BÁO cáo THỰC HÀNH VI SINH KỸ THUẬT môi TRƯỜNG

Bé tµi nguyªn & M«i trêng

trêng ®¹i häc tµi nguyªn & m«i trêng hµ néi

BÁO CÁO THỰC HÀNH:
VI SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

GV Hướng Dẫn : Hoàng Ngọc Khắc
SV Thực Hiện : Ma Thị Hạp
Lớp : CĐ8KM2 – Nhóm I/1

1


Mục Lục

Trang
Bài 1: Nội quy phòng thí nghiệm và sử dụng kính hiển vi
3
Bài 2: quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi
4
Bài 3: Quan sát tế bào vi khuẩn và nấm mốc
7
Bài 4: Quan sát tế bào vi sinh vật ( nhuộm Gram)
12
nhuộm kép
Bài 5: Quan sát tê bào vi khuẩn răng miệng
17
Bài 6: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
19

2


Bài 1: Nội quy phòng thí nghiệm và sử dụng
kính hiển vi
I. Nội quy
II. Cách sử dụng kính hiển vi

3


1. Cấu tạo của kính hiển vi













Ống kính
Giá đỡ ống kính
Đĩa kính
Thân kính
Đế kính

Mâm kính
Chốt an toàn
Bộ phận điều chỉnh màn kính
Bộ phận điều chỉnh càng cua
Bộ phận điều chỉnh cường độ ánh sáng
ốc sơ cấp
Ốc vi cấp

2. Chuyển vật kính:
 Khi quan sát bằng kính hiển vi ta cần quan sát từ vật kính theo thứ tự 4X, 10X,
40X rồi mới đến 100x.
 Chú ý : không sử dụng vật kính 100X để quan sát khi không cần thiết.
 Nếu trên vật kính có ghi chữ oil thì cần nhỏ một giọt dầu set lên lamen.
 Sauk hi dung xong kính phải dung bong tẩm xăng lau đầu vật kính.
3. Một số dụng cụ :






Que cấy
Lam kính
Lamen
Đèn cồn
Que chang








Kính hiển vi
Đĩa nuôi cấy vi sinh
Ống nghiệm
Pipet
Ống durham

Bài 2: quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi
I. Mục đích, yêu câu
 Quan sát, nhận biết được đặc điểm sinh học của các nhóm vi khuẩn, khuẩn xạ, nấm
mốc, nấm men.
 Vẽ và mô tả hình dạng, kích thước của vsv thuộc các nhóm đó

4


 Yêu cầu về kỹ năng:
 Kỹ năng sử dụng kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử
 Kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản giọt ép.
 Kỹ năng quan sát đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển vi.
II. Chuẩn bị:
1. Mẫu vi sinh:
Ngô mốc, cơm mốc, vỏ quýt mốc, sữa chua, bèo
2. Dụng cụ:
 Lam kính
 Que chang
 Lamen
 Kính hiển vi

 Đèn cồn
 Dầu soi
3. Hóa chất:
- Xăng hoặc xilen để lau kính hiển vi sau khi quan sát.
III. Cách tiến hành
1. Làm tiêu bản:
 Lấy lam kính và lame sạch đã khử trùng bằng cách hơ qua ngọn đèn cồn
 Khử trùng que cấy, lây một ít mẫu vi sinh vật, phải để nguội que cấy mới tiến hành
lấy vi sinh vật.
 Cho một giọt nước vô trùng lên lame.
 Cho tiếp mẫu vi sinh vật lên rồi giàn đều khoảng 1cm2
 Đặt lamen lên ( tránh có bọt khí)
 Mang đi quan sát trên kính hiển vi.
Chú ý: Nếu giọt nước tràn ra ngoài lam kính thì dùng giấy thấm bớt nước
hoặc dùng vaelin bôi quanh mép lam kính để giọt dung dịch không bị khô.


Bật đèn với kính hiển vi điện tử hoặc lấy ánh sáng mặt trời đối với kính hiển
vi quang học.

Sau đó ta tiến hành quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 4X. Mắt nhìn vào
thị kính và tay chỉnh ốc vi cấp ( chỉnh thô để đưa tiêu bản lên) cho tới khi nhìn thấy
ảnh mờ của sinh vật cần quan sát.

Tiếp tục ta chuyển lên quan sát bằng vật kính 10X, điều chỉnh ốc vi cấp để
nhìn rõ vsv hơn

Làm tương tự đối với vật kính 40X.

5


Khi dùng đến vật kính 100 X ta phải nhỏ một giọt dầu soi lên trên lame và
điều chỉnh sao cho vật kính chìm vào trong giọt dầu. Điều chỉnh nút vi cấp sao cho
nhìn thấy vsv một cách rõ nhất.
IV. Kết quả

6


Hình 1a

Hình 1b

Hình 2

Hình
1a, 1b

Tên VSV
Cơm thiu

Hình dạng

Ghi chú

Tập trung,
trôi theo
mảng

7


Hình

2

Tên
VSV

Sữa
chua
(Lactic)

Nhóm VSV

Lactobacterium

Kích thước

Ghi chú

Vi khuẩn Lactic thường
Streptococus lactis : Là liên
có dạng hình cầu, hình cầu khuẩn lactic được sử dụng
oval và hình que, đường
rộng rãi trong chế biến các
kínhcủa dạng cầu khuẩn sản phẩm sữa như sữa chua,
lactic từ 0,5-1,5 μm, các
crem, bơ chua, phomat. Khi

tế bào hình cầu xếp
đông tụ sữa các cụcvón chặt
thành từng cặphoặc
và nhẵn được tạo thành.
chuỗi có chiều dài khác
nhau. Kích thước tế bào
trực khuẩn
Lactic từ 1-8 μm,trực
khuẩn thường đứng riêng
lẻ hoặc kết thành chuỗi

8


Bài 3: Quan sát tế bào vi khuẩn và nấm mốc
nhuộm đơn
I. Mục đích, yêu cầu
 Quan sát, nhận biết được đặc điểm sinh học của các vi sinh vật nấm mốc, nấm
men.
 Vẽ và mô tả hình dạng, kích thước của vsv thuộc các nhóm đó.
 Yêu cầu về kỹ năng thực hành:
 + Kỹ năng sử dụng kinh hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử.
 +Kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản giọt ép.
 + Kỹ năng quan sát các đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển
vi.
II. Chuẩn bị
1. Mẫu vật:
 Quan sát tế bào vi khuẩn : sữa chua, nước dưa chua, các loại thực phẩm ôi
thiu…
 Nấm men: dịch ép hoa quả lên men, rượu nếp…

 Nấm mốc: thực phẩm bị mốc, bánh mì, hoa quả bị thối…
2. Dụng cụ:
 Phiến kính (lame)
 Lá kính (lamelle)
 Que cấy
 Đèn cồn
 Bôcan
 Kính hiển vi
3. Hóa chất:
 Thuốc nhuộm : Xanh Methylen
 Dung dịch gốc: pha 6g xanh Methylen trong 100ml rượu ethylic.
 Dung dịch thuốc nhuộm: hút 1ml dd trên pha trong 40ml nước cất.
 Xăng hoặc xylen để lau kính hiển vi sau khi quan sát.
 Dầu soi
III. Cách tiến hành
1. Làm tiêu bản sống
 Lấy lam kính, lamelle sạch.
 Sau đó nhỏ một giọt xanh Metylen lên trên lam kính.
 Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn
 Dùng que cấy lấy một lượng mẫu vi sinh vật vừa đủ cho lên lam kính.( Đặt
mẫu vi sinh vật ở giữa giọt xanh metylen ssau đó giàn đều ).

9


 Đậy lamelle lên và mang đi quan sát lần lượt với các vật kính 4X, 10X, 40X
và 100X
2. Làm tiêu bản cố định
 Khử trùng que cấy bằng đèn cồn.
 Dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi sinh vật giàn đều lên trên lam kính, sau

đó hơ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi sinh vật.
 Nhỏ một giọt xanh methylen lên, để 1-2 phút
 Rửa lại bằng nước cất, thấm bớt nước trên lam kính
 Đợi 1 phút cho lam kính hết nước
 Đậy lamelle lên trên
 Mang mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi với các vật kính lần lượt là 4X,
10X, 40X và 100X. (với vật kính 100X khi quan sát ta phải sử dụng dầu soi)

3. Quan sát trên kính hiển vi
 Đạt tiêu bản vừa làm ở trên vào giá để tiêu bản của kính hiển vi và cố định
lại.
 Bật đèn, tiến hành lấy ánh sáng từ phía ánh sáng mặt trời (đối với kính hiển
vi không có đèn).
 Tiến hành quan sát dưới vật kính 4X: mắt hìn vào thị kính, tay để vào ốc
chỉnh thô để đưa tiêu bản lên xuống sao cho từ đó ta xác định được điểm
cần quan sát .
 Khi thấy hình ảnh mờ của vi sinh vật, ta chuyển lên xem ở vật kính 10X, và
bắt đầu điều chỉnh ở nút vi cấp để thấy hình ảnh của vi sinh vật rõ hơn.
 Tiếp tục chuyển lên vật kính 10X
 Tới khi xem ở vật kính 100X thì ta nhỏ một giọt dầu lên trên lamelle. điều
chỉnh để thị kính 100X sao cho đầu kim chìm trong giọt dầu. Tiến hành quan
sát và điều chỉnh nút vi cấp để nhìn thấy hình ảnh của vi sinh vật một cách
rõ nhất.

IV. Kết quả

10


Hình 3

Hình
Hình
4

3

Tên
Tên
VSV
VSV
Nấm
mốc

Sữa
chua
(Lactic)

Nhóm VSV
Nhóm VSV

Kích thước
Kích thước

Ghi chú
Ghi chú

monophyletic

Từ 3-5µm

Vi khuẩn Lactic thường
có dạng hình cầu, hình
oval và hình que, đường
kínhcủa dạng cầu khuẩn
lactic từ 0,5-1,5 μm, các
tế bào hình cầu xếp
thành từng cặphoặc
chuỗi có chiều dài khác
nhau. Kích thước tế bào
trực khuẩn
Lactic từ 1-8 μm,trực
khuẩn thường đứng riêng
lẻ hoặc kết thành chuỗi

Các sợi nấm có thể phân
Streptococus
lactis có
: Làthể
liên
nhánh và các nhánh
lại
cầuphân
khuẩn
lactic
được
sử
dụng
nhánh liên tiếp tạo
rộng
rãi

trong
chế
biến các
thành hệ sợi
nấm
(mycelium)
sảnsinh
phẩm
nhưbông.
sữa chua,
khí
xùsữa
xì như
Trên
crem,
bơ
chua,
phomat.
Khi
môi trường đặc và trên một
đông
tụ sữa
các tự
cụcvón
số
cơ chất
trong
nhiên,chặt
bào
và

nhẵn
được
tạo
thành.
tử nấm, tế bào nấm hoặc một
đoạn sợi nấm có thể phát
triển thành một hệ sợi nấm có
hình dạng nhất định gọi là
khuẩn lạc nấm (Hình 4)

Lactobacterium

Hình 4

11


Hình 5a

Hình

Tên
VSV

Nhóm
VSV

Hình 5b

Kích thước

Cấu tạo

Ghi chú

Tế bào nấm men
được cấu tạo chủ yếu
từ các phần cơ bản
sau: thành tế bào,
màng nguyên sinh
chất, chất nguyên
sinh, nhân, không
bào, hạt dự trữ, ty
thể, ribosom

Thuộc cơ thể
đơn bào. Nấm
men thường có
hình dáng khác
nhau (hình cầu,
hình elip, hình
bầu dục, hình
dài...)

- Tế bào nấm
men có kích
thước lớn gấp từ
5-10 lần so với
5a,5b

Nấm monophyl
men
etic

tế bào vi khuẩn.
Chiều dài
9÷10μm x chiều
rộng 2÷7 μm)

12


Bài 4: Quan sát tế bào vi sinh vật ( nhuộm Gram)
nhuộm kép
I. Mục đích, yêu cầu:
 Quan sát, nhận biết và phân biệt được các loại vi sinh vật đang quan sát.
 Vẽ và mô tả về hình thái, kích thước
 Yêu cầu về ky năng thực hành:
 Kỹ năng sử dụng kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang hoc.
 Kỹ năng làm tiêu bản tạm thời, tiêu bản giọt ép.
 Kỹ năng quan sát các vsv trên kính hiển vi
II. Chuẩn bị
1. Mẫu vi sinh vật:
 E.coli
 Bacilus
 Vi khuẩn nước thịt
 Hỗn hợp E.coli và Bacilus
 Lactic: sữa chua
 Vi khuẩn công sinh: rễ cây
2. Dụng cụ:

 Que cấy
 Lam kính
 Lame
 Kính hiển vi
 Đèn cồn
 Bocan
3. Hóa chất:
 Thuốc nhuộm: Tím gentian, Lugon, Fuchsin
 Cồn 900
 Dầu soi
 Nước cất
 Xăng hoặc xylen để lau vật kính sau khi sử dụng
III. Cách tiến hành
1. Làm tiêu bản
 Cách lấy giống vsv để làm tiêu bản:
13


 Đốt đèn cồn lên.Một tay cầm ống nghiệm chứa vsv, tay còn lại cầm que cấy hơ trên
ngọn lửa đèn cồn để khử trùng.
 Sau đó mở nắp ống nghiệm , khử trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn , đưa
que cấy vào lấy sinh khối của vsv ra.
 Sau khi kết thúc các thao tác thì hơ các dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng
lần nữa.

Cách làm dịch huyền phù cho từng loại vsv:





Làm vào ống nghiệm
Cho một ít nước cất vào trong ống nghiệm
Dùng que cấy lấy một ít khối vi sinh vật cho vào trong ống nghiêm
Lắc đều ta được dung dịch huyền phù.
Làm tiêu bản:

Lấy 1 giọt huyền phù vừa làm nhỏ lên lam kính

Tán đều dung dịch huyền phù trên lam kính ra

Để khô tự nhiên hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho khô

Nhỏ một giọt thuốc tím nhuộm gentian vào giữa vết bôi, để 1-2p

Rửa bằng nước( rửa nhẹ cho tiêu bản trôi hết màu). Để khô

Nhỏ một giọt thuốc nhuộm Lugol vào giữa vết bôi (để trong 1-2p)
sau đó rửa lại bằng cồn.

Nhỏ một giọt thuốc nhuộm FuchSin vào giữa vết bôi để trong tầm
1-1.5p. Sau đo rửa lại bằng nước.

Để khô hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn để vết bôi khô.

Mang đi quan sát dưới kính hiển vi.
2. Quan sát dưới kính hiển vi
- Đặt tiêu bản vết bôi vừa làm ở trên vào giá để tiêu bản của kính hiển vi và cố định lại.
- Tiến hành quan sát ở vật kính 4X, khi thấy hình ảnh mờ của vsv ta chuyển lên vật
kính 10X và 40X.

- Tiếp theo sử dụng dầu soi để soi vật kính 100X.

14


IV. Kết quả

Hình 6

Hình

6

Tên VSV

Ecoli

Kích thước

Cấu tạo

Từ 1-3µm

Tế bào E.coli bên ngoài có
vách tế bào, kề trong là màng
sinh chất. Mezosome là cấu
trúc xếp lại của màng sinh chất
có thể liên quan đến phân bào
chất di truyền tạo nên
nucleotid. Các tiêm mao giúp

cho sự vận động của chúng.

Ghi chú
Có thể nuôi vi khuẩn
trong môi trường rắn có
agar trong các hộp petri
để từng tế bào mọc
thành khuẩn lạc dễ quan
sát hơn.

15


Hình 7
Hình

Tên VSV

Nhóm
VSV

Kích
thước

Cấu tạo

Ghi chú

Tế bào hình que
ngắn, đôi khi có dạng

hình

cầu

kết

thành

chuỗi ngắn, không tạo
bào tử, hiếm khi di
động bằng lông roi, kị
7

0,5 – 1,2 x
Lactobacillus Bacillus
1 – 10µm

khí không bắt buộc
nhưng phát triển tốt hơn
trong điều kiện không
có oxy hay có bổ sung
thêm 5% CO2.

Hình thức dinh
dưỡng là hóa
dưỡng hữu cơ,
đòi hỏi môi
trường nuôi cấy
phải giàu chất
dinh dưỡng,

phức tạp, có khả
năng lên men và
phân huỷ
saccharose.

16


Bài 5: Quan sát tế bào vi khuẩn răng miệng
I. Chuẩn bị
1. Mẫu vi khuẩn:
 Vi khuẩn răng miệng
2. Dụng cụ:
 Lam kính
 Lame
 Kính hiển vi
 Que cấy
 Bocan
 Đèn cồn
 Tăm
3. Hóa chất:
 Thuốc nhuộm : Xanh metylen hoặc tím Gential
 Xăng hoặc xylen để lau vật kính

II. Cách tiến hành
1. Làm tiêu bản ép giọt
 Cho 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen hoặc tím Gential vào lam kính.
 Lấy một ít cao răng cho vào giữa giọt thuốc nhuộm
 Tán đều cao răng với thuốc nhuộm
 Đậy lame phía trên và mang đi quan sát dưới kính hiển vi.

2. Quan sát trên kính hiển vi
 Đặt tiêu bản (vết bôi) vừa thực hiện ở trên đặt vào giá để tiêu bản của
kính hiển vi và kẹp lại.
 Sau đó tiến hành quan sát từ vật kính 4X, 10X, 40X và 100X.
 Riêng vật kính 100X phải sử dụng dầu soi.

III. Kết quả

17


Hình 9

Hình

Nhóm VSV

Kích thước

Đường kính

6

streptococcus
mutans

(0.2÷2.0μm)
x chiều dài
(2.0÷8.0μm)

Hình dạng

Ghi chú

Vi khuẩn gây sâu răng hiện diện ở
môi trường miệng của tất cả mọi
Vi khuẩn có người. Giống như là một dịch bệnh
nhiều hình
mà ai cũng mắc phải, ai cũng có vi
dạng (hình
khuẫn streptococcus mutans trong
cầu, hình
miệng, kể cả những người không sâu
que, hình
răng bao giờ (Gọi là caries free)
dấu phẩy, trong miệng của họ cũng có vi khuẫn.
hình xoắn,
Các nhà khoa học ở viện Pasteur
hình sao ....)
Paris đã cố gắng làm thử nghiệm
thuốc chủng ngừa (vaccine) trên
chuột và trên khỉ nhưng đến giờ vẫn
chưa thành công.

Bài 6: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

18


I. Môi trường đặc (thạch đĩa/đĩa thạch)

 Chuẩn bị:
 Môi trường nuôi cấy
 Mẫu nghiên cứu





Đất: rắn pha lỏng (10g đất pha với 90ml nước)
Nước cất
Thực phẩm, cơ chất
Dụng cụ: pipet, ống nghiệm, đèn cồn, tủ nuôi cấy, que trang



Tiến hành:

Môi trường thạch : Dùng micropipet lấy mẫu cho
vàocác đĩa thạch 0,1 ml
 Que trang
 Để từ 48h – 72h trong điều kiên nhiệt độ ổn
cho vi sinh vật phát triển

định

 Kiểm tra kết quả sản phẩm: trên môi trường sau nuôi cấy, nhìn mặt dưới đĩa thạch
có các khuẩn lạc phát triển. Đếm số khuẩn lạc. Mỗi 1 chấm là 1 tế bào.
II. Môi trường lỏng
 Chuẩn bị: giống môi trường đặc
 Tiến hành:

19


 Tra bảng MC crady:

10-1

10-2

10-3

2

1

0

 Kết quả: đất, nước ở các khu vực khác nhau được tính bằng các công thức khác
nhau.
không khí: làm các đĩa thạch.
 Phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU)
 Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 để tính kết quả:
A(CFU/ml) = N/(n1.V.f1 + n2.V.f2 + ....+ ni.V.fi)
Trong đó:
 ni : số lượng đĩa cấy tại độ pha bảng thứ i.10-1 (3đĩa)
 V : thể tích mẫu cấy lên đĩa
 fi : độ pha loãng thứ i 10,10-1, 10-2, …

20

Nhận xét của giảng viên hướng dẫn

• ………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
……………..
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………..

21