Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu

Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong thế giới vi sinh vật, bên cạnh vi khuẩn, nấm mốc thì nấm men
chiếm một tỉ lệ rất lớn, bao gồm cả những chủng có lợi và có hại. Đặc biệt
một số chủng nấm men có khả năng lên men một số loại thực phẩm, có thể sử
dụng để sản xuất các thực phẩm truyền thống.
Việc sử dụng nấm men với mục đích phục vụ cho con người đã được
nhà bác học người Pháp Louis Pasteur và nhà bác học người Đan Mạch E.C
Hansen tiên phong nghiên cứu từ giữa những năm 1800 và cũng từ thời điểm
này, những công trình nghiên cứu về tính đa dạng của những sản phẩm thực
phẩm được sản xuất hoặc có tác động của nấm men đã cho thấy được vai trò
to lớn của nó.
Ban đầu, để sản xuất cồn từ tinh bột, ở Châu Á, người ta thường dùng
các loại bánh men truyền thống; ở Châu Âu và Châu Mỹ, người ta dùng chế
phẩm enzyme thu nhận được từ malt để đường hóa. Theo thời gian, công nghệ
sản xuất cồn rượu ngày càng được hoàn thiện. Từ bánh men thuốc bắc, thuốc
nam của người Châu Á, các nhà khoa học đã phân lập được các giống vi sinh
vật thuần khiết có khả năng đường hóa cao và ứng dụng thành công trong
công nghiệp như: nấm Rhizopus và Mucor (trong phương pháp amylose) hay
loài nấm sợi Aspergillus trong phương pháp mycomalt. Ngày nay, thay vì
công đoạn nuôi cấy mốc, người ta sử dụng trực tiếp chế phẩm enzyme công
nghiệp trong công đoạn đường hóa, làm tăng hiệu suất đường hóa cũng như
hiệu suất lên men rất nhiều.
Các phương pháp sản xuất rượu theo quy mô công nghiệp có một
nhược điểm là yêu cầu điểu kiện vô trùng nghiêm ngặt. Trong khi đó, việc sản
xuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống bằng chế phẩm bánh men rượu
không đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt về vi sinh, lại thu được rượu có hương vị
thơm ngon. Do đó, những nghiên cứu gần đây có xu hướng quay lại công
nghệ lên men rượu truyền thống. Hầu hết các nghiên cứu đều nhằm nâng cao

và ổn định hiệu suất của lên men truyền thống: nghiên cứu phân lập, ứng
dụng những chủng giống đặc biệt vào lên men rượu truyền thống ở Nhật Bản,

Page 1


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Philipines, Trung Quốc… Trong nước, hiện đã có nhiều nghiên cứu về những
đặc tính của những chủng giống nấm men, nấm mốc phân lập từ bánh men
rượu; nghiên cứu ứng dụng loại bánh men có bổ sung hỗn hợp nấm men và
nấm mốc trong lên men rượu gạo có kiểm soát: nghiên cứu ảnh hưởng của các
vị thuốc lên hệ vi sinh vật trong bánh men...[16]
Do đó cần phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng nấm
men phân lập từ các nguồn tự nhiên để tìm cách tối ưu hóa, ứng dụng vào việc
sản xuất bánh men rượu là rất cần thiết. Xuất phát từ những yêu cầu đó,
chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân
lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu”.

Page 2


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về nấm men
2.1.1. Định nghĩa, hình thái và cấu tạo của nấm men
2.1.1.1. Định nghĩa [3], [12], [17]
Nấm men (Yeast, levure) là loại nấm đơn bào sinh sản bằng hình thức

nẩy chồi hoặc phân đôi tế bào, có cấu tạo khá hoàn chỉnh gần giống tế bào cơ
thể bậc cao. Chúng cư trú ở nhiều nơi, đặc biệt là trên lá, hoa quả và trong đất,
nước, trên lương thực, thực phẩm có hàm lượng đường cao.
Nấm men là vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại hydratcacbon
và đường khác nhau. Loài nấm men Saccharomyces cerevisae có khả năng
hấp thụ rất nhiều loại đường như: glucoza, fructoza, mannoza, galactoza,
sacaroza, maltoza, maltotrioza và một phần rafinoza. Ngoài ra 2 loài có ích
nhất là: Saccharomyces cerevisae và Saccharomyces uvarum (carlsbergensis)
có khả năng sử dụng các dextrin và melibioza tương ứng. Tuy nhiên, loài
Saccharomyces và các loài có quan hệ gần gũi với nó không có khả năng
chuyển hóa tất cả các loại đường như pentoza (riboza, xyloza, và arabinoza),
xenlobioza (sản phẩm thủy phân của hemixenluloza, xenluloza), lactoza,
insulin và xenluloza [2], [10].
2.1.1.2. Hình thái của tế bào nấm men [3], [11], [12]
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tùy loài nấm
men mà tế bào có hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, hình ovan,
hình elip... và thường không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi, loài và điều kiện
nuôi cấy. So với các vi sinh vật khác tế bào nấm men có kích thước tương đối
lớn: đường kính khoảng 1µm; chiều dài 8µm.Và kích thước này thay đổi tùy
theo loài, lứa tuổi, và điều kiện nuôi cấy.
2.1.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men [4], [11]
Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp gần giống như tế bào thực
vật. Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân,
không bào và các hạt dự trữ.

Page 3


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu

Thành tế bào được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chất
glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit và glucozamin. Glucan là hợp chất
cao phân tử của D- Glucozamin, mannan là hợp chất cao phân tử của D Mannoza. Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu
và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra. Màng tế bào có chiều
dày không quá 1nm và dính chặt vào tế bào chất. Tế bào chất có cấu trúc không
đồng nhất và ở thể keo. Độ nhớt của tế bào chất cao hơn của nước 800 lần.
Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là
chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Nhân của tế bào nấm men ngoài ADN còn
có protein và nhiều loại men.
Ty thể là cơ quan năng lượng của tế bào. Ty thể nấm men có hình bầu
dục, được bao bọc bởi 2 lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng
lược hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên.
Cấu trúc của 2 lớp màng ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất.
Trên bề mặt của màng trong có dính vô số các hạt nhỏ hình cầu. Các hạt này
có chức năng sinh năng lượng và giải phóng năng lượng của ty thể. Trong ty
thể còn có các thành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như riboxom,
các loại ARN và các loại enzym cần thiết cho sự tổng hợp protein.
Riboxom của tế bào nấm men có 2 loại: loại 80S ( gồm 2 tiểu thể 60S
và 40S) nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với tế bào chất; loại 70S( gồm
2 tiểu thể 40S và 30S). Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào và
các hạt dự trữ như hạt volutin, hạt glycogen và hạt lipit.
2.1.2. Các quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào nấm men
2.1.2.1. Dinh dưỡng nấm men [4], [12].
Chất dinh dưỡng được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi
trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào ở trạng thái môi trường nghèo hoặc cạn
các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregaloza,
lipit, các hợp chất chứa nitơ sẽ được sử dụng: dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng hoặc là đi vào thành phần tế bào
để phục vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời
sống của tế bào.

Page 4


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
* Dinh dưỡng cacbon
Các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các
rượu, axit hữu cơ, axit amin... có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm
men. Hầu hết các loại nấm men đều không có enzym polyhdrolaza trong đó
có amylaza và xenlulaza. Vì vậy nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh
bột cũng như xenluloza và hemixenluloza.
Hầu hết các loài nấm men đều sử dụng được đường glucoza. Tỷ số các
đường được nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài. Các loài
sacharomyces lên men rượu vang sử dụng glucoza, fructoza, maltoza,
saccaroza, galactoza, với rafinoza chỉ sử dụng được một phần, còn lactoza,
melibioza, dextrin, pentoza và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.
Các axit hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm
men. Chúng có khả năng kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men.
Chúng cũng có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất. Các
axit béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào từng chủng loài
nấm men, vào nồng độ axit, vào chiều dài của mạch cacbon trong phân tử axit
và mức độ điện ly.
* Dinh dưỡng Nitơ [4], [12]
Nguồn N cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitơ có thể là các hợp
chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chứa
nitơ của tế bào là các axit amin, các nucleotit burin, pyrimidin, protein và một
số vitamin.
Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat. Nguồn nitơ vô cơ được
nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ. Đó

là amoni sunphat, phosphat rồi đến các muối axetat, lactat, malat và sucxinat.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin, các peptit, các
nucleotic... Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy
phân protein tự nhiên ( đậu tương, khô lạc...) làm nguồn nitơ hữu cơ.
Nấm men tiêu hóa rất tốt các axit amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn
không sử dụng được protein. Nấm men chỉ sử dụng được các axit amin ở
dạng tự nhiên (L - axit amin). Trong quá trình nuôi cấy nấm men các axit
amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dưỡng.

Page 5


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
* Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ khác [4], [12]
Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm
men thì phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh...
+ Phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào như các
nucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit...các hợp chất phospho
đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong
trao đổi chất hydratcacbon và vận chuyển năng lượng. Trong điều kiện kỵ khí
nấm men tiêu hóa phospho chủ yếu ở giai đoạn đầu, có thể dùng tới 80 - 90%
tổng nhu cầu nguyên tố này.
+ Lưu huỳnh: là thành phần của một số axit amin trong phân tử protein
và là nhóm phụ (- SH) của một số enzym. Trong môi trường với hàm lượng
nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men nhưng ở nồng độ 1mg/l thì lưu huỳnh
đã kìm hãm quá trình này.
+ Các ion kali, canxi cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên
men. Thông thường ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc
sunfat, còn Ca2+ và Mg2+ thường có đủ trong nước sinh hoạt.

+ Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết để quá trình sinh lý trong tế
bào nấm men được xảy ra bình thường.
+ Các nguyên tố vi lượng là mangan, đồng, sắt, kẽm, molipden, bo, liti,
rubidi, coban... Các nguyên tố này chỉ cần một lượng rất nhỏ.
2.1.2.2. Quá trình trao đổi chất cuả nấm men [12]
 Dị hóa và đồng hóa ở tế bào nấm men
* Sự dị hóa
Sự dị hóa là quá trình phân giải các hợp chất dinh dưỡng có phân tử
lớn để có thể qua màng làm nội bào, sau đó tiếp tục phân giải các chất hữu cơ
có phân tử nhỏ thành các hợp chất trung gian và thu nhận năng lượng. Nấm
men phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ (kể cả sản phẩm trung gian) thành
sản phẩm cuối CO2 và H2O và phần lớn năng lượng ở dạng ATP. Phần lớn các
sản phẩm của quá trình dị hóa là vật liệu tế bào dùng cho sinh tổng hợp các
hợp chất cấu trúc tế bào mới, còn một số sản phẩm tế bào không sử dụng thải
ra ngoài môi trường như: rượu etylic, CO2, glycerin...

Page 6


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Các cơ chất dinh dưỡng của nấm men thường dùng là các loại đường
như: các monosaccharit (glucoza, fructoza, galactoza...), các disaccharit
( lactoza, maltoza, sacchroza...) các trisaccharit (xenlobioza...)
* Sự đồng hóa
Đồng hóa là sử dụng các hợp chất trao đổi trung gian do quá trình dị
hóa tạo thành hoặc có sẵn trong môi trường để thực hiện các quá trình sinh
tổng hợp ra các cấu trúc tế bào, như các hợp chất cao phân tử polysaccharit,
protein, axit nucleic, lipit... tạo ra các tế bào mới từ các tiền chất đơn giản
(axit amin, các bazơ purin và pyrimidin, axit hữu cơ).

Các quá trình đồng hóa và dị hóa thường xảy ra ở các vùng khác nhau
trong tế bào, song chúng lại xảy ra đồng thời do các enzym đặc hiệu. Các quá
trình lên men và hô hấp hoặc là phản ứng hiếu khí hay kị khí đóng vai trò cơ
bản trong trao đổi chất của tế bào nấm men. Các phản ứng trao đổi chất trong
tế bào nhờ chất xúc tác sinh học là các enzym. Trong tế bào vi sinh vật có
hàng ngàn enzym được chuyển hóa xúc tác những phản ứng đặc trưng. Những
enzym và hệ enzym khác nhau được khu trú trong các cơ quan của tế bào
hoặc đơn giản là chúng được hòa tan trong tế bào chất. Các enzym invertaza,
permeaza đảm nhận việc đồng hóa các loại đường và vận chuyển các chất qua
màng tế bào.
 Trao đổi năng lượng
Nấm men cần nguồn năng lượng trong quá trình phân giải (hay oxy hóa
hoặc đốt cháy) các hợp chất dinh dưỡng từ ngoài vào tế bào. Nguồn cung cấp
năng lượng chủ yếu cho nấm men là gluxit, thực chất là một số loại đường
đơn và đường đôi. Các loại đường trước hết được biến thành glucoza và
fructoza. Hai loại đường bị biến đổi qua một số phản ứng tới axit pyruvic và
giải phóng ra hợp chất năng lượng giàu ATP. Tiếp theo giai đoạn đường phân
là sự phân giải triệt để các hợp chất trung gian thành sản phẩm cuối cùng là
CO2 và H2O.
 Hô hấp
Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy tiện. Chúng có thể sống ở điều kiện
hiếu khí cũng như kỵ khí. Chính vì vậy chúng có 2 kiểu hô hấp khác nhau, tùy
thuộc vào lượng oxy cung cấp cho quá trình trao đổi chất.

Page 7


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Hô hấp hiếu khí:

C6H12O6 + 6O2
6CO2 + 6H20 + 674 cal
Hô hấp kỵ khí:
C6H12O6
2 CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal
2.1.2.3. Sinh trưởng của nấm men [12]
Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh
dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết trong môi
trường giảm tới mức thấp nhất. Khi đó sinh trưởng phát triển của chậm dần và
ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự phân tăng
sinh khối không đáng kể. Nếu trong cả quá trình nuôi cấy này ta không bổ
sung và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì ta có quần thể tế bào trong
không gian sống có giới hạn.
Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung, trong đó
có nấm men được chia làm 4 pha:
- Pha lag (pha tiềm phát hay pha làm quen):
Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa sinh
sản. Vận tốc sinh trưởng xem như bằng không. Đây là pha tiềm phát, nấm
men còn thích nghi với môi trường mới, trong đó một tế bào bị ức chế, thậm
chí có thể chết. Số lượng tế bào nấm men lúc này là không tăng hoặc tăng
không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng xảy ra mạnh mẽ. Tế bào có
kích thước tăng lên đáng kể, hàm lượng các chất đều tăng lên. Trong môi
trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào càng non, khỏe thì
pha lag càng ngắn.
- Pha logarit (pha phát triển chỉ số hay pha phát triển theo cấp số nhân).
Trong pha này nấm men sẽ phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhân
với tốc độ sinh trưởng là cực đại. Trong pha này, nấm men có hoạt tính sinh
lý sinh hóa rất đặc trưng và chúng rất nhạy cảm với các nhân tố không thuận
lợi hơn các tế bào đã trưởng thành và ở trạng thái ổn định.
Trong pha chỉ số tế bào phát triển ồ ạt, trong khi đó các chất dinh

dưỡng trong môi trường không phải là vô tận mà ngược lại ngày một giảm đi,
hơn nữa trong môi trường xuất hiện và tích tụ những sản phẩm trao đổi chất
không cần thiết đối với giống nuôi cấy. Như vậy trong quá trình chất dinh

Page 8


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
dưỡng cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận
lợi cho sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định.
- Pha ổn định: Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật thể quần
thể là tối đa.
- Pha suy vong: Trong pha này tế bào sống giảm dần và tế bào chất
tăng dần, một số tế bào chất bị tự phân do các enzym proteaza nội bào. Các tế
bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện
dạng hạt. Tế bào chất bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạt
chất béo nhỏ.
2.1.2.4. Sinh sản của nấm men [3], [4], [12], [13]
Nấm men có 3 hình thức sinh sản: sinh dưỡng (bằng nảy chồi hoặc
phân cắt tế bào), hữu tính ( bằng bào tử) và vô tính (bằng bào tử). Tùy thuộc
vào điều kiện nuôi cấy tế bào nấm men sẽ sinh sản theo cách sinh sản vô tính
hay cách sinh sản hữu tính.
* Sinh sản sinh dưỡng
Là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấm men. Có 2 hình thức sinh
sản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức phân đôi tế bào. Ở hình thức nảy chồi,
từ một cực của tế bào mẹ nảy chồi thành một tế bào con, sau đó hình thành
vách ngăn ngang giữa 2 tế bào. Tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc có
thể dính với tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men giống như
hình dạng cây xương rồng tai nhỏ.

* Sinh sản vô tính: bằng 2 hình thức bào tử túi và bào tử bắn.
Bào tử túi là những bào tử đã được hình thành trong một túi nhỏ gọi là
nang. Trong nang thường chứa từ 1 đến 8 bào tử, đôi khi đến 12 bào tử.
Bào tử bắn là những bào tử sau khi hình thành nhờ năng lượng của tế
bào bắn mạnh về phía đối diện. Đó là một hình thức phát tán của tế bào.
* Sinh sản hữu tính: do 2 tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành
hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử
được phát tán ra ngoài. Nếu 2 tế bào nấm men có hình thái kích thước giống
nhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm
men khác nhau thì được gọi là tiếp hợp dị giao.

Page 9


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
2.1.3. Một số ứng dụng của nấm men
2.1.3.1. Vai trò và ứng dụng của nấm men trong công nghiệp thực phẩm
[12], [13], [17]
Các sản phẩm từ nấm men khi nuôi cấy hiếu khí ta thu được một lượng
lớn sinh khối và sản phẩm chủ yếu là sinh khối của nấm men được dùng làm
men bánh mỳ, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cân đối protein và vitamin
trong khẩu phần dinh dưỡng, khi nuôi cấy kị khí ta thu được là rượu etylic là
sản phẩm chủ yếu, ngoài ra còn có một loạt sản phẩm phụ, trong đó CO 2 là
sản phẩm kinh tế, còn lại là các hợp chất có mùi vị hương thơm hoặc làm cải
thiện hoặc làm giảm chất lượng cho rượu thành phẩm.
Nấm men là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, nó
tham gia vào các quá trình chuyển hóa vật chất, phân hủy chất hữu cơ trong
đất. Hoạt tính sinh lý của nhiều loại nấm men được ứng dụng trong công
nghiệp thực phẩm, nông nghiệp và các ngành khác. Đặc biệt trong quá trình

sản xuất các lọai rượu, cồn, nước giải khát lên men, làm thức ăn gia súc; trong
y học như sản xuất chất kháng sinh penixilin, trong việc tổng hợp các loại axit
hữu cơ, các loại enzym, các nhân tố sinh trưởng, trong công nghệ enzym nấm
men là nhân tố tích cực nhất.
Ngoài hoạt tính sinh lý, bản thân tế bào nấm men có rất nhiều loại
vitamin và các axit amin, đặc biệt là các axit amin không thay thế. Đặc tính
này được dùng để chế tạo thức ăn gia súc từ nấm men.
2.1.3.2. Ứng dụng của nấm men trong sản xuất rượu [12], [14]
 Bản chất của quá trình lên men
Về bản chất, lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được thực hiện
do hoạt động sống của vi sinh vật dưới xúc tác của enzym nhằm cung cấp
năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng.
Cũng như quá trình oxy hóa khử sinh học ở mọi cơ thể khác, các mạch
phản ứng của sự đường phân, chu trình Krebs, chu trình pentosophosphat là
những phanr ứng hóa sinh cơ bản nhất của quá trình lên men ở tế bào vi sinh
vật. Khác với cả quá trình hô hấp, trong quá trình lên men, hydro (gồm e - và
H+) tách khỏi cơ chất được chuyển tới chất nhận cuối cùng là các chất hữu cơ

Page 10


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
khác nhau tạo thành các sản phẩm tích tụ trong môi trường. Đó là các sản
phẩm mà người ta nhận được trong sản xuất lên men.
Năng lượng giải phóng ra từ sự phân giải các hợp chất hữu cơ trong
quá trình sản xuất lên men tuy không nhiều, song do chính là nguồn cung cấp
năng lượng đáp ứng nhu cầu về năng lượng cần cho hoạt động sống của vi
sinh vật trong các quá trình lên men tương ứng.
*Điều kiện của quá trình lên men

Thành phần của môi trường
- Glucid : Glucid là nguồn dinh dưỡng quan trọng của vi sinh vật, đóng
vai trò chủ chốt trong sự tạo năng lượng cho tế bào vi sinh vật. Ngoài ra nó
còn là nguồn cung cấp vật liệu tạo nên các thành viên của tế bào. Trong môi
trường lên men, glucid thường được sử dụng dưới dạng chiết có đường, mật rỉ
hoặc các nguyên liệu và bã thải chứa đường, tinh bột. Các vật liệu chứa tinh
bột thường cũng được thủy phân thành đường trước khi lên men.
- Phosphat vô cơ :
Phosphat vô cơ đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng.
Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphat
amon, phosphat kali.
- Nitơ :
Nitơ tham gia quá trình tạo protein và nhiều chất có đặc tính sinh học
khác của tế bào vi sinh vật. Trong môi trường lên men, nitơ thường được sử
dụng dưới dạng muối nitrat và các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn
gốc vi sinh vật.
- Vitamin và nguyên tố vi lượng :
Vitamin là nguyên tố vi lượng là các chất sinh trưởng cần thiết cho hoạt
động sống của vi sinh vật. Chúng thường được sử dụng với lượng rất ít nhưng tác
dụng của chúng rất lớn và đa dạng đối với sự sống bình thường của vi sinh vật.
Tác nhân gây lên men
Điển hình của tác nhân gây lên men là nấm men. Trong số các giống
nấm men, Saccharomyces là giống được sử dụng rộng rãi. Nấm men đặc điểm
là trong môi trường yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành rượu
etylic và CO2 và không có khả năng chuyển hóa tiếp etanol tạo thành, có

Page 11


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên

trong quá trình sản xuất bánh men rượu
nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích lũy rượu etylic.
Tế bào nấm men còn có đặc điểm là khả năng tạo ra các nội enzym, nghĩa là
những enzym xúc tác ở bên trong tế bào. Như vậy sự phân ly đường sẽ xãy ra
ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO 2 được tạo thành thì đi ra
khỏi tế bào và tích tụ ở trong môi trường.
Các chủng nấm men có ứng dụng nhiều trong công nghiệp bia, rượu,
nước uống thuộc họ Saccharomyceteae bao gồm các giống Pichia,
Saccharomyces, Torulaspora, Debaryomyces, Schizosaccharomyces.
 Nguyên liệu và các điều kiện lên men
Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất rượu là tinh bột. Trước khi thực hiện
quá trình lên men, tinh bột cần được thủy phân thành đường. Sự thủy phân có
thể thực hiện nhờ enzym amylaza từ nguồn khác như enzym vi sinh vật hoặc
malt. Trong các nguồn cung cấp enzym này, ngoài amylaza còn chứa các
enzym khác. Vì vậy, cùng với sự thủy phân tinh bột cũng đồng thời xảy ra sự
thủy phân các chất khác chứa trong nguyên liệu lên men như: protein, hợp
chất phospho, chất béo... Nhiều sản phẩm thủy phân của các chất này chất
dinh dưỡng cần thiết cho nấm men và cũng là những chất tạo hương vị cho
sản phẩm cho quá trình lên men rượu, hoa quả, bánh mỳ...
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men như nồng độ đường,
độ axit của môi trường, nhiệt độ. Nồng độ đường thích hợp cho đa số nấm
men là 12 - 16%. Khi nồng độ đường quá cao hoặc quá thấp thì hiệu lực lên
men đều bị giảm thấp. Độ axit của môi trường cũng giữ vai trò quan trọng.
Quá trình lên men xảy ra bình thường khi pH = 4 - 4.5. Trong môi trường
kiềm, sự lên men tiến triển theo đường hướng đặc biệt tạo thành sản phẩm
chính là glycerin. Nhiệt độ có ảnh hưởng tới vận tốc lên men. Thường vận tốc
lên men lớn nhất vào khoảng 29 - 32 0C. Trong thực tế tùy yêu cầu quá trình
lên men tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24 - 28 0C. Sự tích tụ rượu trong
môi trường có tác dụng độc hại đối với nấm men. Đa số trường hợp sự lên
men đường bị đình chỉ khi nồng độ rượu trong môi trường đạt từ 12 - 14% thể

tích. Khí CO2 ức chế sự lên men, nhưng sự thoát khí CO2 có tác dụng khuấy
động dịch lên men do đó làm tăng tốc độ lên men.

Page 12


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
 Diễn biến sinh lý quá trình lên men rượu
Đường và các chất dinh dưỡng khác của quá trình lên men trước tiên
được hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua bề mặt
bán thấm vào bên trong tế bào. Trong tế bào, đường bị chuyển hóa qua chuỗi
phản ứng enzym để tạo thành sản phẩm cuối cùng của sự lên men là rượu và
CO2. Rượu etylic và CO2 được tạo thành thoát ra khỏi tế bào và khuyếch tán
vào môi trường xung quanh. Vì rượu hòa tan được với nước theo bất kỳ tỷ lệ
nào nên nó có thể khuyếch tán vào môi trường một cách nhanh chóng và tạo
ra một đậm độ lớn ở xung quanh tế bào nấm men. Khí CO 2 cũng hào tan được
trong dịch thể, song độ hòa tan của nó trong nước không lớn lắm. Do vậy mà
môi trường lên men nhanh chóng bão hòa bởi khí CO 2. CO2 bám vào tế bào
nấm men thành những cái bột. Khi các bọt đạt đến độ lớn nào đó thì lực nâng
của nó vượt quá trọng lượng của tế bào và cả tế bào bọt được nâng lên nổi
trên bề mặt, bọt vỡ, tế bào nấm men bị chìm xuống. Như vậy tế bào nấm men
vốn dĩ không di động trở thành di động ở trong môi trường lên men khiến cho
sự trao đổi chất trong tế bào trở nên mạnh mẽ hơn sự lên men cũng được tăng
lên một cách tương tự.
 Cơ chế sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men rượu
Lên men rượu là phân giải yếm khí đường dưới tác dụng của enzym vi
sinh vật đặc hiệu. Trong sự lên men rượu, axit pyruvic được tạo thành và bị
decacboxyl hóa tạo thành acetaldehyl và CO 2 nhờ sự xúc tác của pyruvat
decacboxylaza.

CH3 - C - COOH
CH3CHO +CO2
(1)
Pyruvat decacbonxylaza
O
Axit pyruvic
Acetaldehyd
Sau đó, acetaldehyde bị khử thành rượu etylic dưới tác dụng xúc tác
của ancoldehydrogenaza của nấm men.
CH3CHO + NADH+ + H+
CH3CH2OH +NAD+ (2)
Acoldehydrogenaza
Ở đây NADH2 tạo thành trong phản ứng oxy hóa glyceradehyd 3P của
quá trình đường phân đóng vai trò chất cho hydro, còn acetaldehyd là chất
nhận. Trong điều kiện thoáng khí quá trình lên men bị ức chế, khi đó hydro

Page 13


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
tách ra được chuyển qua chuỗi hô hấp tới oxy và axit pyruvic, sản phẩm của
quá trình đường phân sẽ tiếp tục bị oxy hóa qua nhiều bước trong chu trình
Krebs. Các cặp hydro tách ra được chuyển tới oxy. Quá trình này liên hợp với
quá trình tạo ATP.
Sự lên men rượu trong điều kiện bình thường: Xảy ra khi pH = 4 –
5 và có thể chia làm hai thời kỳ:
Thời kỳ cảm ứng
Trong thời kỳ nay lượng acetaldehyd tạo thành theo phản ứng (1) còn ít,
khi đó hydro được chuyển từ NADH 2 tới glyceradehyd 3P tạo thành glycerin

3P. Chất này bị khử gốc P nhờ enzyme photphataza tạo thành glycerin
CH2OP NADH2
NAD CH2OP
CH2OH
C6H12O6…

CHO

CHOH

CHOH
P

CHO
CH2OH
CH2OH
Glyceradehyd 3P
glycerin 3P
glycerin
Vậy glycerin là sản phẩm phụ của lên men rượu trong môi trường axit.
Thời kỳ tĩnh
Khi lượng acetadehyd đã đạt tới mức nào đó thì chất tiếp tục nhận
hydro từ để chuyển thành rượu etylic theo phản ứng (2).
C6H12O6
CH3CHO + NADH2 + CH3CH2OH + NADH+
 Sự ức chế lên men rượu khi có mặt oxy
Sự lên men rượu xảy ra mạnh mẽ trong điều kiện yếm khí, hiệu suất
dự trữ năng lượng cho tế bào vi sinh vật trong trường hợp này rất thấp. Do
vậy để duy trì sự sống vi sinh vật phải sử dụng một lượng lớn glucoza nhờ
quá trình lên men.

Khi có oxy, quá trình lên men bị ức chế và chuyển sang cơ chế hô hấp.
Sự ức chế lên men khi có mặt oxy gọi là hiệu ứng Pasteur. Trong quá trình
này ATP được tổng hợp mạnh mẽ nhờ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa liên
hợp với quá trình vận chuyển proton và electron qua dãy hô hấp tới oxy. Kết
quả là trạng thái tích lũy năng lượng glucoza không nhiều cũng đủ duy trì sự
sống và phát triển của chúng. Bởi vậy khi có hiệu ứng Pasteur thì không
những tạo thành etanol và CO2 giảm mà cả tiêu thụ đường cũng giảm.

Page 14


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
2.2. Tổng quan về bánh men
Ở các nước Châu Á, theo truyền thống người ta hay dùng các loại bánh
men để sản xuất rượu, cồn từ tinh bột. Lúc đầu, bánh men cũng được tạo ra từ
những mẻ ủ tốt nhất bằng cách tạo hình, đem sấy khô, rồi bảo quản để dùng
dần. Bằng cách này, người ta hoàn toàn chủ động được quá trình sản xuất và
đảm bảo cả chất lượng sản phẩm. Từ đó phương pháp sản xuất bánh men phát
triển khá hoàn thiện và tạo ra được nhiều loại bánh men khác nhau, tùy từng
dân tộc và thị hiếu người tiêu dùng. Các loại bánh men đươc sản xuất theo
phương pháp truyền thống về nguyên tắc là giống nhau. Nhưng tùy theo đặc
điểm khí hậu, nguyên liệu và sở thích từng địa phương mà người ta bổ sung
vào nấm men một số thành phần khác.
2.2.1. Bánh men thường
Thành phần chính là bột gạo sống và giống vi sinh vật. Một trong
những cách làm bánh men thường được thực hiện như sau:
Gạo ngâm nước (3h) để ráo
xay thành bột
nhào với men

giống + nước
định hình bánh men
ủ men ở 29 - 30 0C,
trong 48h
sấy khô ở 400C hay phơi nắng
bánh men thành phẩm.
2.2.2. Bánh men rượu lá
Bánh men lá thường được người dân tộc thiểu số sản xuất và tiêu thụ.
Đồng bào thiểu dân tộc thiểu số sử dụng bánh men lá để sản xuất rượu cần. Ở
đây thay cho các vị thuốc bắc là các loại lá khác nhau. Chất lượng rượu phụ
thuộc rất lớn vào số lượng và thành phần các loại lá. Bánh men lá có 3 loại:
loại một lá, loại hai lá, loại ba lá.
2.2.3. Bánh men thuốc bắc
Ngoài thành phần bột gạo, vi sinh vật còn có các vị thuốc bắc. Trong
bánh men thuốc bắc ở Mai Đông - Vân Hà (Hà Bắc) có 10 đến vị thuốc bắc
như bạch truật, nhục đậy khấu, nhục quấy .
Việc cho thuốc bắc vào có thể là để kích thích sinh trưởng cho hệ vi
sinh vật trong bánh men, để sát trùng hoặc có thể tạo mùi thơm đặc trưng của
sản phẩm.

Page 15


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
2.3. Quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống
Giới thiệu bánh men và quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp
truyền thống [16].
Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam.
Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có một phương pháp sản xuất riêng. Trong

chế phẩm bánh men thuốc bắc chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn,
nấm men và nấm mốc (nấm sợi). Thực chất, men thuốc bắc là canh trường
không thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tổng hợp hệ
enzyme đường hóa và lên men rượu.
Nguyên liệu chính để sản xuất bánh men là: bột gạo, men giống. Quy
trình sản xuất theo phương pháp truyền thống như sau:
Gạo
Làm sạch
Nước

Ngâm nước
Để ráo

Men mốc
giống

Xay thành bột

Nghiền mịn

Trộn men

Nước

Làm ẩm
Tạo hình
Ủ
Hong khô

Bánh men

rượu

Quy trình sản xuất bánh men rượu theo phương pháp truyền thống

Page 16


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu làm bánh men: Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu
truyền thống là bột gạo ẩm trộn lẫn với bánh men giống giả nhỏ.
Làm bánh men
Gạo sau khi xay thành bột được nhào trộn đều với men giống đã được
nghiền nhuyễn theo tỉ lệ nhất định. Sau đó định hình thành dạng viên, đặt vào
các khay có lót trấu và ủ trong thời gian thích hợp để hệ vi sinh vật trong bánh
men phát triển và nở xốp. Khi bánh men nở xốp, nấm mốc mọc đều và có mùi
rượu thì tiến hành hong khô. Bánh men thành phẩm được bảo quản để sử
dụng dần.
Lưu ý có hỗn hợp bột trước khi tạo hình nên có độ ẩm vừa phải, không
khô quá cũng không nhão quá, thích hợp nhất là khoảng 50 - 55%. Nhiệt độ ủ
khoảng 30 - 350C là tốt, nhiệt độ hong không quá 350C.
Việc sản xuất bánh men theo phương pháp cổ truyền có những ưu và
nhược điểm nhất định. Ưu điểm là không cần giống vi sinh vật thuần khiết,
không đòi hỏi kỹ thuật cao và không cần nhiều vốn đầu tư. Tuy nhiên chất
lượng bánh men kém vì có nhiều tạp khuẩn dẫn đến chất lượng bánh men
cũng không ổn định và hiệu suất lên men không cao.
Ngày nay cùng với những tiến bộ trong phân lập, nhân giống, kỹ thuật
sản xuất bánh men rượu có thay đổi : thay vì sử dụng bánh men gốc để sản xuất
bánh men, người ta dùng trực tiếp chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuất

bánh men, hoặc vẫn dùng bánh men gốc nhưng bổ sung thêm những giống
thuần khiết, có hoạt lực cao để tăng chất lượng của bánh men thành phẩm.
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu

Page 17


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
- Nấm men được phân lập từ các nguồn : dứa, nho có trong tự nhiên.
- Gạo tẻ được mua tại các chợ ở thành phố Huế.
- Nấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng từ Nhật Bản.
Môi trường nuôi cấy
Các môi trường và thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu
(phụ lục):
- Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm men: môi
trường Hansen. (MT1)
- Môi trường nhân giống nấm men: môi trường Hansen – Cao nấm
men. (MT2)
- Nghiên cứu khả năng lên men của các loại đường: môi trường nước
chiết giá đậu có bổ sung 2% các loại đường. (MT3)
- Môi trường nghiên cứu khả năng lên men: môi trường Hansen bổ
sung 20% glucose. (MT4)
3.2. Nội dung nghiên cứu [1], [6], [7], [9]
- Phân lập các chủng nấm men thuần chủng từ các nguồn nho và dứa.
- Xác định được một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm men
phân lập được:
+ Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và của tế bào nấm men.

+ Khả năng lên men của một số loại đường: glucoza, sacchroza,
maltoza, lactoza của nấm men.
+ Khảo sát khả năng lên men rượu của các chủng nấm men phân lập được.
+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của các
chủng nấm men như: thời gian, nhiệt độ.
+ Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men.
- Phương pháp sản xuất bánh men rượu.
+ Sản xuất bánh men rượu từ chủng nấm men phân lập được.
+ Ảnh hưởng của độ ẩm đến chất lượng bánh men và khả năng lên
men rượu của bánh men.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Nấm men
3.3.1.1. Phân lập nấm men [6[, [7]

Page 18


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Chuẩn bị một dãy ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã được
khử trùng. Đồng nhất và lấy 1g mẫu cho vào ống nghiệm, tiến hành pha loãng
thành các nồng độ liên tiếp. Lấy 1ml dung dịch ở một độ pha loãng được chọn
cho vào hộp peptri đã được khử trùng, đổ môi trường Hansen đã được khử
trùng và làm nguội đến 50oC vào, xoay nhẹ và đều tay hộp peptri để môi
trường phân bố đều trong đĩa. Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 35 oC ± 2oC. Sau 24 36h lấy ra quan sát khuẩn lạc.
Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, dùng que cấy phân lập tiếp trên môi
trường đặc. Tiếp tục phân lập đến khi nào được các khuẩn lạc thuần chủng.
3.3.1.2. Cấy chuyền và giữ giống [2], [8]
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng cho vào ống
nghiệm chứa dung dịch Hansen. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 35 oC ± 2oC. Sau

24h lấy que cấy nhúng vào dịch rồi cấy vạch lên đĩa thạch chứa môi trường
Hansen. Nuôi trong tủ ấm cho khuẩn lạc phát triển. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ
cấy vào ống thạch nghiêng. Giống được bảo quản trong ống thạch nghiêng ở
3 - 4oC trong vòng 1 tháng.
3.3.1.3. Nhân giống [9]
Môi trường nhân giống là môi trường lỏng được chuẩn bị và thanh
trùng trong ống nghiệm và bình tam giác. Chủng nấm men được lấy trong ống
giống. Sau 24h phát triển thì cấy tiếp sang bình tam giác (tỉ lệ 1% về thể tích).
Tùy thuộc quy mô phòng thí nghiệm mà các cấp nhân giống thích hợp.
3.3.1.4. Nhuộm, soi tế bào nấm men [1], [2], [6].
Nguyên tắc: vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp
phụ. Trong đa số trường hợp thuốc nhuộm kết hợp với vi sinh vật rất bền
vững khó bị phá hủy hoặc bị nước làm phai đi.
Cách tiến hành: cho vài giọt canh trường nấm men và một giọt thuốc
nhuộm lên phiến kính, trộn đều, đậy lá kính lại để yên 2 - 3 phút rồi đem quan sát.

3.3.1.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập được
 Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men theo
thời gian nuôi cấy

Page 19


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Theo một số tài liệu thì đa số nấm men phát triển bình thường trong
khoảng nhiệt độ 280C - 320C [6], [12]. Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ là 30 0C
để khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men theo thời gian là
12h, 24h, 36h, 48h và 72h.
Nấm men được lấy từ ống giống sau khi đã nhân giống được bổ sung

vào các ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng.Tiến hành nuôi cấy ở nhiệ
độ 300C theo các khoảng thời gian trên. Định kỳ lấy ra và đo mật độ tế bào
bước sóng 620nm.
 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của
các chủng nấm men
Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến khả năng phát triển của
các chủng nấm men phân lập được, chúng tôi chọn các mốc nhiệt độ 25 0C,
300C, 350C, 400C để khảo sát nhiệt độ tối thích cho từng chủng nấm men.
Nấm men được lấy từ ống giống, sau khi đã nhân giống được bổ sung vào
các ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng. Sau khoảng thời gian tối thích
nhất cho từng chủng nấm men thì lấy ra đo mật độ tế bào ở bước sóng 620nm.
 Khảo sát khả năng lên men các nguồn đường của các chủng
nấm men [1]
Môi trường sử dụng để nghiên cứu là môi trường nước chiết giá đậu.
Cách tiến hành:
Phân 10ml môi trường nước chiết giá đậu có chứa từng nguồn đường
khác nhau (chiếm 2%) vào ống nghiệm có chứa ống Durham. Ống đối chứng
không có một nguồn đường nào. Các ống nghiệm được khử trùng sau đó cấy
vào 0.1ml dịch huyền phù nấm men để ở nhiệt độ là 35 oC. Sau 24h lấy ra
quan sát hiện tượng.
Quan sát việc tạo thành CO2 và đẩy ống Durham để biết nấm men có
hay không có khả năng lên men từng nguồn đường.

 Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men
phân lập được [1]

Page 20


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên

trong quá trình sản xuất bánh men rượu
Cho môi trường Hansen đã được thay glucoza bằng tinh bột vào các đĩa
peptri, sau đó cấy các chủng nấm men theo phương pháp chấm điểm và nuôi
cấy ở nhiệt độ 35oC trong 24h. Nhuộm màu bằng dung dịch thuốc nhuộm
Lugol. Sau đó quan sát đường kính vùng thủy phân tinh bột xung quanh
khuẩn lạc nấm men. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy thì
chứng tỏ là nấm men có khả năng phân giải tinh bột.
 Khảo sát khả năng lên men rượu [5], [6], [9]
Xác định hoạt lực lên men bằng cách xác định lượng CO 2 sinh ra trong
quá trình lên men. Phương pháp này dựa trên sự sai khác trọng lượng trước và
sau khi lên men.
Cách tiến hành :
Cho 200ml dung dịch lên men vào bình tam giác dung tích 250ml rồi
bổ sung 3% dịch nấm men thuần chủng đã được phân lập ở trên, đậy kín
miệng bình. Sau khi gieo cấy nấm men rồi, nút chặt bằng ống cao su có ống
hồi lưu, có kẹp giấy ở đầu ống hồi lưu, cân toàn bộ trên cân kỹ thuật. Nuôi
cấy trong tủ ấm ở 350C và qua từng thời gian nhất định (12h, 24h, 36h, 48h).
Trong quá trình lên men, CO2 thoát ra cho phản ứng với Ba(OH)2. Thông ống,
dẫn khí từ bình lên men vào trong bình chứa Ba(OH) 2 10%. Sau một thời gian
ta sẽ thấy có kết tủa trắng. Điều đó chứng tỏ rằng có CO 2 trong dịch lên men.
Sau đó cân lại để xem xét sự giảm khối lượng, cân toàn bộ bình lại cho đến
lúc trọng lượng không đổi (lên men kết thúc) thường là 2 - 3 ngày.
CO2 + Ba(OH)2
BaCO3  + H2O
Sự sai khác trọng lượng trước và sau khi lên men,từ đó biết được lượng
CO2 bay ra. Chủng nấm men nào có khả năng sinh CO 2 lớn nhất thì chủng đó
có khả năng lên men rượu tốt nhất.
 Xác định sự có mặt của rượu [6]
Cách thực hiện: cho phản ứng với K2Cr2O7 và H2SO4 đậm đặc.
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch lên men, thêm vào 1ml dung dịch H 2SO4

đậm đặc và nhỏ thêm từng giọt cho đến khi màu da cam của thuốc thử này
chuyển sang màu xanh lam nhờ tác dụng với rượu theo phương trình:
2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH

Da cam

4KCr(SO4)2+ 3CH3COOH +11H2O

Xanh lam

Page 21


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
3.3.2. Phương pháp sản xuất bánh men rượu
3.3.2.1. Quá trình nhân giống nấm men, nấm mốc [16]
Sau khi xác định khả năng lên men của các chủng nấm men phân lập
được, lựa chọn chủng nấm men nào có khả năng lên men tốt nhất đem đi nhân
giống trên môi trường Hansen – Cao nấm men (MT2) ở nhiệt độ 350C, thời gian
nhân giống 24h, tiến hành bổ sung vào quy trình sản xuất bánh men rượu.
Ngoài việc ứng dụng chủng nấm men phân lập ở các nguồn nho và dứa,
chúng tôi còn bổ sung chủng nấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng dùng
để sản xuất koji ở Nhật Bản vào quy trình sản xuất bánh men rượu. Chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae được nhân giống trong môi trường Czapeck ở
nhiệt độ 350C, thời gian nhân giống 24h, tiến hành bổ sung vào quy trình sản
xuất bánh men rượu.
3.3.2.2. Quy trình sản xuất bánh men rượu [16]
Sau khi phân lập, nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa cũng như khả
năng lên men rượu của các chủng nấm men. Tiến hành lựa chọn chủng thích

hợp để ứng dụng vào quy trình sản xuất bánh men rượu.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tham khảo một số tài liệu và sử dụng
quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống (ở mục 2.3 của phần TQTL)
[16] để tiến hành sản xuất bánh men rượu.
3.3.2.3. Xác định độ ẩm của bột gạo [16]
Gạo được ngâm 2h, để ráo rồi đem nghiền lấy bột khô để nhào bánh.
Cân chính xác 5g bột để xác định độ ẩm theo phương pháp sấy tới khối lượng
không đổi.
Phương pháp xác định hàm lượng nước bằng cách sấy ở nhiệt độ 105 0C
đến khối lượng không đổi.
Dụng cụ: Cốc thuỷ tinh đường kính 50mm, cao 30mm, tủ sấy, bình hút
ẩm, cân phân tích
Cách tiến hành:

Page 22


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
- Cân 5g bột gạo đã được trộn đều vào cốc thuỷ tinh đã sấy khô và biết
khối lượng. Đem sấy cốc có chứa mẫu ở nhiệt độ 105 0C đến khối lượng không
đổi. Lần cân đầu được cân sau khi sấy 40 phút, lần cân tiếp theo sau 20 phút.
Tính kết quả:
Hàm lượng nước được tính bằng % theo công thức
X =

(G1 − G2 ) × 100
;
G

(%)

Trong đó:
G : khối lượng của bột gạo, tính bằng g
G1 : khối lượng của cốc thuỷ tinh và bột gạo trước khi sấy, tính bằng g
G2 :khối lượng của cốc thủy tinh và bột gạo sau khi sấy, tính bằng g
3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu được sẽ tiến hành xử lý bằng phần mềm SAS.

Page 23


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu

PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập các chủng nấm men từ các nguồn tự nhiên
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng nấm men
trên môi trường Hansen (MT1) từ các nguồn nguyên liệu là nho và dứa. Quá
trình phân lập được thao tác nhiều lần cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện đồng
nhất trên bề mặt thạch đĩa. Kết quả từ các khuẩn lạc mọc được, sơ bộ chúng
tôi chọn được 4 chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau và có ký hiệu là: K2,
Y1, Y2 và Y3.
Kết quả quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc kết hợp với nhuộm và
soi tế bào nấm men bằng kính hiển vi điện tử của 4 chủng được trình bày ở
bảng 4.1:
Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các
chủng nấm men phân lập được
Nguồn

phân lập
Dứa

Kí hiệu
khuẩn lạc

Đặc điểm khuẩn lạc

K2

Có nhân to, màu trắng sữa, viến nhẵn mỏng.

Y1

Có nhân, màu trắng sữa, có nhân, nhẵn bóng.
Có nhân, màu trắng sữa, viến răng cưa,
hình cầu
Không có nhân, màu trắng sữa,
viến nhẵn bóng.

Y2
Nho

Y3

Kết quả từ bảng 4.1 cho thấy, đa số các chủng Y1, Y2, Y3, K2 có tế
bào hình cầu hay hình oval. Khuẩn lạc có kích thước lớn (từ 5 - 8 mm), màu
sắc chủ yếu là màu trắng sữa, viền răng cưa (Y2) hoặc viền nhẵn bóng (K2,
Y1, Y3), có nhân (K2, Y1, Y2) hoặc không nhân (Y3).
Nấm men là đối tượng vi sinh vật chiếm tỷ lệ rất lớn trong tự nhiên, đặc

biệt là ở các nguồn nguyên liệu giàu gluxit như các loại hoa quả chín, rau quả

Page 24


Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên
trong quá trình sản xuất bánh men rượu
chứa hàm lượng tinh bột cao. Ngoài ra, theo G. Chandrasena và cộng sự
(2006) khi tiến hành phân lập từ các nguồn hoa quả như dứa, nho, cà chua,
cam ... đã thu được rất nhiều chủng nấm men khác nhau như: Saccharomyces
ovifirmis, S. fructuum, S. acidifaciens, S. bayanus.[18].
4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men phân
lập được
4.2.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men
Để khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men, chúng tôi
tiến hành nuôi cấy trên môi trường Hansen lỏng (MT2). Khả năng sinh trưởng
của các chủng được thể hiện bằng cách đo sự tăng sinh khối thông qua giá trị
OD ở bước sóng 620nm. Giá trị này được đo 12h một lần trong suốt quá trình
nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.1.
Bảng 4.2. Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men
theo thời gian nuôi cấy
OD620nm

Thời gian
(h)
0
12
24
36
48

60

Y1
0.260d
0.597c
0.994a
0.905ab
0.775abc
0.741bc

Y2
0.164f
0.869d
1.126a
1.060ab
0.992bc
0.929cd

Y3
0.080f
0.420e
0.723a
0.641b
0.540c
0.517cd

K2
0.158e
0.744d
1.021a

0.915ab
0.867cb
0.787cd

72

0.660c

0.550e

0.484d

0.750e

Ghi chú: - Số liệu được trình bày ở các bảng trên là giá trị trung bình với n (n=3).
- Số liệu cùng cột có mũ khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ( α = 0.05)

Page 25