương ở một số quốc gia trên thế giới
Quốc gia
Argentina
Brazil
Trung Quốc
Ấn ðộ
Indonesia
Thái Lan
Hoa Kỳ
Việt Nam

Năm 2006
26,79
23,80
16,66
10,63
12,88
15,60
28,82
13,91

Năng suất (tạ/ha)*
Năm 2007
Năm 2008
29,71

28,22
28,13
28,13
14,54
17,03
12,35
10,40
12,91
13,12
15,93
15,99
28,07
26,72
14,70
14,03

Năm 2009
18,48
26,18
16,48
10,64
13,48
16,33
29,58
14,61

* Theo số liệu thống kê của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc (FAO)

[107].
Có thể kể ñến nhiều nguyên nhân làm cho năng suất và sản lượng ñậu tương

không ổn ñịnh trong một vài năm trở lại ñây ở trên thế giới và tại các quốc gia trồng
ñậu tương là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác nhưng ñáng chú ý nhất phải kể ñến là do
tình hình biến ñổi khí hậu và hạn là một yếu tố có ảnh hưởng không nhỏ ñến sản xuất
ñậu tương trên thế giới. Hạn hán hay vấn ñề không chủ ñộng ñược nguồn nước làm
giảm tới 40% phần năng suất của cây ñậu tương. Theo thống kê của cơ quan nông
nghiệp Hoa Kỳ thì sản lượng ñậu tương của Argentina hơn 10 triệu tấn vào năm 2009,
trong ñó năng suất khoảng 10 tạ/ha. Nguyên nhân gây ra tình trạng này chính là do
tình trạng hạn hán tại một số nước Châu Mỹ Latinh trong ñó có Argentina (Bảng 1.3).
Do sự suy giảm năng suất và sản lượng tại hai quốc gia hàng ñầu về sản xuất ñậu
tương là Brazil và Argentina nên ñã ảnh hưởng ñến sản lượng ñậu tương của cả thế
giới (Bảng 1.3).
Ở Việt Nam: ðậu tương ñược gieo trồng từ lâu ñời, trước cây ñậu xanh và ñậu ñen.
Tuy nhiên, với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống có năng suất thấp,
sản xuất nhỏ lẻ, giá thành ñậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với ñậu
tương nhập khẩu là lý do khiến cho nông dân không mặn mà với cây ñậu tương. Diện
tích trồng ñậu tương tăng qua các năm nhưng vẫn chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ (1,5 - 1,6%
tổng diện tích cây nông nghiệp).
8

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Bảng 1.4. Sản lượng sản xuất ñậu tương tại các tỉnh và thành phố
Các ñịa phương

Sản lượng các ñịa phương (nghìn tấn)*
2006

2007

2008

2009

Hà Nội

2,1

2,1

43,9

11,8

Hà Tây

47,7

51,7

Vĩnh Phúc

10,2

6,4

10,5

4,2

Bắc Ninh

2,9

3,2

4,0

4,1

Quảng Ninh

1,1

1,1

1,1

1,3

Hải Dương

2,9

2,5

2,3

2,7

Hưng Yên

8,4

7,9

6,9

5,8

Thái Bình

12,4

13,8

14,0

16,8

Hà Nam

11,1

12,0

13,0

2,1

Nam ðịnh

5,3

5,6

5,4

4,0

Hà Giang

14,1

14,1

20,4

23,7

Cao Bằng

4,4

5,2

5,1

4,1

Bắc Kạn

2,9

2,8

3,6

4,0

Tuyên Quang

3,2

4,1

4,5

3,9

Lào Cai

4,7

5,4

4,9

5,3

Thái Nguyên

3,6

3,1

2,8

2,5

Lạng Sơn

2,0

3,0

2,7

2,2

Bắc Giang

4,5

3,4

3,1

3,0

ðiện Biên

10,7

11,2

13,0

11,7

Lai Châu

1,7

1,8

2,1

2,4

Sơn La

11,1

11,5

10,0

9,8

Hoà Bình

3,4

4,3

3,6

1,9

Thanh Hóa

6,6

7,6

6,3

7,4

ðắk Lắk

10,4

11,3

11,2

10,4

ðắk Nông

26,7

30,3

30,5

33,2

ðồng Nai

3,2

3,2

2,1

1,5

ðồng Tháp

14,0

16,6

13,7

10,7

An Giang

2,8

3,1

2,0

1,6

* Theo số liệu của Tổng Cục Thống kê [107].

Mặc dù chưa có những số liệu thống kê cụ thể thiệt hại do hạn hán gây ra ñối
với sản xuất ñậu tương ở Việt Nam. Tuy nhiên, khi nhìn vào số liệu thống kê sản
9

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

lượng ñậu tương tại các tỉnh và thành phố của Việt Nam có thể thấy rằng tại nhiều khu
vực sản lượng sản xuất ñậu tương giảm ñáng kể so với những năm trước ñây, thêm vào
ñó kết hợp với những thông tin về tình hình thời tiết bất thường trong vòng 3 năm trở
lại ñây có thể thấy rằng bên cạnh những yếu tố bất lợi sinh học và phi sinh học khác
thì hạn hán cũng ñã ảnh hưởng không nhỏ tới sản lượng ñậu tương ở một số tỉnh thành
nói riêng và do ñó ảnh hưởng ñến sản lượng sản xuất ñậu tương của cả nước nói
chung.

Kết hợp với những số liệu thống kê cụ thể về sản lượng ñậu tương ở các quốc
gia trên thế giới và ñánh giá tình hình sản xuất ñậu tương tại Việt Nam trong vòng 4
năm trở lại ñây có thể khẳng ñịnh rằng, vấn ñề nâng cao khả năng kháng hạn trở nên
cấp thiết ñối với cây ñậu tương. Thêm vào ñó những nghiên cứu này hoàn toàn mới
ñối với tình hình nghiên cứu cây ñậu tương tại Việt Nam và phù hợp với xu thế chung
trên thế giới.
1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ðẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ðẬU
TƯƠNG
Khi gặp các ñiều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng ñể có thể
thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá ña dạng nhưng có thể chia
thành ba cơ chế chủ ñạo bao gồm: cơ chế trốn thoát ñiều kiện hạn (drought escape),
cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance).
Cơ chế trốn thoát ñiều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình
trong giai ñoạn ñược cung cấp ñủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống ñậu tương
ngắn ngày ñược trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này
ñể thích ứng với các ñiều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt
ñầu nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này
có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước
xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. ðối với cơ chế tránh hạn thì các giống ñậu tương sẽ có
các cơ chế ñể duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai ñoạn hạn thông qua việc
tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận
khác nhau của cây. Ở các giống ñậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có
thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao ñổi chất có
10

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

thể diễn ra bình thường trong ñiều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất
thấp. Sức căng của các mô và tế bào của cây ñược duy trì thông qua việc tổng hợp
mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao ñổi (Nguyen và ñtg, 2007) [68].
1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong ñiều kiện hạn
1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy
nước cung cấp cho các hoạt ñộng sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây ñậu
tương sự thích nghi với các ñiều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ
ñể có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp ñất sâu (Taylor và ñtg, 1978) [93]. Bên
cạnh ñó hệ thống rễ sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp ñất có ñộ
ẩm cao và tìm kiếm các chất dinh dưỡng. Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng
ñến ñộ sâu của rễ ñậu tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate). Do rễ trụ
ñược hình thành ñầu tiên ở ñậu tương, chính vì thế việc xác ñịnh các giống ñậu tương
có ñặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác ñịnh khả năng ñâm sâu của rễ. Sự
khác nhau về tính trạng kéo dài bộ rễ ở các giống ñậu tương ñã ñược nghiên cứu khá
chi tiết ở trong ñiều kiện nhà lưới (Kaspar và ñtg, 1984) [54]. ñã ñánh giá 105 giống
ñậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ khác nhau giữa các giống vào khoảng
1,3cm/ngày. Những nghiên cứu tiếp theo trên các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho
thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu trên 120cm so với các giống còn lại.
Một vài nghiên cứu cũng ñã ñược thực hiện ñối với hệ thống rễ nhánh của cây ñậu
tương cho thấy trong ñiều kiện hạn số lượng rễ nhánh trên ñơn vị chiều dài rễ trụ tăng
ñáng kể, nhưng chiều dài và ñường kính rễ trụ không thay ñổi. Hạn chế về nước ở cây
ñậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ ñó làm tăng tỉ lễ rễ : thân. Ở cây ñậu
tương không ñược tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây ñậu tương ñược tưới
nước (Huck và ñtg, 1983) [47]. Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương
quan rất chặt chẽ ñối với nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu
trúc và số lượng rễ nhánh ở các giống chịu hạn. Những tính trạng này thường ñược
dùng như các chỉ tiêu quan trọng ñể ñánh giá và nhận dạng các giống ñậu tương có
tính chịu hạn. Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây ñậu tương ñược chia thành
hai giai ñoạn là sinh trưởng sinh dưỡng (V) và sinh trưởng sinh sản (R). Giai ñoạn V

11

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

ñược chia thành VE ñến VN, trong giai ñoạn VN ñỉnh sinh trưởng xuất hiện và các
giai ñoạn VN ñược ñánh số phụ thuộc số lượng lá bánh tẻ xuất hiện. Giai ñoạn R ñược
chia thành các giai ñoạn từ R1 ñến R8. Trong hai giai ñoạn ñầu R1 và R2 hình thành
hoa, giai ñoạn R3 và R4 là sự hình thành quả ñậu tương, các giai ñoạn chín và làm
chắc hạt là từ R5 tới R8. Ở cây ñậu tương, khi hạn hán xảy ra ở các giai ñoạn sớm hay
muộn của giai ñoạn sinh trưởng sinh sản làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, ñặc biệt là
hệ thống rễ ở các lớp ñất sâu. Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi
hạn hán xảy ra ở giai ñoạn R4 và R5 (Hoogenboom và ñtg, 1987) [43]. Trong một
nghiên cứu khác cho thấy cây ñậu tương khi bị xử lý hạn ở giai ñoạn trước khi ra hoa
sẽ cho năng suất hạn cao những cây ñậu tương bị xử lý hạn ở giai ñoạn sau khi nở hoa,
ñiều này ñược giải thích là do chúng ñã phát triển bộ rễ ñầy ñủ ñể thích ứng với ñiều
kiện hạn trước khi nở hoa (Hirasawa và ñtg, 1994) [39]. Các kết quả này cho thấy nếu
khi cây ñậu tương phát triển bộ rễ lớn ở những giai ñoạn sớm của quá trình sinh trưởng
sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các ñiều kiện hạn.
Các kết quả từ các nghiên cứu ñược trình bày trên ñây cho thấy những tính
trạng bộ rễ có thể sử dụng ñể cải thiện tính chịu hạn ở cây ñậu tương bằng các phương
pháp nhân giống thông thường. Tuy nhiên, các phương pháp ño ñạc các tính trạng liên
quan ñến bộ rễ thường rất khó thực hiện. Thay vào ñó các phương pháp phân tử sẽ là
công cụ hỗ trợ cho các phương pháp truyền thống ñể nghiên cứu các tính trạng về rễ.
Quá trình chọn lọc các gen liên quan ñến các tính trạng về rễ bao gồm các nghiên cứu
sàng lọc gen từ các cơ sở dữ liệu, thiết kế mồi ñể nhân bản gen, xác ñịnh sự ña dạng,
phát triển phương pháp phân tích hệ gen, xác ñịnh quần thể nghiên cứu. Phương pháp
này ñã thành công trong việc xác ñịnh nhiều gen quý quy ñịnh các tính trạng rễ ở lúa

trong ñiều kiện hạn (Valliyodan và ñtg, 2006) [98]. Thêm vào ñó, việc hiểu biết các cơ
chế sinh lý và quá trình ñiều hòa di truyền của sự thích nghi của bộ rễ dưới ñiều kiện
hạn sẽ giúp ích cho việc xác ñịnh các gen ñặc hiệu, các quá trình chuyển hóa ñể sử
dụng cho việc nâng cao khả năng chịu hạn của cây ñậu tương bằng phương pháp sử
dụng chỉ thị gen hoặc kỹ thuật chuyển gen.
12

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

1.2.1.2. Khả năng cố ñịnh nitơ của cây ñậu tương trong ñiều kiện hạn
Khả năng cố ñịnh nitơ ở các loài cây họ ñậu thường rất nhạy cảm ñối với tình
trạng nước ở trong ñất. Trong ñiều kiện hạn, cây ñậu tương không chỉ giảm khả năng
cố ñịnh CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố ñịnh nitơ cũng bị ảnh hưởng
nghiêm trọng. Kết quả này làm giảm sinh tổng hợp protein (Purcell và King, 1996)
[75]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố ñịnh nitơ trong ñiều kiện hạn ñã ñược xác
ñịnh ở cây ñậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2 giảm, nguồn carbon tới các nốt
sần giảm, hoạt tính của enzym sucrose synthase giảm, hàm lượng ure và axit amin tự
do tăng (King và Purcell, 2005) [56]. ðặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và
nốt sần ñã ñược xác ñịnh ở cây ñậu tương trong ñiều kiện hạn. Hoạt tính của enzym
nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày ñầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi ñó quá trình
quang hợp giảm khoảng 5%. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp
ñến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng ñối với khả năng
khuyếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong ñất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá
của cây ñậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt
sần.
Sự thay ñổi về di truyền cũng ñược xác ñịnh ở các cá thể nhạy cảm với khả
năng cố ñịnh nitơ trong ñiều kiện hạn. Khi so sánh các giống ñậu tương có hoặc không

có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới ñiều kiện hạn ở giai ñoạn sinh
trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất
hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong
những chỉ tiêu ñể sàng lọc các dòng cây ñậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn
trong ñiều kiện khô hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng ñậu tương dựa
vào chỉ tiêu này, 8 dòng ñậu tương có khả năng cố ñịnh nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt
hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng ñậu tương này, Sinclair và ñtg (2007) [86] tìm ra
rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên
cứu. Giống ñậu tương Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố ñịnh nitơ cao, ñã
ñược dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai ñể tạo ra giống ñậu tương có năng suất cao
ở các ñiều kiện hạn. Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt ñược dùng ñể
cải thiện khả năng cố ñịnh nitơ và năng suất trong các ñiều kiện ngập úng (Sinclair và
13

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

ñtg, 2007) [86]. Cho ñến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích ñược liệu khả
năng cố ñịnh nitơ trong ñiều kiện hạn có ñược ñiều hòa ở mức ñộ cơ thể của cây ñậu
tương hay không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta ñã biết
rằng, tín hiệu ñiều hòa quá trình cố ñịnh nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen
feedback mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá. King và Purcell (2005)
[56] ñề xuất giả thiết là sự kết hợp ure và axit aspartic ở nốt sần và quá trình vận
chuyển một số các axit amin từ lá có thể tham gia vào cơ chế ức chế phản hồi ở cây
ñậu tương. Gần ñây một nghiên cứu trên hệ thống rễ phân tách ở ñiều kiện hạn cho
thấy hoạt tính cố ñịnh nitơ ñược ñiều khiển ở mức ñộ khu trú (local) hơn là ở mức ñộ
tín hiệu nitơ hệ thống (Marino và ñtg, 2007) [64]. Nhiều nghiên cứu cũng ñang ñược
thực hiện theo hướng này ñể hiểu hơn bản chất phân tử các nhân tố hạn chế và ñiều

hòa quá trình cố ñịnh nitơ trong ñiều kiện hạn ở cây ñậu tương.
1.2.2. Các tính trạng liên quan ñến sự thích ứng của lá cây ñậu tương trong ñiều
kiện hạn
1.2.2.1. Cường ñộ thoát hơi nước của khí khổng
Cường ñộ thoái hơi nước của khí khổng là một trong những tính trạng sinh lý
của lá có liên quan chặt chẽ ñến khả năng sử dụng nước của cơ thể thực vật khi cây
gặp ñiều kiện khô hạn. Khi cây gặp bất lợi về nước, cơ thể thực vật sẽ thực hiện quá
trình chuyển ñổi từ pha trung hòa nước, mà trong ñó việc sử dụng nước ở trong cơ thể
không tùy thuộc vào lượng nước ở bên ngoài, sang pha thứ cấp khi mà việc sử dụng
nước sẽ liên quan trực tiếp ñến lượng nước ở bên ngoài (Sinclair và ñtg, 1986) [85].
Quá trình chuyển hóa này liên quan ñến việc giảm cường ñộ thoát hơi nước qua khí
khổng ở lá và có thể xảy ra ở nhiều loài cây khác nhau trong các ñiều kiện khác nhau.
Cường ñộ thoát hơi nước là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng ñến sự trao ñổi khí và
hơi nước ở lá. Ảnh hưởng của hạn hán ñến sự sinh trưởng của lá, cường ñộ thoát hơi
nước và lượng nước ở trong cây ñược nghiên cứu khá chi tiết ở ñậu tương. Chúng ta
biết rằng, hạn hán làm giảm tốc ñộ mở rộng của lá, cường ñộ thoát hơi nước của khí
khổng và sức căng của lá. Trong ñó, nó làm tăng hàm lượng axit abscisic (ABA) ở lá
và xylem. Nghiên cứu này cho thấy việc giảm cường ñộ thoát hơi nước của khí khổng
xảy ra ñồng thời với việc tăng hàm lượng ABA ở trong xylem và xảy ra trước khi có
14

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

những thay ñổi về sức căng của lá. ðiều này chỉ ra rằng các tín hiệu hóa học ABA bắt
nguồn từ rễ ñiều khiển hoạt ñộng của khí khổng khi tính trạng thiếu nước tương ñối ở
trong ñất xảy ra (Liu và ñtg, 2003) [61]. Sự khác nhau về mặt di truyền về khả năng
duy trì khí khổng mở dưới ñiều kiện bất lợi về nước ñã ñược nghiên cứu ở ñậu tương.

Khi so sánh các loài cây họ ñậu khác với cây ñậu tương cho thấy, cây ñậu xanh, ñậu
ñen và ñậu ñũa có khả năng ñiều khiển sự ñóng mở khí khổng tốt hơn khi cây bị mất
nước. Các nghiên cứu khác cũng ñã chứng minh rất rõ ràng rằng cường ñộ thoát hơi
nước của khí khổng giảm tỉ lệ thuận với sự mất nước ở cây ñậu tương (Liu và ñtg,
2005) [62]. Khả năng ñiều khiển cường ñộ thoát hơi nước của khí khổng dưới ñiều
kiện hạn là một ñặc tính sinh lý tốt ñể phát hiện các giống ñậu tương chịu hạn do các
phương pháp ño ñạc chính xác ñã ñược phát triển. Tuy nhiên, khả năng di truyền tính
trạng này cũng là một yếu tố rất quan trọng cần ñược quan tâm.
1.2.2.2. Cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì
ðặc tính sinh lý thứ hai của lá cũng có thể ñược sử dụng ñể ñánh giá và xác
ñịnh khả năng chịu hạn và khả năng sinh trưởng của cây trồng trong ñiều kiện hạn ñó
là cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì của lá (Epidermal conductance). Cường ñộ
thoát hơi nước tổng số của lá ñược tính bằng tổng của cường ñộ thoát hơi nước của khí
khổng và của mặt biểu bì. Khi khí khổng mở, quá trình thoát hơi nước của biểu bì
thường không ñược tính ñến khi tính toán cường ñộ thoát hơi nước tổng số của lá. Tuy
nhiên, khi lá bị thiếu nước hay bị bóng tối, trong các ñiều kiện này thì khí khổng
thường ñóng, thì hệ thống thoát hơi nước ở bề mặt biểu bì có thể vượt qua cả cường ñộ
thoát hơi nước của khí khổng. Trong những ñiều kiện thiếu nước nghiêm trọng khi khí
khổng ñóng hoàn toàn, cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì ñược dùng ñể xác ñịnh
lượng nước mất mát của mô lá. Nhiều loại thực vật sống trong môi trường khô có
cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì rất thấp (Riederer và ñtg, 2001) [77], và những
loài cây trồng có cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì thấp thường duy trì khả năng
sống tốt và dài hơn trong những ñiều kiện khô hạn (Jovanovi và ñtg, 1996) [52].
Nghiên cứu trên 74 giống ñậu tương thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau cho thấy
sự khác nhau ñáng kể về cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì ở các giống này và có
quan hệ chặt chẽ với môi trường mà các giống nghiên cứu sinh sống. ðiều ñang quan
15

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn

tâm ñó là sự khác nhau này không liên quan ñến sự khác nhau về mật ñộ khí khổng ở
lá. Những giống có cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì thấp có thể cải thiện khả năng
phát triển và sinh trưởng của lá ở những ñiều kiện bất lợi về nước, vì thế diện tích lá
ñược duy trì ñảm bảo sự sinh trưởng của cây sau khi bị hạn. Nghiên cứu gần ñây cho
thấy mối tương quan nghịch (r = -0,74) giữa cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì và
hiệu quả sử dụng nước trong ñiều kiện hạn, kết quả này dẫn ñến một giả thiết cho rằng
cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì thấp sẽ là một chỉ tiêu ñáng tin cậy về tính chịu
hạn (Hufstetler và ñtg, 2007) [48]. Giống ñậu tương dại có cường ñộ thoát hơi nước
của biểu bì thấp hơn hẳn so với các giống ñậu tương canh tác. Trong số các giống ñậu
tương ñược gieo trồng ngày nay, các giống ở khu vực nhiệt ñới có cường ñộ thoát hơi
nước của biểu bì thấp nhất và thế năng thẩm thấu nhỏ hơn so với các giống ở khu vực
khí hậu ôn hòa, ñiều này có thể là do quá trình chọn lọc tự nhiên dưới các ñiều kiện
môi trường (James và ñtg, 2008a) [49]. Nghiên cứu trên các quần thể lai cho thấy
cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì khác nhau một cách có ý nghĩa dao ñộng từ 60 93% (James và ñtg, 2008b) [50]. Như vậy tính trạng này có tính di truyền khá cao. Tuy
nhiên, ñể khẳng ñịnh tính hữu dụng của các tính trạng này trong việc tạo ra các giống
ñậu tương có tính kháng hạn cần nhiều nghiên cứu sâu hơn ñể xác ñịnh mối quan hệ
giữa cường ñộ thoát hơi nước của biểu bì, khả năng duy trì sức căng của lá và sức sống
của cây.
1.2.2.3. Mật ñộ lông tơ của lá
Hệ thống lông tơ của lá là một ñặc ñiểm chung của các loài thực vật chịu hạn,
cũng như một số loài cây trồng trong ñó có ñậu tương. Trong ñiều kiện hạn thì ñây là
một trong những tính trạng thích nghi quan trọng của cây ñậu tương. Các dòng có mật
ñộ lông tơ cao có sức sinh trưởng sinh dưỡng tốt hơn, mật ñộ rễ nhiều hơn và rễ ñâm
sâu hơn. Mật ñộ lông tơ của lá tăng lên làm tăng tính kháng ở các lớp bề mặt của lá lên
tới 50%. Nhiệt ñộ của lá giảm, sự mất nước bị giới hạn và quá trình quang hợp tăng
lên do sự thâm nhập của phóng xạ thấp hơn cũng có liên quan ñến mật ñộ lông tơ của
lá (Specht và ñtg, 1985) [87]. Hơn nữa, nếu hệ lông tơ càng dày ñặc thì có thể làm

giảm hiện tượng nhiễm bệnh gây ra bởi virus khảm ñậu tương. Tuy nhiên, mật ñộ lông
tơ ñược ñiều khiển bởi hai allen là Pd1 và Pd2, tăng lên sẽ tạo ra những hiệu ứng có lợi
16

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn