Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen GEN mùi thơm trên cây lúa (oryza sativa l)

GIÁO D C VÀ ÀO T O

NÔNG NGHI P VÀ PTNT

VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM
---------

CHÂU T N PHÁT

NG D NG CH TH PHÂN T
VÀ DÒNG BAC

XÁC

PCR

NH GEN

MÙI TH M TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa L.)

LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P

N TH

- 2013


B

GIÁO D C VÀ ÀO T O

B

NÔNG NGHI P VÀ PTNT

VI N KHOA H C NÔNG NGHI P VI T NAM
---------

CHÂU T N PHÁT

NG D NG CH TH PHÂN T
DÒNG BAC

XÁC

PCR VÀ

NH GEN MÙI

TH M TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa L.)
Chuyên ngành: Di truy n và Ch n gi ng cây tr ng
Mã s : 62.62.01.11
LU N ÁN TI N S NÔNG NGHI P
Ng

ih

ng d n khoa h c:

1. GS.TS. Nguy n Th Lang
2. GS.TS. Bùi Chí B u

N TH

- 2013


ii

ng Hòa Xã H i Ch Ngh a Vi t Nam
c l p – T Do – H nh Phúc
-------------

I CAM OAN

Tôi xin cam oan công trình nghiên c u:” ng d ng ch th phân t PCR
và dòng BAC

xác

nh gen mùi th m trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là

a riêng tôi. Các s li u, k t qu nêu trong lu n án là trung th c và ch a t ng
ai công b trong b t k công trình nào khác.

Tác gi lu n án

Châu T n Phát

c


iii

IC MT
Xin chân thành bi t n các Th y, các Cô h
-

ng d n khoa h c:

GS.TS. Nguy n Th Lang, ã h t lòng ch d n nh ng n i dung c n thi t
th c hi n các môn h c, các thí nghi m và n i dung nghiên c u

hoàn

thành lu n án.
-

GS.TS. Bùi Chí B u, ã t n tình ch b o và h
ph

ng d n các n i dung,

ng pháp và k ho ch tri n khai thành công các môn h c, th c hi n

các thí nghi m.
-

Các th y cô tham gia gi ng

o Vi n Lúa

y l p nghiên c u sinh khóa 1

ào

ng b ng sông C u Long.

Không th hoàn thành lu n án n u không có s giúp
và

ac s

h

ng d n khoa h c

ng viên c a Cô và Th y.

Xin chân thành bi t n H i
th i gian

ng ánh giá lu n án c p C S : ã dành nhi u

c và óng góp nhi u ý ki n qúi báu cho lu n án

c hoàn thi n.

Xin chân thành c m n:
-

Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam.

-

Ban giám

c Vi n Lúa

ng b ng sông C u Long, ã giúp

ki n cho tôi trong h c t p và th c hi n
ng

Ban giám hi u Tr

-

Ban giám hi u và t p th th y cô giáo tr

i H c C n Th .

Trâu Qu - Gia Lâm - Hà N i ã t o
trong su t th i gian tôi theo h c ch

th c hi n
-

ng

i h c N ng Nghi p I -

u ki n và giúp

tôi r t nhi u

ng trình cao h c t i ây.

Phòng Khoa h c và H p tác qu c t - Vi n Lúa
Long, ã theo dõi,

u

tài.

-

-

t o

ng b ng sông C u

ng viên tôi trong su t quá trình h c t p c ng nh

tài t t nghi p.

môn Di Truy n và Ch n Gi ng – Vi n Lúa
Long, ã giúp

v trang thi t b c ng nh h

su t quá trình th c hi n

tài t t nghi p.

ng b ng sông C u

ng d n chuyên môn trong


iv

-

môn Công Ngh H t Gi ng - Vi n Lúa
ng viên và t o
trong th i gian qui

-

u ki n v th i gian giúp tôi có th hoàn thành lu n án
nh.

TS. Bùi Th Thanh Tâm, TS. Ph m Trung Ngh a ã óng góp nhi u ý
ki n quí báu

-

ng b ng sông C u Long, ã

hoàn thi n cho các môn h c chuyên

Sau cùng, xin c m thông s hy sinh, chia s và
ng

i thân trong gia ình, b n bè,

và lu n án.

ng viên c a cha m và

ng nghi p góp ph n không nh vào

thành công c a lu n án.

Tác gi lu n án

Châu T n Phát


v

CL C
i dung

Trang

Trang ph bìa

i

i cam oan

ii

ic mt

iii

cl c

v

Danh sách b ng

viii

Danh sách hình

x
xiv

Danh m c các t vi t t t
M

1

U

1. Tính c p thi t c a

tài

1

2. M c tiêu nghiên c u

1

3. Ý ngh a khoa h c và th c ti n c a

tài

2

3.1 Ý ngh a khoa h c

2

3.2 Ý ngh a th c ti n

2

4.

it

2

Ch

ng 1: T NG QUAN TÀI LI U VÀ

ng và ph m vi nghiên c u
S

KHOA

C

A

3

TÀI
1.1 C s khoa

c

a

tài

3

1.1.1 H p ch t t o mùi th m, gen th m và m t s y u t môi tr
nh h

ng

ng

3

n vi c hình thành mùi th m trên lúa

1.1.2 Nguyên lý và yêu c u trong ch n gi ng b ng MAS

8

1.1.3 Nhi m s c th nhân t o c a vi khu n BAC (Bacterial Artificial

9

Chromosome)
1.2

ng

ng thành t u di truy n

14

1.2.1 Nghiên c u di truy n gen mùi th m trên cây lúa

14

1.2.2 M t s nghiên c u trong và ngoài n

19

ch n l c gen mùi th m

c ng d ng PCR trong


vi

1.2.3 M t s nghiên c u trong và ngoài n

c v

ng

ng BAC

25

NG PHÁP NGHIÊN

27

DNA trong ch n gi ng lúa
Ch

ng 2: N I DUNG, V T LI U VÀ PH
U

2.1 N i dung nghiên c u

27

2.1.1 N i dung 1

27

2.1.2 N i dung 2

27

2.1.3 N i dung 3

27

2.2 V t li u nghiên c u

27

2.3 Ph

28

ng pháp nghiên c u

2.3.1 Ph

ng pháp lai t o

28

2.3.2 Ph

ng pháp phòng thí nghi m

33

2.4 ánh giá k t qu nghiên c u

46

2.5

47

a

m nghiên c u

2.6 Th i gian th c hi n

47

Ch

48

ng 3: K T QU VÀ TH O LU N

3.1 Kh o sát

c tính th m và không th m trên các gi ng lúa mùa và lúa

48

cao s n
3.1.1 ánh giá ki u hình mùi th m trên b lúa mùa
3.1.2

a ph

ng

ánh giá ki u gen mang gen mùi th m b ng ch th SSR trên

48
66

các gi ng lúa mùa
3.1.3 ánh giá ki u hình mùi th m trên b lúa cao s n

70

3.1.4

73

ánh giá ki u gen mang gen mùi th m trên các gi ng lúa cao

n th nghi m

3.2 ánh giá ki u hình và ki u gen mùi th m trên các gi ng s d ng làm
t li u lai và qu n th con lai sau khi

77

c lai t o

3.2.1 ánh giá mùi th m trên các gi ng lúa b m

77

3.2.2 Phát tri n qu n th c a 20 t h p lai

79


vii

3.2.3 Phân tích a d ng di truy n d a vào ki u hình c a các gi ng

80

lúa b m và các t h p lai th h F1
3.2.4 Phân tích s bi u hi n di truy n mùi th m

qu n th cây lai F1

83

3.2.5 Phân tích s bi u hi n di truy n mùi th m

qu n th F3 t c p

84

3.2.6 ánh giá ki u gen mùi th m c a m t s gi ng b m và t h p

86

lai OM2517/OM3536

lai b ng ch th phân t
3.2.7

ánh giá ki u hình và ki u gen mùi th m trên qu n th BC2F2

88

t h p lai OM2517/OM3536
3.3 Khai thác th vi n BAC nh m dòng hóa vùng ch a gen qui

nh mùi

93

th m
3.3.1 Sàng l c gen th m c a cây lúa thông qua BAC DNA
3.3.2 Xây d ng BAC contig (các chu i DNA nhân b n n m li n k )

93

105

trên vùng gen mùi th m
3.3.3 Xác
3.3.4

nh BAC DNA ch a alen mùi th m

ng d ng ch th phân t trong ch n l c dòng mang gen mùi

106
107

th m
T LU N VÀ

NGH

113

1. K T LU N

113

2.

114

NGH

DANH

C CÔNG TRÌNH Ã CÔNG B

TÀI LI U THAM KH O
PH L C


viii

DANH SÁCH B NG
th t

N i dung

Trang

ng 2.1

Các ch th phân t

ã s d ng

lu n án và trình t m i t
ng 2.2

Ngu n g c và m t s

nghiên c u trong

tài

27

ng ng
c

m c a các gi ng lúa

cs

28

c

m c a các gi ng lúa

cs

29

ng thí

35

ng làm b
ng 2.3

Ngu n g c và m t s
ng làm m

ng 2.4

Tr ng l

ng agarose theo n ng

và

i t

nghi m
ng 2.5

Ch

ng trình ch y PCR v i ch th SSR

37

ng 2.6

Ch

ng trình ch y PCR v i ch th STS

38

ng 3.1

C p

mùi th m trên lá c a m t s gi ng lúa mùa

a

51

mùi th m trên thân

a m t s gi ng lúa mùa

a

52

mùi th m trên

a m t s gi ng lúa mùa

a

53

ng 3.4

M t s gi ng lúa mùa ch th hi n mùi th m trên lá và h t

54

ng 3.5

M t s gi ng lúa mùa ch th hi n mùi th m trên thân và

55

ph
ng 3.2

C p
ph

ng 3.3

ng
ng

C p
ph

t

ng

lá
ng 3.6

M t s gi ng lúa mùa ch th hi n mùi th m trên

t và

55

Các gi ng lúa mùa th hi n mùi th m toàn di n trên thân,

56

thân
ng 3.7

lá và h t
ng 3.8

ánh giá ki u hình mùi th m trên lá, thân và h t

a 30

70

So sánh ki u hình và ki u gen trên 30 gi ng thu c b lúa

76

gi ng lúa cao s n thu c b cao s n
ng 3.9

cao s n


ix

ng 3.10

C p

mùi th m trên lá, thân và h t

a các gi ng lúa b

78

ng 3.11

C p

mùi th m trên lá và thân

a các t h p lai th h

79

F1
ng 3.12

Mùi th m trên thân, lá và h t c a qu n th F3 t c p lai

84

OM2517/OM3536
ng 3.13

So sánh ki u gen và ki u hình trên qu n th BC2F2 c a t

92

p lai OM2517/OM3536
ng 3.14

Nh ng dòng BAC d

tuy n ph trên locus mùi th m

97

c sàng l c b ng ch th RM223
ng 3.15

Nh ng dòng BAC d

tuy n ph trên locus mùi th m

98

c sàng l c b ng ch th RG28FL-RB
ng 3.16

Nh ng dòng BAC d

tuy n ph trên locus mùi th m

100

c sàng l c b ng ch th SP6
ng 3.17

Ba m

i sáu (36) dòng BAC ã

c phát hi n sau khi

ch y

n di ki m tra s n ph m PCR v i 3 ch th phân t

101

RM223, RG28FL-RB và SP6
ng 3.18

V trí c a 36 dòng BAC

c xác

nh thông qua 3 ch th

103

phân t RM223, RG28FL-RB và SP6
ng 3.19

Các cá th BC2F2 t t h p lai OM2517/OM3536

c

110

ch n sau khi sàng l c PCR v i 2 ch th 25D10 và 31F5
ng 3.20

So sánh ki u gen và ki u hình trên qu n th BC2F2 c a t
p lai OM2517/OM3536 sau khi ánh giá b ng 2 ch th
phân t 25D10 và 31F5

112


x

DANH SÁCH HÌNH
th t

N i dung

Hình 1.1
Hình 2.1a

n
S

Trang

v t lý c a Xa4 locus.
phát tri n qu n th lai

12
n và lai h i giao

31

c th c hi n vào bu i

32

thông qua MAS
Hình 2.1b

Thao tác kh

c bông lúa

chi u trong nhà l

i

Hình 2.2a

Thao tác th ph n

32

Hình 2.2b

Thao tác g n th lai

32

Hình 2.2c

H t lai thu

c sau khi bông lúa ã

c th ph n

32

thành công
Hình 2.3

ánh giá mùi th m trên lá

33

Hình 2.4

ánh giá mùi th m trên thân

33

Hình 2.5

ánh giá mùi th m trên h t

34

Hình 2.6

Th vi n BAC sau khi

Hình 2.7
Hình 2.8

c c y chuy n

th ng array th c hi n c y chuy n
Dòng BAC

c chuy n vào môi tr

39
39

ng LB l ng và

40

qua êm trên máy l c
Hình 2.9
Hình 2.10

Hình 3.1

S

t ng quát quá trình ly trích DNA BAC

42

thí nghi m khai thác th vi n BAC

44

l các gi ng có mùi th m trên lá, thân và h t
103 gi ng lúa mùa

Hình 3.2

a ph

a ph

a ph

51

ng

l các gi ng có mùi th m trên h t c a 103 gi ng
lúa mùa

50

ng

l các gi ng có mùi th m trên thân c a 103 gi ng
lúa mùa

Hình 3.4

ng

l các gi ng có mùi th m trên lá c a 103 gi ng
lúa mùa

Hình 3.3

a ph

49

ng

53


xi

Hình 3.5

Bi u

phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

59

th m trên h t
Hình 3.6

Bi u

phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

61

th m trên lá
Hình 3.7

Bi u

phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

63

th m trên thân
Hình 3.8

Bi u

phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

65

th m trên thân, lá và h t
Hình 3.9

Ki m tra ch t l

ng DNA c a các gi ng lúa mùa

67

trên gel agarose 0.9%
Hình 3.10

S n ph m PCR v i m i RM223 trên 23 gi ng lúa
mùa

Hình 3.11

a ph

68

ng

T l các gi ng có mùi th m trên thân, lá và h t c a

72

các gi ng lúa cao s n

Hình 3.12

S n ph m PCR v i m i RM223 trên 30 gi ng thu c
cao s n

c khu ch

i gen mùi th m

73

n di

trên agarose gel 3%
Hình 3.13

S n ph m PCR v i m i RG28FL-RB trên 30 gi ng
thu c b cao s n

c khu ch

74

i gen mùi th m

n di trên agarose gel 1,2%
Hình 3.14

S n ph m PCR v i m i SP6 trên 30 gi ng thu c b
cao s n

c khu ch

i gen mùi th m

75

n di trên

agarose gel 3%
Hình 3.15

T l các gi ng có mùi th m trên lá, thân và h t c a

77

các gi ng lúa b m
Hình 3.16

T l các gi ng có mùi th m trên lá và thân c a các

80

h p lai
Hình 3.17

Bi u

phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

th m trên 9 gi ng lúa b m và 20 t h p lai

82


xii

Hình 3.18

K t qu

n di s n ph m PCR c a m i RG28FL-RB

87

trên 11gi ng/dòng lúa làm b m và 20 t h p lai
Hình 3.19

T

l

các

cá

th

BC2F2

t

t

h p

lai

88

OM2517/OM3536 có mùi th m trên lá, thân và h t
Hình 3.20

K t qu

n di s n ph m PCR trên qu n th BC2F2

89

a t h p lai OM2517/OM3536 v i ch th RM223
Hình 3.21

K t qu

n di s n ph m PCR trên qu n th BC2F2

90

a t h p lai OM2517/OM3536 v i ch th SP6
Hình 3.22

K t qu

n di s n ph m PCR trên qu n th BC2F2

a t

h p lai OM2517/OM3536 v i ch

91

th

RG28FL-RB
Hình 3.23

Ba tr m tám m
trong

Hình 3.24

a petri t

Môi tr

i t (384) dòng BAC phát tri n
ng

ng LB t i th i

gi (hình B) sau khi ã
Hình 3.25

K t qu

ng v i 1

93

a (plate)

m 0 gi (hình A) và 20

94

c chuy n dòng BAC

n di ki m tra các m u DNA BAC trên gel

95

agarose 0.9%
Hình 3.26

K t qu

n di s n ph m ph n ng PCR c a các

98

dòng BAC d tuy n v i ch th RM223
Hình 3.27

K t qu

n di s n ph m ph n ng PCR c a các

99

dòng BAC d tuy n v i ch th RG28FL-RB
Hình 3.28

K t qu

n di s n ph m ph n ng PCR c a các

100

dòng BAC d tuy n v i ch th SP6
Hình 3.29

Xác

nh nh ng dòng BAC d tuy n

th m b ng

Hình 3.30a

locus mùi

102

n di phân tích PFGE trên các dòng

BAC

c phân c t b i enzyme gi i h n HindIII

K t qu

i n di ki m tra s n ph m PCR c a 2 dòng

BAC ch ng l p s d ng ch th RG28FL-RB

106


xiii

Hình 3.30b

Lai Southern Blot c a 2 dòng BAC ch ng l p

c

106

phân c t v i HindIII s d ng RG28FL-RB làm con
dò

Hình 3.31

B n
BC2F2 t

Hình 3.32

liên k t gen t i locus mùi th m trên qu n th

107

t h p lai OM2517/OM3536

S n ph m PCR c a ch th 25D10 trên qu n th

108

BC2F2 t c p lai OM2517/OM3536
Hình 3.33

S n ph m PCR c a ch th 31F5 trên qu n th BC2F2
c p lai OM2517/OM3536

109


xiv

DANH M C CÁC T

VI T T T

%

ph n tr m

2AP

2-acetyl-1-pyrroline

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

ALP

Amplicon Length Polymorphism

AP-PCR

Arbitrary M i-PCR

BAC

Bacterial Artificial Chromosome

BC

Lai h i giao (Backcross)

BES

BAC-Ends Sequence

bp

base pair

CHEF

Contour-clamped Homogeneous Electric Field

cM

centiMorgan

cm

centimeter

ctv
BSCL

ng tác viên
ng b ng sông C u Long

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

E.coli

Escherichia coli

EAP

External Antisense Primer

EDTA

Ethylene diamine tetra acetate

ESP

External Sense Primer

ETS

Expressed Tagged Site

F

Forward

F1

Filial 1

F2

Filial 2

F3

Filial 3

fgr

fragrant gene

FISH

Flourescence in situ hybridization

FPC

Fingerprinting Contig

FSTs

Flanking Sequence Tags

I/E

Integration/Excision


xv

IFAP

Internal Fragrant Antisense Primer

INSP

Internal Non-fragrant Sense Primer

IPTG

Isopropyl thiogalactoside

IRRI

International Rice Research Institute

Kbp

Kilo base pair

KDM 105

Khao Dawk Mali 105

LB

Luria Bertani

LRR

Leucine Rich Repeat

MAS

Marker-Assisted Selection

MRDHV-

Moderately Repeat, Dispersed and Highly Variable DNA,

DNA

minisatellite

mRNA

messenger Ribonucleic Acid

NBS

Nucleotide Binding Site

NIL

Nearly Isogenic Line

NST

Nhi m s c th

Nu

Nucleotide

Ori

Origin of replication

PAC

P1-derivative Artificial Chromosome

pBR322

plasmid Bolivar & Rodrigues 322

PCR

Polymerase Chain Reaction

PFGE

Pulse Field Gel Electrophoresis –

QTL

Quantitative Trait Loci

R

Reverse

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RG

Rice Genome

RILs

Recombinant inbred line

RM

Rice Microsatellite

RT-PCR

Reverse Transcriptase –PCR

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

SFP

Single Functional Polymorphism

n di trong tr

ng xung


xvi

SNPs

Single Nucleotide Polymorphism

SSCP

Simple Strand Conformation Polymorphism

SSR

Simple Sequence Repeat (microsatellite)

STRs

Short Tandom Repeats

STS

Sequence Tagged Site

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris base, Boric acid, EDTA

TE

Tris/EDTA

l

Microliter


1

U
1.Tính c p thi t c a

tài

Lúa g o là th c n c n b n c a 39 n
cung c p t 35

n 59% ngu n n ng l

u ki n v t ch t còn thi u th n, l

c và vùng

a lý trên th gi i, lúa g o

ng cho h n 3 t ng

ng th c không

i [1b]. Tr

n ng

c ây, v i

i ta ch có nhu c u là

n no. Nh ng ngày nay do m c s ng c a ng

i dân ngày càng nâng cao thì nhu c u

n no ã thay

ng cao d n tr thành nhu c u quan

i, vi c n ngon, có dinh d

tr ng không th thi u

i v i con ng

t trong nh ng m c tiêu hàng
th tr

i. Do ó ch t l

u, trong ó mùi th m

ng xu t kh u g o c a th gi i. Tuy nhiên, s n l

ng g o

c xem nh là

c ánh giá r t cao trên
ng g o th m t các gi ng

lúa th m c truy n và các gi ng nh p n i nh : Tám Th m, Nàng Th m Ch

ào,

Séng Cù, N p Cái Hoa Vàng, Khao Dawk Mali, Basmati,... thì có r t ít không
áp ng nhu c u th tr

ng và khó m r ng di n tích.

gi i quy t v n

nhà khoa h c ã lai t o và phóng thích nhi u gi ng lúa có ch t l
nh ng ph
ch a n

này, các

ng th m ngon

ng pháp còn mang tính th công, ch n l c b ng c m quan là chính,
nh và m t nhi u th i gian. M t khác, vi c ng d ng công ngh di truy n

phân t , hi n t

ng tái t h p gen, gi i mã chu i trình t gen ã thúc

y hoàn thi n

gi ng lúa có nhi u tính tr ng quý hi m trong m t th i gian ng n [1a]; trong ó
nghiên c u

ch n gi ng lúa có gen mùi th m là m t trong nh ng ng d ng hi u

qu công ngh trên.

ch n t o gi ng lúa có ch t l

gian, hi u qu cao, áp ng nhu c u th tr

ng th m ngon, rút ng n th i

ng ngày càng r ng thì vi c ng d ng k

thu t trong sinh h c phân t nh m ch n t o ra lúa có ch t l

ng g o th m là c p

thi t.
Vì v y,

tài: ” ng d ng ch th phân t PCR và dòng BAC

gen mùi th m trên cây lúa (Oryza sativa L.)”

xác

nh

c th c hi n.

2.M c tiêu nghiên c u
- Xác

nh

gen ‘‘fgr’’ qui

c các dòng/gi ng lúa và các cá th trong các qu n th lai mang
nh mùi th m b ng ph

ng pháp s d ng ch th phân t DNA.


2

- Xác

nh

c các ch th DNA liên k t v i gen ‘‘fgr’’ quy

nh mùi th m

cây lúa trên c s khai thác th vi n BAC.
3. Ý ngh a khoa h c và th c ti n c a

tài

3.1 Ý ngh a khoa h c
- Xác

nh nh ng d u chu n phân t riêng bi t liên k t v i gen “fgr” trên cây

lúa giúp cho vi c ch n dòng con lai hi u qu
- Xác

nh nh ng dòng BAC DNA

n.

t o các ch th m i liên k t v i gen qui

nh mùi th m khai thác t ngu n dòng BAC
gen

c tiêu, ph c

hi u rõ

n v k thu t dòng hóa

nghiên c u sâu h n v ch c n ng gen này.

3.2 Ý ngh a th c ti n
-

tài ã góp ph n b sung nh ng dòng lúa có tri n v ng bi u th mùi th m

thông qua ng d ng nh ng d u chu n phân t riêng bi t liên k t ch t v i gen “fgr”
ph c

cho vi c phát tri n nh ng gi ng lúa th m cao
-

i nh ng k t qu

và phân tích ch th m i t

t

n

BSCL.

c t vi c khai thác th vi n BAC,

ó chuy n sang ch th ch a

tài ã tìm

n gen mùi th m ph c v

cho ch n gi ng lúa.
4.

it

ng và ph m vi nghiên c u

- Nghiên c u trên các
n hi n ang

it

ng là các gi ng lúa mùa và các gi ng lúa cao

c duy trì và nhân gi ng.

- Khai thác th vi n BAC DNA

xác

nh nh ng dòng BAC ch a gen mùi

th m.
- Ph m vi nghiên c u:
+C

xác

nh n i dung có liên quan

v i gen “fgr” trên nhi m s c th s 8 và ng
cao

n có gen

n các ch th phân t liên k t

ng k t qu trên

c tiêu.

+ Phân l p

c o n phân t mang gen

c tiêu.

ch n gi ng lúa

3

CH
NG QUAN TÀI LI U VÀ C
1.1 C s khoa h c c a

NG 1
S

KHOA H C C A

TÀI

tài

1.1.1 H p ch t t o mùi th m, gen th m và m t s y u t môi tr
ng

ng nh

n vi c hình thành mùi th m trên lúa
1.1.1.1 H p ch t t o mùi th m và s

th hi n c a chúng trên các b

ph n c a cây lúa
Mùi th m c a h t g o

c xác

nh do nhóm formaldehyde, ammonia và

hydrogen sulfide t o nên. M t vài nghiên c u còn ghi nh n mùi th m là do s t ng
a propanol, pentanol và hexanol trong quá trình t n tr . Ngày nay b ng ph
pháp hi n

i

ã xác

nh mùi th m

ng

c t o thành b i hàng tr m l ai

hydrocacbon, alcohol, aldehyde, keton, acid, phenol, pyridine và nh ng h p ch t
khác ã

c ghi nh n trong c m [3], [70].

Kim [64] báo cáo r ng các h p ph n hydrocacbon không khác nhau có ý
ngh a gi a lúa th m và không th m, tuy nhiên lúa th m có m c
alcohol, aldehyde, keton, acid; trong ó lúa th m có n ng

cao h n v

2-acetyl-1-pyrroline

cao g p 15 l n so v i lúa không th m.
Lorieux và ctv [76] ã phân tích m u g o c a 2 gi ng lúa Azucena (th m) và
IR64 (không th m), k t qu không tìm th y ch t 2-acetyl-1-pyrroline
(không th m), trong khi ó gi ng lúa th m Azucena có hàm l

IR64

ng cao v ch t này.

Trong s 89 h p ch t phân tích, x lý th ng kê cho th y các ch t sau có s khác bi t
gi a gi ng lúa th m và không th m

ó là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline,

benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 và hexanol.
Buttery và ctv [39]
không ch

ngh r ng s khác nhau gi a lúa th m và không th m

s hi n di n hay v ng m t c a ch t 2-acetyl-1-pyrroline mà còn trong

khác nhau v s l

ng c a ho t ch t có trong lúa g o. Nhi u alen c a m t gen

th m có th t o ra s bi n
th m khác nhau.

i nh trong cùng m t enzyme k t qu là d n

n tính


4

Buttery và ctv [40] ã phân tích và xác

nh 2-acetyl-1-pyrroline (2-AP) nh

là m t thành ph n quan tr ng óng góp vào mùi th m c a các gi ng lúa th m. Theo
ánh giá v ch t l

ng mùi th m c a 2-acetyl-1-pyrroline

mùi c a ngô n . Xác
ppb

nh n ng

c mô t gi ng nh

mùi th m c a 10 gi ng lúa, kho ng n ng

n 90ppb v i lúa chà tr ng. Lúa ch a chà tr ng n ng

t 6

2-acetyl-1-pyrroline

là 100-200ppb. Vì th có th ngh r ng b m t l p aloron c a h t g o gi m t vai
trò quan tr ng trong vi c hình thành mùi th m c a c m khi n u. M i c a ng
th phát hi n

c h p ch t th m 2-acetyl-1-pyrroline

Do ó, ánh giá b ng c m quan trong
kh u giác bình th

n ng

u ki n nh t

ng k t qu có th tin t

ng

i có

0,007ppm (7 ppb).

nh và v i nh ng ng

i có

c.[47]

Ahmed và ctv [31], Lin và ctv [74] ã kh ng

nh l i báo cáo c a Buttery và

ctv [40], Paule và ctv [84] r ng 2-acetyl-1-pyrroline là h p ch t chính t o nên mùi
c tr ng cho các gi ng lúa th m.
Bên c nh ó, Buttery và ctv [38] ã phân tích lá c a cây lá d a (Pandabases
amaryllifolius) nh n th y r ng thành ph n bay h i chính c ng là 2-acetyl-1pyrroline (2AP) và có m t s liên h r t m t thi t gi a ch t 2-acetyl-1-pyrroline
trong lá c a cây lá d a và lúa th m. N ng

c a ch t 2-acetyl-1-pyrroline trong lá

a cây lá d a cao h n g p 10 l n trong lúa th m và cao h n g p 100 l n trong lúa
không th m.
Tóm l i, hi n nay có hai quan
Quan

m v thành ph n ch t th m c a lúa g o.

m th nh t cho r ng ch t th m

c t o ra t các h p ch t aldehyde

(CHO) và keton (C=O) và các h p ch t v i l u hùynh. Quan

m th hai cho r ng

ch t th m lúa g o, do vòng ryrrol ki m sóat tính th m c a ch t 2-acetyl-1-pyrroline
[34]. Kader và Delseny [59] cho r ng có s khác nhau trong vi c th hi n mùi th m
trên các b ph n c a cây lúa, h p ch t 2AP
n m cho

n khi chín và

c th hi n m t cách t nhiên t giai

c bi t là trong giai

ph n c a cây lúa ngo i tr r , mùi th m

n h t tr

ng thành trên các b

c tích l y nhi u nh t trên b ph n h t

lúa. Bên c nh ó, Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv [102] c ng kh ng

nh mùi

th m không th hi n ho c th hi n r t th p không áng k trên b ph n r lúa.


5

1.1.1.2 Gen th m
Li và Gu [71] nghiên c u v s di truy n và v trí c a gen th m trên lúa,
nhóm tác gi nh n th y r ng các gen c a chúng có alen v i nhau thông qua vi c lai
thu n ngh ch gi a các gi ng lúa th m.
Bradbury và ctv [78] ã phân tích mùi th m c a lúa Basmati và Jasmine v i
th hi n c a 2-acetyl-1-pyrroline. M t gen l n fgr trên NST s 8 c a lúa qui
s th hi n tính tr ng quan tr ng này và có m t gen t

tên

ng ng mã hóa protein có

i là Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) th hi n s

trong vùng ch a gen th m. Gen fgr có s t
lúa. Ng

c

i, gen mã hóa BAD1

nh

ng

nh

a hình có ý ngh a

ng v i gen mã hóa BAD2 trong

trên nhi m s c th s 4. Gen mã hóa

BAD liên k t v i gen kháng stress trong cây tr ng. Quá trình t ng h p 2-AP (2acetyl-1-pyrroline: h p ch t chính t o mùi th m trên lúa) ph thu c gián ti p vào
ho t tính c a enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD2). Khi enzyme
BAD2 ho t
n hàm l

ng m nh s c nh tranh c ch t v i enzyme sinh t ng h p 2-AP d n
ng 2-AP b gi m và lúa s không có mùi th m. Ng

enzyme BAD2 b
t ho t tính d n
th m.

t bi n d n

c l i, n u gen sinh

n xu t hi n mã k t thúc s m s làm enzyme BAD2

n enzyme t ng h p sinh ra 2-AP nhi u và cây lúa s có mùi

u này có th

c xem là lúa có ch a gen th m l n fgr. Do ó gi ng lúa

nào mang gen mã hóa BAD2 nguyên v n bình th

ng s không th hi n mùi th m

2-AP hay không ch a gen th m l n fgr. S t o mùi th m
quan tr ng trên cây lúa. Th

các gi ng lúa gi vai trò

ng thì cây lúa tr ng trong môi tr

ng khó kh n hay

ch u nh ng stress phi sinh h c nh là khô h n, l nh ho c m n thì m i th hi n mùi
th m.

ây c ng gi ng nh là m t c ch kháng c a cây

i v i nh ng tác nhân phi

sinh h c mà s n ph m c a nó là t o ra h p ch t th m 2-AP (2-acetyl-1-pyrroline).
Hay 2-AP là s n ph m cu i c a quá trình này.
Shi và ctv [107] c ng k t lu n gen fgr là gen l n n m trên NST s 8 liên
quan

n mùi th m c a lúa. Gen này có

t alen l n m t ch c n ng bad2 và alen

tr i BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không th m. T ng s 34 gi ng lúa
th m và không th m ã

c nghiên c u và gi i trình t

n phân t BAD2/bad2.


6

Trong s 24 gi ng lúa th m có 12 gi ng ch a alen bad2-E7 (bad2-E7: m t i 8 c p
baz và 3 SNPs trên exon s 7), m

i hai gi ng còn l i ch a alen bad2-E2 (bad2-

E2: m t i 7 c p baz trên exon s 2). C hai alen

u qui

nh mùi th m c a lúa.

a trên chu i trình t khác nhau gi a BAD2 và 2 alen l n bad2 ã phát tri n
nh ng ch th phân t giúp cho vi c xác

nh dòng lúa th m, phân bi t rõ dòng

không th m và th m xét v ki u gen. Tuy nhiên, ki u hình bi u th ra bên ngoài vô
cùng ph c p

u này có th do i u ki n môi tr

ho t promoter

gen th hi n mùi th m.

ng qui

nh s

c ch ho c kích

Bên c nh ó, Fitzgerald và ctv [80] c ng ã có nh n xét t

ng t v i Shi và

ctv [107]: 2-acetyl-1-pyrroline là h p ch t chính t o nên mùi th m trong lúa và
c tích l y do b i s m t i 8 c p baz trong m t alen
nghiên c u này, 2-acetyl-1-pyrroline
a alen fgr ã

c xác

c

nh l

locus “fgr”. Trong

ng. S th hi n hay v ng m t

nh trong 464 m u c a các gi ng lúa truy n th ng

a

Trung Tâm Ngân Hàng Gen IRRI mang tên T.T.Chang. K t qu cho th y r ng
nhi u gi ng lúa th m,
p baz , nh ng

c bi t t Nam và

ông Nam Á, không bi u th

n ph m 2-acetyl-1-pyrroline v n

c xác

m t i8

nh trong c d ng

o và d ng c m c a nh ng gi ng này. S m t i 8 c p baz trong locus fgr không
ch là nguyên nhân qui
tích l y

nh mùi th m mà còn có m t

u khi n

n ph m 2-acetyl-1-pyrroline. Protein t ng s 2-acetyl-1-pyrroline

mã hóa b i nh ng gen

c

ng d ng fgr không bi u th khác bi t có ý ngh a so v i

ki u gen n-fgr. M t vài ki u gen fgr,
tích l y s l

t bi n khác ã

c bi t t Nam Á mã hóa protein này v i s

ng l n 2-acetyl-1-pyrroline nh Basmati. S

1-pyrroline trong các gi ng lúa th m n-fgr có th

c

t bi n

o ra 2-acetyl-

o ra m t vài l n trong quá

trình thu n hóa và ti n hóa. Gen fgr và các alen khác liên quan t i 2-acetyl-1pyrroline ã qui

i trong các gi ng lúa th m

n c truy n có mùi th m cao. S xác
pyrroline có th

y ra trong các ch

Nam Á

nh nhi u

o ra các gi ng lúa

t bi n

ng trình ch n gi ng lúa

c

i v i 2-acetyl-1a

ng ngu n di

truy n c a 2-acetyl-1-pyrroline nh m phát tri n gi ng lúa có mùi th m cao và ch t
ng t t.


7

1.1.1.3 M t s y u t môi tr

ng nh h

ng

n vi c hình thành mùi

th m trên lúa
+ Nhi t
Theo Juliano [57b] vi c hình thành mùi th m trong h t t ng lên
th p trong su t giai

nhi t

n vào ch c c a h t. Gi ng lúa Basmati yêu c u nhi t

(25oC ban ngày, 21oC ban êm trong su t quá trình tr

th p

ng thành) thì t t cho vi c

hình thành mùi th m.
+

t

Nhân t

t c ng nh h

thông qua dinh d

ng

n mùi th m và các tính tr ng ch t l

ng cây tr ng và m i quan h t

bay h i v i các thành ph n bay h i có liên quan

ng khác

ng tác c a các ch t dinh d

n mùi th m. Singh và ctv [94]

nh n th y có s khác nhau m t cách có ý ngh a v mùi th m c a lúa
ru ng li n k nhau m c dù là cùng m t gi ng.
ng giúp hình thành mùi th m

u ki n

t t i x p và

hai th a
t vùng cao

c t t h n.

Bên c nh ó, Bocchi và ctv [36] ã ánh giá s
t trên ch t l

nh h

ng c a các

ng mùi th m c a lúa trên ru ng th nghi m

ng cao nh t c a các ch t bay h i trong h t có liên quan

lo i

ng sét th p và hàm l

gen và

t trên ch t l

ng cát cao. nh h

ng c a t

ng h t lúa c a lúa Japonica thì c ng

c tính

Pavia, Italy và k t

lu n r ng hàm l
t có hàm l

ng

n các

ng tác ki u

c báo cáo b i Lee

và ctv [68].
+ T p quán canh tác
Theo Singh và ctv [94] lúa s có mùi th m h n khi cây lúa
so v i khi
ng

c s tr c ti p

c c y. Bên c nh ó th i gian thu ho ch là m t nhân t khác có nh

n mùi th m và nh ng tính tr ng ch t l

ng khác

lúa. Vi c trì ho n thu

ho ch sau khi chín có th làm gi m mùi th m. C n ng su t và ph m ch t h t s
gi m i n u vi c thu ho ch v

t quá th i gian này. S tác

ach trên ph m ch t lúa g o thông qua s gi m hay thay
t do b i nhi t

, m

ng c a vi c trì hoãn thu
i trong các thành ph n

, côn trùng d ch h i và các vi sinh v t khác.


8

+

thu n gi ng

Theo Singh và Singh [93] trong h u h t các vùng tr ng lúa th m b n
n

, ng

i nông dân th

ng s d ng h t c a các th h tr

a

c. Không có ch

ng

trình c i thi n n ng su t cho các gi ng lúa này. K t qu là h t không thu n d n

n

vi c gi m i mùi th m.
Tóm l i, các thành ph n di truy n, t p quán canh tác, môi tr
khác có nh h

ng

n s th hi n c a mùi th m và các tính tr ng ch t l

trên lúa th m. Cùng m t gi ng
xu t h t có ch t l

ng và các nhân

c tr ng

các n i khác nhau có th không s n

ng nh nhau. Tính tr ng ch t l

hi n t t nh t trong các vùng b n

ng

ng c a các gi ng này

a c a chúng khi

c th

c tr ng.

1.1.2 Nguyên lý và yêu c u trong ch n gi ng b ng MAS
Ch n t o gi ng nh ch th phân t (MAS) là k thu t ch n t o gi ng k t h p
gi a ph
làm

ng pháp truy n th ng v i ph
c vi c này c n xác

và các gen qui

nh các

liên k t ch t v i các
ph i có s t

nh

ng pháp công ngh sinh h c hi n

c c p b m mang nh ng

c tính ó ã

cl pb n

i.

c tính mong mu n

và có nh ng ch th phân t

c tính ó. Tiêu chu n quan tr ng nh t trong l a ch n b m

ng ph n r t l n v tính tr ng m c tiêu có trong b m và s di truy n

a tính tr ng này

b m . Xét v m c

a hình gi a b m , tính ch t này càng

n k t qu càng t t [2]. Bên c nh ó, nguyên lý c b n trong ch n gi ng b ng
MAS là s

d ng ph

ng pháp lai truy n th ng và ph

(Backcross-BC) nhi u l n cho

n khi

t

c th h BC mong mu n. Trong qúa

trình này s s d ng các ch th phân t
Cu i cùng

ng pháp lai h i giao

ch n các cá th có ki u gen mong mu n.

n m t th h nào ó s ch n ra cá th cho t th

mang ki u gen mong mu n c n c i t o. Ph

t o dòng thu n có

ng pháp ch n t o gi ng này v a chính

xác v a có th rút ng n th i gian ch n l c, di n tích tri n khai do có th phân tích
và ch n

c các gi ng mang gen ngay

sau 7-10 ngày mà không c n ch
c t o ra thông qua ph

giai

n s m, thí d nh cây gieo t h t

n khi thu h ach [20]. M t s gi ng lúa m i ã

ng pháp ch n gi ng nh ch th phân t nh là OM4495