quy trình xác định thuốc diệt cỏ glyphosate

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU
1. Tên đề cương:
Nghiên cứu quy trình xác định thuốc diệt cỏ glyphosate, paraquat và một số chất bảo
vệ thực vật phân cực mạnh trong môi trường bằng phương pháp LC-MS.
2. Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề cương
Trong thập niên vừa qua, việc sử dụng chất diệt cỏ họ organophosphate – glyphosate
[(N-phosphonomethyl) glycine] (hình 1) – ngày càng trở nên phổ biến và hiện nay là một
trong những thuốc diệt cỏ được sử dụng nhiều nhất trên thế giới [1]. Nó được dùng để
kiểm soát các loại cỏ trong nông nghiệp, lâm nghiệp, làm vườn và cả trong ngành đường
sắt. Sau khi được phun tưới, glyphosate nhanh chóng bị hấp thụ trong đất và bị phân hủy
một phần thành aminomethylphosphonic acid (AMPA) – chất chuyển hóa chính của nó
(hình 1) và sau đó đi vào hệ thống nước ngầm và nước bề mặt (sông ngòi) [2].

Hình 1. Glyphosate (trái) và AMPA (phải)
Sở dĩ glyphosate được sử dụng rộng rãi là do tính hiệu quả cao và được cho là an toàn
đối với môi trường do nó thường gắn kết với chất keo của đất và bị phân hủy bởi vi khuẩn
có trong đất. Nhưng cũng chính vì vậy đã làm gia tăng việc sử dụng glyphosate tràn lan
dẫn tới sự biến đổi gen cây trồng kháng glyphosate và gia tăng lượng glyphosate đi vào hệ
thống nước [3]. Mặc dù glyphosate được coi như hợp chất “không độc” [4] nhưng những
nghiên cứu gần đây cho thấy những thuốc bảo vệ thực vật có chứa glyphosate gây ảnh
hưởng đến sự điều chỉnh vòng tế bào [5]. Dư lượng glyphosate giờ đây được tìm thấy
trong nhiều loại mẫu bao gồm cả mẫu thực vật [6]. Nồng độ tối đa cho phép của
glyphosate trong nước uống tại Mỹ là 0.70 mg/L [7] và 0.1 g/L tại Liên Hiệp Châu Âu
[8].
Việc xác định glyphosate trong nền mẫu môi trường và nông nghiệp gây ra rất nhiều
vấn đề khó khăn do nó là một hợp chất có phân tử lượng nhỏ, có độ phân cực rất cao và
khả năng tan trong nước rất lớn và ít tan trong dung môi hữu cơ. Hơn nữa, nó có cấu trúc
tương tự như những thành phần có trong cây như amino acid nên sẽ gây nhiễu trong quá
trình phân tích. Ngoài ra, glyphosate có khả năng hấp thụ mạnh vào những thành phần
khoáng chất hoặc hữu cơ có trong các tầng địa chất [2, 9] và tạo ra phức cation kim loại
[10] gây ra khó khăn cho việc cô lập và phân tích.

Những khó khăn trong việc xác định glyphosate đã và đang gây nên nhiều vấn đề
trong việc khảo sát chất lượng môi trường. Ví dụ như ở Đan Mạch chỉ gần đây mới phát
hiện ra sự ô nhiễm rộng khắp hệ thống nước ngầm [11]. Theo những nhà nghiên cứu
Canada, glyphosate làm gia tăng sự phát triển nấm làm hại lúa mạch [11]. Những ảnh
hưởng khác của glyphosate đã có thể được phát hiện nếu có được những phương pháp
phân tích hiệu quả và dễ dàng.
Nhiều phương pháp sắc ký đã được phát triển cho việc phân tích glyphosate và
AMPA như sắc ký khí (GC), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
[12-15]. Tuy nhiên, đặc tính ion và tan nhiều trong nước của nó khiến cho phương pháp
HPLC có nhiều ưu điểm hơn GC. Do trong thành phần hóa học của nó không có những
nhóm chức thích hợp cho việc phân tích bằng UV, huỳnh quang, ... nên glyphosate và
AMPA cần phải được tạo dẫn xuất với 9-fluorenylmethylchloroformate (FMOC-Cl) để
tạo ra hợp chất phát huỳnh quang đồng thời làm giảm độ phân cực của nó để có thể phân
tích được bằng phương pháp sắc ký lỏng huỳnh quang hoặc khối phổ. Một trong những
bất lợi chính của việc sử dụng thuốc thử dẫn xuất FMOC-Cl là sẽ tạo ra một hợp chất thứ
cấp FMOC-OH gây nhiễu mũi sắc ký của glyphosate khi phân tích bằng sắc ký lỏng đầu
dò huỳnh quang [15, 17, 18]. Các dẫn xuất của FMOC với glyphosate và AMPA thường
được tách trên cột pha đảo silica C18. Tuy nhiên, việc sử dụng pha động với đệm pH trung
tính như ammonium acetate thường gây ra sự bành rộng và kéo dài pic sắc ký [14, 19,
20]. Ngoài ra, quá trình tạo dẫn xuất này sẽ làm kéo dài thời gian phân tích. Do đó việc
tìm ra một phương pháp phân tích trực tiếp không qua quá trình tạo dẫn xuất có ý nghĩa
khoa học và thực tiễn rất lớn nhưng cũng là một thách thức cho người nghiên cứu phương
pháp.
Bên cạnh glyphosate thì đề tài cũng sẽ đề cập đến việc phân tích glufosinate là một
hợp chất thường được phun kết hợp với glyphosate trong các thuốc diệt cỏ có glyphosate
trên thị trường. Sau khi được phun vào đất, glufosinate bị chuyển hóa thành 1,3methylphosphinicopropionic acid (MPPA).
Trong những năm gần đây sắc ký tương tác ưa nước (Hydrophilic Interaction Liquid
Chromatography, HILIC) được cộng đồng khoa học đặc biệt quan tâm do có nhiều ứng

dụng trong lãnh vực dược phẩm, sinh học, y học, môi trường, an toàn thực phẩm,…[21]
Trong thế hệ cột sắc ký HILIC mới ra đời, loại cột chứa ligand zwitterion có nhiều tính
năng đặc biệt như phân tích đồng thời cả cation, anion và các hợp chất trung hoà điện như
cột ZIC-cHILIC, Obelisc N (cột tách đa cơ chế được chế tạo theo công nghệ tế bào
(Liquid Separation Cell technology – LiSCTM) có khả năng tách những hợp chất nhỏ có
độ phân cực rất cao như glyphosate) [22].
Theo các nghiên cứu mà chúng tôi đã thực hiện với những hợp chất phân cực có
nhóm carboxyl và amine tương tự như glyphosate và AMPA thì cột zwitterion phù hợp
cho việc phân tích các hợp chất ưa nước và mang cả 2 loại điện tích như glyphosate và
AMPA mà không cần phải tạo dẫn xuất để làm giảm độ phân cực.


Cột zwitterion và sắc ký đa cơ chế
Trong các loại cột HILIC và Obelisc có mặt trên thị trường hiện nay, cột với nhóm
chức zwitterion có nhiều ưu điểm như vừa duy trì cơ chế phân bố HILIC vừa có thêm khả
năng trao đổi cả cation lẫn anion. Điều này cho phép chúng ta phân tích đồng thời chất
trung hòa điện, chất mang điện tích dương, âm và zwitterions mà không cần phải phân
tích nhiều lần trên nhiều loại cột khác nhau. Sự lưu giữ đa cơ chế mở rộng khả năng hoạt
động của cột đồng thời cũng gây không ít khó khăn trong việc phát triển phương pháp vì
tính phức tạp của nó. Vì thế trong đề tài này loại cột zwitterion sẽ được khảo sát . Các loại
cột trên thị trường hiện nay: với vị trí đảo ngược của các tâm điện tích (ZIC-HILIC và
ZIC-cHILIC) và cột Obelisc N (hình 3) với cấu hình tương tự cột ZIC-cHILIC. (hình 2)

Hình 2. Pha tĩnh ZIC-HILIC và ZIC-cHILIC

Hình 3: Cấu tạo pha tĩnh Obelisc N
Paraquat hay gramoxone (1,1-dimethyl-4,4'-bipyridylium chloride) là hợp chất được
sử dụng để diệt cỏ dại trong sản xuất bông, gạo và ngô. Cùng với paraquat là diquat (1,1'ethylene-2,2'-bipyridyldiylium dibromide) chúng thuộc họ bipyridyl nên có khả năng diệt
cỏ rất mạnh do đó được ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam (hình 4).
Tuy nhiên do độc tính rất mạnh của hai hợp chất này khi tiếp xúc với động vật và con

người [23] nên hiện nay tại Châu Âu và Mỹ đã cấm sử dụng nhưng tại Việt Nam thì vẫn
đang là những chất bảo vệ thực vật sử dụng nhiều nhất. Độ phân cực của 2 hợp chất này
cũng gần tương tự như glyphosate nên cũng có khả năng được lưu giữ và tách trên cột sắc
ký lỏng đa cơ chế.


Hình 4. Paraquat (trái) và Diquat (phải)
Thêm vào đó, chúng tôi cũng sẽ nghiên cứu phân tích các chất bảo vệ thực vật phân
cực mạnh khác như họ atrazine, phenylurea, carbamat, chlorophenoxy acid,…. Đây là
những hợp chất có độ phân cực rất cao (logKOW < 0) và có khả năng lưu giữ tốt hơn
glyphosate trên cột pha đảo C18 thông thường cũng sẽ được khảo sát để mở rộng khả
năng ứng dụng của đề tài trong việc khảo sát ô nhiễm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật
trong môi trường nước và đất.

3. Mục đích nghiên cứu của đề cương
Nghiên cứu phát triển một phương pháp phân tích HPLC-MS với cột sắc ký đa cơ chế
nhằm xác định đồng thời hàm lượng thuốc diệt cỏ glyphosate, glufosinate và các chất
chuyển hóa; từ đó phát triển một phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ những chất
này cùng với paraquat, diquat và phát triển quy trình phân tích các chất bảo vệ thực vật
phân cực mạnh khác trên cột C18.
Nghiên cứu một quy trình chiết làm sạch nhằm loại bỏ các tạp chất và làm giàu mẫu
để tăng tính chọn lọc và độ nhạy của phương pháp phân tích.
Sau khi phương pháp phân tích toàn diện bao gồm quá trình phân tích LC-MS và quá
trình chiết làm sạch, làm giàu đã được thẩm định thì sẽ áp dụng vào khảo sát dư lượng
của chúng trong môi trường tại nơi khảo sát và rộng ra các vùng xung quanh một khi các
chất này được lưu chuyển tới theo mưa, thủy triều, …
4. Đối tượng, phương pháp nghiên cứu
- Đối tượng: thuốc diệt cỏ glyphosate, glufosinate và các chất chuyển hóa cùng với
paraquat, diquat và các chất bảo vệ thực vật phân cực mạnh.
- Phương pháp nghiên cứu: LC-MS, chiết pha rắn (SPE), PCA (Principal

Component Analysis) dùng để thống kê, khoanh vùng, lập bản đồ mức độ ô nhiễm
các chất này trong môi trường.
5. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu
 Phương pháp phân tích trực tiếp glyphosate, glufosinate và các chất chuyển hóa
của chúng trên cột sắc ký lỏng đa cơ chế ghép nối với đầu dò khối phổ và so sánh
với phương pháp phân tích gián tiếp khi tạo dẫn xuất với FMOC.
 Phương pháp phân tích LC-MS đối với paraquat và diquat trong nền mẫu môi
trường.


 Phương pháp phân tích LC-MS đối với các chất bảo vệ phân cực mạnh họ atrazine,
phenylurea, chlorophenoxy acid, carbamat trên cột C18.
 Sự tồn tại của các chất này trong môi trường đất và nước cũng như theo dõi sự
chuyển hóa, sự phân hủy của chúng theo thời gian.
6. Dự kiến kết quả đạt được:
 Một quy trình phân tích trực tiếp glyphosate, glufosinate và các chất chuyển hóa
của chúng trên cột sắc ký lỏng đa cơ chế.
 Một quy trình phân tích trực tiếp paraquat và diquat trên hệ sắc ký lỏng khối phổ.
 Số liệu khảo sát dư lượng chất bảo vệ thực vật trong nước và đất tại một số vùng
trồng trọt chính của thành phố Hồ Chí Minh và lưu vực sông Cửu Long.
 Dữ liệu về quá trình chuyển hóa, phân hủy, loại bỏ trong đất và nước cũng như tác
động đến môi trường.
7. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án
 Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Phân tích thuộc Khoa Hóa – Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
 Phòng Phân tích Trung tâm thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành
phố Hồ Chí Minh.
 Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Hóa dầu thuộc trường Đại học Bách
khoa Thành phố Hồ Chí Minh.
 Phòng Sắc ký Khối phổ thuộc Viện Khoa học Phân tích tại Lyon – Pháp

(Institu des Sciences Analytiques – ISA).
8. Tài liệu tham khảo:
1.

L. A. Castle, D. L. Siehl, R. Gorton, P. A. Patten, Y. H. Chen, S. Bertain, H. Cho, N.
Duck, J. Wong, D. Liu, M. W. Lassner, Science 304, 1151 (2004).
2.
M.L. Rueppel, B.B. Brightwell, J. Schaefer, J.T. Marvel, J. Agric. Food Chem. 25, 517
(1977).
3. U.S. Department of Agriculture. Agricultural Chemical Usage-1995 and 1999 Field
crops summary; National Agricultural Statistics Service: Washington, DC, 1996 and
2000.
4. G. M. Williams, R. Kroes, I. C. Munro, Regul. Toxicol. Pharmacol. 31, 117 (2000).
5. J. Marc, O. Mulner-Lorillon, R. Belle, Biol. Cell 96, 245 (2004).
6. C. Cox, J. Pestic. Reform 18 (3), 3 (1998).
7. USEPA web site: />8. EEC Council Directive 98/83/EEC, OJ L 330 12.05.1998, pp 32-54.
9. D. G. Thompson, J. E. Crowell, R. J. Daniels, B. Staznik, L. M. MacDonald, J. Assoc.
Off. Anal. Chem. 72, 355 (1989).
10. R.L. Glass, J. Agric. Food Chem. 31, 280 (1983).
11. The Royal Society of Chemistry. Pesticide Outlook; October 2003, pp 189-190.
12. E. Börjesson, L. Torstensson, J. Chromatogr. A 886, 207 (2000).


13. M. Corbera, M. Hidalgo, V. Salvado, P.P. Wieczorek, Analytica Chimica Acta 540, 3
(2005).
14. R.J. Vreeken, P. Speksnijder, I. Bobeldijk-Pastorova, T.H.M. Noij, J. Chromatogr. A
794, 187 (1998).
15. C. Hidalgo, C. Rios, M. Hidalgo, V. Salvado, J.V. Sancho, F. Hernández, J. Chromatogr.
A 1035, 153 (2004).
16. C.J. Miles, L.R.Wallace, H.A. Moye, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 69, 458 (1986).

17. J.V. Sancho, F. Hernández, F.J. López, E.A. Hogendoorn, E. Dijkman, P. Van Zoonen,
J. Chromatogr. A 737, 75 (1996).
18. T.V. Nedelkoska, G.K.C. Low, Analytica Chimica Acta 511, 145 (2004).
19. M. Ibáñez, O.J. Pozo, J.V. Sancho, F.J. López, F. Hernández, J. Chromatogr. A 1081,
145 (2005).
20. M. Ibáñez, O.J. Pozo, J.V. Sancho, F.J. López, F. Hernández, J. Chromatogr. A 1134, 51
(2006).
21. P.G. Wang, W. He, Hydrophylic Interaction Liquid Chromatography and Advanced
Applications, CPR Press Taylor & Francis Group, 2011
22. N. Yoshioka, M. Asano, A. Kuse, T. Mitsuhashi, Y. Nagasaki, Y. Ueno, J. Chromatogr.
A 1218, 3675 (2011).
23. S. L. Tompsett, Acta Pharmacol. et Toxicol. 28, 346 (1970).

9. Phân bổ thời gian thực hiện:
 Năm thứ 1:
 4 tháng đầu: tổng hợp, phân tích tài liệu; kết thúc bằng việc trình bày tiểu
luận lý thuyết và tổng quan của đề tài.
 8 tháng tiếp theo: sẽ làm quen với các phương pháp phân tích sắc ký lỏng
trên cột đa cơ chế và hệ khối phổ, thực hiện các khảo sát sơ bộ với
glyphosate, glufosinate và các chất chuyển hóa để nắm vững lý thuyết và
phương pháp cũng như định rõ những khó khăn, vướng mắc, vấn đề cần giải
quyết trong thời gian tiếp theo; cùng với đó sẽ phát triển phương pháp phân
tích các chất bảo vệ thực vật phân cực mạnh khác.
 Năm thứ 2: triển khai phương pháp nghiên cứu trên các mẫu nước và đất thu
thập tại các vùng trồng trọt chính của tp.HCM  đánh giá sơ bộ phương pháp
và kết quả thu được.
 Năm thứ 3: tiếp tục công việc của năm thứ 2 và có thể mở rộng đối tượng mẫu
cho một số nơi thuộc đồng bằng sông Cửu Long; viết bài đăng báo và viết luận
án. Nếu số lượng công việc lớn và có những khó khăn trở ngại bất ngờ trong
quá trình nghiên cứu khiến NCS không thể hoàn tất luận án trong 3 năm thì sẽ

kéo dài thêm 1 năm
Xác nhận của Giáo viên hướng dẫn

TS. TRẦN THỊ NHƯ TRANG