THỤ TINH NHÂN TẠO IVF - Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp thu nhận đến việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHẦN MỞ ĐẦU
Ở sinh vật đa bào, cơ thể đƣợc cấu trúc, tổ chức chặt chẽ theo hệ thống: tế bào mô - cơ quan - cơ thể. Trƣớc đây ngƣời ta cho rằng, hầu hết các tế bào chỉ có thể tồn
tại và thực hiện chức năng bên trong cơ thể sống hoàn chỉnh. Thế nhƣng, công nghệ
nuôi cấy tế bào đã mở ra khả năng đặc biệt mà theo đó các tế bào có khả năng tồn tại
độc lập bên ngoài cơ thể nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc nhiều chức năng sinh học của
chúng. Nuôi cấy tế bào chính là kỹ thuật để tạo, nuôi và giữ nguồn tế bào trong điều
kiện nhân tạo.
Trên đối tƣợng động vật bậc cao, các nhà nghiên cứu đã rất thành công khi nuôi
cấy và sử dụng các dòng tế bào sinh dƣỡng (tế bào da, cơ, thần kinh, gan, thận...) hay
các khôi mô, cơ quan cơ thể và sử dụng chúng trong các mục đích y, sinh học, nông
nghiệp, bảo tồn. Thành công của kỹ thuật thụ tinh in vitro ở ngƣời đã mang đến niềm
vui và hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng hiếm muộn trên thế giới.
Ở vật nuôi, ngƣời ta có thể thu nhận nguồn phôi dồi dào phục vụ cho các nghiên
cứu khác nhƣ nhân bản động vật, tạo động vật chuyển gene, khai thác nguồn tế bào
mầm... Hơn thế nữa, khả năng cấy chuyển phôi, chuyển gene, xác định giới tính của
phôi trƣớc khi cấy giúp tạo ra vật nuôi theo ý muốn đã không còn là điều mong ƣớc.
Các khả năng này giúp cho công tác chọn giống, tạo giống mới nhanh và có hiệu quả
hơn.
Đối tƣợng nghiên cứu là heo đƣợc giết thịt tại lò mổ. Và tại sao heo đƣợc chọn
làm đối tƣợng nghiên cứu?. Heo là loài động vật có sức sinh sản cao trong mỗi lứa đẻ
(7-10 con/lứa). Vấn đề nghiên cứu tạo phôi heo trong điều kiện in vitro là việc làm ít
có ý nghĩa về mặt kinh tế, tuy nhiên, về mặt khoa học thì nghiên cứu này nhằm thu
đƣợcnhững kết quả bƣớc đầu về khả năng tạo phôi động vật trong điều kiện in vitro.
Ngoài ra, một khi đã làm chủ đƣợc khả năng tạo phôi in vitro thì vấn đề khai thác
nguồn phôi này để ứng dụng vào các nghiên cứu về sau sẽ đƣợc chủ động hơn. Đó là
lý do em thực hiện đề tài: “ Ảnh hƣởng của môi trƣờng và phƣơng pháp thu nhận đến
việc ổn định tế bào sinh dục chuẩn bị cho thụ tinh IVF”.
Nội dung đề tài:
- Thu nhận giao tử đực và cái.

- Nuôi và đánh giá trứng trên môi trƣờng KSOM, môi trƣờng M16, môi trƣờng
KSOM bổ sung 10% dịch nang trứng.
- Thu nhận tinh trùng từ phƣơng pháp Swim – up và phƣơng pháp Simple wash.
- Thử nghiệm IVF.

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

1


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

2


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.1. Sơ lược về đối tượng nghiên cứu
Lợn nhà hay lợn nuôi là một gia súc đƣợc thuần hóa, đƣợc chăn nuôi để cung cấp thịt.
Hầu hết lợn nhà có lớp lông mỏng trên bề mặt da.

Hình 1.1. Lợn (Sus scrofa domesticus)
Vị trí phân loại:
- Lớp: Mamalia
- Bộ: Artiodactyla
- Họ: Suidae

- Chi: Sus
- Loài: S. scrofa
- Phân loài: S. s. domesticus
1.2. Lịch sử phát triển của thụ tinh trong ống nghiệm[4], [12]
1.2.1. Những thí nghiệm đầu tiên về IVF
IVF đƣợc tiến hành lần đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier và cộng sự (cs) (1954).Kỹ
thuật này đƣợc Brackett ứng dụng và phát triển vào chăn nuôi bò sữa từ 1982.Từ đó, IVF
đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở các nƣớc chăn nuôi phát triển.
Động vật
Năm
Tác giả
Thỏ
1954-1959
Dauzier, Thibault Chang
Chuột túi má
1963
Yanagimachi và Chang
Chuột nhắt
1969
Yvvamatsu và Chang
Ngƣời
1978
Steptoe và Edvvards
Dê
1981
Kim và Iritani
Bò
1982
Brackett và cs
Cừu

1983
Wright và Bondioli
Heo
1986
Chan và cs
Bảng 1.1. Những thí nghiệm đầu tiên về thụ tinh IVF ở động vật
1.2.2. Lịch sử nuôi phôi heo Invitro
Heo là động vật đƣợc quan tâm đặc biệt vì trong buồng trứng của chúng có chứa
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

3


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
số lƣợng lớn (hơn 200.000) các nang trứng sơ cấp (primordialfollicles).
Trong những năm đầu thập kỷ 1980, ngƣời ta đã thu đƣợc các phôi invivo từ các
con heo dạng “động vật cho” và các phôi trên có thể nuôi phát triển từ giai đoạn 4 tế bào
đến giai đoạn phôi nang (blastocyst).
Sau đó, những hiểu biết về đặc điểm phát triển của trứng heo đã giúp hình thành
các loại môi trƣờng nuôi trứng chín trong điều kiện in vitro.
Năm 1986, Chan và cs đã thành công trong việc tạo phôi heo in vitro.Sau đó, kỹ
thuật nuôi phôi thụ tinh invitro giai đoạn 2 tế bào đến giai đoạn blastocyst đạt đƣợc thành
công.
Đến nay, khả năng tạo đƣợc động vật con từ quá trình thụ tinh trong ống nghiệm
của trứng nuôi chín invitro đã thành công.Tuy nhiên, khả năng tạo trứng chín in vitro
phục vụ qui trình tạo phôi vẫn chƣa hoàn chỉnh. Do đó, mục tiêu chính của thập kỷ qua là
tập trung vào nghiên cứu khả năng tạo đƣợc trứng chín in vitro.
1.3. Cơ sở khoa học của thụ tinh trong ống nghiệm
Trong sinh sản hữu tính ở động vật bậc cao, thụ tinh là quá trình kết hợp giữa tinh
trùng và trứng để tạo ra một tế bào mới gọi là hợp tử, hợp tử sẽ phát triển thành cơ thể

mới.Quá trình này xảy ra bên trong cơ thể mẹ.
Thụ tinh trong ống nghiệm là quá trình do con ngƣời tiến hành kết hợp giữa tinh
trùng với trứng để tạo ra hợp tử, đƣợc thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ. Sau đó, hợp tử
đƣợc chuyển vào tử cung để phát triển thành cơ thể.
1.3.1. Hệ sinh dục động vật hữu nhũ [1], [2]
1.3.1.1. Hệ sinh dục cái
Hệ sinh dục cái của một số động vật tuy có khác nhau ở một số chi tiết nhƣng chủ
yếu gồm những cấu trúc cơ bản sau: buồng trứng, hệ thống ống dẫn, tử cung, âm đạo và
các bộ phận sinh dục bên ngoài.
 Buồng trứng: dạng cặp nằm hai bên tử cung, dự trữ các nang trứng.
 Vòi tử cung: nơi dẫn trứng và diễn ra sự thụ tinh.
 Tử cung: cơ quan để hợp tử làm tổ và phát triển.
 Âm đạo: cơ quan giao hợp.
 Âm hộ: là cơ quan sinh dục nằm ngoài cơ thể nối liền với âm đạo.
Buồng trứng động vật hữu nhũ là cơ quan dự trữ các tế bào mầm sinh dục và noãn
bào đƣợc hình thành trong giai đoạn phôi thai. Chức năng đặc biệt của buồng trứng là sử
dụng lần lƣợt các nang trứng dự trữ này đến khi cạn kiệt và điều tiết hormone.Buồng
trứng đảm bảo cho các noãn lớn lên đều đặn rồi rụng trứng, đồng thời nó chuẩn bị cho tử
cung tiếp nhận những trứng đã đƣợc thụ tinh.
Số lƣợng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và phát
triển dần trong quá trình lớn lên của cá thể, càng lớn tuổi thì số nang trứng có hiệu quả
càng ít. Ở bò, có hơn 100.000 nang trứng lúc mới sinh, sau 9 năm giảm còn 2.500 nang
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

4


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
trứng; ở heo, có hơn 200.000 nang trứng sơ cấp ở buồng trứng; ở ngƣời, khi sơ sinh có
khoảng 30.000 - 300.000 nang trứng nguyên thủy, khi trƣởng thành còn 400-500 nang.

1.3.1.2. Hệ sinh dục đực
Gồm các cấu trúc cơ bản sau:
 Tinh hoàn: dạng cặp, nằm trong bìu có nhiều ngăn, tiết tinh trùng.
 Mào tinh: nối với tinh hoàn, đƣờng dẫn của tinh trùng.
 Ống dẫn tinh: nối với mào tinh
 Túi tinh: nơi chứa tinh và tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch.
 Tuyến tiền liệt: tiết dịch có trong thành phần của tinh dịch.
 Niệu đạo: nằm trong dƣơng vật, tinh trùng phóng ra ngoài qua niệu đạo.
Ngay trƣớc thời điểm phóng tinh, tinh trùng di chuyển từ mào tinh vào ống dẫn
tinh, ống phóng tinh và niệu đạo để ra ngoài.Trên đƣờng đi, tinh trùng đƣợc hòa với các
dịch tiết từ các tuyến phụ để tạo thành tinh dịch.
1.4. Quá trình sinh giao tử
1.4.1. Quá trình sinh noãn[1], [3]
Một noãn bào trƣởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó đƣợc phóng thích từ
một nang noãn trƣởng thành của buồng trứng. Sự trƣởng thành của noãn có liên hệ mật
thiết với sự trƣởng thành của các nang noãn.
1.4.1.1. Sự hình thành và phát triển nang noãn
Hình thành nang trứng là quá trình diễn biến nối tiếp của các giai đoạn phát triển
khác nhau của nang trứng từ khi ra khỏi nơi dự trữ, phát triển thành tế bào trứng. Quá
trình diễn ra nhƣ sau: từ những nang trứng nguyên thủy (primordial iollicle) trở thành
nang quá độ là giai đoạn chuyển tiếp cho sự hình thành nang trứng sơ cấp (preantral
follicle) đến nang thứ cấp (antral follicle).
Sự tăng trƣởng và thành thục của nang trứng trong buồng trứng thể hiện hàng loạt
sự biến đổi ở mức phân tử các thành phần khác nhau của nang nhƣ noãn bào, lớp tế bào
hạt và lớp tế bào vỏ. Các hiện tƣợng này đƣợc chi phối bởi những nhân tố khác nhau bên
trong buồng trứng, bên trong nang và những tín hiệu hormone.

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

5

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 1.2. Cấu trúc một nang noãn trưởng thành trước khi phóng noãn
1.4.1.2. Nội tiết của nang tăng trƣởng
Sự tăng trƣởng, thành thục, rụng trứng và hoàng thể hóa của nang trƣởng thành
phụ thuộc vào các yếu tố:
 Sự điều tiết thích hợp
 Hàm lƣợng đủ
 Tỷ lệ phù hợp của Follicle Stimulating Hormone (FSH) và Luteinizing
Hormone (LH) trong huyết thanh.
Trong đó, FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang,
kích thích quá trình phân bào nguyên nhiễm các tế bào hạt (có sự hỗ trợ của Estradiol) và
quá trình hình thành dịch nang.LH kích thích các tế bào vỏ và thụ quan LH hiện diện từ
lúc bắt đầu sự hình thành tế bào vỏ.
1.4.1.3. Sự hình thành và phát triển của noãn
Sự phát triển của noãn gồm 4 giai đọan:
 Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục
 Sự gia tăng số lƣợng tế bào mầm bằng nguyên phân
 Sự giảm chất liệu di truyền bằng giảm phân
 Sự trƣởng thành về cấu trúc và chức năng của noãn
Trong quá trình giảm phân của noãn có 2 giai đoạn noãn ở trạng thái ngừng tăng
trƣởng (block):
 Block thứ nhất khi noãn bƣớc vào giai đoạn tiền kỳ (prophase) của giảm
phân I, cho ra noãn sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle- GV). Các
noãn sẽ vƣợt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH tức khi cá
thể đến tuổi trƣởng thành sinh dục.
 Block thứ hai khi ở giai đoạn trung kỳ (metaphase-MI) của giảm phân II
(MII), cho ra noãn thứ cấp ở giai đoạn MII. Noãn chỉ vƣợt qua đƣợc giai

đoạn MII khi có sự thụ tinh của tinh trùng.
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

6


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.4.1.4. Mối tƣơng quan giữa kích thƣớc nang và sự phát triển của noãn
Khả năng một nang noãn sơ cấp tiếp tục phân chia giảm nhiễm để tiến tới giai
đoạn trƣởng thành (MII) và phóng noãn phụ thuộc mật thiết vào kích thƣớc của nang
chứa noãn đó. Các thí nghiệm in vitro và in vivo đều cho thấy noãn sơ cấp không thể tiếp
tục phân chia giảm phân nếu noãn còn trong nang nguyên thủy hay nang sơ cấp. Chỉ có
những noãn GV đƣợc chứa trong nang trƣớc phóng noãn có kích thƣớc bình thƣờng mới
có khả năng tiếp tục phân chia giảm phân để trƣởng thành.Những noãn GV chứa trong
nang thứ cấp chỉ có thể tiếp tục phân chia giảm phân đến giai đoạn MI, sau đó dừng lại.
Đây là cơ sở cho việc thu nhận các loại nang trứng đạt kích cở trƣởng thành từ buồng
trứng, phục vụ cho việc nuôi cấy in vitro.
1.4.2. Sự trưởng thành của noãn
1.4.2.1. Sự trƣởng thành của nhân
Ngay sau quá trình giảm phân, noãn GV sẽ đi qua các giai đoạn: tan biến túi mầm
(GVBD); metaphasel (MI) và metaphase II (Mll), sau cùng là sự phóng noãn. Thời gian
noãn trƣởng thành qua các giai đoạn này sẽ khác nhau tùy loài, ở ngƣời, noãn GV trải qua
giai đoạn GVBD 15 giờ, metaphase I (MI) 20 giờ và metaphase II (MII) 35 giờ sau đỉnh
LH.Sự phóng noãn xảy ra khoảng 38 giờ sau đỉnh LH.Ở bò, từ giai đoạn GV đến giai
đoạn MII mất khoảng 19 giờ.Ở heo, thời gian này mất khoảng 38 giờ.
Chính sự khác nhau cơ bản về thời gian trƣởng thành của noãn là cơ sở cho việc
giải thích tại sao để nuôi trƣởng thành các tế bào trứng trong điều kiện in vitro cần
khoảng 18-20 giờ ở bò và 38-44 giờ ở heo [15].
1.4.2.2. Sự trƣởng thành của tế bào chất
Trong quá trình này, các bào quan trong tế bào chất đƣợc tổ chức lại chuẩn bị cho

quá trình thụ tinh và sự tổng hợp protein cũng đƣợc sắp xếp để chuẩn bị cho sự phát triển
của phôi.Nhƣ vậy, sự trƣởng thành về nhân và tế bào chất là tiêu chuẩn cho sự trƣởng
thành của trứng trong điều kiện in vivo. Đây cũng là cơ sở thu nhận các trứng trƣởng
thành trong điều kiện in vitro.
1.4.2.3. Sự phóng noãn [7]
Sự phóng noãn xảy ra vào cuối kỳ tăng trƣởng, ở giai đoạn này, nang trứng trội có
khả năng đáp ứng với sự tăng lên mạnh và đột ngột của các kích dục tố bằng sự thay đổi
hoàn toàn cấu trúc của nó, dẫn đến hiện tƣợng rách nang và giải phóng noãn bào. Đồng
thời, trong noãn bào xảy ra những thay đổi đáng kể tạo ra một noãn bào trƣởng thành
hoàn toàn sẵn sàng cho sự thụ tinh:
 Noãn tách rời khỏi màng trong, tạo ra khoảng trống quanh noãn hoàng.
 Trong nhân của noãn, các nhiễm sắc thể kết thúc giảm phân I, thể cực thứ
nhất đƣợc phóng thích vào khoảng trống quanh noãn hoàng
 Giảm phân II khởi động rồi dừng lại ở trung kì II
 Giảm phân II chỉ tiếp tục sau khi thụ tinh cùng với sự phóng thích thể cực
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
thứ hai. Noãn không thụ tinh sẽ bị thoái hóa. Mỗi trứng rụng đƣợc bao xung
quanh bởi màng trong suốt và các tế bào quanh noãn. Các tế bào quanh
noãn sẽ tiếp tục biệt hóa thành tế bào tiết steroid để duy trì sự mang thai nếu
trứng đƣợc thụ tinh.
1.5. Quá trình sinh tinh[1], [2], [5], [7]
Tinh trùng đƣợc hình thành từ ống sinh tinh trong tinh hoàn. Đây là loại tế bào
thích ứng với chức năng vận chuyển và mang bộ gen đơn bội.
1.5.1. Cấu tạo tinh trùng
Mặc dù tinh trùng có hình dạng khác nhau tùy từng loài. Nhƣng tinh trùng có cấu

tạo cơ bản gồm: đầu, cổ, thân và đuôi.
1.5.1.1. Phần đầu
Ngay sau khi các tiền tinh trùng đƣợc hình thành chúng vẫn có những đặc điểm
của các tế bào biểu mô nhƣng sau đó nhanh chóng tăng chiều dài để hình thành tinh trùng
với cấu trúc cơ bản gồm bốn phần: phần đầu, phần cổ, phần thân và phần đuôi.

Hình 1.3.Cấu trúc tinh trùng
Phần đầu: Có hình bầu dục, một lớp bào tƣơng mỏng và màng tế bào bao quanh bề
mặt, gồm hai phần chính là nhân và thể đỉnh (acrosome).
 Nhân: chứa nhiễm sắc thể ở dạng kết đặc cao, không có ARN, chiếm 65%
thể tích phần đầu, có kích thƣớc lớn, chứa đầu vật chất di truyền là các
dezoxyribonucleoprotein với nồng độ cao.
 Thể đỉnh (Acrosome): Hai phần hai mặt ngoài phía trƣớc của đầu tinh trùng
đƣợc bao bọc bởi một “mũ” dày gọi là acrosome hình thành từ bộ máy
Golgi. Acrosome chứa các enzyme thủy phân nhƣ là hyaluronidase và
proteolytic enzyme có khả năng phân giải protein. Những enzyme này đóng
vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của tinh trùng vào trứng.
1.5.1.2. Phần cổ
Phần cổ của tinh trùng chủ yếu có các trung tử đầu và trung tử đuôi. Rất ngắn, co
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

8


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
lại, gắn vào chỗ lõm ở đáy phía sau của thân, chứa nhiều ti thể để cung cấp năng lƣợng
cho đuôi hoạt động. Khớp cổ rất lỏng lẻo, nên khi tinh trùng đã lọt vào trong trứng thì cổ
sẽ tách đầu ra khỏi thân và đuôi dễ dàng.
1.5.1.3. Phần thân
Gồm có sợi trực và tế bào chất bao quanh, có tiết diện to hơn phần đuôi. Trong đó

ti thể chiếm gần hết tế bào chất và đƣợc xếp theo dạng xoắn ốc bao quanh sợi trục. Ti thể
chứa enzyme oxy hóa và oxyphosphoryl hóa và các chất khác tham gia vào quá trình
chuyển hóa và dự trữ năng lƣợng quan trọng cho tinh trùng.
1.5.1.4. Phần đuôi
Cấu tạo chủ yếu là sợi trục gồm đuôi chính và chóp đuôi.Lông roi kéo dài từ đuôi
cho đến trung thể của thân. Cấu trúc trung tâm gồm 11 vi ống đƣợc gọi là trục cấu trúc và
đƣợc bao phủ bởi một màng mỏng. Trung tử hình thành vi ống của đuôi tinh trùng. Ti thể
quấn chặt lông roi, cung cấp ATP cho đuôi.Đuôi đảm bảo có thể chuyển động. Lúc di
động liên quan đến sự trƣợt của vi ống sợi trục, sự di chuyển đƣợc thực hiện nhờ chuyển
động co duỗi, lƣợn sóng và đập đuôi.
Đuôi của tinh trùng có ba cấu phần chính:
- Cấu trúc xƣơng trung tâm gồm 11 vi ống gọi là axoneme.
- Màng tế bào rất mỏng bao bọc axoneme.
- Hệ thống ti thể xung quanh axoneme gần phần trƣớc của đuôi (phần giáp cổ
tinh trùng).
Vận động của đuôi tinh trùng (theo kiểu vận động của các roi) giúp tinh tùng di
chuyển đƣợc. Việc này do các vi ống ở phía trƣớc và phía sau của axoneme trƣợt theo
chiều dọc. Năng lƣợng cần thiết cho quá trình vận động do các ATP tổng hợp trong ti thể
cung cấp. Tinh trùng bình thƣờng vận động tiến tới với tốc độ 1 ÷ 4 mm/phút.Với khả
năng vận động này tinh trùng có thể di chuyển trong đƣờng sinh dục của nữ giới để tìm
gặp trứng.
1.5.2. Sự sinh tinh trùng
Sự sinh tinh trùng gồm 4 giai đoạn:
 Sinh sản: tinh nguyên bào ở màng đáy tiến hành phân chia nguyên nhiễm
nhiều đợt, tạo ra các dạng tinh nguyên bào A và B. Tinh nguyên bào B là
tiền thân của các tinh bào.
 Sinh trƣởng: là giai đoạn của những tinh bào sơ cấp. Chúng tăng về kích
thƣớc và trong nhân tế bào hình thành từng đôi nhiễm sắc thể.
 Phát triển: có 2 kỳ phân chia liên tiếp, tinh bào sơ cấp phân chia thành tinh
bào thứ cấp, từ đó phân chia lần 2 thành hai tinh tử. Nhƣ vậy, 1 tinh nguyên

bào phân chia thành 4 tinh tử.
 Thành thục: tinh tử trải qua giai đoạn tạo hình tinh trùng và trở thành tinh
trùng là thể có chức năng để gặp và kết hợp đƣợc với trứng.
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

9


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
1.5.2.1. Đặc điểm quá trình sinh tinh
Trong các đợt phân bào, sự phân chia tế bào chất không triệt để. Do đó, các tế bào
hợp thành thể hợp bào và giữ liên hệ nhau qua các cầu nối tế bào chất. Qua đó, các ion và
phân tử có thể lƣu thông qua tất cả các tế bào giúp tinh trùng trƣởng thành đồng bộ.
1.5.2.2. Sự trƣởng thành của tinh trùng trƣớc khi thụ tinh
Tinh trùng có khả năng thụ tinh phải trải qua quá trình “kiện toàn năng lực thụ
tinh” hay “ sự hoạt hóa tinh trùng”, bởi vì sau khi phóng tinh, tinh trùng có thể di động
nhƣng chƣa có khả năng thụ tinh. Sự kiện toàn năng lực thụ tinh đƣợc thực hiện khi tinh
trùng di chuyển trong đƣờng sinh dục cái, thông qua các giai đoạn biến đổi: quá trình khả
năng hóa, sự tăng động và phản ứng cực đầu.
 Phản ứng khả năng hóa: làm thay đổi chất bên trong và trên bề mặt tế bào.
Do đó, làm màng tế bào mất ổn định và có thể thực hiện phản ứng cực đầu
(thể đỉnh).
 Phản ứng tăng động: là kết quả của phản ứng khả năng hóa làm tinh trùng
thay đổi kiểu di động.
 Phản ứng cực đầu: đây là phản ứng kích thích sự gia tăng nồng độ Ca2+
ngoại bào liên quan đên việc tái tổ chức lại lớp màng ở phần đầu tinh trùng.
Sau phản ứng này, các enzyme thủy giải từ đầu tinh trùng đƣợc giải phóng,
đồng thời để lộ ra các vị trí gắn với màng trong suốt giúp tinh trùng xâm
nhập vào trứng.
1.6. Sự thụ tinh và phát triển phôi[5], [10]

1.6.1. Sự thụ tinh
Gồm 5 bƣớc:
 Tinh trùng gắn với lớp màng trong suốt của trứng.
 Tinh trùng thực hiện phản ứng cực đầu.
 Tinh trùng xâm nhập vào bên trong màng trong suốt.
 Tinh trùng gắn vào lớp màng bào tƣơng của trứng.
 Sự hợp màng giữa trứng và tinh trùng và hình thành tiền nhân.
1.6.1.1. Tinh trùng gắn với lớp màng trong suôt của trứng
 Tinh trùng xuyên qua lớp cumulus
Trƣớc khi một tinh trùng xâm nhập đƣợc vào tế bào trứng, có rất nhiều (hàng trăm)
tinh trùng bám quanh một trứng. Chúng tiết ra enzyme hyaluronidase phân hủy lớp tế bào
quanh noãn (gồm nhiều vòng tế bào curnulus bao bên ngoài và một vòng rộng các tế bào
vành tia - corona radiate).
 Tinh trùng gắn với lớp màng trong suốt
Màng trong suốt là một lớp vỏ ngoại bào bao quanh trứng có thành phần chính là
glycoprotein, gồm ZPi (200kD), ZP2 (120kD) và ZP3 (83kD).
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

10


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Trong quá trình khả năng hóa, màng bào tƣơng của tinh trùng bị mất cholesterol
trở nên lỏng lẻo, làm cho các thụ quan (receptor) di chuyển tự do trên bề mặt của màng
và tập trung về phía đỉnh đầu của tinh trùng, nhờ đó chúng dễ dàng gắn với các ligand
trên bề mặt màng trong suốt. Khi tiếp xúc với màng trong suốt, các receptor này lập tức
liên kết với các ligand glycoprotein trên màng trong suốt, cụ thể là với ZP3.Sự gắn giữa
các cặp receptor - ligand này mang tính đặc hiệu loài cao.Sau sự gắn kết, đầu tinh trùng
đƣợc gắn chặt trên bề mặt màng trong suốt và thực hiện các phản ứng cần thiết cho sự
xâm nhập của tinh trùng vào bên trong trứng.

1.6.1.2. Tinh trùng thực hiện phản ứng cực đầu
Nồng độ ion Ca2+ và phân tử ZP trên màng trong suốt đƣợc xác định có vai trò
khởi động phản ứng cực đầu.Kết quả của phản ứng làm phơi bày các thụ quan có khả
năng gắn với màng trong suốt.
1.6.1.3. Tinh trùng xâm nhập vào bên trong màng trong suốt
Có sự thể hiện vai trò của ZP2 trong sự gắn thứ cấp giữa tinh trùng và trứng sau
khi lớp màng ở đỉnh đầu tinh trùng bị tách khỏi tinh trùng làm cho sự liên kết giữa tinh
trùng và noãn bị gián đoạn. Tiếp theo, các enzyme acrosin từ đầu tinh trùng đƣợc phóng
thích sẽ thủy giải các phân tử glycoprotein trên bề mặt màng trong suốt, làm thay đổi cấu
trúc của màng trong suốt, tạo thành một lỗ nhỏ cho tinh trùng chui vào. Mặt khác,
enzyme acrosin có vai trò phá hủy các vị trí liên kết của tinh trùng trên màng trong
suốt.Cơ chế này giúp ngăn cản sự thụ tinh đa tinh trùng.
1.6.1.4. Tinh trùng tiếp xúc với màng bào tƣơng
Sau khi qua màng trong suốt, đầu tinh trùng di chuyển vào khoang quanh
noãn.Tinh trùng trở nên bất động trƣớc khi hợp màng với trứng.Sự hợp màng xảy ra giữa
màng bào tƣơng của tinh trùng với màng bào tƣơng của trứng.Màng trong thể đỉnh đƣợc
liên kết chặt chẻ với nhân tinh trùng bên trong bào tƣơng trứng, còn đuôi tinh trùng tách
khỏi phần đầu và cổ, rồi phân hủy dần bên trong bào tƣơng trứng.
1.6.1.5. Sự hình thành tiền nhân
 Sự hình thành tiền nhân
Ngay sau quá trình hoà nhập, vỏ bọc xung quanh nhân tinh trùng tiêu biến do tác
động của các yếu tố trong bào tƣơng của noãn. Phân bào giảm nhiễm thứ hai đƣợc tiếp
tục và kết quả giải phóng thể cực thứ hai.Nhiễm sắc thể trong noãn đƣợc bao bọc bởi một
màng và tiền nhân cái đƣợc hình thành. Chất nhiễm sắc ở đầu tinh trùng tan ra và cũng
đƣợc bao bọc bởi một lớp vỏ và tiền nhân đực đƣợc hình thành.
 Sự di chuyển của tiền nhân
Lúc mới hình thành, các tiền nhân tách riêng nhau: tiền nhân cái nằm ở dƣới cực
cầu thứ hai và tiền nhân đực nằm ở dƣới vỏ chỗ tinh trùng xâm nhập. Sau đó, cả 2 tiền
nhân di chuyển về phía trung tâm của noãn.Quá trình di chuyển này có sự tham gia của
các thoi vô sắc và các sợi actin trong cấu trúc của noãn. Sau khoảng 20 giờ thụ tinh (tùy

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

11


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
loài) các tiền nhân đi tới trung tâm và nằm sát vào nhau. Sau khoảng vài giờ, màng của
các tiền nhân bị vỡ ra và các chất liệu di truyền của 2 giao tử hòa nhập với nhau, đây là
sự hòa hợp nhân.
1.6.2. Sự phát triển phôi
1.6.2.1. Sự phân chia tế bào [2], [10]
Quá trình thụ tinh đƣợc hoàn tất dẫn đến sự hình thành phôi ở dạng một tế bào.Sau
đó phôi bắt đầu phân chia thành dạng 2, 4, 8, 16 tế bào.Các tế bào này- gọi là các nguyên
bào phôi (blastomere) - ngày càng đƣợc phân chia nhiều hơn, nhỏ hơn và kết hợp lại
thành khối rắn chắc đƣợc gọi là phôi dâu (morula).Sau giai đoạn này phôi hình thành
dạng phôi nang (blastocyst) có sự tích lũy chất dịch bên trong tạo khôi cầu rỗng.Sau đó,
blastocyst tiếp tục qua giai đoạn phôi nang trƣơng nở (expanded blastocyst) và thoát khỏi
màng trong suôi ở giai đoạn phôi nang nở (hatching blastocyst) và bắt đầu làm tổ trong tử
cung.
Nguyên bào phôi không cần các phân tử tín hiệu đặc trƣng để khởi động quá trình
phân chia. Phôi tự điều hoà quá trình phân chia tế bào theo “đồng hồ” nội bào. Chu kỳ tế
bào sinh dƣỡng và tế bào phôi đều giống nhau.
1.6.2.2. Sự biểu hiện gene và tổng hợp protein ở phôi
Trƣớc thụ tinh, noãn chín và rụng đã có cấu tạo sinh hóa hoàn chỉnh cho sự tổng
hợp protein.Trong quá trình phát triển và trƣởng thành trứng chứa đầy ribosome cơ quan
nội bào tổng hợp protein, RNA ribosome (rRNA), RNA thông tin (mRNA) và RNA vận
chuyển (tRNA).Quá trình phân chia tế bào đầu tiên không phụ thuộc vào sự tổng hợp
RNA ở phôi. Các thí nghiệm đã chứng minh, trong các chu kỳ phát triển tế bào ở giai
đoạn sớm, sự chuyển hoá và tổng hợp protein hoàn toàn dƣới sự kiểm soát các thông tin
mà trứng nhận đƣợc từ cá thể mẹ, gọi là sự chuyển tiếp thông tin từ mẹ sang hợp tử

(material to zygote transition-MZT).
Giai đoạn truyền đạt thông tin di truyền từ mẹ sang phôi có ý nghĩa quan trọng về
mặt sinh học và trong nuôi cấy các tế bào phôi. Trên thực tế, giai đoạn này xuất hiện
đồng thời với giai đoạn phôi ngừng phân chia trong điều kiện nuôi cấy còn thiếu một yếu
tố nào đó. Phôi của một số loài chuột bị ức chế ở giai đoạn 2 tế bào, phôi bò bị ức chế ở
giai đoạn 8 tế bào và phôi cừu bị ức chế ở giai đoạn 16 tế bào trong điều kiện in vitro.
Các thay đổi về điều kiện nuôi cấy nói chung làm giảm đi sự ức chế đặc trƣng cho từng
loài động vật. Hiện nay ngƣời ta vẫn chƣa biết đƣợc điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng tới sự
truyền đạt thông tin từ mẹ sang phôi nhƣ thế nào và có hay không sự tham gia của các
phân tử tín hiệu đặc trƣng.
1.7. Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm gồm các giai đoạn cơ bản [4]:
 Thu nhận và chọn lọc giao tử cái
 Thu nhận và chọn lọc giao tử đực
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

12


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
 Dung hợp các giao tử đực và cái.
 Nuôi hợp tử phát triển thành phôi
 Chuyển phôi cho con cái nhận nuôi

Hình 1.4 . Quy trình cơ bản của kỹ thuật IVF
1.7.1. Thu nhận giao tử cái[8]
Trứng có thể thu nhận từ động vật đƣợc kích hoạt bằng kích dục tố (KDT) hoặc từ
buồng trứng động vật giết mổ. Các KDT gây sự rụng trứng gồm cóPregnant-Mare‟sSerum-Gonadotropin (PMSG) và Human Chorionic Gonadotropin (hCG).
Trứng thu nhận từ động vật đƣợc kích hoạt bằng KDT là những trứng thành thục
(trứng chín). Trứng thu nhận từ buồng trứng động vật giết mổ là trứng chƣa chín, do đó

trứng cần nuôi trƣởng thành trong môi trƣờng. Quá trình này gọi là quá trình nuôi trứng
chín trong điều kiện invitro(invitro maturation – IVM).
1.7.2. Thu nhận trứng từ buồng trứng[6], [16]
Ở buồng trứng heo có các loại nang trứng có kích thƣớc khác nhau: từ nhỏ
(<3mm), đến trung bình (3-6mm), hay lớn (>6mm). Nhìn chung, tế bào trứng thu từ
những nang trứng có kích thƣớc trung bình thƣờng sử dụng cho quá trình IVM. Các trứng
từ những nang trứng này đang dừng lại ở metaphase I (M I) của phân bào giảm
nhiễm.Khả năng chuyển tiếp M I thành M II có thể đạt đƣợc ở những tế bào trứng đã đạt
tới kích thƣớc trƣởng thành.
Tuy nhiên sự không đồng nhất của tế bào trứng thu từ những nang có kích thƣớc
khác nhau có thể ảnh hƣởng đến quá trình phân bào giảm nhiễm, sự chín bào tƣơng và
khả năng phát triển sau đó. Vì thế, một thời gian nuôi cấy trƣớc lúc chín là cần thiết để
cho phép các trứng từ những nang nhỏ hơn đạt tới giai đoạn có thể so sánh với trứng thu
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

13


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
từ những nang lớn hơn.
Hiện nay, theo các quy trình IVF thƣờng quy ở động vật hữu nhũ, các nang trứng
có đƣờng kính 2-8mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng đƣợc sử dụng cho việc thu
nhận các trứng chƣa chín (Long và cs, 1993; Miyoshi và cs, 1999).
1.7.3. Phương pháp chọn tế bào trứng cho IVM[4]
Ngƣời ta nhận thấy, tế bào trứng thu từ các nang sơ cấp và nuôi ở điều kiện không
có lớp tế bào hạt (cumulus) sẽ tăng trƣởng không tốt. Ngƣợc lại, khi trứng còn đƣợc bao
quanh bởi các tế bào hạt thì khả năng tăng trƣởng rất tốt. Trong điều kiện này, các tế bào
hạt còn kết dính với tế bào trứng thông qua các điểm nối mà qua đó trứng có đƣợc khả
năng tăng trƣởng và trở thành hoàn chỉnh để trải qua sự trƣởng thành về nhân. Vì thế,
trong những hệ thống IVM các mối tƣơng tác giữa trứng và tế bào hạt luôn đƣợc duy trì.

Do đó, sự hiện diện các tế bào hạt là tiêu chuẩn để lựa chọn các tế bào trứng cho quy
trình IVM.
Trên cơ sở đó, cách phân loại trứng thu nhận từ buồng trứng đƣợc dựa trên độ dày,
mỏng của tế bào hạt bao quanh trứng. Trứng đƣợc phân làm 3 loại:
 Loại A: có từ 3-5 lớp tế bào cumulus bao kín quanh tế bào trứng.
 Loại B: có ít hơn 3 lớp tế bào cumulus bao quanh một phần tế bào trứng.
 Loại C: không có lớp tế bào cumulus bao quanh
Ở nhiều phòng thí nghiệm, trứng đƣợc lựa chọn cho quá trình IVM thƣờng có từ
ba hoặc nhiều hơn các lớp tế bào cumulus bao quanh (trứng loại A và B). Ở một mức độ
nhất định, mức độ dãn nở của cumulus có thể là một chỉ số của sự nuôi chín thành công
nhân và tế bào chất [6].

Hình 1.5. Sự phân loại trứng thu nhận từ buồng trứng
1.7.4. Cơ sở đánh giá sự trưởng thành của trứng[6], [10], [12]
Nhìn chung, quá trình nuôi chín tế bào trứng có thể chia làm hai giai đoạn, đó là
giai đoạn chín nhân và chín tế bào chất:
 Chín nhân là thuật ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm nhiễm và
những chuyển biến đến giai đoạn M II.
 Chín bào tƣơng là thuật ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự chuẩn bị
cho trứng thụ tinh và phát triển trƣớc làm tổ, định vị lại các tiểu thể của bào
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

14


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
tƣơng, nhƣ ty thể và các tế bào hạt vỏ (cortical granules).
Sự chín nhân đƣợc xác định bởi sự phát triển của thoi vô sắc giai đoạn M II từ túi
mầm.Theo Motlik và Fulkal (1976), đặc điểm hình thái của giai đoạn túi mầm (germinal
vesicle stage) đƣợc lựa chọn để đánh giá sự chín invitro của trứng. Do đó, sự xuất hiện

thể cực là một tiêu chuẩn quan trọng cho việc đárih giá giai đoạn phát triển. Đồng thời, để
xác định sự trƣởng thành tế bào chất, cần có những đo lƣờng gián tiếp thông qua hàm
lƣợng Glutathione (GSH) bên trong tế bào.Sự tổng hợp GSH trong khi nuôi chín tế bào
trứng là điều kiện tiên quyết cho quá trình làm loãng nhiễm sắc chất ở nhân tinh trùng
chuột và sự hình thành tiền nhân đực thành công.
1.7.5. Thành phần môi trường nuôi chín trứng in vitro[2] [10] [14] [20]
1.7.5.1. Thành phần chính
- Nƣớc
Nƣớc là thành phần chính cho mọi môi trƣờng. Chất lƣợng của nƣớc rất quan
trọng, nƣớc có chất lƣợng tốt phải qua hệ thống chƣng cất, siêu lọc nhằm loại bỏ các chất
khoáng và các loại ion tồn tại trong nƣớc.
- Nguồn năng lƣợng
Thực nghiệm cho thấy glucose, lactate, pyruvate là nguồn cơ chất năng lƣợng
ngoại sinh quan trọng nhất cho trứng và phôi.Tuy nhiên, tùy giai đoạn phát triển mà trứng
hoặc phôi có nhu cầu năng lƣợng với từng cơ chất khác nhau.
- Nguồn Protein
Vai trò của protein trong môi trƣờng nuôi không chỉ là nguồn đạm có sẵn mà còn
là chất hấp thụ ion kim loại độc.
Huyết thanh
Một số loại thƣờng sử dụng: huyết thanh bào thai bò (Fetal calf serurn- FCS) huyết
thanh bò động dục, huyết thanh bò trƣởng thành (Bovine adult serum-BSA).
Albumine huyết thanh (Serum albumine): nếu không bổ sung huyết thanh vào môi
trƣờng nuôi, ngƣời ta có thể bổ sung protein dƣới dạng alburnine. Albumine huyết thanh
bò (BSA) là loại thƣờng sử dụng.
Hai nguồn protein trên cần đƣợc lựa chọn phù hợp mục đích sử dụng:
Theo kết quả nghiên cứu của Zhang và Sirard, việc bổ sung BSA trong môi trƣờng
nuôi trứng không cung cấp khả năng nở rộng các tế bào cumulus và sự chín của trứng so
với khi bổ sung FCS. Những kết quả tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận trên bò, chuột và
thỏ.Qua đó cho thấy, trong FCS hiện diện một số yếu tô có khả năng tái lập lại quá trình
phân bào giảm nhiễm và cung cấp khả năng chín của các tế bào trứng ở điều kiện in vitro.

Theo nghiên cứu ở chuột, nếu bổ sung huyết thanh trong môi trƣờng nuôi trứng sẽ
ngăn cản màng trong suốt (zona pellucida) khỏi sự cứng hóa (hardening). Ngƣợc lại,
trong môi trƣờng có bổ sung BSA, sự cứng hóa màng zona xảy ra và sự xâm nhập tinh
trùng bị cản trở. Do đó, BSA đƣợc sử dụng nhƣ biện pháp ngăn cản sự xâm nhập đa tinh
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

15


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
trùng trong các quy trình thụ tinh in vitro.
Cơ chế của sự làm cứng màng trong suốt là do sự chuyển dạng của một
glycoprotein ở màng từ dạng ZPZ sang dạng ZPZf đƣợc điều khiển bởi một protease do
các tế bào hạt vỏ giải phóng. Chất Fetuin đƣợc biết là một glycoprotein chính trong FCS
có khả năng ức chế sự cứng màng trong suốt của trứng chuột do ngăn cản sự chuyển đổi
của ZPZ thành ZPZf.
- Muối
Đây là thành phần rất quan trọng trong nuôi trứng và phôi nhằm đảm bảo áp suất
thẩm thấu.Có nhiều ion chịu trách nhiệm cho sự điều hòa này, nhƣng chủ yếu Na+,
K+.Hàm lƣợng các ion trong môi trƣờng đƣợc dựa trên thành phần các chất khoáng trong
huyết tƣơng máu.
- Hệ đệm
Hệ đệm thông dụng nhất là bicacbonat dƣới 5% CO2.Cơ chế của hệ đệm này giống
với cơ chế hệ đệm sinh lý trong máu.
- Kháng sinh
Kháng sinh đƣợc sử dụng nhằm hạn chế sự nhiễm nấm mốc, nhiễm khuẩn.Các
kháng sinh thƣờng sử dụng là Penicillin, Streptomycin và Gentamycin.
1.7.5.2. Các thành phần bổ sung [12], [56]
- Hormone
Nhìn chung, hầu hết các môi trƣờng IVM heo đều đƣợc bổ sung hormone, đặc biệt

là LH/FSH, và các yếu tố sinh trƣởng khác. Theo Mattioli và cs (1991), tỷ lệ trứng chín
tăng lên đáng kể khi có LH (76%) và FSH (86%) so với khi không bổ sung (35%).
Có nhiều báo cáo cho rằng, hormone trong môi trƣờng nuôi chín không chỉ làm dễ
dàng cho quá trình phân bào giảm nhiễm mà còn ảnh hƣởng đến quá trình chín tế bào
chất của các trứng heo ở điều kiện in vitro.Ngƣợc lại, một số báo cáo cho rằng các tế bào
trứng heo có thể trải qua giai đoạn GVBD trong môi trƣờng không có hormone. Vì thế,
hormone cần đƣợc bổ sung hay không vào môi trƣờng nuôi trứng chín vẫn còn là vấn đề
cần tranh luận.
Gần đây, Funahashi và cs (1994) đã báo cáo về sự vắng mặt của các hormone
(PMSG và estradiol) giữa mốc thời gian 20 giờ và 24 giờ nuôi trứng chín đã có hiệu quả
đối với sự phân bào giảm nhiễm và sự chín tế bào chât của các trứng heo in vitro. Nhƣ
vậy, các trứng heo có thể hoàn tất sự chín in vitro ở điều kiện không có sự bổ sung
hormone vào môi trƣờng nuôi chín.
- Dịch nang trứng [19], [18]
Các tác giả, Naito và cs (1988), Yoshida và cs (1992), Funahashi & Day (1993),
Long và cs (1999) đã xác định tác dụng của dịch nang trứng lên khả năng chín in vitro
của các tế bào trứng khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi.
Kết quả phân tích dịch nang trứng của heo (porcine iollicular fluid -PFF) cho thấy
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

16


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
sự hiện diện của những thành phần có tính acid, có trọng lƣợng phân tử 10.000 200.000.Các thành phần này đƣợc biết có vai trò điều khiển quá trình chín của trứng
(Yoshida và cs, 1992), cải thiện tỷ lệ mở rộng các tế bào cumulus, sự chín của nhân, sự
thụ tinh và sự phát triển bình thƣờng của phôi. Sato và cs (1987, 1990) đã tìm thấy từ
dịch nang trứng chất glycosaminoglycan (GAG) có tác dụng ngăn cản sự thoái hóa của
các tế bào trứng heo sau hiện tƣợng tan biến túi mầm.
Westergaard và cs (1984) đã chứng minh trong dịch nang trứng của ngƣời có chứa

cơ chất có khả năng cảm ứng quá trình phân bào giảm nhiễm các tế bào mầm phôi chuột.
1.7.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả IVM
1.7.6.1. Thời gian thu nhận mẫu buồng trứng
Nhìn chung, buồng trứng của heo trƣớc thành thục về tính dục đƣợc thu nhận từ lò
mổ là nguồn tế bào trứng cho các kỹ thuật IVM. Nhiệt độ vận chuyển và thời gian từ khi
buồng trứng đƣợc thu nhận đến khi hút tế bào trứng có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng
trứng. Vì thế, duy trì khả năng sống của tế bào trứng trong quá trình này là cực kỳ quan
trọng để đạt đƣợc việc nuôi chín tế bào trứng thành công. Thông thƣờng, buồng trứng
đƣợc giữ ấm (37- 39°C) trong dung dịch sinh lý hay PBS có bổ sung kháng sinh, đƣợc
chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian nhanh nhất (1-2 giờ).
1.7.6.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng [11]
- Sự trƣởng thành của động vật giết mổ
Theo Nottle và cs (1997), các trứng thu nhận và cho thụ tinh từ các con heo cái
trƣởng thành có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro hơn so với trứng thu từ các
con chƣa trƣởng thành.
- Stress
Các yếu tố gây stress của môi trƣờng nhƣ nhiệt độ quá cao có thể ảnh hƣởng sự
sinh sản của cả heo đực và cái. Theo Wetterman và Bazer (1985), nhiệt độ cao có thể
thay đổi sự tăng trƣởng của nang trứng và điều này làm giảm chất lƣợng trứng.
- Dinh dƣỡng cá thể cái
Theo Ashworth và cs (1999), trứng đƣợc nuôi chín trong môi trƣờng dịch nang
trứng thu nhận từ heo cái cho ăn đầy đủ có tỷ lệ chín nhân cao hơn so với các trứng đƣợc
nuôi với dịch nang thu từ các heo cái cho ăn hạn chế. Điều này cho thấy, dinh dƣỡng đã
ảnh hƣởng lên sự tiết của dịch nang và chất lƣợng trứng.
1.8. Thu nhận giao tử đực[1], [6]
Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các tế bào trứng đã đƣợc thực hiện với
tinh tƣơi hay tinh đông lạnh qua giải đông, ở nhiều phòng thí nghiệm, do khó khăn trong
bảo quản lạnh, nên tinh dịch tƣơi vẫn là một nguồn tinh trùng chính cho các nghiên cứu
IVF. Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tƣơi có một số thành phần không có lợi
cho hoạt động của tinh trùng.

1.8.1. Cơ sở của quá trình thu nhận tinh trùng
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

17


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tinh trùng là những tế bào chuyên hóa cao độ để hoàn thành mục tiêu chính là thụ
tinh cho trứng.Trong sự thụ tinh, để tiếp cận đƣợc với trứng, tinh trùng phải lƣu chuyển
qua nhiều môi trƣờng khác nhau. Do đó, khả năng hoạt động là cần thiết cho quá trình
này. Trong đó, khả năng hoạt động tiến thẳng đƣợc xem là biểu hiện sự thành thục của
tinh trùng về hình thái và trao đổi chất.
1.8.2. Các phương pháp thu nhận tinh trùng[13], [9]
1.8.2.1. Giới thiệu
Tinh trùng cần đƣợc tách khỏi tinh tƣơng để sử dụng với nhiều mục đích khác
nhau nhƣ: (1) thử nghiệm chẩn đoán chức năng của tinh trùng và (2) điều trị vô sinh
thông qua các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART). Với mục đích thứ nhất, tinh trùng cần phải
đƣợc tách ra khỏi tinh tƣơng trong vòng 1 giờ sau khi xuất tinh nhằm hạn chế tối đa các
tổn hại đến tinh trùng do các sản phẩm của các tế bào lạ (không phải tinh trùng) gây ra.
1.8.2.2. Mục đích
Trong giao hợp tự nhiên, tinh tƣơng giúp tinh trùng thâm nhập vào chất nhầy cổ tử
cung (Overstreet và cs, 1980). Tuy nhiên, trong điều trị vô sinh bằng các kỹ thuật ART
khi rào cản tự nhiên bị phá vỡ thì một số thành phần của tinh tƣơng (nhƣ kẽm,
prostaglandins) lại gây trở ngại cho việc có thai.
Mục đích của việc phân tách tinh trùng ngƣời khỏi tinh dịch là thu đƣợc mẫu cô
đặc, chứa tỷ lệ phần trăm tinh trùng di động và hình dạng bình thƣờng cao, đồng thời loại
bỏ các mảnh vỡ, tế bào lạ và các tinh trùng chết.
Đối với những mẫu tinh dịch bình thƣờng chỉ cần pha loãng tinh dịch với môi
trƣờng nuôi cấy và ly tâm. Tinh trùng chuẩn bị theo phƣơng pháp này thƣờng đƣợc dùng
trong IUI (Boomsma và cs, 2004). Tuy nhiên, khi mẫu có một hoặc vài thông số bất

thƣờng trong tinh dịch đồ thì cần sử dụng phƣơng pháp ly tâm trên thang nồng độ không
liên tục hoặc swim-up trực tiếp.
1.8.3. Các yêu cầu của quá trình chuẩn bị tinh trùng
Các yêu cầu cần thực hiện trong điều kiện in vitro:
 Trong môi trƣờng hoạt hóa cần có sự hiện diện các thụ quan của
cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc albumine huyết thanh bò hoặc ngƣời
(bovine serum albumin -BSA hoặc human serum albumin -HSA), sẽ thực
hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng. Huyết thanh có hiệu quả
hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumine
và dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận
cholesterol.
1.9. Hệ thống thụ tinh và nuôi phôi invitro

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

18


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hình 1.6.Quá trình xâm nhập của tinh trùng vào noãn
1.9.1. Hệ thống thụ tinh invitro
1.9.1.1. Điều kiện
- Nhiệt độ [1]
Nhiệt độ ủ trong quá trình thụ tinh là nhân tố quyết định cho tỷ lệ thụ tinh, nếu
37°C thích hợp cho các noãn bào chuột và ngƣời thì nhiệt độ ấy lại không phù hợp cho
những loài gia súc có nhiệt độ cơ thể 38-39°C.
- Thời gian thụ tinh [10]
Cơ hội thụ tinh và sự phát triển sẽ tốt nếu tiến hành thụ tinh cho trứng khoảng 4
giờ sau khi hình thành thể cực đầu tiên.

- Khả năng duy trì sự thụ tinh của tinh trùng
Các tinh trùng heo đƣợc hoạt hóa sẽ có khả năng thụ tinh in vitro cho các trứng
trong vòng 2,5 giờ sau sự xâm nhập của chúng vào các tế bào trứng (theo Nagai và cs,
1993). Có nhiều yếu tố cần thiết giúp chúng có thể duy trì khả năng thụ tinh nhƣ tỷ lệ về
khả năng xâm nhập vào trứng phải lớn hơn 50% sau 2 giờ đƣợc bổ sung vào môi trƣờng
có các tế bào trứng (Mori và cs, 1995).
- Mật độ tinh trùng
Trong số tinh trùng đƣợckiện toàn năng lực thụ tinh invitro, ngƣời ta không xác
định đƣợc tỷ lệ tinh trùng thực sự đƣợc hoạt hóa. Do đó, trong các quá trình thụ tinh, tinh
trùng thƣờng đƣợc sử dụng với một lƣợng rất lớn (vài triệu tinh trùng/ml). Điều này gây
ra tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng trong điều kiện invitro cao hơn nhiều lần so với trong điều
kiện in vivo.Ngoài ra, quá nhiều tinh trùng sẽ gây ảnh hƣởng xấu đối với sự phát triển của
phôi giai đoạn sớm.
- Loại tinh trùng chết ra khỏi môi trƣờng sau khi thụ tinh [6]
Các nghiên cứu của Grupen và Nottle (2000) cho thấy sự hiện diện của tinh trùng
chết trong môi trƣờng sau thời gian thụ tinh sẽ ảnh hƣởng đến sự phát triển phôi. Do đó,
cần chuyển tế bào trứng cùng với tinh trùng bám vào màng trong suốt khỏi phần tinh
trùng đã chết để tránh tác động oxy hóa của các sản phẩm trao đổi của tinh trùng lên sự
phát triển phôi.
- Môi trƣờng [6]
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

19


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Hầu hết các môi trƣờng IVF heo đƣợc bổ sung caffein, một chất ức chế
phosphodiesterase đƣợc biết làm tăng nồng độ cAMP nội bào.
Ngoài những thành phần đƣợc bổ sung trong IVF, loại môi trƣờng nuôi cấy cũng
ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ tinh đa tinh trùng. Martinez-Mardrid và cs (2001) đã sử dụng hai

môi trƣờng IVF khác nhau, môi trƣờng đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trƣờng Tyrode
cải tiến (mTALP) để so sánh về tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng và tỷ lệ thụ tinh đa tinh
trùng.So với mTBM, trong mTLAP cho tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng cao hơn (92-94%
so với 61-77%).Vì thế, lựa chọn môi trƣờng IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng
để giảm tối thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhƣng đạt tỷ lệ thụ tinh cao.
1.9.1.2. Đánh giá sự thụ tinh [10]
Ở các tế bào trứng, 12-20 giờ sau thụ tinh sẽ xuất hiện 2 tiền nhân chứng tỏ hiện
tƣợng thụ tinh đã xảy ra về mặt hình thái và vi thể. Tuy nhiên, có hay không có tiền nhân
không phải là một bằng chứng chắc chắn.Sự phân chia tế bào cũng là một trong những
bằng chứng của sự thụ tinh.
1.9.2. Hệ thống nuôi phôi [15]
Việc nuôi phôi có thể sử dụng một số phƣơng thức khác nhau nhƣ nuôi cấy in vivo
trong ống dẫn trứng của một con vật thay thế nhƣ thỏ, cừu hoặc chuột; nuôi cấy phôi với
các tế bào sinh dƣỡng bổ sung vào môi trƣờng nuôi; hoặc nuôi trong các môi trƣờng xác
định.
1.9.2.1. Hệ thống nuôi phôi in vivo[14]
Các phôi heo có thể đƣợc nuôi trong bộ phận sinh sản của các loài khác.
Các phôi giai đoạn sớm có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang khi nuôi trong
đoạn thắt ống dẫn trứng của cừu (Prather và cs, 1991). Tỷ lệ thu nhận phôi phát triển
trong ống dẫn trứng cừu đạt tỷ lệ cao (83%). Ngƣợc lại, đoạn thắt ống dẫn trứng của thỏ
lại không phù hợp cho sự phát triển của phôi heo (Herrmann và Holtz, 1985).Ống dẫn
trứng chuột có khả năng sử dụng để nuôi phôi heo trong một khoảng thời gian dài.Nhƣng
ống dẫn trứng chuột chƣa trƣởng thành không cung cấp sự phát triển phôi heo vƣợt qua
giai đoạn 4 tế bào (Ebert và Papaioannou, 1989).
1.9.2.2. Hệ thống nuôi phôi trong môi trƣờng xác định [6], [14]
Môi trƣờng nuôi cấy các phôi sau thụ tinh cũng bao gồm những thành phẩn chính
nhƣ các môi trƣờng nuôi trứng nhƣng không bổ sung hormone. Trong nuôi phôi, vấn đề
bảo đảm áp suất thẩm thấu rất đƣợc quan tâm. Do đó, các yếu tố bảo vệ áp suất thƣờng
đƣợc sử dụng nhƣ taurine, hypotaurine, sorbitol. Ngoài ra, huyết thanh thƣờng sử dụng
với hàm lƣợng cao hơn so với trong môi trƣờng nuôi trứng nhằm kích thích khả năng

phân chia của các nguyên bào phôi, đặc biệt trong các giai đoạn phát triển muộn của phôi
(từ giai đoạn phôi dâu trở lên).
Nghiên cứu trên các động vật thí nghiệm nhƣ chuột và chuột đồng hamster đã
làm tiền đề cho các ứng dụng trên phôi heo. Kết quả ghi nhận từ nghiên cứu trên
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

20


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
chuột hamster cho thấy glucose và phosphate gây ức chế, thậm chí gây hiện tƣợng
“block” trong quá trình phát triển in vitro của phôi. Kết quả tƣơng tự cũng đƣợcghi
nhận trên các phôi chuột nhắt (Chatot và cs, 1989), chuột cống (Reed và cs, 1992), bò
(Ellington và cs, 1990; Moore và Bondioni, 1993) và heo (Petter và cs, 1990; Misener
và cs, 1991).
Một số các thí nghiệm đƣợc thực hiện và kết quả ghi nhận rằng: nên thay đổi
một số thành phần trong môi trƣờng nuôi cấy phôi heo. Các phôi heo có thể phát triển
từ giai đoạn một tế bào trong môi trƣờng có sử dụng glutamine hoặc glucose nhƣ là
nguồn cơ chất năng lƣợng ngoại bào duy nhất (Petter và cs, 1990).
Các mức độ cao về khả năng phát triển phôi đã đƣợc ghi nhận ở một loại môi
trƣờng đƣợc thiết kế, gọi là môi trƣờng NCSU-23 (North Carolina State
University).Trong môi trƣờng này có chứa taurine và hypotaurine (Petter và Reed,
1991; Reed và cs, 1992) là các chất có tiềm năng bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào.

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

21


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

22


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

2.1. Nguồn mẫu
Tinh trùng đƣợc thu nhận từ heo đực giống tại Viện chăn nuôi quốc gia (Dƣơng
Quản Hàm - Gò Vấp – TP. Hồ Chí Minh).
Buồng trứng heo đƣợc thu nhận từ lò mổ địa phƣơng (Sơn Kỳ - Tân Phú – TP. Hồ
Chí Minh)

Ảnh 2.1. Mẫu tinh heo

Ảnh 2.2. Mẫu buồng trứng

2.2. Dụng cụ và thiết bị sử dụng
2.2.1. Dụng cụ
 Dụng cụ cố định:
- Micropipette NIC – NPX 100 (10-100µl) (Nichiryo, Nhật Bản).
- Hộp đựng đầu côn (Biohit, Nhật Bản).
- Buồng đếm hồng cầu: buồng đếm Neubauer cải tiến, có lamelle
phủ dày (độ dày số 4, 0.44mm).
- Bút bi / Bút chì.

- Đĩa 4 giếng
- Pipette nhựa
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

23


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

-

Dụng cụ tiêu hao:
Găng tay dùng 1 lần.
Lọ đựng mẫu tinh dịch: Lọ dùng một lần có miệng rộng và có vạch chia thể tích.
Giấy đo pH.
Lame kính (Sail Brand, Trung Quốc).
Đầu côn vàng, xanh.
Ống nghiệm nhỏ (15cm)
Khăn: không có xơ vải.
2.2.2. Thiết bị
Máy ly tâm Rotofix 32 (Hettich Zentrifugen, Đức).
Kính hiển vi quang học CX21 (Olympus, Nhật Bản).
Tủ ấm Ine 400 (Memmert, Đức).
Thùng rác: thùng bỏ các vật sắc, nhọn; thùng chứa rác y tế, nguy hiểm.

2.3. Hóa chất
-

Môi trƣờng đệm mPBS
Môi trƣờng KSOM

Môi trƣờng M16
Môi trƣờng KSOM bổ sung 20% dịch nang trứng
Môi trƣờng NaHCO3 0.5%
Alcool 700
Alcool 900
Môi trƣờng EBSS

2.4. Thực nghiệm 1: Thu nhận giao tử đực và cái
2.4.1. Thu nhận giao tử đực

SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

24


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Mẫu tinh dịch

100
80

Đo thể tích
60

East
West

40

North

Bỏ vào
tủ ấm (37oC)
20
0

30 -60 phút

1st Qtr 2nd Qtr 3rd Qtr 4th Qtr

Sự ly giải

Độ nhớt

Có

Phá nhớt

Tính chất tổng quát (màu sắc)
5 phút
Đo pH tinh dịch

Tạo tiêu bản tƣơi:
- X10: Hiện tƣợng kết dính, kết đám, tế
bào lạ.
- X40: Đánh giá độ di động, xác định độ
pha loãng.

15 phút

Tạo tiêu bản nhuộm Eosin-Nigrosin, xác
định tỷ lệ sống của tinh trùng.
Pha loãng, xác định mật độ tinh trùng, tổng
số tinh trùng/lần xuất tinh.
10 phút

Kết quả

Sơ đồ 2.1. Quy trình đánh giá chất lượng tinh trùng heo
SVTH: NGUYỄN THANH VŨ

25