Nghiên cứu phân biệt loài phụ salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT LOÀI PHỤ
SALMONELLA GÂY BỆNH VỚI CÁC LOÀI PHỤ
KHÁC TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT LOÀI PHỤ SALMONELLA
GÂY BỆNH VỚI CÁC LOÀI PHỤ KHÁC TRONG
THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ
CHUYÊN NGÀNH VI SINH
MÃ SỐ: 1.05.12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

i

Nguyễn Tiến Dũng

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. ..........................................................................................................6
TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................................6
1.1. Vị trí phân loại và cách gọi tên Salmonella ................................................7
1.2. Đặc điểm sinh học và tính chất nuôi cấy ..................................................10
1.3. Đặc điểm kháng nguyên............................................................................11
1.4. Bệnh do Salmonella ...................................................................................12
1.5. Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh của Salmonella ...........13
1.5.1. Đặc điểm bộ gen...................................................................................13
1.5.2. Các cụm gây bệnh ................................................................................14
1.5.3. Các gen gây độc ...................................................................................15
1.6. Đặc điểm tiến hóa về tính gây bệnh..........................................................18
1.6.1. Các bước tiến hóa về tính gây bệnh của giống Salmonella ...................18
1.6.2. Tiến hoá theo hướng tăng tính gây bệnh ...............................................19
1.6.3. Loài phụ S. entreica I tiến hóa theo hướng thích nghi với vật chủ là
người và động vật máu nóng .................................................................20
1.6.4. Tiến hóa của protein có vai trò bám dính có liên quan đến phổ vật chủ 21
1.7. Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ .................................................22

1.7.1. Cấu tạo của hệ tiêu hóa của người và động vật máu nóng liên quan đến
quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn .........................................................22
1.7.2. Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ ..............................................24
1.7.3. Cơ chế phòng vệ của vật chủ đối với sự xâm nhập của mầm bệnh .......25
1.8. Triệu chứng bệnh do Salmonella..............................................................28
1.9. Ý nghĩa của việc phân biệt loài phụ S. enterica I với Salmonella spp.
trong thực phẩm và thủy sản ...................................................................29
CHƯƠNG 2. ........................................................................................................ 33
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP........................................................................... 33
2.1. Thiết bị chính ............................................................................................34
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

ii

Nguyễn Tiến Dũng

2.2. Hoá chất, môi trường ................................................................................34
2.2.1.Hóa chất................................................................................................34
2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật .............................................................36
2.3. Vật liệu thí nghiệm....................................................................................36
2.3.1. Chủng giống vi sinh vật ........................................................................36
2.3.2. Chuột sử dụng trong các nghiên cứu ....................................................37
2.4. Phương pháp .............................................................................................37
2.4.1. Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật ............................................37
2.4.2. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp nuôi cấy........................38
2.4.3. Phương pháp nuôi cấy để phân lập hoặc phát hiện Salmonella spp. trong

thực phẩm .............................................................................................39
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy xác định S. enterica I .......................................42
2.4.5. Phương pháp PCR để phát hiện Salmonella spp., S. enterica I và để khảo
sát sự hiện diện của các gen ..................................................................44
2.4.6. Thí nghiệm khảo sát lựa chọn gen mục tiêu cho qui trình phát hiện
Salmonella spp. và S. enterica I.............................................................47
2.4.7. Khảo sát xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện phân S. enterica I
và Salmonella spp. trong thực phẩm dựa vào hai gen invA và iagAB.....47
2.4.8. Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. và S. enterica I trong thực phẩm
bằng phản ứng multiplex PCR 2 cặp mồi nhân bản đồng thời gen mục
tiêu invA và iagAB.................................................................................48
2.4.9. Phương pháp RT-PCR trong thí nghiệm khảo sát sự biểu hiện của các
gen gây bệnh .........................................................................................48
2.4.10. Phương pháp nghiên cứu khả năng xâm nhiễm và gây bệnh ở chuột...50
2.4.11. Nghiên cứu sự phiên mã in vivo của gen ssrA ở Salmonella sử dụng mô
hình chuột bị gây nhiễm ........................................................................53
2.4.12. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn phát hiện
Salmonella spp. .....................................................................................53
2.4.13. Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR trong phân tích Salmonella spp.
trong thực phẩm ....................................................................................55
CHƯƠNG 3. ........................................................................................................ 59
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN.................................................................................. 59
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

iii

Nguyễn Tiến Dũng

3.1. Phân lập định danh Salmonella từ thực phẩm, thủy sản bằng phương
pháp nuôi cấy, sinh hóa, miễn dịch ..........................................................60
3.2. Nghiên cứu phương pháp phát hiện Salmonella spp. và loài phụ gây
bệnh S. enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng PCR .......................61
3.2.1. Khảo sát khả năng nhân bản sao các gen mục tiêu invA, fimA, iagAB,
spvC ở Salmonella bằng các cặp mồi tương ứng ...................................61
3.2.2. Phát hiện Salmonella spp. bằng phản ứng PCR dựa trên gen mục tiêu
invA.......................................................................................................62
3.2.3. Phát hiện loài phụ gây bệnh S. enterica I bằng phản ứng PCR dựa vào
gen mục tiêu iagAB ...............................................................................64
3.2.4. Phát hiện phân biệt Salmonella spp. và S. enterica I bằng phản ứng
multiplex PCR dùng 2 cặp mồi ..............................................................66
3.2.5. Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. và S. enterica I trong thực phẩm
bằng phản ứng multiplex PCR 2 cặp mồi nhân bản đồng thời gen mục
tiêu invA và iagAB.................................................................................68
3.3 Nghiên cứu so sánh sự hiện diện và biểu hiện của các gen gây bệnh ở
Salmonella spp. và loài phụ S. enterica I..................................................70
3.3.1. So sánh sự hiện diện các gen gây bệnh ở Salmonella spp. và loài phụ S.
enterica I từ mẫu có nguồn gốc thực phẩm và mẫu có nguồn gốc bệnh
phẩm .....................................................................................................70
3.3.2. So sánh mức độ phiên mã của các gen gây bệnh ở Salmonella spp. và
loài phụ S. enterica I trong điều kiện in vitro.........................................73
3.3.3. Khảo sát sự phiên mã in vivo của gen ssrA ở Salmonella sử dụng mô
hình chuột bị gây nhiễm ........................................................................76
3.4. Nghiên cứu so sánh đặc tính gây bệnh của loài phụ S. enterica I với các
loài phụ khác.............................................................................................78
3.4.1. Khảo sát so sánh tính gây bệnh in vivo của loài phụ S. enterica I với các
loài phụ khác.........................................................................................78

3.4.2. Sự khác biệt về tính kháng các nhân tố phòng vệ của vật chủ ...............83
3.4.3. Mối quan hệ giữa các gen gây bệnh và độc lực của Salmonella............89
3.5. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp. và S. enterica I để
ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm ........................................................92

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

iv

Nguyễn Tiến Dũng

3.5.1 Tối ưu hóa quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp. trong thực phẩm
dựa vào gen invA...................................................................................92
3.5.2. Đề xuất quy trình phân tích Salmonella spp. bằng phương pháp PCR dựa
trên gen mục tiêu invA...........................................................................96
3.5.3. Đánh giá hiệu lực của quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp. trong
thực phẩm dựa trên gen mục tiêu invA...................................................98
3.5.4. Đề xuất quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp. dựa vào gen mục
tiêu invA thành tiêu chuẩn ngành trong lĩnh vực thủy sản....................101
3.6. Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện phân biệt Salmonella spp.
với S. enterica I trong thực phẩm...........................................................101
3.6.1. Tối ưu hóa quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện phân biệt
Salmonella spp. với S. enterica I trong thực phẩm dựa vào gen invA và
iagAB ..................................................................................................101
3.6.2. Đề xuất quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện phân biệt
Salmonella spp. với S. enterica I trong thực phẩm dựa vào gen invA và

iagAB ..................................................................................................104
CHƯƠNG 4. ...................................................................................................... 106
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ.................................................................................... 106
4.1 Kết luận ....................................................................................................107
4.2. Đề nghị.....................................................................................................108
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

v

Nguyễn Tiến Dũng

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự phòng vệ của vật chủ chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh ..........26
Bảng 1.2. Các yêu cầu về Salmonella trong các qui định an toàn vệ sinh thực phẩm
của một số nước ...................................................................................30
Bảng 2.1. Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu ..................................35
Bảng 2.2. Danh mục chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm .....................37
Bảng 2.3. Các phương pháp phân lập và định danh vi sinh vật đã sử dụng ...........37
Bảng 2.4. Các đặc trưng sinh hóa của Salmonella ................................................41
Bảng 2.5. Các đặc trưng sinh hoá của S. enterica I...............................................43
Bảng 2.6. Nhiệt bộ bắt cặp của các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng
multiplex PCR .......................................................................................46

Bảng 3.1. Tổng hợp kết quả phân lập, định danh các chủng Salmonella từ thực
phẩm dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu ..........................................60
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra tính chuyên biệt các gen fimA; invA mục tiêu trên các
chủng Salmonella đã được xác nhận nguồn gốc ...................................63
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự hiện diện của các gen invA và fimA trên các chủng
Salmonella có nguồn gốc tự nhiên và được nuôi cấy thuần chủng .........63
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen iagAB trên các chủng vi sinh vật
..............................................................................................................65
Bảng 3.5. Kết quả multiplex PCR kết hợp 2 cặp mồi nhân bản sao đồng thời 2 gen
invA và iagAB........................................................................................66
Bảng 3.6. Tần suất hiện diện của Salmonella spp. và S. enterica I trong các nhóm
thực phẩm tại TP. HCM ........................................................................69
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen gây độc ở các chủng Salmonella 72
Bảng 3.8. Tỉ lệ phân bố các gen gây bệnh ở các loài phụ Salmonella khác nhau...73
Bảng 3.9. Tỉ lệ phân bố các các gen gây bệnh ở các chủng Salmonella đã khảo sát
..............................................................................................................73
Bảng 3.10. Kết quả biểu hiện các gen gây bệnh ở các chủng Salmonella .............74
Bảng 3.11. Tỉ lệ biểu hiện các gen gây bệnh ở các loài phụ Salmonella khác nhau
..............................................................................................................75
Bảng 3.12. Tỉ lệ phân bố và sự biểu hiện các gen gây bệnh ở các chủng Salmonella
đã khảo sát ............................................................................................75
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

vi

Nguyễn Tiến Dũng

Bảng 3.13. Sự biểu hiện của gen ssrA trước và sau khi xâm nhiễm vào chuột .......77
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng thuộc loài phụ S.
enterica I và các loài phụ khác ..............................................................79
Bảng 3.15. Khả năng xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các chủng S. enterica I
..............................................................................................................82
Bảng 3.16. Khả năng xâm nhiễm gan lách chuột bởi các chủng Salmonella phân
lập từ thực phẩm ...................................................................................83
Bảng 3.17. Quy định số thứ tự các chủng được dùng trong các thí nghiệm khảo sát
tính kháng các nhân tố phòng vệ của vật chủ.........................................85
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát thời gian tăng sinh cần thiết để phát hiện Salmonella
spp.trong thực phẩm bằng phản ứng PCR .............................................94
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 lên phản ứng PCR phát hiện Salmonella
spp.........................................................................................................95
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp lên phản ứng PCR ............................95
Bảng 3.21. Tương quan giữa kết quả phân tích Salmonella bằng phương pháp
PCR và phương pháp nuôi cấy ..............................................................98
Bảng 3.22. Kết quả đánh giá độc lập qui trình PCR phân tích Salmonella trong
thực phẩm dựa vào gen mục tiêu invA .................................................100
Bảng 3.23. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR phát hiện
Salmonella trong thực phẩm dựa vào gen invA được đánh giá độc lập bởi
các phòng thí nghiệm khác nhau .........................................................100
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 lên phản ứngPCR 2 cặp mồi nhân bản
đồng thời 2 gen invA và iagAB ............................................................102
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp lên phản ứng PCR 2 cặp mồi nhân bản
sao đồng thời hai gen invA và iagAB...................................................102
Bảng 3.26. Mật độ tế bào Salmonella được nuôi cấy có thể phát hiện được bằng
phản ứng PCR 2 cặp mồi.....................................................................103
Bảng 3.27. Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng PCR 2 cặp mồi để nhân bản gen
invA và iagAB ở mẫu thực phẫm bị gây nhiễm Salmonella ..................104

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Mục lục, danh mục bảng , hình

vii

Nguyễn Tiến Dũng

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD..........................................11
Hình 1.2. Quá trình tiến hóa hình thành tính gây bệnh ở Salmonella ....................19
Hình 1.3. Cấu tạo các lớp tạo nên ống tiêu hóa ....................................................23
Hình 2.1. Kích thước các vạch của thang DNA .....................................................36
Hình 2.2. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường phân lập XLD ....40
Hình 2.3. Phản ứng ngưng kết huyết thanh của Salmonella ..................................... 42
Hình 2.4. Đặc trưng sinh hoá của S. enterica I .....................................................44
Hình 2.5. Dụng cụ phẩu thuật và chuột sau khi phẩu thuật ...................................51
Hình 3.1. Phân tích sản phẩm phản ứng PCR phát hiện Salmonella spp., S. enterica
I bằng các cặp mồi invA1-invA2, fimA1- fimA2, iagAB1-iagAB2 và
spvC1-spvC2. .......................................................................................61
Hình 3.2. Tín hiệu khuếch đại khi thực hiện phản ứng multiplex PCR đồng thời với
hai cặp mồi invA1-invA2 và iagAB1- iagAB2 trên các chủng Salmonella
và không phải Salmonella.....................................................................67
Hình 3.3. Biểu hiện ở chuột bệnh và chuột khỏe mạnh ..........................................81
Hình 3.4. Tính chịu acid của các chủng Salmonella .............................................86
Hình 3.5. Khả năng kháng nitrite của các chủng khảo sát.....................................87
Hình 3.6. Khả năng kháng H2O2 của các chủng Salmonella..................................89

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Phần Mở đầu

1

Nguyễn Tiến Dũng

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Phần Mở đầu

2

Nguyễn Tiến Dũng

Salmonella là nhóm vi sinh vật gây bệnh đường ruột nguy hiểm, được quan
tâm bởi các nhà nghiên cứu bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường và an toàn vệ
sinh thực phẩm. Về bệnh học, Salmonella được quan tâm nhiều đến đặc điểm, cách
thức, liều lượng gây bệnh, đặc điểm phân loại, kháng nguyên, biểu hiện lâm sàng,
phương pháp chẩn đoán và phương pháp điều trị… Về khía cạnh dịch tễ học và vệ
sinh môi trường, Salmonella được quan tâm đến đặc điểm phân bố trong môi
trường, đặc điểm truyền bệnh và gây dịch… Về an toàn vệ sinh thực phẩm,

Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm vì khả năng gây bệnh rất nghiêm
trọng, gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Tất cả các qui định về an toàn vệ sinh thực
phẩm đều không cho phép sự hiện diện của vi khuẩn này trong 25g thực phẩm.
Giống Salmonella có hai loài chính là S. enterica và S. bongori được chia
thành 2339 kiểu huyết thanh. Trong số đó, loài S. enterica được chia thành 6 loài
phụ gồm 2321 kiểu huyết thanh được phân bố trong các loài phụ như sau: 1379 ở S.
enterica subsp. enterica (I), 466 ở S. enterica subsp. salamae (II), 93 ở S. enterica
subsp. arizonae (IIIa), 309 ở S. enterica subsp. diarizonae (IIIb), 64 ở S. enterica
subsp. houtenae (IV), 10 ở S. enterica subsp. indica (VI). Loài S. bongori (được coi
là loài phụ V) có 18 kiểu huyết thanh. Các loài phụ cũng như các kiểu huyết thanh
của Salmonella phân bố không đồng đều trong tự nhiên. Trong khi các loài phụ S.
enterica từ II đến VI là những vi sinh vật hiện diện thường xuyên trong đường ruột
của các loài động vật lưỡng thê và bò sát thì loài phụ S. enterica I thường xuyên
được tìm thấy ở người, động vật máu nóng và chim. Một số kiểu huyết thanh lại chỉ
thích nghi với một ký chủ đặc hiệu như S. pollurum/galinarum chỉ tìm thấy ở gia
cầm và chim, S. typhi chỉ tìm thấy ở người và các loài linh trưởng… Một số nghiên
cứu khác cũng đã chỉ ra rằng Salmonella gây bệnh cho người chủ yếu nằm trong
loài phụ S. enterica I.
Mặt khác, các nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy S. weltevreden là kiểu
huyết thanh thường xuyên hiện diện trong nước ở các ao hồ nuôi thuỷ sản tại Anh,
Xứ Wales và Úc. Kiểu huyết thanh này cũng thường xuyên được tìm thấy trong các
sông hồ và ao nuôi thuỷ sản ở các nước trong khu vực Đông Nam Á. Nghiên cứu
của Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh (CDC) Hoa Kỳ cho thấy kiểu huyết thanh này
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Phần Mở đầu

3

Nguyễn Tiến Dũng

hiếm khi được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của người, nghĩa là khả năng gây
bệnh của của kiểu huyết thanh này hầu như không có. Như vậy một số dòng
Salmonella hiện diện thường xuyên trong môi trường tự nhiên là không gây hại cho
con người.
Về khía cạnh vệ sinh an toàn thực phẩm, Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt
quan tâm vì khả năng gây bệnh cho người qua con đường thực phẩm. Tuy nhiên các
nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy rằng không phải tất cả các dòng
Salmonella đều có khả năng gây bệnh cho người, mà chỉ có những dòng có mang
yếu tố gây bệnh và có khả năng chống lại hệ thống phòng vệ của vật chủ thì mới có
khả năng gây bệnh cho người. Mặt dù vậy, yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm
của hầu hết các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella
trong 25g thực phẩm, không phân biệt dòng hay kiểu huyết thanh Salmonella bị
nhiễm có thực sự nguy hiểm cho con người hay không. Trên thực tế các phương
pháp phân tích Salmonella trong thực phẩm hiện nay chỉ xác định đến giống, không
phân loài hay kiểu huyết thanh (Salmonella spp.). Điều này đã gây nhiều khó khăn
và thiệt hại cho các nhà sản xuất và kinh doanh thực phẩm, đặc biệt là ngành thủy
sản.
Các dẫn chứng nêu trên cho thấy cần xem xét lại một cách nghiêm túc quan
niệm cho rằng mọi Salmonella spp. nhiễm vào thực phẩm đều nguy hiểm cho con
người, cũng như cần có phương pháp hữu hiệu để phát hiện phân biệt Salmonella có
khả năng gây bệnh với Salmonella khác trong thực phẩm. Như vậy việc nghiên cứu
xác định sự khác biệt giữa các dòng Salmonella gây bệnh với các dòng Salmonella
vô hại khác, đồng thời thiết lập phương pháp phát hiện phân biệt giữa chúng với
nhau có ý nghĩa rất lớn nhằm cung cấp cơ sở khoa học để xóa bỏ một phần rào cản
về yêu cầu Salmonella trong thực phẩm hiện nay.
Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm cho đến nay vẫn chủ yếu sử
dụng phương pháp nuôi cấy. Với phương pháp này, thời gian phát hiện là 4 - 6

ngày, tốn nhiều công sức lao động, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh các
mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc được nghi
ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác, quy trình phân tích này không cho phép phân
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Phần Mở đầu

4

Nguyễn Tiến Dũng

biệt các loài hay loài phụ Salmonella với nhau. Phương pháp PCR (Polymerase
Chain Reaction) được coi là phương pháp có tiềm năng thay thế phương pháp nuôi
cấy trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, trong đó có Salmonella, vì có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao. Nhờ vào tính đặc hiệu này, có thể thiết kế quy trình PCR
để phát hiện phân biệt giữa nhóm Salmonella gây bệnh và nhóm không gây bệnh
hiện diện thường trực trong môi trường tự nhiên. Tuy nhiên, để phương pháp PCR
trở thành một phương pháp tiêu chuẩn chính thức có thể dùng thay thế cho phương
pháp nuôi cấy, đang được xem là phương pháp chuẩn hiện nay, thì cần tiến hành
việc xác nhận hiệu lực nhằm khẳng định các thông số kỹ thuật của một phương
pháp PCR là tương đương với phương pháp nuôi cấy. Việc xây dựng được phương
pháp PCR chuẩn như vậy mở đường cho việc đưa phương pháp PCR trở thành tiêu
chuẩn chính thức thay thế phương pháp nuôi cấy còn nhiều nhược điểm nêu trên.
Để góp phần giải quyết các vấn đề nêu ra như trên, mục tiêu của luận án này
nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và các công cụ ứng dụng cho việc phân biệt
các loài phụ S. enterica I gây bệnh và các loài phụ Salmonella khác, phục vụ công
tác giám sát chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm nói chung và trong thủy sản nói
riêng tại Việt Nam.

Để thực hiện được mục tiêu này, trong giới hạn của luận án, các nội dung sau
đây đã được khảo sát, nghiên cứu:
1. Nghiên cứu phương pháp phát hiện Salmonella spp. và loài phụ gây bệnh
S. enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng PCR.
2. Nghiên cứu so sánh sự hiện diện và biểu hiện các gen gây bệnh của S.
enterica I và Salmonella spp.
3. Nghiên cứu so sánh đặc tính gây bệnh của loài phụ S. entrica I với các
loài phụ khác
4. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp. và S. enterica I ứng
dụng trong giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm
Trong các nội dung này, nội dung xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện
Salmonella spp. trong thực phẩm là một bộ phận của đề tài khoa học công nghệ
trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Phần Mở đầu

5

Nguyễn Tiến Dũng

kiểm tra giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm”, mã số KC.04.30, được thực hiện
trong các năm 2004-2005, do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐH Quốc gia
TP.HCM) làm cơ quan chủ trì, PGS.TS Trần Linh Thước làm chủ nhiệm.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010

Chương 1. Tổng quan tài liệu

6

Nguyễn Tiến Dũng

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

7

Nguyễn Tiến Dũng

1.1. Vị trí phân loại và cách gọi tên Salmonella
Salmonella là vi khuẩn hình que, di động, Gram âm (-) thuộc họ vi khuẩn
đường ruột Enterobacteriaccae, có mối quan hệ di truyền chặt chẻ với E. coli.
Salmonella được phát hiện và mô tả chi tiết lần đầu tiên vào năm 1880 bởi Eberth.
Năm 1884, Salmonella được nuôi cấy thành công bởi Gaffky. Vào cuối những năm
1940, Edward và Ewing bắt đầu nghiên cứu thiết lập phương pháp xác định và phân
biệt giống Salmonella với các loài khác trong họ Enterobacteriaccea. Cho đến nay,
mặt dù sự phân loại và danh pháp của Salmonella đã có nhiều thay đổi nhưng
phương pháp đã được mô tả bởi hai tác giả trên vẫn còn đang được sử dụng rất phổ
biến [2],[3].

Theo định nghĩa năm 1986 của Ewing, giống Salmonella được xếp vào họ vi
khuẩn đường ruột Enterobacteriaccae và thuộc tộc Salmonelleae [41], [74]. Đặc
điểm sinh hóa chung của giống này là có khả năng sinh H2S, phản ứng methyl red
dương tính, phản ứng lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase và arginine
dehydrolase dương tính, không sinh indol, không có khả năng thủy phân urea, thử
nghiệm Voges – Proskauer âm tính, không có khả năng khử amin của phenylalanine
và tryptophane, không có khả năng sinh acid từ các nguồn carbon như sucrose,
adonitol, raffinose, α-methyl-glucoside. Các chủng thuộc các loài phụ (subspecies,
subsp.) I, II, IV và V không có khả năng sử dụng và tạo acid từ lactose nhưng các
chủng thuộc các loài phụ IIIa và IIIb có khả năng sử dụng và sinh acid từ nguồn
carbon này. Các chủng thuộc các loài phụ I, II và V có khả năng lên men và sinh
acid từ dulcitol nhưng các chủng thuộc IIIa, IIIb và IV không sử dụng được dulcitol
[41], [73], [74]. Minor và cộng sự bổ sung đặc điểm của loài phụ VI là không sử
dụng và không sinh acid từ inositol hay sorbitol, 22% có khả năng lên men đường
lactose, 67% lên men đường dulcitol. Tác giả này cho rằng loài phụ V khác biệt với
các dòng khác của Salmonella. Năm 1989, Reeves và cộng sự xếp loài phụ V thành
loài thứ hai của giống Salmonella với tên gọi là Salmonella bongori. Hiện nay
giống Salmonella được chia thành hai loài là S. enterica và S. bongori [41].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

8

Nguyễn Tiến Dũng

Theo hệ thống phân loại như trên, cho đến nay nhiều quốc gia vẫn thống nhất

chia giống Salmonella thành hai loài và các loài phụ như sau [41]:
- S. enterica subsp. enterica (còn gọi là loài phụ S. enterica I hay 1)
- S. enterica subsp. salamae (còn gọi là loài phụ S. enterica II hay 2)
- S. enterica subsp. arizonae (còn gọi là loài phụ S. enterica IIIa hay 3a)
- S. enterica subsp. diarizonae (còn gọi là loài phụ S. enterica IIIb hay 3b)
- S. enterica subsp. houtenae (còn gọi là loài phụ S. enterica IV hay 4)
- S. enterica subsp. indica (còn gọi là loài phụ S. enterica VI hay 6)
- S. bogori.
Trên thực tế, các dòng Salmonella được gọi tên không theo tên của loài hay
loài phụ mà thông thường được gọi tên theo kiểu huyết thanh (serotype). Sự phân
bố các kiểu huyết thanh theo các loài hay loài phụ như sau [41], [46]:
- S. enterica subspecies enterica (I): 1379 serotypese
- S. enterica subsp. salamae (II): 466 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. arizonae (IIIa): 93 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. diarizonae (IIIb): 309 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. houtenae (IV): 64 kiểu huyết thanh
- S. enterica subsp. indica (VI): 10 kiểu huyết thanh
- S. bongori (V): 18 kiểu huyết thanh
Các kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S. enterica I thông thường được gọi theo
tên địa danh nơi phân lập, trong đó tên của kiểu huyết thanh được viết hoa và không
in nghiêng [41]. Ví dụ: S. enterica I có kiểu huyết thanh Typhimurium được gọi tên
là Salmonella Typhimurium. Từ năm 1984, các tên kiểu huyết thanh không cần phải
viết hoa nữa.
Trong luận án này tên của các dòng Salmonella được gọi theo một trong hai
cách như sau:
- Gọi theo loài phụ: ví dụ, Salmonella enterica I để chỉ cho loài phụ
Salmonella enterica subsp. enterica.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010

Chương 1. Tổng quan tài liệu

9

Nguyễn Tiến Dũng

- Gọi theo kiểu huyết thanh: ví dụ, Salmonella typhimurium là S. enterica I
có kiểu huyết thanh Typhimurium.
Một số kiểu huyết thanh không được đặc tên thì gọi tên theo công thức kháng
nguyên của chúng. Ví dụ: Salmonella enterica IIIb có kiểu huyết thanh 60:k:z được
viết như sau: Salmonella 60:k:z.
Các loài phụ của loài S. enterica được phân biệt dựa vào các đặc tính sinh
hóa như sau [41],[73],[74]:
- S. enterica I không lên men lactose, lên men dulcitol sinh acid, sử dụng
được tartrate nhưng không sử dụng được galacturonate.
- S. enterica II không lên men lactose, lên men dulcitol sinh acid, có khả
năng dử dụng malonate, galacturonate, tartrate và làm tan gelatin.
- S. enterica IIIa lên men lactose sinh acid, không lên men dulcitol và
inositol, có khả năng sử dụng malonate nhưng không có khả năng sử dụng
galacturonate.
- S. enterica IIIb không lên men lactose trong 24 giờ nuôi cấy nhưng lên men
được sau 24 giờ nuôi cấy, không sử dụng dulcitol và inositol, sử dụng được
malonate.
- S. enterica IV không lên men lactose, inositol và dulcitol, có thể sử dụng
được salicin, phản ứng dương tính với kali cyanua (KCN), âm tính với ONPG (o nitrophenyl--D-galactopyranoside).
- S. enterica VI không lên men inositol và sorbitol. Một số kiểu huyết thanh
trong nhóm này có thể lên men lactose và dulcitol, không sử dụng salicin, malonate,
tartrate, sorbitol, làm tan gelatin.

Trường hợp S. bongori (hay còn gọi là Salmonella V), loài này có đặc điểm
sinh hóa như sau: không lên men lactose, inositol nhưng lên men dulcitol, phản ứng
dương tính với kali cyanua (KCN) và ONPG.

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

10

Nguyễn Tiến Dũng

1.2. Đặc điểm sinh học và tính chất nuôi cấy
Salmonella có dạng hình que, kích thước khoảng 0,4 – 0,6 x 1,0 – 3,0µm, có
khả năng tăng trưởng cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không có khả năng hình
thành bào tử, nhuộm Gram (-). Phần lớn Salmonella có khả năng di động nhờ lông
roi; một số ít các kiểu huyết thanh không di động như S. gallinarum và S. pullorum
[2],[73].
Salmonella có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 5,2 - 46,2oC và pH từ
3,7- 9,5, nhiệt độ tối ưu là 37C, pH tối ưu trong khoảng 6,8 - 7,2. Vi khuẩn này có
tính chịu nhiệt kém, bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50C trong 1 giờ, 70C trong 15 phút,
100C trong 5 phút. Vi khuẩn này dễ dàng được nuôi cấy trên các môi trường thông
thường, phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính trong khoảng 2 - 4mm, trơn
láng, bờ đều. Khi phát tiển trong môi trường lỏng, Salmonella cho canh khuẩn đục
đều, lắng cặn khi kéo dài thời gian nuôi cấy và trên bề mặt môi trường có lớp ván
mỏng [2],[3],[73].
Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate), khuẩn lạc
Salmonella điển hình có dạng trong suốt, hơi nhuốm đỏ, đôi khi có tâm đen, thường

có vùng đỏ hồng xung quanh (Hình 1.1). Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant
Green Phenol red Lactose Sucrose), Salmonella có khuẩn lạc trong suốt, có vùng đỏ
hồng xung quanh, không có tâm đen. Trên môi trường BSA (Bismuth Sulphite
Agar), S. typhi có khuẩn lạc dẹt, khô, đen nhánh, môi trường xung quanh chuyển
thành màu nâu đen và thường có ánh kim bạc phớt trên bề mặt môi trường. Các
dạng Salmonella khác tạo khuẩn lạc xanh lá cây hoặc đen ướt, không có vùng nâu
đen bao quanh. Trên môi trường thạch MC (Mac Conkey Agar), Salmonella tạo
khuẩn lạc có dạng dẹt, trong, ở tâm hơi tím đỏ và làm biến đổi môi trường từ hồng
sang hơi vàng [47].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

11

Nguyễn Tiến Dũng

Hình 1.1. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD

1.3. Đặc điểm kháng nguyên
Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính là: kháng nguyên H (hay kháng
nguyên lông, flagella); kháng nguyên Vi (hay kháng nguyên vỏ, capsul) và kháng
nguyên O (hay kháng nguyên màng tế bào, somatic membrane). Cấu trúc kháng
nguyên của Salmonella được sử dụng để xác định nguồn gốc các chủng gây nên các
triệu chứng lâm sàng từ các mẫu bệnh phẩm hay từ các nguồn phân lập khác. Kiểu
kháng nguyên được chia thành 9 nhóm từ A - I, mỗi nhóm gồm các kiểu kháng
nguyên được chia chi tiết hơn. Cho đến nay đã có 2339 kiểu kháng nguyên của

Salmonella đã được xác định [2],[3],[74].

- Kháng nguyên H
Kháng nguyên H là các kháng nguyên lông (tiên mao), có thể được biểu hiện
ở dạng một pha duy nhất hay hai pha (pha 1 và pha 2): kháng nguyên pha 1 có tính
đặc hiệu chỉ gắn với kháng thể tương ứng; kháng nguyên pha 2 không đặc hiệu, có
thể gắn với các kháng thể khác loại. Pha đặc hiệu của kháng nguyên H được dùng
làm tiêu chí bổ sung khi cần xác định các dòng Salmonella có cùng kiểu kháng
nguyên O.
- Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên Vi là loại kháng nguyên vỏ, hiện diện trên vỏ polysaccharide
ở bên ngoài và thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ.
- Kháng nguyên O
Kháng nguyên O là thành phần O-polysaccharide của phức hợp
lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella. LPS gồm 3 thành
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

12

Nguyễn Tiến Dũng

phần: bên ngoài là màng O-polysaccharide, phần chính giữa (R) và một màng lipid
bên trong. LPS là nội độc tố được phóng thích khi tế bào bị ly giải, đóng vai trò
quan trọng trong sự gây bệnh của Salmonella. Cấu trúc lặp lại một cách tự nhiên
của các tiểu đơn vị đường ở chuỗi O-polysacchaside quyết định tính đặc hiệu của
kháng nguyên O và đặc tính gây bệnh của từng kiểu huyết thanh. Những chủng

Salmonella kháng nguyên O được gọi là thể nhám (rough) bởi chúng có khuẩn lạc
xù xì, bị mất hay giảm đặc tính gây bệnh so với dạng hoang dại thể trơn (smooth)
còn đầy đủ các chuổi trình tự O-polysaccharide [74].

1.4. Bệnh do Salmonella
Salmonella được coi là một trong những vi sinh vật gây bệnh rất nguy hiểm
cho người và động vật. Các bệnh do vi khuẩn này gây nên thường là sốt thương hàn,
nhiễm trùng máu, viêm ruột kết và nhiễm trung tâm. Viêm ruột kết là một trong
những bệnh phổ biến nhất gây ra bởi Salmonella. Các bệnh như nhiễm trùng máu và
xâm nhiễm trung tâm là những bệnh gây ra sau khi viêm ruột kết. Sốt thương hàn
được gây ra bởi S. typhi, S. paratyphi và một số kiểu huyết thanh khác [6],[9].
Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên như trong nước, trong đất, trên
gia cầm, các động vật nuôi, động vật hoang dại, các loài côn trùng, cá, tôm, trong
thực phẩm… Tuy nhiên chỉ một số ít các chủng phân lập được xác định theo kiểu
huyết thanh [19],[74].
S. enterica I là đối tượng gây bệnh rất quan trọng cho người và động vật bậc
cao. Tất cả các kiểu huyết thanh được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của người
đều thuộc loài phụ này [9]. Đây là nhóm tiến hóa cao nhất của giống Salmonella, có
thể xâm nhiễm chuyên biệt vào các mô sâu và xuyên thủng hệ thống phòng vệ của
các động vật có hệ miễn dịch hoàn hảo.
Theo nghiên cứu tại Viện Vệ sinh phòng dịch Hà Nội [19],[29], các kiểu
huyết thanh S. typhi, S. typhimurium và S. enteritidis là những kiểu huyết thanh
thường xuyên được phân lập từ các bệnh nhân tại Việt Nam. Đây cũng là hai kiểu
huyết thanh gây bệnh thường xuyên được phân lập từ các nước phương Tây.
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

13

Nguyễn Tiến Dũng

Tại Mỹ, hằng năm có khoảng 40.000 trường hợp bị nhiễm bệnh do
Salmonella được báo cáo. Tuy nhiên con số này được cho là chỉ chiếm 1-5% số
lượng nhiễm bệnh thật sự và ước tính có khoảng 2-4 triệu trường hợp nhiễm bệnh
với chi phí điều trị bệnh vào khoảng 2 tỉ USD. Mặc khác, số người nhiễm bệnh
Salmonella ngày càng có xu hướng gia tăng kể từ sau chiến tranh thế giới thứ hai
đến nay. Có nhiều nguyên nhân gây nên hiện tượng gia tăng số lượng người nhiễm
bệnh Salmonella, trong số đó có các nguyên nhân là sự gia tăng số lượng người già
trên 60 tuổi, sự thay đổi trong canh tác nông nghiệp, phân phối thực phẩm và ngày
càng có nhiều người tiêu thụ thực phẩm tươi sống hay chỉ qua phương thức nấu nhẹ
trước khi ăn. Sự lan truyền của bệnh Salmonella cho người chủ yếu qua con đường
thực phẩm. Tuy nhiên sự lây nhiễm trực tiếp giữa người và người hay động vật cho
người đôi khi cũng diễn ra [19],[73].

1.5. Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh của Salmonella
1.5.1. Đặc điểm bộ gen
Cấu trúc bộ gen DNA của S. typhimurium rất giống với E. coli, gồm một
phân tử DNA vòng có kích thước khoảng 4 x 106bp dài khoảng 1,4mm, mã hoá cho
khoảng 4800 gen [9,10]. Cho đến nay bộ gen của 2 kiểu huyết thanh S.
typhimurium và S. typhi đã được giải mã. Ngoài các vùng có trình tự tương đồng
cao với E. coli, ở Salmonella còn có sự hiện diện của các vùng gây bệnh PAI
(pathogenicity islands) mã hóa cho nhiều nhân tố gây độc của Salmonella. Các PAI
thường có hàm lượng GC rất khác so với phần còn lại của nhiễm sắc thể. Các gen
thuộc vùng này được hình thành từ quá trình tiến hóa của vi khuẩn này [9],[45].
Bowe và cộng sự đã phát hiện ra rằng có ít nhất 4% bộ gen của S. typhimurium cần
thiết cho quá trình xâm nhiễm, gây chết chuột và hầu hết các gen gây bệnh là cần
thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm. Số lượng lớn các gen gây bệnh

cho thấy rằng sự sống sót trong vật chủ cần có sự cân bằng tinh tế của nhiều gen
hoạt động một cách chính xác tại đúng thời điểm và trong môi trường thích hợp
[48],[51]
Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

14

Nguyễn Tiến Dũng

1.5.2. Các cụm gây bệnh
Một số PAI hiện diện ở Salmonella đã được xác định cho đến nay [45],[48],
bao gồm:
- SPI-1 là cụm gen dài 40kb tại vị trí 63 phút trên DNA của Salmonella, có
vai trò trong sự xâm nhiễm của Salmonella vào các tế bào biểu mô và vô hiệu hóa
đại thực bào của vật chủ.
- SPI-2 là cụm gen dài 40kb tại vị trí 31 phút trong locus tRNA val, giúp
Salmonella xâm nhiễm và sống sót bên trong các đại thực bào. Các thể đột biến trên
SPI-2 có độc lực giảm rất nhiều, chúng không thể nhân lên trong các cơ quan như
gan, lách của vật chủ nhiễm bệnh, cũng như giảm khả năng vựợt qua mảng Peyer để
đi vào trong biểu mô ruột. Các nghiên cứu in vitro cũng cho thấy rằng các thể đột
biến SPI-2 bị giảm khả năng sống sót trong đại thực bào và khả năng nhân lên trong
các tế bào bạch cầu đơn nhân.
- SPI-3 là cụm gen được định vị tại locus 82 phút trên bộ gen, ngay sau salC,
một locus của tRNA. Cụm gen này mã hóa cho 10 khung đọc mở ORF (open
reading frame) và 6 đơn vị phiên mã trong đó có operon mgtCB (mã hóa cho protein
MgtC và protein MgtB vận chuyển Mg2+, có vai trò giúp Salmonella sống sót trong

đại thực bào) [11].
- SPI-4 dài 27kb tại vị trí 92 phút trên DNA bộ gen. Cụm gen này mã hóa
cho 18 protein được cho là có vai trò giúp Salmonella sống sót trong đại thực bào
vật chủ [57].
- SPI-5 được định vị tại locus tRNA ser ở vị trí 20 phút trên nhiễm sắc thể, mã
hóa cho các gen giúp Salmonella sống sót sót trong đại thực bào [57].
- SPI-6 định vị bên cạnh tRNAphe, giúp Salmonella tồn tại được trong đại
thực bào. Cụm gen này có hai khung đọc mở ORF rất giống các gen atsAB của
Klebsiella aerogenes mã hóa cho arylsulfatase. Ngoài ra còn có ORF mã hóa gen
stmR được cảm ứng khi Salmonella hiện diện trong đại thực bào, bốn ORF khác
liên quan đến khả năng sống sót được trong đại thực bào [45],[48].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

15

Nguyễn Tiến Dũng

Các cụm SPI có đặc điểm chung là mang phần gen có liên quan về chức
năng với nhau và cần thiết cho các kiểu hình gây bệnh chuyên biệt được hình thành
từ quá trình tiến hóa theo hướng tăng cường tính gây bệnh ở Salmonella.
Salmonella được tiến hóa qua 3 giai đoạn (Hình 2.2) [9].
1.5.3. Các gen gây độc
- invA
Locus inv hiện diện ở cụm gen SPI-1 gồm các gen giúp Salmonella xâm
nhiễm được vào các tế bào biểu mô ruột. Một vài gen thuộc locus này được biểu

hiện và protein được tiết vào môi trường tương tác với biểu mô vật chủ. Gen hilA
(hyper invasive locus) mã hóa cho protein HilA có vai trò trong điều hòa sự phiên
mã cac gen inv thông qua tín hiệu hàm lượng ôxi thấp ở ruột. Gen invA là một thành
viên của locus inv, có vị trí tại 59 phút trên nhiễm sắc thể của Salmonella. Các đột
biến trên gen invA làm giảm 500 lần khả năng xâm nhiễm tế bào biểu mô của
Salmonella nhưng không ảnh hưỏng đến khả năng bám dính vào các tế bào này vào
màng nhầy. Gen invA được xác nhận là hiện diện trên hầu hết các chủng Salmonella
[25],[27],[63].
- iagAB
Gen iagA, còn gọi là gen hilA, mã hoá cho protein hoạt hóa sự phiên mã các
gen gây xâm nhiễm ở Salmonella, đồng thời có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp
đến sự biểu hiện của các gen phoPQ. Gen iagB, nằm liền kề ngay sau iagA, có chức
năng chưa được xác định. Các gen iagAB được chứng minh là chỉ hiện diện ở các
kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S. enterica I [71],[72].
- Gen phoPQ
Gen pho PQ mã hóa cho 2 thành phần chức năng PhoP và PhoQ của hệ
thống điều hòa 2 thành phần (two components reguratory system) PhoP/PhoQ có
vai trò trong tính gây độc của Salmonella. Đột biến trên một trong 2 gen phoP hoặc
phoQ này đều làm tăng LD50 lên đến 104 lần và giảm khả năng sống sót cuả
Salmonella trong đại thực bào. Hệ thống PhoP/PhoQ có vai trò hoạt hóa các gen,

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010


Chương 1. Tổng quan tài liệu

16

Nguyễn Tiến Dũng

trong đó sự hoạt hóa gen pag liên quan mật thiết đến sự sống sót của Salmonella
trong đại thực bào và tăng sức đề kháng của Salmonella đối với kháng sinh [23].
PhoQ là một protein cảm biến Mg2+ (Mg2+ sensor). Khi nồng độ Mg2+ đạt
mức mM thì, thông qua PhoP, protein này sẽ ức chế phiên mã 25 locus trong đó có
các gen giúp sự tăng trưởng của Salmonella. Ngoài Mg2+, Ca2+ và Mn2+ cũng được
cảm biến bởi PhoQ. Hệ thống PhoP/PhoQ không chỉ liên quan đến tính gây bệnh
của Salmonella mà còn liên quan đến các đặc điểm khác ở vi khuẩn này [36],[40].
- pmrAB
Các gen pmrA và pmrB mã hóa cho hai protein PmrA và PmrB thuộc hệ
thống điều hòa hai thành phần PmrA/PmrB hiện diện ở Salmonella và các vi khuẩn
gram âm khác, trong đó PmrA là protein điều hòa và PmrB là protein cảm biến
(sensor). PmrA/PmrB được chứng minh có liên quan đến khả năng kháng
polymyxin B của vi khuẩn. PmrA/PmrB chịu sự điều hòa bởi hệ thống PhoP/PhoQ.
PmrB cảm biến nồng độ cao của sắt nên có vai trò trong khả năng tăng trưởng của
Salmonella trong môi trường có nồng độ ion Fe2+ ở mức độc đối với tế bào [7].
- ssrAB
Gen ssrA mã hóa cho SsrA có vai trò cảm biến; gen ssrB mã hóa cho SsrB là
protein điều hòa của hệ thống điều hòa hai thành phần SsrA/SsrB. Hệ thống này
điều hòa sự hình thành các thành phần của hệ thống tiết loại III (type III sorting
system) có vai trò trong sự nhân lên của Salmonella trong đại thực bào và khả năng
truyền nhiễm khắp cơ thể chuột. Gen ssrAB nằm trong cụm gen SPI-2 và chịu sự
điều hòa ở mức phiên mã bởi một thành phần của hệ thống điều hòa hai thành phần
EnvZ/OmpR. Trong thể thực bào của đại thực bào, các chất có tính ôxi hóa mạnh là
nguyên nhân gây hư hỏng DNA, protein và làm chết tế bào vi khuẩn. Do đó, khả
năng sửa chữa các sai hỏng trên DNA và protein của vi khuẩn có quan hệ chặt chẽ
với tính gây bệnh của vi khuẩn. SsrA giúp vi khuẩn chống lại môt phần tổn thương
do bị ôxi hóa bằng cách ngăn sự tạo thành các protein bất bình thường có độc tính
cho tế bào vi khuẩn [12,18].

Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học
phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010