Nhân giống cây bình vôi tím bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ: SV 2013-01

Tên đề tài:
“NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM (Stephanla rotunada Luour)
BẮNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : Đào Bá Tuyên

Thái Nguyên , 2014


KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ: SV 2013-01

Tên đề tài:
“NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI TÍM (Stephanla rotunada Luour)
BẮNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT”

: Đào Bá Tuyên
Chủ trì đề tài
Những người tham gia

:
Thời gian thực hiện
: Từ 03/2013 – 03/2014
Giảng viên hướng dẫn
: ThS. Vi Đại Lâm
Địa điểm nghiên cứu
: Phòng thí nghiệm
Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên

Thái Nguyên, 2014


LỜI CẢM ƠN
Sau 1 năm tham gia thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học, nay em đã hoàn
thành đề tài nghiên cứu của mình.
Nhân dịp này em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Ths. Vi Đại Lâm và Ths.
Nguyễn Thị Tình, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực
hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks. Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa
học trong suốt thời gian học tập.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ,
động viên để em có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh
khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô

và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, tháng 03 năm 2014
Sinh viên

Đào Bá Tuyên


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ
Tên đề tài: “Nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada Luour)bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”
- Mã số: SV 2013-01
- Chủ nhiệm đề tài: Sv. Đào Bá Tuyên
- Tell: .(+84)1658889205
E-mail:
- Cơ quan chủ trì đề tài: Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên
- Cơ quan phối hợp thực hiện :
- Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học - công nghệ thực
phẩm, Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên
- Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 3 năm 2014
1. Mục đích
Hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada
Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2. Nội dung chính
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu
vô trùng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái
sinh, nhân nhanh cây Bình Vôi tím.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra

rễ của cây Bình Vôi tím.
3. Kết quả chính đạt được
- Sản phẩm khoa học: 01 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học
- Sản phẩm ứng dụng: Bước đầu hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình
vôi tím (Stephania rotunada Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.


SUMMARY
- Research Project Title “ Propagation of Stephania rotunada Luour by
Plant tissue culture techni que ”.
- Code number: T2013-01
- Coordinator: Dao Ba Tuyen
- Tell: 01658889205
Email:
- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agricultural and
Forestry
- Cooperating Institution: Faculty of Biotechnology and Food
Technology.
- Duration: March 2013 to March 2014
1. Objectives: Implement the Plant breeding on Stephania rotunada Luour by
Plant tissue culture
2. Main contents:
- The effects of chemical disinfection on ability to produce sterilized
materials
- The influences of growth stimulants substance on ability to produce roots
of Stephania rotunada Luour
- The influence of growth stimulants on ability to regenerate and proliferate
roots of Stephania rotunada Luour
3. Obtained results:
- Scientific Result: 01 Scientific researched Report

- Applied Result: Construct the general process of Plant breeding on
Stephania rotunada Luour by Plant tissue culture


M ỤC L ỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................1
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................................2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................................2
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn...................................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
2.1. Giới thiệu về cây Bình vôi.......................................................................................3
2.1.1. Phân loại khoa học ................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố.............................................................................3
2.2. Vai trò của cây bình vôi tím ....................................................................................5
2.2.1. Giá trị về kinh tế ...................................................................................................5
2.2.2. Giá trị về dược liệu ...............................................................................................5
2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật...............................................................7
2.3.1. Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào ............................................................7
2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ..................................................................8
2.3.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................................................8
2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật..............................................................8
2.3.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật.......................................9
2.3.4. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro .................................................. 13
2.3.4.1. Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ. ........................................................................ 13
2.3.4.3. Nhân nhanh ..................................................................................................... 13
2.3.4.4. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh ............................................................................ 14
2.3.4.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên ............................................ 14

2.4. Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình vôi..................................................... 14
2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước ................................................ 15


LỜI CẢM ƠN
Sau 1 năm tham gia thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học, nay em đã hoàn
thành đề tài nghiên cứu của mình.
Nhân dịp này em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Ths. Vi Đại Lâm và Ths.
Nguyễn Thị Tình, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực
hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ks. Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa
học trong suốt thời gian học tập.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ,
động viên để em có tự tin trong học tập và nghiên cứu khoa học.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh
khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô
và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, tháng 03 năm 2014
Sinh viên

Đào Bá Tuyên


PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................ 30

5.1. Kết luận ..................................................................................................... 30
5.2. Kiến nghị................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 31


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [1] ......................... 3
Bảng 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng.............. 20
bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn. ............ 20
Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch
Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn. ..................................... 20
Bảng 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tái sinh chồi từ
chồi nách trên thân cây Bình Vôi ..................................................................... 21
Bảng 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BA và NAA đến khả
năng nhân nhanh chồi cây Bình Vôi ................................................................. 22
Bảng 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và đến ................................23
khả năng ra rễ của cây Bình Vôi ..................................................................... 23
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng
bằng dung dịch NaOCl đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn ................. 24
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung
dịch Ca(OCl)2 đến khả năng tạo mô sạch nấm và vi khuẩn .............................. 25
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng ......... 26
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả
năng nhân nhanh chồi Bình vôi ........................................................................ 27
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
của cây Bình vôi sau 4 tuần nuôi cấy................................................................ 28


DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 2.1: Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour).............................................. 4


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bình Vôi tím, dân tộc Tày ở tỉnh Bắc Kạn thường gọi là “cà tòm đeng” có
nghĩa là bình vôi đỏ, tên khoa học là “Stephania rotunada lour” thuộc họ tiết dê
(Menispermaceae). Bình Vôi tím là một cây dây leo giống như các loại Bình
Vôi khác, dưới gốc rễ hình thành củ, mọc bám vào vách đá nhưng củ Bình Vôi
tím nhỏ hơn loại trắng nhiều (chỉ nặng khoảng 0,5kg - 1kg), vỏ củ mầu nâu, dây
mầu tím, phần thịt củ mầu đỏ, nhựa dây cũng mầu đỏ. Phần dây leo và lá y hệt
cây bình vôi trắng, nhưng lá nhất là lá ngọn và lá non mầu tím. Cây Bình Vôi
tím phân biệt đực cái rõ vì hoa đực và hoa cái khác gốc, củ cũng khác, củ cây cái
thường tròn, củ cây đực thường dài hơn.
Bình Vôi tím là một loại dược liệu quý, ít gặp, thuộc loại hiếm. Dùng để
điều trị các bệnh về đường ruột (như viêm loét dạ dầy, viêm đại tràng, lỵ cấp
mãn…) các bệnh về khớp và thần kinh. Đặc biệt, nếu dùng bột củ bình vôi tím
với liều lượng 5g - 10g/ngày còn có tác dụng tiêu u (u đại tràng, u phổi). Dùng
củ tươi giã nát tẩm nước vo gạo để đắp các u lành tính bên ngoài kể cả biếu
basedow thì có hiệu quả tốt, u nhỏ lại trông thấy chỉ sau một đợt điều trị từ 10
ngày - 15 ngày.
Hiện nay với nhu cầu sử dụng ngày càng tăng và việc khai thác liên tục trong
nhiều năm không chú ý tới bảo vệ tái sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác làm
Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour) vốn phân bố khá phổ biến ở các tỉnh miền
núi phía bắc hiện đang bị suy giảm nghiêm trọng, và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng nuôi
cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tế bào tạo
ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao và hệ số nhân
lớn. Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển những loài cây thuốc quí có tiềm

năng.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân
giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada lour) bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào thực vật ”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Bình Vôi tím (Stephania rotunada
lour)bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1


1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống cây
Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là cơ sở nhân nhanh loài dược
liệu quí có nguy cơ cạn kiệt.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung cho kĩ thuật nhân giống Bình vôi,
nhân nhanh cây giống sạch bệnh, chất lượng đảm bảo và bảo tồn nguồn gen quí
hiếm.
Thực hiện đề tài giúp sinh viên hoàn thiện về cả kiến thức lý thuyết và
thực tiễn, mang lại những kinh nghiệm và tác phong làm việc khoa học cho
công tác sau này.

2


PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Bình vôi
2.1.1. Phân loại khoa học
Bảng 2.1. Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [1]

Giới (regnum)

Plantae

Ngành

Magloliophyta

Phân lớp

Magloliosida (Dicotyedones)

Bộ (ordo)

Ranunculales

Họ (familia)

Menispermaceae

Chi (genus)
Stephania
Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania
spp, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức
cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông
và nam châu Á cũng như Australasia[21]. Chi Bình vôi có khoảng trên 45
loài. Một số loài công bố ở Việt Nam: Stephania glabra (Roxb) Miers, S.
kuinanensis, S. Pierrei Diels, S. Sinica Diels, S.rotunda Lour [14],…
2.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố
Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi

Stephania, họ Tiết dê (Menispermaceae). Ở Việt Nam còn có các tên gọi khác
như là: cây củ một, củ mối tròn, dây mối trơn, củ gà ấp,..
Các loại Bình vôi có đặc điểm chung như sau: dây leo, thân nhẵn,
thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm. Thân nhẵn hơi xoắn vặn. Rễ củ đa
dạng, có thể rất to, vỏ ngoài xù xì màu nâu - nâu đen. Lá mọc so le, cuống lá
dài, đính vào trong phiến lá khoảng 1/3; phiến lá mỏng, hình tim, gần hình
tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, hai mặt nhẵn; gân lá xuất phát từ chỗ đính
của cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá. Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ lá hoặc
những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc, hoa đực có 6 lá đài
xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; nhị: 2-6, thường là 4; hoa cái
có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình trứng. Quả hạch hơi dẹt, mọng nước màu
đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình móng ngựa, hình trứng hoặc gần tròn mang
4 hàng vân dạng gai, hai mặt bên lõm ở giữa có lỗ thủng hoặc không. Mùa
hoa: tháng 4-6; mùa quả: tháng 8-10 [5],[15].
3


Hình 2.1: Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour)
Bình vôi là cây mộc hoang dại, sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm
21-230C, lượng mưa 2000 - 2500mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5-7.
Các loại Bình vôi ở nước ta có diện phân bố rất rộng trên cả ba miền
Bắc, Trung, Nam. Thường tập trung ở vùng núi đá vôi như Tuyên Quang, Cao
Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm
Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu. Sự phân bố của mỗi loài rất khác nhau, tùy theo
đặc tính sinh học của chúng. Đặc điểm riêng của một số loài [15]:
Củ Bình vôi (Stephania rotunda Lour): Dây leo có rễ củ vùi dưới đất một
nửa giống hình củ bình vôi, ruột màu vàng, thơm. Lá hình khiên, mọc cách. Phổ
biến ở các rừng thưa Phú Thọ, Vĩnh Yên, Ninh Bình,…
Stephania pierrei Diels: Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng. Lá có
kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác. Hoa đực không có cánh hoa.

S. hainanensis H.S. Lo et Y. Tsoong: Cành non và cuống lá có dịch màu
trắng hoặc vàng nhạt.
S. cambodia Gagnep: Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài
khác.
S. dielsiana Y.C.Wu: Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt
sau có màu tím hay tím hồng.
S. excentria H.S.Lo: Cuống lá rất dài, có khi đến 14cm, giá noãn có lỗ lệch một
bên.
S. cepharantha Hay: Giá noãn không có lỗ.
S. sinica Diels: Giá noãn không có lỗ.

4


2.2. Vai trò của cây bình vôi tím
2.2.1. Giá trị về kinh tế
Cây Bình vôi là một loại cây thuốc nam mọc tự nhiên ở một số vùng của
nước ta không chỉ có tác dụng về mặt y học cây Bình vôi còn có giá trị về mặt
kinh tế và đây cũng là cây trồng “xóa đói giảm nghèo” của người dân tộc vùng
cao. Tuy nhiên, loại cây quý này đang dần cạn kiệt trước việc khai thác ồ ạt của
người dân.
Bình vôi là một loại cây dạng leo dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta,
chỉ cần đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước là có thể phát triển tốt. Nó không đòi
hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao
cho người trồng. Cây Bình vôi sẽ là cây có tiềm năng lớn trong y học là nguồn
nguyên liệu cho ngành dược và mang lại kinh tế cho người trồng.
2.2.2. Giá trị về dược liệu
Cây Bình vôi thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), là cây chứa nhiều hoạt
chất có giá trị về dược liệu. Bình vôi có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu ứ,
chỉ thống, khu phong. Hoạt chất được nhiều nhà khoa học chiết xuất từ cây Bình

vôi là rotundin. Nhiều thí nghiệm lâm sàng trên chuột cống trắng cho thấy Bình
vôi có tác dụng an thần, gây ngủ.
Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền Bình vôi được dùng để chữa
bệnh mất ngủ, ho hen, kiết lỵ, sốt, đau bụng,… Trong y học hiện đại, rotundin
được dùng làm thuốc an thần gây ngủ, giảm đau, điều trị một số trường hợp rối
loạn tâm thần chức năng, trạng thái căng thẳng thần kinh, mất ngủ dai dẳng do
nguyên nhân tâm thần [4].
Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian. Củ
Bình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa
hen, ho lao, lỵ, sốt, đau bụng.
Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alcaloid: L-tetrahydropalmatin
(rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử
dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc, đặc biệt là thuốc an thần. Các
alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin. Trong đó
quan trọng nhất là rotundin.
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của một số chất
trong cây như sau:
Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi
và P.Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là
5


rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ
trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn, đưa Việt Nam trở thành nước
đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin (1944: Nhật; 1957: CHDC Đức;
1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc...).
Theo Ngô Đại Quang (1999) tác đụng dược lý của rotundin đã được
nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc. Rotundin được áp dụng từ năm 1944
và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết
quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là

gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như
độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ
không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá
chất [9].
Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh
dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột
(150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp
15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và
hiện tại không xác định được LD50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn
lá cao của chế phẩm. Rotundin ít độc. Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều
30mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày. Ở
Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là
rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an
thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất
ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v...
Theo Fakhrutdinov Sf(1962), roemerin gây tê niêm mạc và phong bế.
Đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số
co bóp, với liều cao tim ếch ngừng đập ở thời kỳ tâm trương. Roemerin đối
kháng với tác dụng tăng co bóp ruột của acetylcholine. Đối với hệ thần kinh
trung ương với liều thấp roemerin có tác dụng an thần gây ngủ, liều cao kích
thích gây co giật dẫn đến tử vong. Roemerin còn có tác dụng dãn mạch hạ
huyết áp [17].
Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke
Sawada và Masao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng dãn mạch nhẹ trên
những mạch vi tuần hoàn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác
dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do
chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu
6

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ
Tên đề tài: “Nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada Luour)bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”
- Mã số: SV 2013-01
- Chủ nhiệm đề tài: Sv. Đào Bá Tuyên
- Tell: .(+84)1658889205
E-mail:
- Cơ quan chủ trì đề tài: Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên
- Cơ quan phối hợp thực hiện :
- Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học - công nghệ thực
phẩm, Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên
- Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2013 đến tháng 3 năm 2014
1. Mục đích
Hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình vôi tím (Stephania rotunada
Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
2. Nội dung chính
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng đến khả năng tạo vật liệu
vô trùng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái
sinh, nhân nhanh cây Bình Vôi tím.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng ra
rễ của cây Bình Vôi tím.
3. Kết quả chính đạt được
- Sản phẩm khoa học: 01 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học
- Sản phẩm ứng dụng: Bước đầu hoàn thiện quy trình nhân giống cây bình
vôi tím (Stephania rotunada Luour) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.


điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ

đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể
sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành
một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [11].
2.3.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên
hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.
Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh
để thực hiện chức năng phân chia.
Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng.
2.3.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho
sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.3.3.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a) Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm
bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị
nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi
cấy mô in vitro [12].
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa
quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất
khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao.
Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: NaOCl, cồn 700, Ca(OCl)2, HgCl2
0,1% … để khử trùng.
b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH
- Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố
như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời

gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian
chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày [12]
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
8


Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh
trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi.
Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux,
ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của
mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so
với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn
cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong
các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ
2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy
từ 35 - 40cm.
- Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc
vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn
chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là
25±20C [11].
- pH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi
trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường
được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar
khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [16].
2.3.3.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường

nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành
phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều
gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm
nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn
bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một
số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…
a) Nước
Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi
trường dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm
nghiên cứu. Nếu môi trường chuẩn bị cho nuôi cấy protoplast, tế bào hay
9


meristem thì nên dùng nước cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng nước
máy trong nuôi cấy mô. Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng
nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và
các loài vi khuẩn [11].
b) Dinh dưỡng vô cơ
Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dưỡng đa
lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. Theo thống nhất của Hội sinh lí học
thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nồng độ lớn
hơn 0,5 mmol/l gọi là nguyên tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần
có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố
khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật. Giống như cây
trồng ngoài tự nhiên các mô và cơ thể thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm
trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh
dưỡng cần thiết cho sự phát triển. Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng
và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [11]:
- Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K),

canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S).
- Các nguyên tố vi lượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn),
kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo).
Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các
nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật.
Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng
khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng. Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ
đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng
khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính. Theo
nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần
các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô. Môi trường nhân tạo sử dụng phổ
biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi
trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên
tắc này [11].
c) Đường
Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng
nuôi cấy mô thực vật. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá
trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của
chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí
10


hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối). Các mô có màu
xanh cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro. Mặt khác, quá trình quang
hợp cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy. Trên thực tế việc bổ sung CO2
là rất khó khăn và tốn kém.
Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường
saccharose ở nồng độ 1-5%. Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp
và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy. Cũng
có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật.

Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi của mẫu cấy [11].
d) Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Đại
đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng
số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các vitamin
thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1),
nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng
thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có
vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy.
e) Agar
Agar là một loại polysacharit của tảo. Agar là chất keo đông thường
được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức
chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành. Nồng độ của
thạch dùng trong nuôi cấy rất dao động tùy theo độ tinh khiết của hóa chất và
mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12 g/l, trung bình 6-12 g/l) nếu nồng độ quá cao
môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi
dưỡng mô cấy. Ở 800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái sol còn ở 400C
thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lít
nước. Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng [11].
f) Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát
sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào:
nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó [11].
Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra
còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng
phát triển và phân hóa cơ quan.
11


SUMMARY

- Research Project Title “ Propagation of Stephania rotunada Luour by
Plant tissue culture techni que ”.
- Code number: T2013-01
- Coordinator: Dao Ba Tuyen
- Tell: 01658889205
Email:
- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agricultural and
Forestry
- Cooperating Institution: Faculty of Biotechnology and Food
Technology.
- Duration: March 2013 to March 2014
1. Objectives: Implement the Plant breeding on Stephania rotunada Luour by
Plant tissue culture
2. Main contents:
- The effects of chemical disinfection on ability to produce sterilized
materials
- The influences of growth stimulants substance on ability to produce roots
of Stephania rotunada Luour
- The influence of growth stimulants on ability to regenerate and proliferate
roots of Stephania rotunada Luour
3. Obtained results:
- Scientific Result: 01 Scientific researched Report
- Applied Result: Construct the general process of Plant breeding on
Stephania rotunada Luour by Plant tissue culture


phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu
nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường
trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của
rễ. Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt. Nhìn chung

nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường.
2.3.4. Các giai đoạn của nhân giống vô tính in vitro
Theo Goer (1993) quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước
sau [11]:
2.3.4.1. Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ.
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây
mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh đặc biệt là
bệnh vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây trong điều
kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hiệu quả
trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm và tăng khả năng sống và
sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
2.3.4.2. Nuôicấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởng tốt.
Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của mẫu.
Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa
và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá,...
2.3.4.3. Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng số lượng
thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính.
Vấn đề là phải xác định môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp
để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều
cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27ºC, có 16
giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux. Tuy nhiên đối với
mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau như nhân
nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan
Phaleanopsis ở giai đoạn đầu cần che tối,...

13


2.3.4.4. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh
sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng
nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường
nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh
trưởng. Theo Murashige, giai đoạn này là giai đoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của
chồi để sau đó có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên. Tạo
rễ cho chồi là một phần rất quan trọng của bất kì quy trình nhân giống in vitro
nào. Đôi khi một số chồi cần kéo dài trước khi tạo rễ. Để giảm chi phí nhân
giống, nhiều phòng thí nghiệm chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro
và tạo rễ ở bên ngoài bình nuôi cấy.
2.3.4.5. Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số
lá, số rễ, chiều cao cây).
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát
nước.
- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm
cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.
2.4. Tình hình nhân giống và sử dụng củ Bình vôi
Trồng Bình vôi bằng hạt hoặc phần đầu của củ. Thu hái quả chín vào
khoảng tháng 8-10, đãi vỏ lấy hạt. Bảo quản hạt trong cát ẩm. Gieo hạt vào
mùa xuân (tháng 2-3), tỉ lệ mọc sẽ cao. Hạt để cách năm có tỉ lệ mọc thấp.
Chọn đất nhiều mùn, tiện tưới và thoát nước làm vườn ươm. Ở Việt Nam vào
tháng 2-3, khi cây hồi xuân, có thể tìm kiếm cây con ở rừng đem về trồng.
Ngoài ươm cây giống từ hạt, có thể cắt phần đầu của củ để làm giống. Mỗi

đầu có thể xẻ làm 4 mảnh. Thời vụ trồng vô tính này cũng vào tháng 2-3. Đất
trồng cao thoáng nước. Bình vôi trồng ở Việt Nam mới có thấy sâu xanh hại
lá từ tháng 4-10 và củ thối khi bị úng nước. Thu hoạch cây trồng sau 2-3 năm,
thời gian càng lâu năng suất càng cao. Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn
trồng từ mầm củ thu hoạch vào mùa đông tháng 11-12 khi cây tàn lụi. Khi
đào tránh làm sây xát củ. Năng suất trung bình 1 tấn củ khô/ha [15].

14


Trong nhân giống in vitro, năm 2010 Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn
Vinh nghiên cứu nhân giống in vitro và khảo sát hợp chất anlkaloid rotudine
từ cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour) đã đưa ra kết luận [7]:
- Khả năng tạo mô sẹo từ khúc cắt đoạn thân đạt hiệu quả cao trên môi
trường MS bổ sung 2,4-D 5mg/l, BA 0,2mg/l.
- Trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l, NAA 0,2mg/l, quá trình hình
thành chồi từ chồi ngủ xảy ra thuận lợi.
Hiện nay, nước ta thu hái củ Bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại.
Khi thu về cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô được sử
dụng làm thuốc uống hoặc đem chiết rotundin. Từ củ Bình vôi ta có thể chế biến
ra chất rotudin thô hay tinh khiết như sau: Thái hay xát củ Bình vôi như ta sát
nâu. Ép lấy nước, bã còn lại them nước vào khuấy đều rồi lại ép nữa. Làm như
vậy cho tới khi bã hết đắng (alkaloid ra hết). Nước ép để lắng, thêm nước vôi
trong hoặc dung dịch Cacbonat kiềm sẽ cho tủa rotudin thô. Lọc hay gạn lấy
phơi hoặc sấy khô. Như vậy ta sẽ thu được rotudin thô vừa gọn, vừa dễ bảo quản
và dễ vận chuyển. Từ rotudin thô ta có thể chiết rotudin tinh khiết bằng cách
dùng cồn hay dung dịch axit sunfuric 5 hay 10% nóng, lọc rồi kết tinh. Làm đi
làm lại nhiều lần, theo nguyên tắc chung của kết tủa alkaloid, ta sẽ thu được
rotudin tinh khiết
2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh
lục đỏ. Nhiều cây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do bị khai thác mạnh
phục vụ cho việc sản xuất trên quy mô công nghiệp. Để bảo tồn nguồn gen
những cây thuốc quý này, quy trình nhân giống cây dược liệu được nhiều tác
giả nghiên cứu hoàn thiện như: nhân giống vô tính các dòng Kava (Piper
methysticum G. Forster) có hoạt tính sinh học cao (Đinh Đoàn Long và cs
(2004)) [18]. Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Pack Kee Youep đã nuôi
cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamnenis Ha et Grush v.) trên
môi trường MS cơ bản.
Đối với cây bình vôi, năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình vôi
mọc ở Việt Nam các chất tinh bột, đường khử oxy, axít malic, men oxydaza
và một alkaloit với tỉ lệ 1,2-1,5% (tính trên củ tươi), được Bùi Đình Sang đặt
tên là rotudin [5].
Năm 1944, Kondo (Nhật) đưa ra công thức khai triển của rotudin như
sau với công thức thô là C13H19(OCH3)3CH3N.
15