Quá trình thủy phân trùn quế thu enzyme protease

MỤC LỤC

1.

2.

TỔNG QUAN ................................................................................................................................ 3
1.1.

Trùn quế. ........................................................................................................................... 3

1.2.

Protease. ............................................................................................................................ 4

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................................................... 5
2.1.

Vật liệu .............................................................................................................................. 5

2.2.

Hóa chất – dụng cụ - thiết bị : ................................................................................. 6

2.3.

Phương pháp phân tích sử dụng ........................................................................... 6

2.3.1.

Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Biure ................................ 6

2.3.2.

Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến .................... 8

2.3.3.

Tinh sạch bằng sắc kí lọc gel ........................................................................ 9

2.3.4.

Phương pháp điện di SDS-PAGE .............................................................. 11

2.4.
2.4.1.

Sơ đồ thí nghiệm ......................................................................................... 12

2.4.2.

Tiến trình thí nghiệm .................................................................................. 14

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................................. 15

3.

4.

Quy trình thí nghiệm................................................................................................ 12

3.1.

Đo độ ẩm mẫu ban đầu ........................................................................................... 15

3.2.

Xác định hàm lượng protein mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu .......... 15

3.3.

Xác định hoạt tính protease mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu ........... 16

3.4.

Lọc gel ............................................................................................................................. 18

3.5.

Điện di ............................................................................................................................ 20

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………..19

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................. 20

1


Danh mục hình
Hình 1: Trùn quế………………………………………………………………………….4
Hình 2: Phản ứng tạo phức Cu2+ - protein………………………………………………..7

Hình3. Sắc ký lọc gel……………………………………………………………………..9
Hình4. Đồ thị miêu tả mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạt tính riêng…………………….17
Hình6. Kết quả điện di…………………………………………………………………...18

Danh mục bảng
Bảng 1: Một số serine protease thông dụng hiện nay…………………………………….5
Bảng 2. Thành phần đổ gel……………………………………………………………….12
Bảng 3. Hàm lượng protein trong dịch trùn tự phân và mẫu ban đầu……………………15
Bảng4. Kết quả phân tích hoạt tính enzyme……………………………………………...16

2


1. TỔNG QUAN
1.1.

Trùn quế.

Trùn Quế có tên khoa học là Perionyx excavatus, chi Pheretima, họ Megascocidae.
Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang
phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực
tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất.
Phân loại khoa học:
Giới (regnum)

Animalia

Ngành (phylum)

Annelida

Lớp (class)

Clitellata

Phân lớp (subclass)

Oligochaeta

Bộ (ordo)

Haplotaxida

Họ (familia)

Megascolecidae

Chi (genus)

Perionyx

Loài (species)

P. excavatus

Trùn Quế là một trong những giống trùn đã được thuần hoá, nhập nội và đưa vào nuôi công
nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loài trùn mắn đẻ, xuất hiện rải rác ở vùng nhiệt
đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch. Chúng được sử dụng rộng rãi trong việc chuyển
hóa chất thảm ở Philippines, Australia và một số nước khác.
Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, ấm áp, yên tĩnh. Chúng sợ ánh sáng, nhiệt độ cao, tiếng

động, hóa chất bảo vệ thực vật, muối, vôi. Nhiệt độ thích hợp 20 - 30°C, ẩm độ 75-80%,
pH 7,0 - 7,5. Ở nhiệt độ khoảng 30°C và ẩm độ thích hợp trùn Quế sinh trưởng và sinh sản
rất nhanh
Kích thước Trùn Quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, nước chiếm khoảng 80 – 85%, chất khô
khoảng 15 – 20%. Hàm lượng các chất (tính trên trọng lượng chất khô) như sau:
Protein: 68 –70%
Lipid: 7 – 8%,
Chất đường: 12 –14 %
Tro 11 – 12%.

3


Do có hàm lượng Protein cao nên Trùn Quế được xem là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý
giá cho các loại thức ăn gia súc, gia cầm, thủy hải sản… Ngoài ra, Trùn Quế còn được dùng
trong y học…. Phân trùn là loại phân hữu cơ sinh học có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích
hợp cho nhiều loại cây trồng, không gây ra tình trạng "sốc" phân, yêu cầu trữ dễ dàng, đặc
biệt thích hợp cho các loại hoa kiểng, làm giá thể vườn ươm và là nguồn phân thích hợp
cho việc sản xuất rau sạch.

Hình 1: Trùn quế
1.2.

Protease.

Protease là nhóm enzyme được ứng dụng rỗng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp và chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản
xuất xà phòng.
Người ta có thể thu nhận protease từ nhiều nguồn khác nhau như thực vât, động vât và vi
sinh vật.

Phân loại protease
Protease là nhóm xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide của protein.
Năm 1960, Hartley đã phân loại enzyme thủy phân protein theo 4 nhóm dựa theo tên hóa
học các amino acid tham gia vào tâm vị trí xúc tác.
Aspartic peptidase là những protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trong trung tâm hoạt
động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian bằng những liên kết không cộng
hóa trị giữa enzyme và cơ chất. Các nhóm carboxyl này thuộc mạch bên R của aspartic,
glutamic hoặc có thể là nhóm carboxyl đầu C của chuỗi polypeptide. Aspartic peptidase
thường hoạt động trong vùng pH acid và bị ức chế đặc hiệu bởi pepstatin.

4


Cysteine peptidase: các enzyme thuộc nhóm này có nhóm thiol (-SH) của cysteine trong
trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm –CO của liên kết peptide tạo phức hợp trung gian
thiolacyl-enzyme. Các cysteine peptidase thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính,
chúng chỉ hoạt động khi nhóm thiol ở trạng thái không bị bao vây. Do đó chất như cysteine,
acid ascorbic thường có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzyme này.
Cystatin, leupeptin là các chất ức chế thuận nghịch và E64 chất ức chế không thuận nghịch
cho nhóm cysteine peptidase rất thông dụng hiện nay.
Kim loại peptidase là những protease trong trung tâm hoạt động có chứa các ion kim loại
trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian
bằng liên kết không cộng hóa trị giống như nhóm aspartic peptidase. Nhóm kim loại
peptidase hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và bị giảm hoạt tính dưới tác dụng
của EDTA.
Serine peptidase: là những protease có nhóm hydroxyl (–OH) của serin trong trung tâm
hoạt động. Các peptidase serine này thường hoạt động ở vùng pH khá rộng từ trung tính
đến kiềm, nhóm -OH của serine tác động lên nhóm –CO của liên kết peptide tạo phức hợp
trung gian acyl-enzyme. Các enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin và
chymotrypsin

Bảng 1: Một số serine protease thông dụng hiện nay.
Enzyme

Vị trí cắt

Nguồn thu

Trypsin
Chymotrypsin
Elastase
Plasmin
Thrombin
V8-protease (Glu-C)
Lys-C
Subtilisin

Arg, Lys
Tyr,Trp,Phe
Gly, Ala, Val
Arg, Lys
Arg
Aps, Glu
Lys
Tyr, Phe, Leu
Đầu C các amin

Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loại khác
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loại khác
Hệ thống tiêu hóa ở động vật và một số loại khác
Máu

Máu
Staphylococcus aureus V8
Lysobacter enzymogenes
Các chủng bacillus khác nhau
Hệ thống tiêu hóa ở động vật

Carboxypeptidase A

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.

Vật liệu
5


Trùn quế dùng trong thí nghiệm ở dạng trùn đông lạnh, được mua tại địa chỉ 139/39/2c
Trịnh Đình Trọng, phường Phú Trung, quận Tân Phú, Tp.Hồ Chí Minh
2.2.

Hóa chất – dụng cụ - thiết bị :

























Hóa chất :
Acetone : 50ml
Dệm phosphate pH 7
Thuốc thử biure
Dd casein 1%
Dd TCA 5%
Dd NaOH 0.5 N
Thuốc thử Folin
Dụng cụ :
Ống nghiệm : 20 ống
Becher 100ml : 3 cái
Erlen 250ml : 3 cái
Erlen 100 :
Pipet 1ml, 5ml, 10ml
Bình nước cất, phễu, bóp caosu, đũa khuấy
Ống ly tâm : 4 cái

Thiết bị :
Máy xay sinh tố
Máy đo độ ẩm
Máy đo quang
Máy ly tâm
Tủ ủ
Tủ sấy
Thiết bị lọc gel
Thiết bị chạy điện di

2.3.

Phương pháp phân tích sử dụng

2.3.1. Xác định hàm lượng Protein bằng phương pháp Biure
2.3.1.1.

Nguyên tắc

6


Các chất chứa từ hai lien kết peptide ( -CO-NH-) trở lên đều cho phản ứng Biure: trong môi
trường kiềm mạnh, các liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành một phức chất có
màu từ tím đỏ tới xanh.
Vì cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein ( nồng độ protein càng cao thì màu sắc
càng đậm) do đó có thể đo cường độ màu bằng máy quang phổ rồi suy ra nồng độ protein
của một dung dịch bất kì.

2.3.1.2.

Hình 2: Phản ứng tạo phức Cu2+ - protein
Cách tiến hành
Albumin
1%
7 ống nghiệm tỉ lệ albumin (ml)/nước cất (ml)

Pha dung
Nước cất dịch protein
chuẩn

Albumin

0

0

2

4

6

8

10

Nước cất

10

10

8

6

4

2

0

Lấy 1ml
Thời gian: 20 phút

Phản ứngBiure

nhiệt độ phòng

4ml thuốc thử biure

Đo độ hấp thụ

Bước sóng 540nm

OD
7

2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến
2.3.2.1.

Nguyên tắc

Dùng enzyme protease để thủy phân cơ chất protein, cụ thể là dung dịch Casein, sản
phẩm tạo thành là các peptide mạch ngắn hay các acid amine. Trong các loại acid amine,
tyrosin chiếm đa số. Định lượng mẫu, cụ thể là tyrosin và tryptophan hòa tan bằng phản
ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để định lượng sản phẩm
do enzyme xúc tác tạo nên. Hoạt tính của protease theo định nghĩa là số µmol tyrosin sinh
ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở
điều kiện chuẩn ( 35.50C, pH 7.6)
2.3.2.2.

Cách tiến hành

Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô để làm 6 ống thử thật, 6 ống thử không,có dán
nhãn .

Ống nghiệm
Dung dịch hóa chất
Thử thật

Thử không

Dung dịch casein 1% (ml)

5

5

Dung dịch TCA 5% (ml)

0

10

Dung dịch enzyme mẫu (ml)

1

1

10

0

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút
Dung dịch TCA 5% (ml)
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Chuẩn bị 2 ống nghiệm khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và
cho vào ống thứ 2 5ml dịch lọc của ống thử không.
Cho thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc đều 10 phút.
Đo độ hấp thu ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK

8


2.3.2.3.

Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí
nghiệm ( 35,5oC: pH 7,6 … ) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan
trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương
ứng với 1 µM tyrosine trong đường chuẩn.
Hđ Protease =

𝜇𝑀 𝑇𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛∗𝑉∗𝐿∗𝑉1
𝑡∗𝑚∗𝑣

Với:
Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g)
V1: thể tích pha loãng ban đầu : 100 ml
V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml)
v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)
t : thời gian thủy phân (phút)
m : khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)
L: độ pha loãng enzyme
µM tyrosine: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn
2.3.3. Tinh sạch bằng sắc kí lọc gel
2.3.3.1.

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa
nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrat hóa cao như dextran,
agarose hay polyacrylamide. Những phân tử có kích thước nhỏ lọt vào bên trong lỗ gel và
bị trì hoãn, do đó di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên

ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh hơn và được tách ra khỏi cột sớm hơn các phân
tử nhỏ.

Hình3. Sắc ký lọc gel
9


Tiến hành

Xác định loại gel

Xác định hoạt tính- hoạt tính
riêng của các peak ở bước
sóng 660 nm lọc gel

Tính toán loại gel cần ngâm

Xác định các peak

2.3.3.2.

Ngâm gel

Các phân đoạn sau lọc so
màu ở bước sóng 540 nm

Nhồi cột
Đưa mẫu vào cột

Thu mẫu qua cột

10


2.3.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate
PolyAcrylamide)
2.3.4.1.

Nguyên tắc

Dựa vào sự di chuyển của các phân tử có mang điện tích trong điện trường. Điện di protein
trên gel tiến hành xử lý gel bằng SDS. Phân tử protein có điện tích tự do chứa những nhóm
acide và base. Nếu các phân tử protein có điện tự do chứa những nhóm acid và base. Nếu
các phân tử protein không được đạt ở điểm đẳng điện thì dưới ảnh hưởng của điện trường
ngoài, chúng sẽ di chuyển sang các cực. Các protein khác nhau có trị số điện tích tự do khác
nhau. Vì thế, tốc độ di chuyển của chúng trong điện trường ở những điều kiện nhất định về
pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau. Do đó, hỗn hợp các loại protein được tách ra thành
1 vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt.
2.3.4.2.

Chuẩn bị gel điện di

Gel polyarcylamine thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh có kết cấu
chuyên dụng để tạo khuôn.
Rửa sạch các tấm thủy tinh bằng nước, để khô rồi lau lại bằng ethanol. Ráp các tấm thủy
tinh theo hướng dẫn của hang sản xuất và kẹp khuôn trên giá đỡ.
Pha gel điện di với thành phần (cho 1 mmieengs gel) như bảng 1
TEMED có tác dụng làm đông gel, là thành phần pha vào sau cùng. Sau đó nhẹ nhàng trộn
đều hỗn hợp gel vừa pha và đổ vào khôn kính đã lắp sẵn
Đổ gel chạy (running gel) trước tới vạch dưới của khuôn kính. Thêm isopropanol lên lớp

trên gel chạy vừa đổ, isopropanol có tác dụng làm phẳng và hút bọt khí của lớp gel chạy.
Đợi khoảng 30 phút cho gel đông.
Rửa sạch lớp isopropanol đã đổ vào gel bằng nước cất nhiều lần. Để khô.
Đổ gel gom (stacking gel) tới mép đông. Tháo bộ kính ra khỏi khuôn kính. Lắp bộ kính có
gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy bộ khung điện cực.

11


Bảng 2. Thành phần đổ gel
Mono solution
4X Running gel
buffer (pH8.8)
H2O
APS 10%
TEMED
2.3.4.3.

Running gel
2,5 ml

Stacking gel
0,325 ml
4X Stacking gel
buffer (pH 6.8)

1,875 ml
3,125 ml
25 l
5 l

0,625 ml
1,525 ml
12,5 l
2 l

Chuẩn bị mẫu

Hút mỗi mẫu cần điện di 100 l vào tube 1,5 ml có bổ sung 20 l Load buffer 6X.
Đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội.
2.3.4.4.

Tiến hành điện di

Nhẹ nhàng lấy lượt ra khỏi bộ điện di. Bơm từng mẫu vào từng giếng với lượng là 20 l.
Thang chuẩn là Protein Ladder với lượng 13-15 l.
Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, thường là 100V –
200V, trong 30 – 90 phút.
Sau khi lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution).
Lắc nhẹ 10 – 30 phút cho Staining solution thấm vào gel
Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution). Thay dung dịch rửa mới vài
lần với thời gian khoảng 15 phút/lần cho đến khi miếng gel có màu trong suốt và xuất
hiện nhiều vạch xanh lơ trên gel.
2.4.

Quy trình thí nghiệm

2.4.1. Sơ đồ thí nghiệm

12

Trùn quế
(đông lạnh)

Rã đông, xay nhuyễn
Xác định độ ẩm, hàm
lượng chất khô
Xác định hàm lượng
protein, họa tính enzyme

Pha thành dung dịch
trùn 13%
Tự phân với nước

-60oC
- t= 18;24;30;36h

Ly tâm (4000
vòng/phut/), 10 phút

Dịch
enzyme thô
Xác định hàm lượng
protein, họa tính enzyme
Tủa acetone
- Tỷ lệ 1:2

Xác định hàm lượng
protein, họa tính enzyme

Ly tâm thu tủa
enzyme

- 4000 vòng/phút
- t=10 phút

Hòa tan tủa với đệm - đệm pH 7
phosphate

Lọc gel
Xác định hàm lượng
protein, họa tính enzyme
Enzyme sau
13
tinh sạch

Điện di kiểm tra mẫu
enzyme sau tinh sạch


2.4.2. Tiến trình thí nghiệm
2.4.2.1. Tuần 1
Nộp đề cương thí nghiệm.
Nhận dụng cụ thí nghiệm.
Chuẩn bị nguyên vật liệu : trùn được mua hôm thứ 6 ngày 26/02/2016 sau đó bảo
quản tronng tủ đông để chuần bị tiến hành thí nghiệm.
2.4.2.2. Tuần 2
- Tiến hành rã đông trùn sau đó cho vào máy xay sinh tố, xay trong thời gian 10 phút
- Xác định độ ẩm trùn quế để pha thành dung dịch trùn có nống độ 13 %.

- Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong mẫu ban đầu.
- Sau khi có dịch trùn 13 %, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân dịch trùn ở các
khoảng thời gian 18, 24, 30, 36 giờ, mỗi lần khảo sát thực hiện 3 mẫu. Tuần 2 tiến
hành thủy phân trùn ở khoảng thời gian 18 và 24 giờ bằng cách cân 5 g dịch trùn
13% cho vào erlen, bịt lại bằng bao ni lông, cho vaò tủ ủ 600C trong khoảng thời
gian khảo sát.
- Sau khi đủ thời gian thủy phân, tiến hành lấy mẫu ra và tiến hành ly tâm ở 4000
vòng/phút trong 10 phút, thu dịch sau đó lấy dịch đem đi xác định hàm lượng protein
bằng phương pháp Biure và hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến.
- Trong thời gian chờ thủy phân, dựng đường chuẩn Biure và đường chuẩn Tyrosin.
2.4.2.3. Tuần 3+4 :
-

Tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân trùn ở 2 khoảng thời gian còn lại là 30 và 36 giờ.
2.4.2.4.

Tuần 5 :

Sau khi khảo sát các khoảng thời gian thủy phân, tìm được thời gian thủy phân trùn tối ưu,
chọn mẫu trùn có hàm lượng protein và hoạt tính enzyme tốt nhất đem đi tủa với acetone
và hòa với đệm phostphate đem đi tinh sạch bằng sắc kí lọc gel.
Xác định hoạt tính và hoạt tính riêng ở những mẫu có peak.
2.4.2.5.

Tuần 6

Diện di kiểm tra kết quả thu được sau khi lọc gel. Chọn mẫu điện di gồm : mẫu có peak khi
lọc gel, mẫu trước khi lọc gel và enzyme thô.

14

3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1.

Đo độ ẩm mẫu ban đầu

-

Khối lượng trùn đem đo : 4.024g

-

Sấy ở 1050C

-

Độ ẩm mẫu dịch trùn nguyên liệu ban đầu máy đo được là 87%
3.2.

Xác định hàm lượng protein mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu

 Phưng trình đườn chuẩn:

Giá trị OD

Đường chuẩn Biure

-

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1 0

y = 0.0582x - 0.0007
R² = 0.9998

2

4

6

8

10

12

Hàm lượng protein (mg/ml)

Phương trình đường chuẩn Albumin: y = 0.0582x – 0.007, R2 = 0.9998
Bảng 3. Hàm lượng protein trong dịch trùn tự phân và mẫu ban đầu
STT mẫu

Thời
gian (h)

1
2
3
4
5
6
7
8
9

18
18
18
24
24
24
30
30
30

Độ pha
Nhiệt
loãng
độ (0C)
(%)
10

60
10
60
10
60
10
60
10
60
10
60
10
60
10
60
10
60
15

OD
0.18
0.228
0.193
0.398
0.558
0.222
0.258
0.28
0.304

Hàm lượng
protein
(mg/ml)
3.1048
3.9296
3.3282
6.8505
9.5997
3.8265
4.4450
4.8230
5.2354


10
11
12
Mẫu ban đầu

36
36
36

10
10
10

60
60
60

0.333
0.195
0.505
0.315

5.7337
3.3625
8.6890
5.4244

Mẫu số 5 có hàm lượng protein cao nhất (9,5997 mg/ml) ứng với thời gian thủy phân
24h.
Số liệu có sự chênh lệch và thay đổi tương đối nhiều, nguyên nhân chủ yếu dẫn đến
kết quả là do máy đo mật độ quang không ổn định, giá trị thay đổi nhiều, một phần khác là
do trong lúc thao tác thí nghiệm, vortex không đều. Một nguyên nhân khác là do tủ ủ 600C,
vì thời gian thực hiện thí nghiệm phải để mẫu qua đêm nên nhiệt độ tủ ủ có thể bị điều
chỉnh hoặc mở ra mở vào nhiều lần khiến nhiệt độ không ổn định.

3.3.

Xác định hoạt tính protease mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu

 Phưng trình đườn chuẩn:

OD
0.6

y = 0.503x + 0.006
R² = 0.998

0.5
0.4

OD

0.3

Linear (OD)
0.2
0.1

M Tyrosin

0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Đường chuẩn y=0.503x+0.006 ; R2 =0.998 với y là ΔOD,x là µM tyrosin

16


Bảng4. Kết quả phân tích hoạt tính enzyme
ST
T

thời
gian
(h)

1
18
2
18
3
18
4
24
5
24
6
24
7
30
8
30
9
30

10
36
11
36
12
36
Mẫu ban đầu

-

pha
loãng
(%)

nhiệt độ ΔOD
(ºC)

µM
tyrosin

HT
(UI/ml)

HTR
(UI/mg)

10
10
10
10

10
10
10
10
10
10
10
10

60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60

0.0213
-0.0270
0.0125
0.0006
0.0087
-0.0157
-0.0038
-0.0032

-0.0107
-0.0543
-0.0038
-0.0050
0.0024

21.2724
-27.0378
12.5248
0.5964
8.7475
-15.7058
-3.7773
-3.1809
-10.7356
-54.2744
-3.7773
-4.9702
2.3857

3.4257
-0.2752
0.1505
0.0029
0.0325
-0.1579
-0.0327
-0.0244
-0.0820
-0.2958

-0.0374
-0.0185
0.0176

0.113
-0.13
0.069
0.009
0.05
-0.073
-0.013
-0.01
-0.048
-0.267
-0.013
-0.019
0.018

Số liệu cũng có sự thay đổi và chênh lệch mặc dù trong cùng 1 điều kiện thủy phân,
cùng thời gian, địa điểm.
Vì sô liệu chênh lệch nên ta chọn một số mẫu để đem làm kết quả sau cùng.
Ta chọn mẫu số 3, 5, và mẫu ban đầu để khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạt
tính riêng, ta có đồ thị sau:

17


Hoạt tính- UI/ml)

Hoạt tính- Hoạt tính riêng

14

0.16

12

0.14
0.12

10

0.1

8

0.08
6

Hoạt tính

0.06

4

Hoạt tính riêng

0.04

2

0.02

0
1

0
3
Hoạt tính riêng- UI/mg

2

Hình4. Đồ thị miêu tả mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạt tính riêng
Từ biểu đồ trên ta thấy hoạt tính enzyme càng cao thì hoạt tính riêng của enzyme cũng tăng.
Cột 1,2 là kết quả hoạt tính ứng với thời gian thủy phân 18h và 24h, so với mẫu ban đầu
(cột 3). Ta thấy sau khi thủy phân thì enzyme có hoạt tính và hoạt tính riêng cao hơn lúc
chưa thủy phân.
3.4.

Lọc gel

Bảng 5 Kết quả lọc gel
Ống số

1

OD

0.013 0.048 0.062 0.076 0.049 0.071 0.045 0.037 0.012 0.000

2

3

4

5

18

6

7

8

9

10


OD

Giá trị OD Biure trong các ống lọc gel
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02

0.01
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Ống số

Hình5. Đồ thị biểu diễn giá trị OD Biure trong các mẫu sau lọc gel
Từ hình 5 nhận thấy có 2 điểm ghi nhận được giá trị OD cao đột biến. Điểm thứ nhất ở ống
số 4, OD tăng từ 0,062 lên 0,076; đây là điểm ghi nhận được phần tử có kích thước lớn nhất
trong mẫu ra khỏi cột gel. Điểm còn lại xuất hiện ở ống 6 , OD từ 0,049 tăng đột biến lên
0,071; đây là 2 peak ghi nhận sự có mặt của các phân tử nhỏ trong mẫu lọc gel – amino

acid, peptide. Còn 1 peak đo được ở mẫu số 3.
Sau đó ta xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp anson, giá trị OD anson của mẫu
số 6 là OD = ODTT – ODTK = 0,156 – 0,138 = 0,018. Vì thể tích dịch lọc thu được ở mẫu
số 4 quá ít nên không đủ thể tích để xác định hoạt tính enzyme. Hoạt tính và hoạt tính riêng
của mẫu số 4 : enzyme trong mẫu số 4 có hoạt tính là 2,3857UI/ml và có hoạt tính riêng là
0,9051 UI/mg

19


3.5.

Điện di

Hình6. Kết quả điện di
Thang chuẩn khá rõ nhưng trên miếng gel lại không thấy xuất hiện vệt màu xanh lơ. Nguyên
nhân là do thao tác trong lúc thí nghiệm trong giai đoạn đổ gel. Dẫn đến việc các phân tử
protein không tách ra được.
Vì thời gian từ lúc lọc gel xong đến khi điện di bảo quản trong điều kiện đông lạnh trong 2
tuần. Sau đó đem ra rã đông nên hàm lượng protein bị mất đi.

20


4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1.

Kết luận

Thời gian tối ưu để thủy phân trùn quế thu enzyme protease là 24 h ở nhiệt độ 60 0C

4.2.

Kiến nghị

Vì thời gian thí nghiệm không nhiều nên chỉ khảo sát một yếu tố đó là thời gian thủy
phân, còn các điều kiện khác như nhiệt độ thủy phân, lượng dung môi… vẫn chưa được
khảo sát nên nếu được khảo sát các yếu tố khác thì sẽ tốt hơn.
Phòng thí nghiệm nên trang bị thêm máy đo quang mới để kết quả thí nghiệm được chính
xác hơn

21


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. Hồ
Chí Minh, 2012.

22