Nghiên cứu quá trình kết tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÀNH VĂN DUY

Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH KẾT TINH STEVIOSIDE
TỪ DỊCH CHIẾT CÂY CỎ NGỌT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Lớp
Khoá học
Giáo viên hướng dẫn

: Chính quy
: Công nghệ Thực phẩm
: CNSH & CNTP
: 42 - CNTP
: 2010 – 2014
: 1. ThS. Phùng Thị Anh Minh
2.TS. Trần Văn Chí

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN
Đối với sinh viên chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng và mỗi sinh

viên nói chung, thực tập tốt nghiệp là một kỳ thực tập rất đặc biệt và có ý nghĩa rất
lớn, bởi đây là lần tiếp xúc với thực tế cuối cùng trước khi bước vào thực tế. Trong
lần thực tập tốt nghiệp này, được sự đồng ý của Được sự nhất trí của Ban giám hiệu
nhà trường và Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP, tôi đã tiến hành đề tài: “ Nghiên
cứu quá trình kết tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt tại bộ môn Quá trình –
Thiết bị Công nghệ Hóa học trường đại học Bách Khoa Hà Nội”. Nhờ sự giúp đỡ
và tạo điều kiện tận tình của thầy Trần Văn Chí , trường ĐHNL Thái Nguyên và cô
Phùng Thị Anh Minh trường ĐHBK Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô của bộ môn
Quá trình – Thiết bị Công nghệ Hóa học, tôi đã có cơ hội nghiên cứu, vận dụng,
ứng dụng, thực hành một phần những kiến thức đã học được một cách khoa học,
đồng bộ, hệ thống giúp tôi rèn luyện, phát triển và hoàn thiện những kỹ năng, phẩm
chất của người kỹ sư tương lai. tôi chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy Trần Văn Chí,
cô Phùng Thị Anh Minh và ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP trường đại học
Nông Lâm Thái nguyên, toàn thể thầy cô của bộ môn Quá trình – Thiết bị Công
nghệ Hóa học trường đại học Bách Khoa Hà Nội trong việc tạo điều kiện giúp đỡ
rất lớn chúng em trong đợt thực tập này.
Thái Nguyên, ngày 12 tháng 5 năm 2014.
Sinh viên

Lành Văn Duy


MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ............................................................................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................ 2
1.4.2. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 2

Phần 2 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
2. Cây cỏ ngọt. ....................................................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung ................................................................................................. 3
2.2. Phân loại khoa học [1] ....................................................................................... 3
2.3. Phân loại theo loài .............................................................................................. 3
2.4. Nguồn gốc cây cỏ ngọt ...................................................................................... 3
2.5. Mô tả cây ............................................................................................................ 4
2.6. Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt. ............................................................. 4
2.7. Thành phần axit amin. ....................................................................................... 5
2.8. Hàm lượng khoáng chất. ................................................................................. 6
2.9. Chất diệp lục (A và B), carotenoids trong cỏ ngọt. [11] ................................. 7
2.10. Các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt. [1] .............................................. 7
2.10.1. Stevioside ....................................................................................... 7
2.10.2. Steviol ............................................................................................ 8
2.10.3. Steviolbioside ................................................................................. 9
2.10.4. Rebaudioside A ............................................................................... 9
2.10.5. Rebaudioside B ............................................................................... 9
2.10.6. Rebaudioside C ( Dulcoside-B) ........................................................ 9
2.10.7. Rebaudioside D ............................................................................. 10
2.10.8.Dulcosides A ................................................................................. 10
2.11. Tính chất lý hóa: [10] .................................................................................... 10
2.12. Kết tinh ........................................................................................................... 12
2.12.1. Khái niệm ..................................................................................... 12


2.12.2. Cơ sở lý thuyết của quá trình kết tinh ............................................. 13
2.12.3. Tính chất ...................................................................................... 13
2.12.4. Ứng dụng của quá trình kết tinh ..................................................... 14
2.12.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh .................................... 14
2.12.6. Ứng dụng và tình hình sản xuất của đường stevioside ..................... 14

Phần 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 17
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................... 17
3.1.1. Đối tượng ....................................................................................... 17
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................... 17
3.1.3. Hóa chất – Chất chuẩn .................................................................... 17
3.1.4. Dụng cụ chính và thiết bị ................................................................. 17
3.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................... 18
3.1.6. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .............................................. 18
Phần 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 31
4.1. Sắc ký và đường chẩn của stevioside chuẩn. ................................................. 31
4.2. Đánh giá hàm lượng stevioside trong cỏ ngọt ................................................ 32
4.3. Hàm lượng trung bình Stevioside sau khi kết tinh đối với từng phương pháp .. 33
4.4. Hiệu suất kết tinh đối với từng phương pháp ................................................. 36
4.4.1. Hàm lượng Stevioside sau khi kết tinh đối với từng phương pháp .... 36
4.5. Đánh giá chất lượng cảm quan đối với từng phương pháp ........................... 36
4.5.1. Nhận xét về cảm quan qua mắt thường. ............................................ 36
4.5.2. Phương pháp kết tinh bằng kêt tinh lạnh............................................ 36
4.5.3. Phương pháp kết tinh thả mầm tinh thể ............................................ 37
4.5.4. Phương pháp sấy cô đặc. ................................................................. 38
4.5.5. Phương pháp sấy phun .................................................................... 38
4.6. Đánh giá chất lượng cảm quan bằng hội đồng đánh giá ................................ 39
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 41


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần của cỏ ngọt.[11] ................................................................................. 5
Bảng 2.2 : Thành phần axit amin của cỏ ngọt. [11] .............................................................. 6
Bảng 2.3 : Thành phần khoáng của cỏ ngọt [11] .................................................................. 7

Bảng 2.4 : Thành phần chất màu của cỏ ngọt........................................................................ 7
Bảng 3.1: Hệ số trọng lượng đánh giá cảm quan ................................................................ 28
Bảng 3.2: Thang điểm đánh giá cảm quan ........................................................................... 29
Bảng 3.3: Thang điểm đánh giá chất lượng ......................................................................... 30
Bảng 4.1: hàm lượng stevioside kết tinh bằng phương pháp kết tinh bằng phương pháp
kết tinh lạnh ............................................................................................................................. 33
Bảng 4.2: hàm lượng stevioside kết tinh bằng phương pháp thả mầm tinh thể .............. 34
Bảng 4.3: hàm lượng stevioside kết tinh bằng phương pháp cô đặc sấy ......................... 35
Bảng 4.5: hiệu suất kết tinh của các phương pháp ............................................................ 36
Bảng 4.6. đánh giá chất lượng cảm quan ............................................................................. 39


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1 : Cây Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley) ...............................4
Hình 2.2: Cấu trúc hóa học Stevioside ....................................................................... 8
Hình 1.3: steviol .........................................................................................................8
Hình 2.4: Steviolbioside ............................................................................................. 9
Hình 2.5: Sự ổn định và tỷ lệ giảm stevioside ở nhiệt độ cao trong 1 giờ. .............. 10
Hình 2.6: Hàm lượng Stevioside trong khoảng pH 1-10 nhiệt độ từ 60 đến 80oC
trong 1 và 2 giờ ................................................................................................11
Hình 2.7: Tỷ lệ giảm của stevioside trong dung dịch axit hữu cơ Độ hòa tan.[1] ... 12
Hình 3.1. Kết tinh bằng ethanol ...............................................................................21
Hình 3.2: sơ đồ kết tinh bằng phương pháp thả mầm tinh thể ................................. 23
Hình 3.3: sơ đồ kết tinh bằng phương pháp cô đặc và sấy ..................................... 25
Hình 3.4:.Sơ đồ kết tinh bột stevioside bằng phương pháp sấy phun ......................27
Hình 4.1 : Sắc ký đồ của Stevioside chuẩn ..............................................................31
Hình 4.2: Đường chuẩn của Stevioside chuẩn ......................................................... 31
Hình 4.3: Sắc ký đồ chiết Shoxlet từ cỏ ngọt ...........................................................32
Hình 4.4 : Sắc ký đồ trích ly từ cỏ ngọt ................................................................... 33
Hình 4.5:Stevioside kết tinh bằng ethanol ...............................................................37

Hình 4.6: Stevioside kết tinh bằng thả mầm tinh thể ...............................................37
Hình 4.7: Stevioside kết tinh bằng phương pháp sấy cô đặc ...................................38
Hình 4.8: Stevioside kết tinh bằng phương pháp sấy phun ......................................38


1

Phần 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay ước chừng trên thế giới hàng năm khoảng 100 triệu tấn đường được
tiêu thụ, đường lại rất cần thiết cho nhu cầu sinh lý của cơ thể. Tuy nhiên, nó cũng
có mặt trái. Vì tạo ra nhiều năng lượng, nó có thể làm cho cơ thể béo phì, đôi khi
chẳng phải vì do dùng quá độ. Ở miệng, các vi khuẩn có thể sử dụng nó tạo ra acid
tác dụng lên răng. Vì vậy, để tránh lên cân, hỏng răng, cũng như ở các bệnh nhân
mắc chứng tiểu đường, người ta buộc lòng phải kiêng cử hoặc dùng đường ít lại,
kiêng kẹo, kiêng kem, bỏ chè, bỏ nước ngọt,… hay tốt hơn, tìm kiếm một chất thay
thế. Chất nầy cốt yếu phải sinh ra năng lượng ít hơn hoặc có độ ngọt lớn để dùng số
lượng nhỏ lại. Dù sao, nó phải thỏa mãn những điều kiện không được phân hủy
trong miệng khi có nước bọt tác dụng vào và nhất là không được biến đổi trong môi
trường acid của dạ dày như đường.[7]
Hiện nay trên thị trường đã có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt có thể
dùng để thay thế đường (saccharin, sodirn cyclamate, acesulfame potassium, phổ
biến nhất là chất aspartame). Những chất này không có tính chất dinh dưỡng, đặc
biệt là có vị ngọt cao gấp cả trăm lần so với đường nhung lại cho rất ít calorie chỉ có
khoảng 2,2 calo cho mỗi gói nhỏ trong khi chỉ cần một muỗng cà phê đường sinh ra
tới 16 calo. Các chất hóa học này được sử dụng nhiều trong các ngành công nghệp
chế biến thực phẩm đồ ăn, nước giải khát và có thể được con người sử dụng hằng
ngày. Chúng rất rẻ tiền và tiện nhưng là chất hóa học nên người ta rất e ngại rằng

chúng sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe nếu sử dụng lâu dài.
Qua một số nghiên cứu về tác hại của đường hóa học thì saccharin đã bị cấm
sử dụng ở một nghiệm cho thấy nó tạo ung thư bàng quang ở loài chuột.
Đối với những người mắc bệnh phenylketonuria thì không nên dùng
aspatame. Đây là bệnh di truyền rất hiếm thấy, trong đó vì sự lệch lạc của một gene
không thể sản xuất được một enzyeme khử bỏ chất phenylalanine. Khi ăn vào
aspartame sẽ phân thành aspartid acid và phenylalanine, chất này tích tụ trong não
sẽ gây tổn hại cho hệ thần kinh trung ương và có thể dẫn đến tử vong.[8]
Trước các nguy hại này của các chât hóa học, tâm lý chung của người tiêu
dùng là tìm ra các sản phẩm từ thiên nhiên. Trong nhóm những chất tạo vị ngọt


2

thiên nhiên , cây Cỏ ngọt càng ngày càng được nhiều người chú ý đến nhất là nhóm
chất stevioside có trong cây cỏ ngọt, Đặc tính quan trọng là cây cỏ ngọt có hàm
lượng đường rất cao và là nguyên liêu sạch có thể làm ngọt các loại thức ăn và đồ
uống mà không gây độc hại cho người vì vậy có thể tay thế đường hóa học. Để biết
được quá trình stevioside kết tinh thế nào tôi tiến hành “Nghiên cứu quá trình kết
tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu được phương pháp phù hợp cho việc kết tinh đường stevioside.
1.3. Yêu cầu
- xác định sắc ký và đường chuẩn stevioside.
- xác định hàm lượng stevioside có trong cây cỏ ngọt.
- xác địnhhàm lượng stevioside có trong dịch chiết cây cỏ ngọt.
- Tìm ra phương pháp tối ưu và hiệu quả trong 4 phương pháp sau.
- Kết tinh bằng kết tinh lạnh.
- Kết tinh bằng thả mầm tinh thể.
- Kết tinh bằng cô đặc và sấy khô.

- Kết tinh bằng máy sấy phun.
- Kết tinh được sản phẩm stevioside và ứng dụng vào sản xuất công nghiệp
tăng hiệu quả lớn nhất khi kết tinh stevioside.
1.4.1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.2. Ý nghĩa khoa học
- Thực hiện đề tài giúp sinh viên có thể bổ sung kiến thức thực tiễn quan trọng
cho lý thuyết đã học, có thêm kinh nghiệm nghiên cứ khoa học.
- Biết được phương pháp nghên cứu một vẫn đề khoa học, xử lý và phân tích
số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học.
- Kết tinh được stevioside từ dịch cây cỏ ngọt, có thể thay thế đường hóa học.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Đường này có thể dùng thay thế đường mía và đường hóa học.
- Đề suất công nghệ sản xuất đường stevioside từ dịch cây cỏ ngọt.
- Trong công nghiệp thực phẩm, stevioside làm tăng độ ngọt mà không làm
tăng năng lượng của thực phẩm.
- Đây là sản phẩm tự nhiên hoàn toàn, phù hợp với sức khỏe của con người.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2. Cây cỏ ngọt.
2.1. Giới thiệu chung
Tên thường gọi: Cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc;
Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley;
Tên đồng nghĩa: Eupatorium rebaudianum Bert [1];
2.2. Phân loại khoa học [1]
Giới : Plantae
Bộ : Asterales

Họ : Asteraceae
Tông : Eupatorieace
Chi : stevia
2.3. Phân loại theo loài
Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ,
Mexico và một vài tiểu bang miền nam Hoa Kỳ.
Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau:
- Stevia eupatoria
- Stevia plummerae
- Stevia rebaudiana
- Stevia salicifolia
- Stevia serrata
Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngọt thì có khoảng
18 loài có thể tạo vị ngọt nhưng chất ngọt trong 18 loài này stevia ribaudiana là loài
cho chất ngọt nhiều nhất. [1]
2.4. Nguồn gốc cây cỏ ngọt
Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ
Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ba Nha đã từng đề cập đến loại thảo
mộc này nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises
Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi là Stevia rebaudianoa
Bertoni.


4

Từ ngàn năm nay thổ dân Gurani người Paraguay đã dùng loại thảo mộc này
làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng để trị một số bệnh
béo phì,tim mạch, cao huyết áp.[7]
2.5. Mô tả cây
Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6m, có khi đến 1m. Thân cứng mọc

thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh. Lá mọc đôi, hình mác hoặc
hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5-7cm, rộng 1-1,5cm, có 3 gân,
4-6 đôi răng nhọn ở phân nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá
thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn. Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu trắng ở
ngọn thân. Quả bé, không có mào lông, hạt không có hột nhũ.
Mùa hoa: tháng 5-9
Bộ phận dùng: Phần trên mặt đất của cây cỏ ngọt.[1]

Hình 2.1 : Cây Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley)
2.6. Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt.
Cỏ ngọt bao gồm carbohydrate (61,93% dw – trọng lượng khô), protein
(11,41% dw), chất xơ thô (15,52% dw), khoáng chất (K, 21,15; Ca, 17,7; Na, 14,93;


5

Mg, 3,26 và Cu, 0,73; Mn, 2,89; Fe, 5,89 và Zn, 1,26 mg/100g dw) và các axit amin
thiết yếu. [10]
Bảng 2.1: Thành phần của cỏ ngọt.[11]
Thành phần

% dựa trên trọng lượng khô

Độ ẩm

5,37

Protein

11,41

Chất béo

3,73

Xơ thô

15,52

Tro

7,41

Carbohydrates

61,93

Đường khử

5,88

Đường không khử

9,77

Tổng số carbohydrates hòa tan

15,65

2.7. Thành phần axit amin.

Về thành phần các axit amin, các dữ liệu cho thấy lá Stevia khô chứa các axit
amin thiết yếu (arginin, lysine, histidine, phenyl alanine, leucine, methionine,
valine, therionine và isolucine) với lượng cao hơn so với những khuyến cáo của
FAO và WHO cho người lớn hàng ngày cũng như các axit amin không thiết yếu
(aspartate, serine, glutamic, proline, glycine, alanine, cystine và tyrosine). Kết quả
tương tự báo cáo rằng có 20 amino acid, 9 axit amin được xác định là acid glutamic,
aspartic acid, lysine, serine, isoleucine, alanine, proline, tyrosine và methionine.[11]


6

Bảng 2.2 : Thành phần axit amin của cỏ ngọt. [11]
Amino axit thiết yếu

Amino axit không thiết yếu

Hàm lượng(g/100g)
Tên

Tên

Hàm lượng
(g/100g)

Lá stevioside

FAO/WHO

Lá stevioside

Arginin

0,45

0,35

Aspartate

0,37

Lysine

0,70

0,58

Serine

0,46

Histidine

1,13

0,18

Glutamic

0,43

Phenyl alanine

0,77

0,63

Proline

0,17

Leucine

0,98

0,66

Glycine

0,25

Methionine

1,45

0,25

Alanine

0,56

Valine

0,64

0,35

Cystine

0,40

Therionine

1,13

0,34

Tyrosine

1,08

Isolucine

0,42

0,28

Tổng

7,67

3,62

Tổng

3,72

2.8. Hàm lượng khoáng chất.
Cỏ ngọt chứa một lượng đáng kể các chất dinh dưỡng quan trọng. Điều này
cho thấy cỏ ngọt là một thành phần cần thiết để bảo vệ cơ thể, điều chỉnh và duy trì
quá trình trao đổi chất khác nhau. Kali, canxi, magiê, natri và chất dinh dưỡng quan
trọng, đã được tìm thấy với lượng hợp lý trong lá cỏ ngọt. Kẽm và mangan được coi
là vi chất dinh dưỡng chống oxy hóa và do đó, sự hiện diện của chúng có thể thúc
đẩy hệ thống miễn dịch và phòng chống các bệnh. Sắt là một yếu tố cần thiết cho
tổng hợp hemoglobin. Lượng sắt cao trong lá Stevia rất hữu ích trong việc duy trì
mức huyết cầu tố bình thường trong cơ thể. Hơn nữa, lá Stevia cũng có thể được sử
dụng để chống thiếu sắt, thiếu máu và rối loạn dinh dưỡng. [11]


7

Bảng 2.3 : Thành phần khoáng của cỏ ngọt [11]
Khoáng vĩ mô Hàm lượng(mg/100g)

Khoáng vi
lượng

Hàm
lượng(mg/100g)

K

21,15

Cu

0,73

Ca

17,70

Mn

2,89

Na

14,93

Fe

5,89

Mg

3,26

Zn

1,26

2.9. Chất diệp lục (A và B), carotenoids trong cỏ ngọt. [11]
Bảng 2.4 : Thành phần chất màu của cỏ ngọt
Lá tươi
Nội dung

Lá khô

Nồng độ

Nồng độ

mg/100g

mg/100g

% giảm
của chất
màu khi
phơi khô

Chlorophyll A

77,40

40,71

47,40

Chlorophyll B

46,39

27,22

41,32

Carotenoids

30,50

7,67

74,85

Tổng

154,29

75,60

50,99

2.10. Các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt. [1]
2.10.1. Stevioside
Công thức hóa học : C38H60O18
Công thức cấu tạo:


8

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học Stevioside
- Stevioside là tinh thể hình kim, điểm nóng chảy 202-204°C, ít tan trong cồn.
- Độ ngọt gấp 110- 270 (300) lần đường sucurose. Vì vậy nó cho ta cảm giác
rất ngọt, không tạo caloric và ổn định ở nhiệt độ cao 198°C, nhưng không trở nên
đậm màu hay tạo Caramen đặc.
- Hàm lượng : 4-13% chất khô.
- Tinh thể hút ẩm mạnh.
- 1 gram tan trong 800ml nước. Tan trong Dioxane. Tan ít trong alcohol
2.10.2. Steviol
Công thức hóa học : C20H30O3
Công thức cấu tạo :

Hình 1.3: steviol


9

Steviol là thành phần không đường của glusides, nó là cơ sở để xây dựng nên
các phân tử đường khác.
Vd: stevioside và rebaudioside A.
2.10.3. Steviolbioside
- Công thức cấu tạo: R1 là H, R2 là G-G

Hình 2.4: Steviolbioside
- Là chất có hàm lượng rất nhỏ trong cây cỏ ngọt.
- Bên cạnh Stevioside, số lượng ít hơn nhưng ngọt hơn stevioside 1,2-1,5 lần.
2.10.4. Rebaudioside A
- Công thức hóa học: C44H7O2.3H2O
- Công thức cấu tạo: R1 là G, R2 là G (2G)

- Rebaudioside A là chất kết tinh không màu, điểm nóng chảy là 242-2440C,
có độ ngọt rất cao bằng 130-320 lần đường surcose.
- Hàm lượng: 2-4% lượng chất khô.
2.10.5. Rebaudioside B
- Công thức hóa học : C38H60O18.2H2O
- Công thức cấu tạo : R1 là H, R2 là G(2G)
- Rebaudioside B là chất kết tinh không màu, điểm nóng chảy 193-1950C.
- Hàm lượng rất nhỏ vào khoảng 0,03- 0,07% hàm lượng chất khô.
2.10.6. Rebaudioside C ( Dulcoside-B)
- Công thức hóa học C44H70O22.3H2O


10

- Công thức cấu tạo: R1 là G, R2 là G(G) Rh
- Rebaudioside C có điểm nóng chảy là 235-2380C. Nó ngọt gấp 40-60 lần
Sucrose.
- Hàm lượng 1-2% trọng lượng chất khô.
2.10.7. Rebaudioside D
- Công thức cấu tạo: R1 là –G-G, R2 là G(2G)
- Có điểm nóng chảy 2830C
- Hàm lượng rất nhỏ 0,1-0,2% lượng chất khô
2.10.8.Dulcosides A
- Công thức cấu tạo :R1 là G,R2 là G-Rh
- Có độ ngọt gấp 30 lần đường Sucrose
- Hàm lượng :0,5-1% trọng lượng chất khô
2.11. Tính chất lý hóa: [10]
- Tính hút ẩm mạnh.
- Nhiệt độ nóng chảy: 1980C
- Độ ngọt gấp 300 lần so với độ ngọt của đường mía.

- Tính tan: 1 gram tan trong 800 ml nước cất. tan trong Dixane, tan ít trong
alcohol.
- Sự ổn định của stevioside ở nhiệt độ cao [10]

Hình 2.5: Sự ổn định và tỷ lệ giảm stevioside ở nhiệt độ cao trong 1 giờ.


11

Giữ stevioside rắn ở nhiệt độ cao trong 1 giờ cho thấy sự ổn định tốt lên đến
120°C. Khi nhiệt độ lên tới 140oC thì bắt đầu quan sát được sự phân hủy. Tới 2000C
thì sự phân hủy xảy ra gần như hoàn toàn. Điều đó cho thấy Stevioside không phù
hợp với các quá trình cần có nhiệt độ cao như nướng.
- Sự ổn định của stevioside ở pH khác nhau tại nhiệt độ cao [10]

Hình 2.6: Hàm lượng Stevioside trong khoảng pH 1-10 nhiệt độ từ 60 đến 80oC
trong 1 và 2 giờ
Trong dung dịch nước stevioside là khá ổn định qua một loạt các giá trị pH và
nhiệt độ. Khảo sát các nhiệt độ khác nhau trong phạm vi pH 2-10 trên 2 giờ, thực tế
không có sự giảm của stevioside ở 60°C, Khi nhiệt độ lên tới 80oC thì sự phân hủy
khoảng 5%, ở pH =1 Stevioside bị giảm đáng kể.
- Sự ổn định của stevioside trong các axit hữu cơ [10]
Sự ổn định của stevioside ở nhiệt độ phòng trong dung dịch các axit hữu cơ
(10 g / l), axit axetic, axit citric và axit tartaric trong khoảng thời gian lên đến 4
tháng cho thấy sự phân hủy của các chất làm ngọt giảm tại giá trị pH thấp hơn.
Trong 10 g / l dung dịch axit axetic (pH 2.6), acid citric (pH 2.1) và axit tartaric (pH
2.1), độ giảm stevioside là 2; 22 và 33% đã được quan sát sau 4 tháng bảo quản.
Vậy chất ngọt Stevia trong dung dịch nước ổn định trong điều kiện có tính axit và
trung tính nhưng thực phẩm ở nhiệt độ hơi cao. không ổn định trong điều kiện kiềm.
Cũng stevioside có vẻ là tương đối ổn định trong chất

12

Hình 2.7: Tỷ lệ giảm của stevioside trong dung dịch axit hữu cơ Độ hòa tan.[1]
Một số nghiên cứu trong lĩnh vực này cho thấy chất ngọt Stevia hòa tan cao
trong methanol và ít hòa tan trong nước. Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, các
chất làm ngọt Stevia là ít tan trong hexan, không hòa tan trong aceton, cloroform và
ether. Theo báo cáo nghiên cứu của bộ môn Hoá hữu cơ thì 1 gram tan trong 800ml
nước. Tan trong Dioxane. Tan ít trong alcohol. Các kết quả khác nhau này là do các
chất làm ngọt Stevia bao gồm một số hợp chất tạo ngọt khác nhau và tính tan của
chúng trong các dung môi là khác nhau.
2.12. Kết tinh
2.12.1. Khái niệm
Nếu giả thiết các phần tử cấu tạo nên vật chất là các nguyên tử, ion hoặc phân
tử, thì tinh thể là trạng thái mà ở đó, các phần tử sắp xếp trong không gian tạo nên
một quy luật nào đó. Về mặt hình học, các phần tử cấu tạo được xem như những
chất điểm, quy luật của những chất điểm này là tính đối xứng và hoàn toàn trong
không gian tinh thể. Do vậy, tinh thể thường nhận một hình thái nhất định dưới
dạng một đa diện nào đó.
Khi làm nguội từ từ một dung dịch bão hòa hay một chất lỏng, chuyển động
nhiệt của các hạt giảm, những phân tử, nguyên tử hay ion tập hợp lại và phân bố,


13

sắp xếp thành mạng lưới không gian với một cấu trúc xác định. Khi đó ta có một
tinh thể, hay quá trình này gọi là quá trình kết tinh.
Trong thực tế, các chất rắn tinh thể được tạo thành từ nhiều tinh thể rất nhỏ
(khoảng 10 – 20 µm) định hướng khác nhau. Các chất rắn như vậy gọi là đa tinh thể.

Với những tinh thể tạo nên chất rắn như một tinh thể duy nhất được gọi là đơn
tinh thể [9]
2.12.2. Cơ sở lý thuyết của quá trình kết tinh
Khi dung dịch bão hòa ở một nhiệt độ cao được để nguội dần thì độ tan sẽ giảm
dẫn đến hiện tượng kết tinh và ta thu được tinh thể. Hình dạng, màu sắc, kích cỡ của tinh
thể thu được phụ thuộc vào bản chất của chất đem hòa tan thành dung dịch, nhiệt độ
trong quá trình làm nguội, thời gian và điều kiện nuôi mầm tinh thể ... [9]
2.12.3. Tính chất
Tính bất đẳng hướng của tinh thể: Trong tinh thể, các đơn vị cấu trúc liên kết
với nhau bằng những liên kết hóa học và được phân bố một cách tuần hoàn theo
những quy luật nhất định tạo thành một mạng lưới không gian đều đặn, mặc dù
chúng có thể đẳng hướng với một vài tính chất nào đó.
Tính bất đẳng hướng thể hiện ở chỗ nhiều tính chất vật lý như độ bền cơ học,
sự khúc xạ ánh sáng, tính dẫn nhiệt, tính dẫn điện, độ cứng, tốc độ hòa tan,...
- Tính định vị nhất định trong vùng không gian tinh thể: Ở nhiệt độ thường,
các phân tử dao động quanh vị trí cân bằng với một biên độ nhất định, nhưng nhiệt
độ càng tăng, biên độ dao động càng lớn.
- Mỗi tinh thể trong quá trình kết tinh phụ thuộc vào các yếu tố sau:
+ Tính đối xứng: Thông thường một chất có thành phần hóa học càng đơn
giản thì mạng lưới tinh thể có tính đối xứng càng cao.
+ Tỷ lệ giữa bán kính các loại hạt trong mạng lưới.
+ Lực tương tác giữa các hạt (bao gồm độ mạnh, tính định hướng của các mối
liên kết giữa các hạt).
+ Điều kiện bên ngoài (nhiệt độ, áp suất,...), đôi khi cũng ảnh hưởng đến cấu
trúc của tinh thể. [9]


14

2.12.4. Ứng dụng của quá trình kết tinh

Tách chất lỏng hóa chất rắn, trong đó sẽ xảy ra quá trình chuyển đổi chất tan
trong dung dịch lỏng vào trong pha rắn mà ở đó tinh thể hình thành ở dạng tinh sạch
nhất.[9]
2.12.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh
Nhiêt độ: làm nguội dung dịch diễn ra càng chậm thì các bạn sẽ càng thu được
tinh thể có kích thước lớn.
Kích thước tinh thể của một chất tuỳ thuộc quá trình hình thành tinh thể diễn
biến nhanh hay chậm, tốc độ kết tinh càng nhỏ, tinh thể có kích thước càng lớn.
Hóa chất để tạo thành mầm tinh thể. [9]
2.12.6. Ứng dụng và tình hình sản xuất của đường stevioside
3.3.6.1. Ứng dụng và triển vọng của stevioside
Stevioside được biết đến như là một chất ngọt tự nhiên không chứa nhiều năng
lượng, được được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, thức uống, thuốc men và hóa
chất hàng ngày, trong tất cả các sản phẩm ðýờng, các stevioside có thể ðýợc sử
dụng ðể thay thế các loại ðýờng. Hiện nay, chủ yếu là stevioside ðýợc sử dụng trong
ðồ uống và thuốc, ðặc biệt là trong nýớc giải khát, cũng ðýợc sử dụng trong thực
phẩm ðông lạnh, ðồ hộp, các loại kẹo trái cây, gia vị, rýợu vang, kẹo cao su và kem
ðánh rãng.
Vì stevioside không cung cấp nhiều năng lượng như các loại đường, nên
stevioside thích hợp cho những người bị béo phì và những người bị bệnh tiểu
đường. Tuy nhiên, stevioside không phải là một loại thuốc mà chỉ là một loại thực
phẩm chức năng giành cho những người ăn kiêng. Giá

trị năng lượng của

stevioside thay đổi tùy theo các điều kiện cụ thể như quá trình điều chế và sự bảo
quản cũng như các hiệu ứng của nó với các vitamin, các chất có trong cơ thể như
vitamin C, axit thiamin, riboflavin, pyridoxin, nicotinic, các axit hữu cơ như axit
axetic, axit citric, axit tartaric, và axit photphoric…
Ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc… stevioside được sử dụng

nhiều làm chất ngọt thay thế như một phụ gia trong thực phẩm, nhưng ở các nước


15

phương Tây và Bắc Mỹ thì giá trị của stevioside chưa được công nhận và chỉ được dùng
như một loại thực phẩm chức năng giành cho những người bị bệnh béo phì.
Do còn có nhiều tranh cãi về tác dụng của stevioside nên mặc dù đã được biết
đến từ lâu nhưng ngày nay stevioside vẫn tiếp tục được nghiên cứu và mở ra nhiều
hướng ứng dụng mới như một loại thuốc chữa bệnh tiểu đường. [12]
- Tình hình sản xuất trên thế giới
Cỏ ngọt được rất nhiều hãng công nghệ, nhiều phòng thí nghiệm kể cả ở Việt
Nam chú ý đến. Trong khoảng trên dưới 500 bản báo cáo, bên cạnh một số lớn các
bài khảo cứu thuần túy, phân tích và xác định cấu tạo, những năm gần đây còn có
một số lớn bàn về các phương cách chiết xuất, làm tinh khiết, những ứng dụng chất
ngọt vào kỹ nghệ, đặc biệt khoảng một trăm văn bằng sáng chế mà trong đó ba phần
tư là của Nhật Bản. Trong số 184 cây stevia đã được khảo sát, 18 loại cho chất ngọt
nhưng không có loại nào cho chất ngọt nhiều bằng Stevia rebaudiana. Ngày nay,
người ta thường dùng nước để chiết xuất chất ngọt trong cây, nhưng cũng thấy có
nhiều trường hợp dùng rượu (methanol, ethanol hay butanol) pha lẫn với nước. Còn
có một phương pháp chiết xuất dùng CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn
(supercritic) tạo ra những sản phẩm rất sạch sau khi xử lý khoan quay, ly tâm và lọc
qua màng lọc, cột trao đổi ion,… Để loại trừ dư vị, ngoài cách dùng màng lọc bán
thấm (semipermeable), những phương pháp đề nghị có thể chia làm hai loại : sử
dụng hoặc sắc ký hoặc kim loại, khoáng chất. Cột sắc ký thường là silicagel,
amberlite, duolite zeolite (đủ cỡ), các chất trùng hợp metaphenylenediamin
formaldehyd hay styren divinylbenzyl,… Kim loại, khoáng chất được dùng là Al,
Fe, Ca dưới các thể oxid, chlorid, sulfat, carbonat, thường thấy nhất là calcium
dihydroxid. Năng suất chiết xuất nằm trong vòng 5-7% nhưng cũng có văn bằng
đưa ra số 11-26%.

Những năm gần đây, cỏ ngọt được trồng thành cây công nghiệp ở các nước
Brazin, Hàn Quốc, Đài Loan. Để thử tăng năng suất chất ngọt, đã thấy có dùng
enzym của Aspergillus oryzae biến hoá stevioside ra thành rebaudioside A vì chất
này ngọt hơn. Bên Nhật Bản, hãng Toyo Sugar refining bán một chất ngọt mang tên


16

Stevia, ngọt hơn 150 lần saccharose với ít nhiều dư vị : chất này được dùng trong
canh, cháo, sirô, nước chấm. Công ty Toyo Soda dùng một enzym khác, glycosyl
transferase, cho tác dụng trực tiếp lên stevia và tinh bột đem lại một chất chỉ ngọt
hơn 120 lần saccharose nhưng mất được phần lớn dư vị. Từ 1983, hãng Jefco cho
biết đã dùng một phương pháp chiết xuất rất hiện đại và có hiệu quả để chế biến
một chất ngọt hơn 300 lần saccharose, loại bỏ được mọi bất tiện lúc ban đầu của
steviosid : vị đắng, ít ổn định. Để cạnh tranh với công ty này, hãng Tama
Biochemical dùng phương pháp cấy mô để cho tăng số lượng stevioside trong cây.
Có thể thấy, những nghiên cứu trên thế giới để tinh chế cỏ ngọt đã tương đối
hoàn thiện, mang lại những sản phẩm có độ tinh khiết cao, tuy nhiên, vì tính kinh tế
nên những phương pháp này chưa thể áp dụng tại Việt Nam. [6]
- Tình hình sản xuất ở Việt Nam
Tính đến thời điểm hiện tại, người dân Việt Nam vẫn quen sử dụng cỏ ngọt
như một thứ đồ uống, cỏ ngọt thường được trồng và xuất khẩu ở dạng thô, chưa qua
chế biến, mang lại hiệu quả kinh tế thấp. Gần đây, có một số đề tài nghiên cứu về
tinh chế Stevioside, tuy nhiên, hầu hết chúng đều có chung nhược điểm là phức tạp,
độ tinh khiết thấp, giá thành sản xuất cao, khó có thể áp dụng rộng rãi trong công
nghiệp. Trên thị trường hiện nay những sản phẩm từ cỏ ngọt hầu hết là ở dạng chè
túi lọc, chưa tận dụng hết được nguồn nguyên liệu sẵn có. Vừa qua, một đề tài sản
xuất Stevioside từ cỏ ngọt của Sở Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã được nghiệm
thu, nhưng do những chi phí sản xuất cao nên vẫn chưa thể đưa ra sản xuất đại trà.
Yêu cầu hiện nay là đơn giản hóa quá trình sản xuất và giảm giá thành sản phẩm để

có thể đưa những sản phẩm trong phòng thí nghiệm ra quy mô lớn hơn. [6]


17

Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng
Cỏ ngọt được công ty chè Hiệp Khánh trồng và thu hoạch, phơi khô và bảo
quản trong túi nilon.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu quá trình kết tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt
3.1.3. Hóa chất – Chất chuẩn
Stevioside chuẩn (hàm lượng >98%) của Mỹ
Bột Ca(OH)2
Axit Citric 15%
Than hoạt tính điều chỉnh pH
3.1.4. Dụng cụ chính và thiết bị
Dụng cụ chính :
Bình tam giác 100ml, 250ml, 500 ml, 1000ml
Giấy lọc
Giấy pH
Phễu, pipet
Buret 10ml, 20ml
Cốc 100ml, 500ml, 1000ml
Ống đong 1000ml
Đũa, đĩa cân
Thiết bị :
Cân phân tích OHAUS - Đức

Bình ổn nhiệt HH-2(Trung Quốc)
Máy khuấy JJ-1(Trung Quốc)
Thiết bị cất quay chân không Heidolph - Đức


18

Bơm hút chân không MZ 2C NT - Đức
Bộ lọc hút chân không
máy sấy phun BF-06-D-44 (Đức)
Tủ lạnh, máy sấy, tủ nung, bếp điện có khả năng điều chỉnh nhiệt độ
Máy cất nước GFL - Đức
Bể siêu âm Elma S900H - Đức
3.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thục hiện tại bộ môn Quá trình – Thiết bị Công nghệ Hóa học
trường đại học Bách Khoa Hà Nội.
Thời gian tiến hành từ tháng 11/2013 đến tháng 6/ 2014.
3.1.6. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
4.1.6.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá hàm lượng stevioside có trong cỏ ngọt và dịch sau khi
trích ly.
- Xác định sắc ký đồ và đường chuẩn của stevioside chuẩn
- Nghiên cứu và xác định hàm lượng stevioside có trong cỏ ngọt.
- Nghiên cứu và đánh giá hàm lượng stevioside trong dịch trích ly.
Nội dung 2: các thí nghiệm kết tinh stevioside có trong cỏ ngọt
- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%)
bằng phương pháp kết tinh lạnh
- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%)
bằng phương pháp thả mầm tinh thể
- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%)

cô đặc và sấy.
- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%.)
bằng phương pháp sấy phun
Nội dung 3:
_ đánh giá cảm quan của sản phẩm sau kết tinh.


19

4.1.6.2. Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành xác định hàm lượng đường stevioside bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPCL) theo phương pháp Abou –Arab et al. (2010) trên hệ thống thiết bị
Alliance của hãng Waters, Mỹ của viện dinh dưỡng quốc gia, Bộ Y tế.

- Phân tích hàm lượng và hiệu suất tinh chế bằng phương pháp sắc ký
lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) với các điều kiện như sau :
• Cột sắc ký: XBD-C18-5µm-4,6×150mm
• Pha động: Methanol/Nước (64.36 v/v)
• Tốc độ dòng: 1ml/phút
• Lượng bơm mẫu: 10ml
• Bước sóng: λ=219nm
• Thời gian: 15min
• Nhiệt độ buồng cột: 25oC
- Phân tích định tính nồng độ chất màu bằng phương pháp đo độ hấp thụ
quang sử dụng máy UV – Vis quét dải sóng từ 190nm – 1100nm. Cắn chiết
được pha nước tới nồng độ 500mg/l, lấy độ hấp thụ quang của tạp chất ở
250nm, vì các yếu tố khác không đổi, nên độ hấp thụ quang tỷ lệ với nồng độ
tạp chất trong dung dịch
Phương pháp 1: Xác định sắc ký đồ và đường chuẩn của stevioside chuẩn
Thực hiện: Pha 10g stevioside chuẩn (hàm lượng >98%) của mỹ bổ sung

100ml nước cất và lắc đều sau đó đem vào máy siêu âm trong 30 phút có khuấy trộn
và lọc lại bằng giấy lọc 0,45 µm, sau đó đem đi phân tích trên máy sắc ký lỏng cao
áp HPCL.
Phương pháp 2: Xác định hàm lượng stevioside có trong cỏ ngọt.
Thực hiện: : cân 10g mẫu bột lá cỏ ngọt đã được sấy khô và nghiền mịn vào
bình nón, bổ sung 100ml nước cất và lắc đều sau đó đem vào máy siêu âm trong 30
phút có khuấy trộn, sau đó đem đi phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp HPCL.
Thí nghiệm 3: Đánh giá hàm lượng stevioside trong dịch trích ly.