PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH hàm LƯỢNG PROTEIN THEO BRADFORD

Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford
Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ
nhạy cao, có thể xác định tới 1µg, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ưu điểm lớn của
phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất
là amoniumsufate.


Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm
Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid
khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực
đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh
dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng
596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung
dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm
màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy
quang phổ kế (Spectrophotometer) ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein
trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (OD o). Lấy giá trị ∆OD = ODX – ODO.
Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ
giá trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.


Hóa chất

− Dung dịch albumine 0.1%.
− Nước cất
− Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau

o

Coomassie Brilliant Blue: 0.001g.

o

Ethanol tuyệt đối:

4.7 g.

o

Phosphoric acid:

85%.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hoà tan trong ethnol trong một chai
đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100 ml bằng nước cất. Lắc
đều và giữ lạnh dưới 4oC.


Dựng đường chuẩn albumine

Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40, 50,
60, 70, 80, 90, 100 µg/ml.
Bảng 3.1. Dựng đường chuẩn albumine
Ống nghiệm

Đối

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

990

980

970

960

950

940

930

920

910

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

chứng

Nồng độ (µg/ml)
Dung dịch
albumin chuẩn
(µl)
Nước cất (µl)
Thuốc thử
Bradford (ml)

Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất. Tất cả các ống sau khi pha
đúng nồng độ, để khoảng 20 phút.
Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 595 nm.
 Dựng đường chuẩn.
Định lượng protein trong mẫu thí nghiệm
Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford. Đem
đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.
Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn.

Kết quả tính toán:
Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khoả sát ta suy ra hàm lượng
protein của mẫu là X (µg/ml) có trong m (g) nguyên liệu.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Vậy lượng protein có trong 1 gam nguyên liệu là:
Hàm lượng protein (mg/g) =

X
1000. m

Hình 3.2. Đường chuẩn albumine
2. Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Amano


Nguyên tắc:

Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein của
enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản
ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với
lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme.


Hoá chất:
−

HCL 0.1 M

−

Ma2CO3 0.4 M

−

Dung dịch Trichloracetic 0.4 M

−

Tyrosin tinh khiết


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

−

NaOH 0.1 M

−

Thuốc thử Folin

−

H3PO4 1/30 M

−

Đệm phosphate (pH 7) 0.1 M

 Dụng cụ và thiết bị
−

Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc.

−

Bể ổn nhiệt

−

Máy đo quang phổ UV – Vis

−

Máy đo pH

 Xây dựng đường chuẩn tyrosine
Bảng 3.2. Đường chuẩn tyrosine
Ống số

Đối

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Dung dịch HCl (µl)

1000

990

980

970

960

950

940

930

920

910

Na2CO3 (ml)

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Nồng độ (µg/ml)
Dung dịch tyrosine
chuẩn (µl)

Thuốc thử Folin
(ml)

chứng
0

Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 100 µgtyrosine / mlHCl như bảng 3.3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na 2CO3 0,4M vào dung dịch
tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn
hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 ± 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ
của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50,
As60, As70, As80, As90. As100
Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thu
của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là As o.


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ
được giá trị ∆ OD1 đến ∆ OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của ∆ OD theo nồng độ
protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine.
 Xác định hoạt tính enzyme protease
Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7.
Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 ± 0,50C trong 10 – 15
phút.
Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở
37 ± 0,50C trong một giờ.
Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme.
Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa.
Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc.
Thêm 1 ml thuốc thử Folin.
Trộn đều, để yên ở 37 ± 0,50C trong 20 phút.

Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm (ghi
nhận kết quả này là Am).
Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành
các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ
là A0.
Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách
lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tínhprotease
theo tính toán sau :
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để
tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều
kiện thí nghiệm. Ký hiệu là: U
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) =

(Am – A0).F.1/100.n.V
m


Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục

F = [10/ ∆ As10 + 20/ ∆ As20 + 30/ ∆ As30 + 40/ ∆ As40 + 50/ ∆ As50 + 60/ ∆ As60 +
70/ ∆ As70 + 80/ ∆ As80 + 90/ ∆ As90+100/∆As100]/10
− Am : độ hấp thu của mẫu
− A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng
− F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước sóng 660
nm trên đường chuẩn.
− n : Hệ số pha loãng của enzyme
− 1/100 : Hệ số chuyển đổi
− V : Thể tích của dung dịch enzyme
− m : khối lượng chế phẩm enzyme thô.

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease: từ kết quả hàm lượng
protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (U/ml) tính hoạt tính riêng của enzyme.
HTR (U/mg) =

Số đơn vị hoạt tính
mg protein enzyme

Đường chuẩn tyrosine