Bài giảng vi sinh vật thực phẩm chương 6 một số phương pháp xác định vi sinh vật

MOÄT SOÁ PHÖÔNG PHAÙP XAÙC ÑÒNH
VI SINH VAÄT


I. HOÁ CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

- Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần
cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo
quản, đònh danh vi sinh vật…
- Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn
carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi lượng… và có các điều
kiện lý hoá phù hợp


I. HOÁ CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

Phân loại:
* Theo bản chất
- Tự nhiên
- Tổng hợp
- Bán tổng hợp
* Theo trạng thái vật lý
- Lỏng (Brothe)
- Rắn
- Bán lỏng (bán rắn)
* Theo mục đích
- Môi trường tiền tăng sinh
- Môi trường tăng sinh:
- Môi trường chọn lọc
- Môi trường phân biệt
- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU
1. Những điểm cần lưu ý:
- Mẫu được lấy phải mang tính đại diện
- Tránh sự tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai.
-Mẫu chưa sử dụng phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân
tích. Mẫu không thể bảo quản đông thì bảo quản ở nhiệt độ 0-4.4oC.
- Mẫu phải được xét nghiệm trong vòng 36h, mẫu không thể đông lạnh
cần xét nghiệm trong vòng 6 h.
- VSV có thể bò tổn thương, trong nhiều trường hợp cần giai đoạn tăng
sinh.
- Cần ghi chú mẫu


II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU

2. Kế hoạc lấy mẫu:
Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m,
M
- Giới hạn vsv, m & M
+ Chấp nhận (< m)
+ Ngưỡng lân cận giới hạn (> m và < M)
+ Không chấp nhận (> M);
- Số mẫu rơi vào trong mỗi khoảng giới hạn vsv (c) (có nghóa là
chấp nhận/lân cận/không chấp nhận).


II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU
2. Kế hoạc lấy mẫu:

* Kế hoạch hai thuộc tính
- Chỉ nêu ra m
- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử >m thì
chấp nhận lô hàng, nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m thì từ chối lô hàng
* Kế hoạch ba thuộc tính
- Đặt ra cả m và M
- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP
- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm
và không chấp nhận được
- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử nằm
trong khoảng >m và M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu >c mẫu trong số n
mẫu thử nằm trong khoảng > m và M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô
sản phẩm


II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU

2. Kế hoạc lấy mẫu:
* Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu
- Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm
không được phép có trong thực phẩm.
- Nếu cho phép một số lượng nhất đònh vsv trong một
đơn vò thể tích thì thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính.


II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU
3. Thu và vận chuyển mẫu
- Thu tại nhiều thời điểm và vò trí. Đối với loại thực phẩm đã biết chỉ nhiễm
bề mặt thì cần dùng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất
đònh hoặc cắt lát với bề dày 2-3 mm để thu mẫu

- Dụng cụ chứa bằng bình nhựa có nắp (tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh dễ
vỡ)
- Chú ý nhiệt độ và thời gian vận chuyển, bảo quản mẫu (còn tuỳ đặc điểm
của thực phẩm)


II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU
- Các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE, đặt vào
khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên ở
nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5oC trong 18 h; hoặc 45oC trong 15 phút
nếu cần.
- Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bò phồng,
biến dạng, bò hở các mối ghép hay khôn. Lau chùi bằng cồn phía ngoài, đưa
vào phòng vô trùng để kiểm.
- Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon… phải kiểm tra độ
kín của bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm


II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU
4. Chuẩn bò mẫu phân tích
- Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: Cân 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào
cối sứ nghiền nát, bỏ vào erlen 150 ml có sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay
nước cất đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dòch để cấy mẫu, ta
có độ pha loãng 10-1.
- Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: cân 10-100 g mẫu (cả cái lẫn
nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền. Cân 10 g đã nghiền nát cho vào
erlen 250 ml có 90 ml dung dòch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều,
để lắng cặn. Hút phần dòch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1.
- Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: Có thể hút trực tiếp mẫu hoặc pha
loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10 ml mẫu cho vào erlen

250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt khuẩn. Ta có độ
pha loãng 10-1.
- Dung dòch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước muối
sinh lý (0.85%), trong buffer nếu cần.


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, việc đònh danh vi sinh vật
được thực hiện dựa vào các đặc điểm về kiểu hình và các phản ứng sinh
hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật. Các phản ứng sinh hoá có thể tiến
hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và
dùng thiết bò tự động.
Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá
biểu thò quy ước bằng các ký hiệu như:
(+): dương tính
(-): âm tính
(+/-): khoảng trên 70% là dương tính
(-/+): khoảng trên 70% là âm tính.



III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.1. Thử nghiệm khả năng lên men
- Xác đònh khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất đònh bởi vi
sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men.
- Sản phẩm tạo thành làm giảm pH môi trường làm thay đổi màu
môi trường
- CO2 tạo ra, được bẫy bằng ống Durham, làm nổi ống.
- Môi trường sử dụng:
+ Phenol Red Broth Base: đỏ (pH 7,4)vàng (pH 6,8): có nguồn

Carbon tuỳ theo vi sinh vật
- Dùng để đònh danh các vi sinh vật thuộc hộ Enterobacteriacea (vi
sinh vật đường ruột)
+ E.coli, Klebsiella, Staphylococcus: +
+ Corynebacterium: -


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.1. Thử nghiệm khả năng lên men

+

+

-

-


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men (Thử nghiệm
Hugh-Leifson)
- Thử nghiệm nhằm xác đònh vi sinh vật biến dưỡng carbon hydrat theo con
đường lên men hay hô hấp
- Môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thò pH là bromothymol blue
-Thử nghiệm gồm 2 ống môi trường; một ống được phủ paraffin lên bề mặt
môi trường. Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường
- Lên men: 2 ống bò acid hoá từ trên mặt xuống đáy môi trường
-Hô hấp: ống kỵ khí bò acid hoá đều hết môi trường, ống hiếu khí bò acid
hoá chỉ ở phần đáy

III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men (Thử nghiệm
Hugh-Leifson)

Hô hấp


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.3. Thử nghiệm Bile Esculin
- Thử nghiệm phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thuỷ
phân liên kết glucoside trong esculin thành esculentin và
glucose.
- Esculentin phản ứng với muối sắt tạo phức hợp màu nâu hay
đen
- Môi trường: Aesculin Medium hay Edwards
- Sau phản ứng:
+ hoá nâu hay đen: +
+ Không đổi màu: -


III. THệ NGHIEM SINH HOA
3.1.3. Thửỷ nghieọm Bile Esculin

+

-

III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
- Xác đònh khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của
vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối
amonium
- Sản phẩm tạo thành là NH3 làm kiềm hoá môi trườngthay đổi màu của
môi trường.
- Môi trường Simmons citrat agar chứa chỉ thò bromothymol blue, xanh lục
(pH trung tính), xanh dương (pH>7,6)
- Sau phản ứng:
+ xanh lục: + Xanh dương: +


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

+

-



III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.5. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
- Xác đònh khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy nhất. Ở những
chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amonium
- Sản phẩm tạo thành là NH3 làm kiềm hoá môi trườngthay đổi màu của
môi trường.
- Môi trường Malonate Broth chứa chỉ thò bromothymol blue, xanh lục (pH
trung tính), xanh dương (pH>7,6)

- Sau phản ứng:
+ xanh lục: + Xanh dương: +


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.5. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

+

-


III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ
3.1.6. Thử nghiệm catalase
- Dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí
- Vi sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H2O2 (chất
rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2.
- Hoá chất: H2O2 30% được giữ lạnh.
-Nhỏ một giọt sinh khối vi sinh vật lên một giọt H2O2.
+ Nếu có sự sủi bọt (O2 sinh ra)vi sinh vật hiếu khí. Vi dụ:
Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus
+ Không suất hiện bọt khí, vi sinh vật kỵ khí. Ví dụ: Clostridium,
Streptococcus


III. THệ NGHIEM SINH HOA
3.1.6. Thửỷ nghieọm catalase

-

+
+

-