Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của endo β1,4glucanase tái tổ hợp trong nấm men Pichia Pastoris

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA SINH HỌC
-----o0o----BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
NĂM 2015

Tên đề tài:

Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của
endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong
nấm men Pichia Pastoris

Cán bộ cố vấn khoa học:

GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc

Chủ nhiệm đề tài:

Ngô Thị Thuỳ Dung

Thừa Thiên Huế, 12 /2015

[Đề tài khoa học]

Page 1


LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ

khi bắt đầu thực hiện đề tài này đến nay, ngoài sự nổ lực của bản thân, chúng em đã nhận
được sự giúp đỡ nhiệt tình của các quý thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học,
Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Huế và Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế
đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng em thực hiện đề tài này, chúng em xin chân thành
cảm ơn.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất chúng em xin gửi đến thầy Nguyễn Hoàng Lộc, thầy
Nguyễn Đức Huy và thầy Nguyễn Ngọc Lương đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên
và giúp chúng em hoàn thành tốt đề tài này.
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân và bạn bè của mình đã
khích lệ, động viên tinh thần cho chúng em trong suốt thời gian học tập và làm việc.
Trong quá trình thực hiện đề tài, bước đầu làm quen với các kĩ thuật có thể mắc nhiều sai
sót, chúng em sẽ cố gắng hoàn thiện mình để ngày một trưởng thành hơn. Với vốn kiến
thức được tiếp thu trong quá trình thực hiện đề tài không chỉ là nền tảng cho quá trình
nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quý báu để chúng em bước vào đời vững chắc và
tự tin.
Sau cùng, chúng em xin kính chúc quý thầy cô trong Khoa Sinh học và GS.TS
Nguyễn Hoàng Lộc thật dồi dào sức khỏe và thành công để tiếp tục thực hiện sứ mệnh
cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!
Huế, ngày tháng năm 2015
Sinh viên

[Đề tài khoa học]

Page 2


MỤC LỤC
Contents

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu hình, bảng
Hình 1.1

Tên hình, bảng
Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong
phức hệ cellulase

Trang
04

Hình 1.2

Trình tự amino acid tương ứng với cấu
trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng
vi sinh vật [55].

06

Hình 1.3

Cấu trúc không gian từ trên xuống (A)
và từ bên sang (B)
của Cel12A từ H. Grisea [67]

07

Hình 1.4

Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất

của Cel12A từ H. Grisea

08

Hình 1.5

Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức
hệ cellulose (B) của cellulose [45].

09

Hình 2.1

[Đề tài khoa học]

Trình tự gen Glu1-TA

Page 3

28


Hình 2.3

Vector pPICZα A (Invitrogen)

29

Hình 2.4

Đường chuẩn glucose

30

Hình 3.1

Các khuẩn lạc dùng để chọn lọc

33

Hình 3.2

Ảnh hưởng của nồng độ methanol đến
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase của P.pastoris tái tổ hợp

34

Hình 3.3

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase của P.pastoris tái tổ hợp

35

Hình 3.4

Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase của P.pastoris tái tổ hợp

36

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt/ký hiệu

Tên đầy đủ

Bp

base pair

Glu

glucanase

dNTPs

deoxyribonucleic triphosphate

EDTA

ethylennediaminetetraacetic acid

EtBr

ethidium bromide

LB

môi trường Luria Bertani

OD

optical density (mật độ quang)

PCR

polymerase chain reaction (khuếch đại DNA)

RE

restriction endonuclease (enzyme cắt hạn chế)

TAE

đệm Tris - acetate - EDTA

TE

đệm Tris - EDTA

[Đề tài khoa học]

Page 4


YPD

môi trường yeast extract - peptone - dextrose

YPDS

môi trường yeast extract - peptone - dextrose - sorbitol

IPTG

isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside

SCP

single cell protein

MCS

multiple cloning site

ORF

open reading frame

PC

positive control

NC

negative control

YP

yeast extract - peptone

YPG

môi trường yeast extract - peptone – glycerol

[Đề tài khoa học]

Page 5


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tương tự
khác. Cellulose được chia thành ba dạng sau: dạng một là endoglucanase hoặc 1,4-β-Dglucan-4-glucanohydrolase hoặc carboxylmethylcellulase (endo-β-1,4-glucanase, EC
3.2.1.4, viết tắt là EG hoặc CMCase); dạng hai là exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan
glucanohydrolase (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ;
dạng ba là glucosidase hoặc D-glucoside glucohydrolase, (EC 3.2.1.21). Endoglucanase
thủy phân liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở
đầu khử và đầu không khử cellulose. β-glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và
cellobiose thành glucose. Hệ enzyme cellulase được phát hiện ở nhiều sinh vật khác nhau
như ở thực vật, động vật, côn trùng, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong đó, cellulase ở
nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là phổ biến nhất. Nhiều loài thuộc các chi Trichoderma,
Aspergillus,

Penicillium,

Fusarium,

Phanerochaete,

Clostridium,

Cellulomonas,

Thermobifida, Streptomyces... có khả năng tiết cellulase ngoại bào lớn đã được nghiên
cứu rộng rãi [18].
Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt
may, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản
xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy… và đặc biệt trong công nghệ xử lý rác
thải, sản xuất phân bón vi sinh [20] .
Tiềm năng ứng dụng của cellulase là rất lớn, đặc biệt là endo β-1,4-glucanase. Do đó, cần
có các phương pháp thích hợp để sản xuất chúng ở qui mô công nghiệp. Công nghệ DNA
tái tổ hợp với việc chọn lọc các gen mã hóa endo β-1,4-glucanase từ các đối tượng có khả
năng tổng hợp cellulase mạnh để tạo dòng và biểu hiện trong các vật chủ thích hợp nhằm
tạo ra một lượng lớn cellulase tái tổ hợp có hoạt tính cao được coi là phương thức có triển
[Đề tài khoa học]

Page 6


vọng và khả thi nhất. Hiện nay, ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về
enzyme này từ chủng Trichoderma asperellum mà chủ yếu tập trung vào các chủng
Aspergillus. Bên cạnh đó năng suất tổng hợp enzyme endo β-1,4-glucanase ở
T.asperellum còn thấp (0.09 U/ml).
Việc tạo dòng gene và tổng hợp enzyme endo β-1,4-glucanase dị chủng ở nấm
Pichia Pastoris sẽ giúp gia tăng sản lượng và do đó góp phần làm giảm giá thành của

enzyme này. Tuy nhiên kết quả sơ bộ cho thấy hiệu suất tổng hợp endo β-1,4-glucanase
tái tổ hợp không cao hơn so với hiệu suất sản xuất từ Trichoderma asperellum). Vì vậy
một trong những giải pháp để tăng hiệu suất là cải thiện hiệu suất biểu hiện bằng cách tối
ưu hóa điều kiện biểu hiện. Xuất phát từ ý nghĩa trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong
nấm men Pichia Pastoris ”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Cải thiện mức độ biểu hiện của endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong nấm men
Pichia Pastoris như tối ưu hóa nhiệt độ cảm ứng và hàm lượng chất cảm ứng.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Enzyme endo-β-1,4-glucanase tái tổ hợp từ chủng Pichia Pastoris.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Nội dung: Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của endo β-1,4-glucanase tái tổ
hợp trong nấm men Pichia Pastoris .
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường
đại học Khoa học, Đại học Huế. Thời gian: Từ 1/2015-12/2015

[Đề tài khoa học]

Page 7


4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
4.1. Ý nghĩa khoa học
Cải thiện mức độ biểu hiện ngoại bào của endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong
nấm men Pichia Pastoris .
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Enzyme endo β-1,4-glucanase tiết ra môi trường ngoại bào mạnh có khả năng

phân hủy được cơ chất cellulose hiệu quả cao, ứng dụng trong xử lý môi trường và các
ngành công nghiệp khác nhau.

[Đề tài khoa học]

Page 8


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-Oglucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ
gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay
cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC
3.2.1.21). Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ
có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.

Hình 1.1. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là một trong ba dạng cellulase. Chúng thuộc
nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử cellulose,
oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác để giải phóng ra
[Đề tài khoa học]

Page 9


cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh mẽ trên
cellulose vô định hình [3].
Endo-β-1,4-glucanase được tạo ra từ các loài khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A. oryzae có khối lượng phân tử

khoảng 34 kDa và 62 kDa [77], chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa [41],
chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa [57], chủng A. terreus M11 khoảng 25 kDa
[30].

1.1. Cấu trúc bậc một
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc
khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượngphân tử, thành
phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Chủng A. oryzae
KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử
protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lượng phân tử 31 kDa, được xếp vào họ
cellulase H. Trong khi đó, Cel B được xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino
acid và khối lượngphân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus bao gồm
410 amino acid với khối lượngphân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các endoglucanase từ
chủng A. niger Z10 có khối lượngphân tử 83 kDa và 50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa
[29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và 55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối
lượng 35 kDa [56].
Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A thuộc
họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt Humicola grisea. Cel12A của H. grisea
là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid (Hình 1.2) [55].

[Đề tài khoa học]

Page 10


Hình 1.2. Trình tự amino acid tương ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số
chủng vi sinh vật [55].

[Đề tài khoa học]

Page 11


1.2. Cấu trúc không gian
Phân tử Cel12A được cấu tạo bởi 15 chuỗi β tạo thành 2 phiến gấp nếp β là A và
B. Phiến A gồm 6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B gồm 9 chuỗi β (B1-B9). Hai phiến này
xếp chồng lên nhau thành hình bánh kẹp. Bề mặt lõm của phiến B tạo nên khe dài 35 Å
để liên kết với cơ chất, khe này chạy dọc bề mặt của enzyme. Trung tâm hoạt động của
enzyme là hai gốc glutamyl 120 và 205 ở chủng H. grisea. Sáu gốc phía ngoài phân bố
phía trên phân tử giống như gài các amino acid tự do. Hai trong số các gốc đó nằm ở đầu
nitơ. Các dải xoắn β được nối với nhau bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với các gốc từ 2932, 40-47, 92-96 và 165-169; các vùng này nối tiếp tương ứng với chuỗi β: B2 đến A2,
A2 đến A3, A5 đến B5 và A6 đến B7. Ba gốc cysteine là C175, C206 và C216 được định
vị trên chuỗi β là A6, B4 và A4. Các chuỗi bên tập trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi
mà bề mặt xúc tác được tăng lên (Hình 1.3).

Hình 1.3. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B)
của Cel12A từ H. Grisea [67]

Gốc cysteine 175 nằm ở chuỗi β A6 trên phiến nhỏ A và tạo ra mấu lồi ở bề mặt
của enzyme gần cấu trúc xoắn α. Chuỗi bên ở trong lõi giữa hai phiến β, liên kết với 6
amino acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180 bằng lực vanderval. Liên kết giữa các
amino acid có kích thướctừ 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A). Gốc cysteine 206 nằm gần trung
tâm xúc tác Glu 205 trên chuỗi B4. Đầu của chuỗi bên ở lõi phiến β, nơi có hệ thống
[Đề tài khoa học]

Page 12


tương tác chặt chẽ với các chuỗi bên của 8 gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 và
T204; cùng với sự tách rời giữa các nguyên tử trong chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.4B).

Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của
enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dưới điểm hoạt động, nơi
tương tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thước từ 3,3
đến 4,8 Å (Hình 1.4C).

Hình 1.4. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea

1.3. Cơ chế xúc tác
Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các
loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành
glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng
enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo
những cách khác nhau. Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi
này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra
glucose [45] (Hình 1.5).

[Đề tài khoa học]

Page 13


Hình 1.5. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulose [45].

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác như exo-β-1,4-glucozidase
(cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase
tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau
đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các cello
oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo
thành glucose (Hình 1.1).
2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE

2.1 Nguồn gốc:
Endo-β-1,4-glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự
nhiên, mà chủ yếu là từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ

[Đề tài khoa học]

Page 14


khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase [4].
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật như chi
Arabidopsis [19], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác
như mối [71], ở động vật thân mềm như Mytilus edulis [76].
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp
enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme có
nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản
xuất các chế phẩm enzyme. Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản
xuất enzyme với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động
tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật sinh
trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé,
nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme
khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh,
vượt xa các sinh vật khác. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh
vật làm nguồn enzyme [15].
Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng
nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những
điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính
xúc tác cao. Có thể nói rằng, với vi sinh vật, người ta có thể điều khiển sự tổng hợp
enzyme dễ dàng hơn trên các đối tượng khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc
tổng hợp định hướng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh

vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp.
2.1.1 Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của
hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử
cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác để giải phóng ra
cellulosedextrin, cellobiose và glucose.
[Đề tài khoa học]

Page 15


Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc
1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase
thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan
cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là β- glucosidase hoặc βglucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong
phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase
thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra
glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) [45].
2.1.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử
Endo-β-1,4-glucanase được phân chia dựa vào đặc điểm phân tử như khối lượng
phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể. Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid
chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose được chia làm 3 nhóm là Cel-1,
Cel-2 và Cel-3.
Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lượng là 62
kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là
QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tương đồng 72% với
cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình tự amino acid của Cel-3 có độ
tương đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối
lượng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC
3.2.1.21) có khối lượng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do

của Cel-2 chưa được xác định [77].
Khi nghiên cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA và
CbhB) cho thấy, cả hai enzyme này đều thuộc nhóm 7 của glycosyl hydrolase (GH7);
trong đó CbhB bao gồm cấu trúc cellulose-bindingomin (CBD) với sự xúc tác riêng bởi
các amino acid giàu liên kết peptide; còn CbhA chỉ gồm sự xúc tác, thiếu CBD và liên
kếtpeptide. Sự phiên mã của gene CbhA và CbhB được cảm ứng bởi D-xylose. Ở chủng
[Đề tài khoa học]

Page 16


A. kawachi, đã phát hiện ba gene mã hóa endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A [45].
Trong đó, cel5A và cel61A có liên kết CBD1; còn cel5A và cel5B thuộc glycosyl
hydrolase nhóm 5 (GH5), cel5B có cấu trúc rất giống cel5A, nhưng thiếu CBD1 và sự
liên kết. Cel5A gồm 4 đoạn intron, cel5B gồm 5 đoạn intron, còn cel61A thuộc nhóm
GH61 không có intron.
Dựa vào cấu trúc bậc một cơ bản, phức cellulase được chia làm 6 họ là A, B, C, D,
E và F [33]. Dựa vào trung tâm xúc tác phức cellulase được chia ra làm 9 họ A, B, C, D,
E, F, G, H và I. Hiện nay, cellulase được xếp thành 12 họ khác nhau là 5, 6, 7, 8, 9, (10),
12, 44, 45, 48, 61 và 74. Trong đó, họ 9 chứa cellulases của vi khuẩn (hiếu khí và kỵ khí),
nấm, thực vật và động vật (protozoa và mối); họ 7 gồm hydrolase nấm và họ 8 gồm
hydrolase vi khuẩn [45].
3 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME
Mỗi loại enzyme được tổng hợp từ các loài khác nhau có cấu trúc và hoạt tính sinh
học khác nhau. Nhiệt độ, pH, các dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hay các ion kim loại có
ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tính của enzyme.
3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới
hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở
nhiệt độ thích hợp và khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50°C.

Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở
nhiệt độ thấp dưới 0°C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa
về nhiệt độ thích hợp. Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A. oryzae hoạt
động mạnh nhất ở nhiệt độ lần lượtlà 50 oC và 60oC [27]. Endo-β- 1,4-glucanase gồm Cel
A và Cel B từ chủng A. oryzae KBN616 có hoạt tính mạnh nhất ở nhiệt độ lần lượtlà
55oC và 45oC[41]. Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55oC
[56], nhiệt độ tối ưu của β-glucosidase từ chủng Trichoderma reesei QM 9414 và chủng
Trametes hirsuta là 50oC [57].

[Đề tài khoa học]

Page 17


3.2 Ảnh hưởng của pH
Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trường, những biến đổi dù nhỏ trong
nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme.
Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc
là acid. Endo-β-1,4-glucanase do các loài khác nhau có pH tối ưu khác nhau. Theo những
nghiên cứu trước đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A. niger NRRL363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 [8]. Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là
5,0 và chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lượt là 3,5 và 4,5 [27]. CMCase của A.
niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5
[22].
3.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại
Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích
thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối
trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide
của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời
các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn
được với cơ chất. Do đó tốc độ thủy phân của enzyme được tăng lên. Các ion kim loại

nặng ở nồng độ gây biến tính có thể kìm hãm không thuận nghịch hoạt độ của enzyme.
Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy, các ion kim loại như Cu2+; Hg2+, Ag+ ức
chế mạnh hoạt tính của các enzyme như xylanase, endoglucanase, mannanase, protease,
cellulase [6], [7], [29]. Trong khi đó ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus
sp. D04 lên 40% so với đối chứng, Mg2+ làm giảm nhẹ hoạt tính (chỉ đạt 92%) và Zn2+
ức chế mạnh hoạt tính so với đối chứng (đạt 37%) [67] nghiên cứu trên chủng
Penicillium chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe2+ ở nồng độ 2,0
mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%); trong khi Mg2+,
Cu2+, Zn2+, Hg2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và
43% với Hg2+) [21].

[Đề tài khoa học]

Page 18


3.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa
Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất mạnh tới hoạt tính của
enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa
là khác nhau khi nghiên cứu trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy các chất tẩy
rửa Tween 20, Tween 80, Trixton X-100, SDS đều làm giảm hoạt tính của cellulase và
SDS làm giảm mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. Các dung môi hữu cơ
(methanol, ethanol, isopropanol và aceton) đều ức chế hoạt tính cellulase, riêng n-butanol
ức chế mạnh mẽ hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63% [6]. Các dung môi hữu cơ methanol,
ethanol, isopropanol không ảnh hưởng mạnh tới hoạt tính xylanase từ chủng A. ozyzae
DSM1863, riêng n-butanol làm tăng và aceton làm giảm nhẹ hoạt tính xylanase. Tween
20 và Triton X-100 không ảnh hưởng mạnh ở nồng độ thấp (0,2-1%) nhưng làm giảm
hoạt tính xylanase ở nồng độ cao 2%, trong khi đó SDS làm giảm hoạt tính enzyme mạnh
ở tất cả các nồng độ.

4. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp
chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình
sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng
sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ
nuôi cấy, pH môi trường, nguồn carbon, nguồn nitrogen.
Nguồn carbon: Các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể sử dụng
nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp
với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả
năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại
đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose.
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp
cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ
[Đề tài khoa học]

Page 19


bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh
tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và
saccharose, chủng CD5-12 là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc
mùn cưa. Nguồn carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưu ấm là vỏ lạc hoặc rơm
[12].
Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các phế
phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các
chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa [18]. Còn theo kết quả nghiên
cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A. flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh
tổng hợp cellulase khi sử dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó

mùn cưa được xem là nguồn cơ chất tối ưu.
Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. brasilianum sinh tổng hợp
cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon xylan
hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém [33]. Theo kết quả nghiên cứu
của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp.
DTQ-HK1 là rơm [10].
Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với
nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ
và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn
chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitrogen là
peptone và cao nấm men [5].
Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng
hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase tổng số từ 46 đến 76
IU/g [11]. Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho thấy, các chủng A. niger có thể sử
dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như: urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó,
urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng
nấm này [49].

[Đề tài khoa học]

Page 20


Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh
vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu
nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15 oC, các loài ưa ấm
thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-37 oC; còn các loài chịu nhiệt có
khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50oC.
Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác
thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 4555oC và có thể chịu được nhiệt độ 65-80 oC [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và

cs (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp
cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50oC [9]. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng
sinh tổng hợpcellulase tối ưu ở nhiệt độ 58 oC [13]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1
và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ưu là 31 và 34 oC [8]. Acharya và cs (2008)
cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện
28oC, pH 4,0-4,5 [18].
pH môi trường nuôi cấy ban đầu: pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng
đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài,
từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng
vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban
đầu là 8,0 [5]; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban
đầu là 6,7 [13]. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở
môi trường có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase
mạnh nhất trong khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0-7,0 [19].
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại
enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian
nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu.

[Đề tài khoa học]

Page 21


5. ỨNG DỤNG
Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase được ứng
dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau như công nghiệp sản xuất giấy và
bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công
nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi
sinh.
5.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu
nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng. Nguyên liệu ban đầu chứa hàm
lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình
nghiền để tách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn. Trong công đoạn
nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose,
tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ
học.Trướckhi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme
hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chấtvào phía trong gỗ và
hiệu quả khử lignin.
Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trướckhi
sản xuất các loại giấy in, giấy viết. Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy
trắng mực in trên giấy. Kỹ thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn trong ngành công
nghiệp giấy và bột giấy [14].

5.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc
trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt được nghiền, thu được
thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép bã thu được dịch quả. Dịch
này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các thành phần của polysaccharide
làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt,
[Đề tài khoa học]

Page 22


tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase
rất quan trọng. Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợp của
glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở
giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại hiệu
quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn.

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng
diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa
một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia [14].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng
phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến hành nâng
cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá trình sử dụng
phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly
trích dịch quả. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các
chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích
ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46%.

5.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và
phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ
yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các polysaccharide gồm
cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4-glucoside. Các chất này làm tăng độ
nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dưỡng. Các chất này có
trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng
như protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất
dinh dưỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng
hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.

[Đề tài khoa học]

Page 23


Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose
như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi

lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm
sợi thường được sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối
protein chứa hàm lượng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi
cho tiêu hóa của vật nuôi [14].

5.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Sử dụng glucanase để xử lý nguyên liệu giàu cellulose và glucan trước khi lên
men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi, trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme
đã được sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase có chứa β-glucanase sử dụng
trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi
Clostridium sinh tổng hợp glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất
dung môi hữu cơ, acetic acid [21], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [26].

5.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh
thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người. Thành
phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong
xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên
cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose
trong rác thải.

5.6. Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa
Cùng với protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase được ứng dụng để
sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải là nơi bám của các
phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tính đến năm 2002 đã có nhiều cellulase
[Đề tài khoa học]

Page 24

được sản xuất dùng cho bột giặt như: endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces
lanuginous [51].

6. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN
6.1. Hệ thống vật chủ Pichia pastoris
Trong những năm 1970, công ty Philip Petroleum đã phát triển các phương pháp
và môi trường nuôi cấy cho sinh trưởng mật độ cao (<130 g/l khối lượng tế bào khô) của
nấm men P. pastoris trong nuôi cấy liên tục chứa methanol để thu sinh khối đơn bào
(SCP) làm thức ăn chăn nuôi. Đến đầu những năm 1980, P. pastoris được phát triển
thành hệ thống biểu hiện gen. Các nhà nghiên cứu đã phân lập gen alcohol oxidase I
(AOX1) cùng promoter của nó và phát triển thành những vector, chủng vật chủ và phương
pháp kỹ thuật di truyền phân tử. Sự kết hợp giữa điều hòa biểu hiện mạnh (dưới sự điều
hòa của promoter AOX1) với những phương pháp và môi trường lên men cho quá trình sản
xuất SCP, kết quả tạo ra hàm lượng lớn protein ngoại lai trong P. pastoris. Do đó, từ năm
1993, hệ thống biểu hiện P. pastoris đã được các nhà nghiên cứu sử dụng rộng rãi trên thế
giới [20].
Pichia pastoris là sinh vật eukaryote thuộc họ Saccharomycetaceae nên có nhiều
khả năng biến đổi hậu dịch mã khi sản xuất protein: cơ chế gấp cuộn, hình thành liên kết
disulfide và quá trình glycosyl hóa... Mặt khác, P. pastoris là vi sinh vật đơn bào nên dễ thao
tác và nuôi cấy như vi khuẩn E. coli hay nấm men S. cerevisiae, có khả năng tổng hợp cả
protein nội bào và ngoại bào [20].
Hệ thống P. pastoris có thể sản xuất protein ngoại lai với hàm lượng cao hơn so
với các chủng S. cerevisiae truyền thống. P. pastoris có thể sinh trưởng mật độ cao nhờ
promoter alcohol oxidase I (AOX1) có khả năng điều hòa mạnh. P. pastoris có hai gen
mã hóa cho alcohol oxidase (enzyme chuyển hóa methanol) là AOX1 và AOX2. Trong đó,
gen AOX1 chịu trách nhiệm với hoạt tính alcohol oxidase trong tế bào. Sự biểu hiện gen
AOX1 được kiểm soát ở cấp độ dịch mã và điều hòa chặt chẽ bởi chất cảm ứng methanol
[Đề tài khoa học]

Page 25