Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng dụng ghép tự thân điều trị các tổn thương mất da

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Trần Lê Bảo Hà
NGHIÊN CỨU XÁC LẬP QUY TRÌNH NUÔI CẤY
TẾ BÀO SỪNG NGƯỜI TRÊN MÀNG COLLAGEN
TỪ MÀNG ỐI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG GHÉP TỰ THÂN
ĐIỀU TRỊ CÁC TỔN THƯƠNG MẤT DA
Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số: 62 42 30 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. BS. Trần Công Toại
2. TS. Hoàng Nghĩa Sơn

Thành phố Hồ Chí Minh - 2010


LỜI CAM ĐOAN
TÔI XIN CAM ĐOAN ĐÂY LÀ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA
RIÊNG TÔI. NHỮNG KẾT QUẢ TRONG NGHIÊN CỨU NÀY HOÀN
TOÀN CHƯA ĐƯỢC CÔNG BỐ BỞI BẤT KỲ TÁC GIẢ NÀO KHÁC.

TRẦN LÊ BẢO HÀ


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành công trình này, tôi đã nhận được sự quan tâm,
giúp đỡ của những người thân, Thầy Cô, bạn bè, đồng nghiệp
xung quanh.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS. TS. BS. Trần
Công Toại, người đã tạo cho tôi những điều kiện tốt nhất cũng như
đã tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn Thầy
đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, tạo nhiều thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện đề tài.
Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với TS. Hoàng Nghĩa
Sơn, người đã bỏ ra nhiều thời gian giúp tôi hoàn thành luận án.
Sự cố vấn của Thầy là nguồn động viên không nhỏ giúp tôi vững
bước trên con đường mà tôi đã chọn.
Dành cho người luôn động viên, hỗ trợ và gắn bó với tôi từ
khi tôi là sinh viên cho đến tận bây giờ và cả sau này, xin đặc biệt
cảm ơn Thầy, ThS. Phan Kim Ngọc.
Chân thành cảm ơn các anh chị, các em Bộ môn Mô phôi – Di
truyền – Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch đã
hỗ trợ, chia sẻ vui buồn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện luận án.


Chân thành cảm ơn các Thầy Cô, đồng nghiệp, các em thuộc
Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ Sinh học Động vật cũng như
Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, đặc biệt là
các em trong nhóm Vật liệu sinh học, đã luôn bên cạnh và hỗ trợ
tôi trong suốt những năm qua.
Cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Út đã cho tôi những góp ý
chân thành.
Luận án này không thể hoàn thành nếu không nhận được
nguồn cung cấp nguyên vật liệu. Qua đó, chân thành cảm ơn Bệnh

viện Chấn thương Chỉnh hình đã cung cấp nguồn da và Bệnh viện
Hùng Vương đã cung cấp màng ối để tôi có thể thực hiện đề tài
này.
Đề tài được hoàn thiện nhờ sự hỗ trợ kỹ thuật từ nhiều cá
nhân và đơn vị. Xin cảm ơn Cô Thoa, Huy - Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương, anh Bình – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc đánh giá sản phẩm của đề tài.
Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ, kỹ thuật viên thuộc
Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi Đồng I và Trường Đại học Y
Dược Tp.HCM đã hỗ trợ tôi trong việc phân tích kết quả mô học.
Xa cách về địa lý nhưng rất gần về tấm lòng, xin bày tỏ lòng
kính trọng và biết ơn đối với các chuyên gia Nhật Bản trong việc
cố vấn, huấn luyện về mặt kỹ thuật cho tôi: GS. Hirotoshi Miyoshi
và GS. Ookawa ở trường đại học Tsukuba, TS. Yuji Shirakata và
TS. Lujun Yang thuộc trường đại học y Ehime và TS. Masahiro
Kino_oka đến từ trường đại học Osaka.


Lời cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với Ba Mẹ,
Người đã nuôi nấng, dạy dỗ, luôn tin tưởng và cho tôi niềm thương
yêu vô bờ. Cảm ơn các Anh Chị đã luôn yêu thương và dành cho
tôi sự quan tâm sâu sắc. Cảm ơn Chồng, người đã cùng chia sẻ,
luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được song hành trên con
đường tình yêu và sự nghiệp, là chỗ dựa vững chắc nhất của cuộc
đời tôi. Cảm ơn Kirin, Sóc – hai con yêu của Mẹ...

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2009

Trần Lê Bảo Hà

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Các chữ viết tắt
Bảng đối chiếu thuật ngữ
Danh mục bảng và đồ thị
Danh mục hình
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1. MÀNG ỐI NGƢỜI .................................................................................... 3
1.1.1. Cấu tạo của màng ối............................................................................... 3
1.1.2. Các đặc điểm sinh học của màng ối giúp cho màng ối có tính
ứng dụng cao trong kỹ nghệ mô (tissue engineering) ........................................ 5
1.1.3. Một số ứng dụng của màng ối ................................................................. 8
1.2. SINH HỌC TẾ BÀO SỪNG ..................................................................... 15
1.2.1. Lớp biểu bì của da - cấu tạo và chức năng............................................... 15
1.2.2. Đặc điểm tế bào sừng .............................................................................. 17
1.2.3. Tế bào gốc biểu bì................................................................................... 19


1.2.4. Vai trò của tế bào sừng trong tái tạo biểu bì da........................................ 24
1.3. GHÉP TỰ THÂN TẤM BIỂU BÌ NUÔI CẤY .......................................... 27
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 27
1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ......................................................... 31

1.3.3. Chỉ định của việc ghép tấm biểu bì nuôi cấy ........................................... 31
1.3.4. Phƣơng pháp tạo tấm tế bào biểu bì nuôi cấy .......................................... 32
1.3.5. Các nhƣợc điểm của việc sử dụng tấm tế bào biểu bì nuôi cấy
và cách khắc phục............................................................................................. 36
Chƣơng 2 – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ XỬ LÝ MÀNG ỐI NGƢỜI
(HAM) THÀNH MÀNG COLLAGEN ............................................................ 38
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu HAM .................................................................... 38
2.1.2. Phƣơng pháp thu nhận mẫu HAM ........................................................... 38
2.1.3. Phƣơng pháp loại tế bào biểu mô HAM .................................................. 39
2.1.4. Xác định thành phần collagen màng........................................................ 40
2.1.5. Phƣơng pháp trải màng collagen trên đĩa nuôi ........................................ 42
2.1.6. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính màng collagen ...................................... 44
2.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP, NUÔI CẤY TẾ BÀO SỪNG .................... 45
2.2.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu da ......................................................................... 45
2.2.2. Phƣơng pháp thu nhận mẫu da ................................................................ 45
2.2.3. Phƣơng pháp phân lập tế bào .................................................................. 46


2.2.4. Phƣơng pháp nuôi tế bào sừng ................................................................ 47
2.2.5. Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào sừng ..................................................... 47
2.2.6. Phƣơng pháp đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên chai nuôi ở lần cấy
chuyền thứ nhất ................................................................................................ 48
2.3. PHƢƠNG PHÁP TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG NHIỀU LỚP ..................... 48
2.3.1. Phƣơng pháp nuôi tế bào sừng trên màng collagen.................................. 48
2.3.2. Phƣơng pháp tạo tấm tế bào sừng nhiều lớp ............................................ 49
2.4. PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TẤM TẾ BÀO SỪNG NHIỀU LỚP .......... 51
2.4.1. Đánh giá sự liên kết của tế bào................................................................ 51
2.4.2. Đánh giá tính toàn vẹn tế bào sau nuôi cấy ............................................. 52
2.4.3. Phƣơng pháp nhận diện tế bào sừng bằng RT-PCR ................................. 53

2.5. GHÉP TỰ THÂN TẤM TẾ BÀO SỪNG NHIỀU LỚP TRÊN
BỆNH NHÂN .................................................................................................. 55
2.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU ....................................................................................... 56
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ XỬ LÝ HAM THÀNH
MÀNG COLLAGEN ....................................................................................... 58
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH MÀNG COLLAGEN ..................... 63
3.2.1. Kết quả đánh giá độ an toàn của màng collagen ...................................... 63
3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của màng collagen đến pH môi trƣờng
nuôi tế bào sừng ............................................................................................... 64
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP, NUÔI, NHÂN TẾ BÀO SỪNG TỪ MÔ DA ..... 69
3.3.1. Kết quả phân lập tế bào sừng từ mô da.................................................... 70
3.3.2. Kết quả nuôi, nhân tế bào sừng ............................................................... 75


3.4. KẾT QUẢ TẠO TẤM TẾ BÀO SỪNG NHIỀU LỚP ............................... 82
3.4.1. Kết quả nuôi tế bào sừng trên màng collagen .......................................... 82
3.4.2. Kết quả tạo tấm tế bào sừng nhiều lớp bằng cách nâng lên
bề mặt không khí (Airlifting) ............................................................................ 86
3.4.3. Kết quả tạo tấm tế bào sừng nhiều lớp bằng cách tăng
nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng nuôi ................................................................. 88
3.4.4. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch tấm tế bào sừng nhiều lớp.................. 91
3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TẤM TẾ BÀO SỪNG NHIỀU LỚP .................... 92
3.5.1. Kết quả đánh giá sự bám dính của tế bào ................................................ 93
3.5.2. Kết quả đánh giá tính toàn vẹn của tế bào sau nuôi cấy ........................... 94
3.5.3. Kết quả đánh giá yếu tố đánh dấu (marker) tế bào bằng RT-PCR............ 96
3.5.4. Kết quả đánh giá sự nhiễm vi khuẩn và nấm của sản phẩm
tấm tế bào nuôi cấy ........................................................................................... 97
3.6. KẾT QUẢ GHÉP TỰ THÂN TẤM TẾ BÀO SỪNG NHIỀU LỚP
TRÊN BỆNH NHÂN ....................................................................................... 100

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 106
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .............................................. 108
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 109
PHỤ LỤC


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AEC

Amniotic epithelial cells

ARN

Acid ribonucleic

bp

Base pair

CEA

Cultured Epidermal Autograft

DEPC

Diethylpyrocarbonate

DMEM

Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPBS

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline

ECM

Extracellular matrix

EDTA

Ethylene diaminetetraacetic acid

EGF

Epidermal Growth Factor

EPU

Epidermal proliferative unit

FBS

Fetal Bovine Serum

FDA

Food and Drug Administration

G banding

Giemsa banding

HAM

Human Amniotic Membrane

HBV

Hepatitis B virus

HCV

Hepatitis C virus

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid

hESC

Human embryonic stem cell

HIV

Human immunodeficiency virus

HLA

Human leukocyte antigen

ISO

International Organization for Standardization

kGy

Kilogray

LSD

Least Significant Different

MMP

Matrix metalloproteinase

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

PAS

Periodic acid Schiff

PCM

Primary culture medium

PCR

Polymerase chain reaction

PEDF

Pigment epithelium-derived factor

pH

Hydrogen ion concentration

PROM

Premature rupture of the foetal membrane

RT

Reverse transcriptase

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEM

Scanning Electron Microscopy

SFM

DK-SFM – Defined keratinocyte serum free medium

SLPI

Secretory leukocyte proteinase inhibitor

TEM

Transmission Electron Microscopy


BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ
TIẾNG ANH

TIẾNG VIỆT

Apoptosis

Sự chết tế bào được lập trình

Cultured Epidermal Autograft

Ghép tự thân tấm biểu bì nuôi cấy

Defined keratinocyte serum free medium

Môi trường không chứa huyết
thanh dành cho tế bào sừng

Desmosome

Thể liên kết

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline

Dung dịch muối đệm phosphat,
không chứa ion Ca2+ và Mg2+

Epidermal Growth Factor

Yếu tố tăng trưởng biểu bì

Epidermal proliferative unit

Đơn vị tăng sinh biểu bì

Epidermal stem cell

Tế bào gốc biểu bì

Extracellular matrix

Khuôn ngoại bào

Fetal Bovine Serum

Huyết thanh bào thai bò

Hemidesmosome

Thể bán liên kết

Hepatitis B virus

Virus gây viêm gan B

Hepatitis C virus

Virus gây viêm gan C

Human Amniotic Membrane

Màng ối người

Human embryonic stem cell

Tế bào gốc phôi người

Human immunodeficiency virus

Virus gây suy giảm miễn dịch ở
người

Keratinocyte

Tế bào sừng

Label-retaining cell

Tế bào giữ chất đánh dấu


Ligand

Phối tử

Marker

Yếu tố đánh dấu

Polymerase chain reaction

Phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ polymerase

Primary culture medium

Môi trường nuôi sơ cấp

Reverse transcriptase

Enzyme phiên mã ngược

Scaffold

Khung nâng đỡ

Transforming growth factor

Nhân tố tăng trưởng chuyển dạng

Transient amplifying cell

Tế bào khuếch đại chuyển

Transmission Electron Microscopy

Kính hiển vi điện tử xuyên


DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
Bảng 1.1. Hiệu quả của các liều chiếu xạ gamma khác nhau lên khả năng
ngăn thấm vi sinh vật của màng ối .................................................... 12
Bảng 1.2. Tóm tắt các thử nghiệm lâm sàng sử dụng CEA trên thế giới............ 30
Bảng 3.1. Tóm tắt hiệu quả loại tế bào biểu mô HAM khi sử dụng
trypsin/EDTA và cạo ........................................................................ 61
Bảng 3.2. Kết quả kiểm nghiệm màng collagen ................................................ 64
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của màng collagen đến sự thay đổi
pH của môi trường SFM .................................................................. 65
Bảng 3.4. Thông tin về các mẫu da đã thu nhận ................................................ 69
Bảng 3.5. Số tế bào sống và % tế bào sống sau khi phân lập ............................ 73
Bảng 3.6. Sự tăng sinh của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất ................. 77
Bảng 3.7. Kết quả đo mật độ quang đánh giá sự tăng trưởng tế bào sừng
trên màng collagen .......................................................................... 83
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng sau lần cấy chuyền
thứ nhất ........................................................................................... 78

Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng trên màng collagen
thông qua kết quả đo mật độ quang.................................................. 84


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Màng ối bọc quanh thai nhi ............................................................... 3
Hình 1.2. Sơ đồ mô tả cấu trúc của màng ối ...................................................... 4
Hình 1.3. Minh họa vai trò của các tế bào tách từ màng ối trong
chữa tổn thương ................................................................................. 9
Hình 1.4. Bé trai 3 tuổi bị bỏng 3% độ 2 tại mặt, sử dụng màng ối
sau khi đã rửa sạch và sấy khô ........................................................... 14
Hình 1.5. Cấu trúc cơ bản của da người ............................................................ 15
Hình 1.6. Đơn vị tăng sinh biểu bì EPU ............................................................ 16
Hình 1.7. Các lớp tế bào sừng của biểu bì ......................................................... 18
Hình 1.8. Tế bào gốc biểu bì ở vùng sâu nhất và nông nhất trong da................. 20
Hình 1.9. Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa tế bào gốc biểu bì ............... 22
Hình 1.10. Các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng tương ứng chương trình
biệt hóa biểu bì ................................................................................ 23
Hình 1.11. Sự phân bố của p63 (đỏ) và involucrin (xanh) trong biểu bì
người bình thường ........................................................................... 23
Hình 1.12. Protein Wnt hoạt hóa các tế bào gốc biểu bì (EpSC)
bất hoạt thành các tế bào khuếch đại chuyển (TA) ........................... 25
Hình 1.13. Các tế bào sừng lan ra làm liền vết thương ...................................... 26
Hình 1.14. Chỉ định của CEA ........................................................................... 32
Hình 1.15. Mô hình minh họa các bước của CEA ............................................. 32


Hình 2.1. Một số hình ảnh xử lý HAM ............................................................. 43
Hình 2.2. Mẫu da toàn bộ và da mỏng .............................................................. 46
Hình 2.3. Minh họa phương pháp nuôi cấy tế bào trên màng collagen

đã được trải trên đĩa lồng ................................................................. 50
Hình 2.4. Vùng lấy da ghép .............................................................................. 56
Hình 3.1. Lớp tế bào biểu mô nguyên vẹn của HAM ........................................ 58
Hình 3.2. HAM nguyên (a), HAM được xử lý trypsin-EDTA
15 phút (b), 30 phút (c), 45 phút (d) và cạo để loại biểu mô ............................. 59
Hình 3.3. HAM đã được xử lý trypsin-EDTA 30 phút và cạo để
loại biểu mô ....................................................................................... 60
Hình 3.4. Kết quả nhuộm trichrom (a) và nhuộm PAS (b) của HAM
đã loại biểu mô .................................................................................. 61
Hình 3.5. Lớp biểu bì và trung bì tách rời nhau sau khi ủ enzym ...................... 71
Hình 3.6. Mô học biểu bì đã tách rời (a), mô học trung bì đã tách rời (b), mô học
trung bì tách rời đã được thu nhận hoàn toàn tế bào lớp đáy (c) ......... 72
Hình 3.7. Tế bào được nuôi sơ cấp ................................................................... 76
Hình 3.8. Tế bào sừng bám trên đĩa nuôi (a) và trên màng collagen (b)
sau 3 giờ cấy chuyền.......................................................................... 82
Hình 3.9. Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen ...................... 85
Hình 3.10. Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không khí........................... 86
Hình 3.11. Kết quả tạo nhiều lớp tế bào sau 4 ngày (a), 7 ngày (b), 10 ngày (c)
nâng lên bề mặt không khí ............................................................... 87


Hình 3.12. Tấm tế bào sau 7 ngày tăng Ca2+ trong môi trường.......................... 88
Hình 3.13. Kết quả tạo nhiều lớp tế bào sau 4 ngày (a), 7 ngày (b), 10 ngày (c)
tăng nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi ......................................... 89
Hình 3.14. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể p63
tấm tế bào sừng nhiều lớp được tạo ra trên màng collagen ............... 91
Hình 3.15. Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy
có sự hình thành liên kết giữa tế bào và màng collagen .................... 93
Hình 3.16. Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy
có sự hình thành liên kết giữa hai tế bào kế cận ............................... 94

Hình 3.17. Bộ nhiễm sắc thể tế bào người nữ sau nuôi cấy .............................. 95
Hình 3.18. Bộ nhiễm sắc thể tế bào người nam sau nuôi cấy............................. 95
Hình 3.19. Kết quả RT-PCR các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng .................... 96
Hình 3.20. Kết quả ghép tự thân tấm tế bào sừng nuôi cấy trên bệnh nhân........ 101


MỞ ĐẦU


1

Hiện nay, nhu cầu điều trị bỏng, mất da, mất phần mềm do tai nạn giao
thông, tai nạn lao động, loét do tiểu đường, do các bệnh lý tim mạch, các vết thương
do xạ trị… rất lớn. Cho đến nay, ghép da tự thân vẫn là “tiêu chuẩn vàng” để tái tạo
bề mặt các vết thương. Tuy nhiên, vùng da cho để ghép tự thân bị hạn chế trong các
vết thương mất da rộng. Điều này thúc đẩy phát triển các liệu pháp khác, trong đó
có liệu pháp ghép tấm tế bào nuôi cấy.
Công nghệ nuôi cấy tế bào là công nghệ hiện đại trong điều trị bỏng, tổn
thương mất da, điều trị thẩm mỹ... Trên thế giới, công nghệ này liên tục được
nghiên cứu để hoàn chỉnh về quy trình công nghệ, về môi trường nuôi cấy… Thông
qua công nghệ nuôi cấy tế bào, nhiều nước trên thế giới đã đạt được những tiến bộ
vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thương mất da, nhiều nạn nhân bỏng sâu và rộng
trên 70% diện tích cơ thể đã được cứu sống cũng như giảm thiểu các di chứng nặng
nề do bỏng sâu để lại. Đồng thời, nhiều vật liệu cũng được nghiên cứu để làm màng
phủ tạm thời các vết thương mất da. Với những ưu điểm như kháng viêm, kháng
khuẩn, tính sinh miễn dịch thấp…, kể từ nghiên cứu đầu tiên của David vào năm
1910, màng ối đã được sử dụng rộng rãi trong chữa trị vết thương mất da. Hơn nữa,
màng ối còn có đặc điểm nổi bật là cấu tạo collagen của màng cơ bản tương tự
màng cơ bản của da người.
Do đó, việc kết hợp giữa màng collagen từ màng ối và tế bào sừng của người

được nuôi cấy để tạo ra tấm tế bào sừng nhằm ứng dụng ghép tự thân là một giải
pháp khả thi trong điều trị các tổn thương mất da và bỏng.
Tại Việt nam đã có nhiều giải pháp điều trị các tổn thương mất da bằng các
màng sinh học, trong đó có màng ối. Thậm chí có nhiều tác giả còn đề xuất việc
ứng dụng tế bào nuôi cấy trong việc điều trị. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có
công trình khoa học nào về việc tạo vật liệu điều trị tổn thương mất da từ sự kết hợp
tế bào nuôi cấy và màng ối được công bố tại Việt nam.


2

Vì vậy tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào
sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng dụng ghép tự thân
điều trị các tổn thương mất da” nhằm đạt các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được quy trình chế tạo màng collagen từ màng ối người ứng dụng
làm giá thể cấy tế bào
2. Xây dựng được quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào sừng người
3. Tạo được tấm tế bào sừng nhiều lớp trên giá thể collagen từ màng ối người


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN


3

1.1. MÀNG ỐI NGƯỜI
Màng ối là một màng mỏng, dai, trong suốt, bao bọc quanh xoang nước ối,
bao quanh dây rốn từ điểm xuất phát ở nhau đến rốn thai nhi. Màng ối có thể được

tách khỏi màng đệm và bánh nhau dễ dàng ngay sau sanh. Ngoài chức năng sản
xuất nước ối, màng ối còn có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập của vi sinh vật trong
thời kỳ bào thai [60].

Hình 1.1. Màng ối bọc quanh thai nhi [121]
1.1.1. Cấu tạo của màng ối
Về nguồn gốc, màng nhau phát triển từ mô ngoài phôi, vừa chứa thành phần
của con (màng ối, màng đệm) và thành phần của mẹ (màng rụng). Cấu trúc màng
đệm-màng ối trên tạo thành hàng rào bao bọc phôi [62].
Về cấu trúc, màng ối bao gồm một lớp đơn tế bào biểu mô, một lớp màng
đáy và một lớp nền. Màng ối không chứa mạch máu hay dây thần kinh. Thay vào
đó, chất dinh dưỡng cần thiết được cung cấp trực tiếp cho màng ối nhờ sự khuếch
tán của dịch ối và từ lớp màng rụng ở bên dưới.
Độ dày trung bình của màng ối từ 0,02 – 0,4mm.


4

Dịch ối

Lớp

Thành phần ngoại bào

Màng ối
Biểu mô
Màng đáy
Lớp đặc
Lớp nguyên
bào sợi

Lớp xốp
Màng đệm
Lớp lưới
Màng đáy
Dưỡng bào
Màng rụng (mẹ)

Hình 1.2. Sơ đồ mô tả cấu trúc của màng ối [62]
Bên trong cùng, gần thai nhất là lớp đơn các tế bào biểu mô nằm trên màng
đáy.
Lớp đặc ở bên dưới màng đáy tạo thành bộ khung dạng sợi chính cho màng
ối. Collagen của lớp đặc do các tế bào trung mô nằm ở lớp nguyên bào sợi tiết ra.
Trong đó, chủ yếu là collagen loại I và loại III tạo thành các bó song song, duy trì
tính cơ học của màng ối. Collagen loại V và loại VI giúp kết nối hai loại collagen
trên với màng đáy.
Nằm ngay trên màng đệm là lớp trung gian hay lớp xốp, chứa nhiều
proteoglycan, glycoprotein, collagen loại III tạo thành cấu trúc xốp [111]. Vì lớp
xốp này liên kết lỏng lẻo với màng đệm nên màng ối có thể dễ dàng tách khỏi màng
đệm [62].


5

1.1.2. Các đặc điểm sinh học của màng ối giúp cho màng ối có tính ứng dụng
cao trong kỹ nghệ mô (tissue engineering)
1.1.2.1. Đặc điểm kháng viêm, kháng khuẩn
Trong một số trường hợp, các phản ứng viêm là tốt do chúng khởi động quá
trình hàn gắn vết thương. Tuy nhiên, các phản ứng này cũng thường gây ra các hậu
quả không mong muốn. Phản ứng chống lại vật thể lạ kích thích đại thực bào và các
tế bào khổng lồ tiết ra những cytokinee, thu hút nguyên bào sợi, gây nên sự xơ hóa

(fibrosis). Các nguyên bào sợi được hoạt hóa bởi nhân tố tăng trưởng chuyển dạng β
(TGF - Transforming growth factor) [82].
Màng ối làm giảm tiết TGF-β cũng như các thụ thể của TGF-β trên nguyên
bào sợi và do đó làm giảm chứng xơ hóa nói trên. Không những vậy, khung nâng
đỡ (scaffold) từ màng ối có thể điều khiển quá trình hàn gắn vết thương bằng cách
kích thích tái cấu trúc mô hơn là kích thích hình thành mô sẹo [143].
Đã có nghiên cứu chứng minh màng ối có tác dụng kháng viêm. Khuôn nền
của màng ối ức chế biểu hiện của một số cytokinee tiền viêm như IL-1α và IL-1β
[132]. Một loại protein khác là MMP (Matrix metalloproteinase) được biểu hiện
trên các tế bào đa nhân và đại thực bào cũng bị ức chế bởi màng ối [66]. Hyaluronic
acid, một glycosaminoglycan có khối lượng phân tử lớn, hiện diện rất nhiều trên
màng ối có thể gắn với CD44. Đây là yếu tố đánh dấu (marker) biểu hiện trên các tế
bào gây viêm và đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn của các tế bào gây
viêm (ví dụ: tế bào lympho) với chất nền của màng ối [65].
β-defensin là nhóm các peptide kháng khuẩn do các tế bào biểu mô và bạch
cầu tiết ra, đóng vai trò trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh [86]. Các tế bào biểu mô
màng ối cũng có khả năng sản xuất β-defensin [81]. Ngoài ra, màng ối còn tiết ra
hai chất ức chế elastase khối lượng phân tử thấp là SLPI (secretory leukocyte
proteinase inhibitor) và elafin [23]. Ngoài đặc tính kháng viêm, cả SLPI và elafin
đều có hoạt tính kháng khuẩn và tham gia vào hệ thống miễn dịch bẩm sinh giúp


6

bảo vệ các bề mặt không bị nhiễm. Việc xử lý màng ối với cả hai chất đối kháng thụ
thể lactoferrin và IL-1 làm cho màng ối có khả năng kháng khuẩn và kháng viêm.
1.1.2.2. Đặc điểm kháng tạo mạch
Màng ối có hoạt tính kháng tạo mạch nhờ sự hiện diện của các hóa chất
kháng tạo mạch trong các tế bào biểu mô và trung mô màng ối như
thrombospondin-1, IL-1, collagen XVIII, IL-10, các nhân tố ức chế mô

metalloprotease (TIMP-1, -2, -3, -4). Màng đáy của màng ối giàu PEDF (pigment
epithelium-derived factor), một yếu tố kháng tạo mạch mới được phát hiện [10].
1.1.2.3. Đặc điểm miễn dịch
Màng ối có tính sinh miễn dịch thấp.
Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch trong suốt quá trình mang thai là bước quan
trọng đầu tiên để chứng minh tính sinh miễn dịch của màng ối. Điều thần kỳ của tạo
hóa thể hiện trong quá trình mang thai. ADN của hợp tử có một nửa từ cha, do đó
thai có các kháng nguyên bán đồng sinh đối với cơ thể mẹ. Tuy nhiên, hợp tử hay
thai không hề bị thải loại. Có thể có vài cơ chế liên quan đến việc bảo vệ thai không
bị tác động bởi hệ miễn dịch của mẹ. Các cơ chế ức chế không đặc hiệu có tính hệ
thống cũng như tại chỗ đã được mô tả. Chúng làm giảm đáp ứng miễn dịch mà
không gây tổn hại đến hệ miễn dịch của người mẹ. Một hàng rào nhau thai ngăn cản
sự lưu thông của các tế bào cũng như các kháng thể gây độc tế bào trước khi chúng
đi vào vòng tuần hoàn của thai. Nhân tố chính ngăn chặn sự thải loại của dưỡng bào
là HLA-G (Human leukocyte antigen). Trái ngược với các gen HLA-A và HLA-B
lớp I bị ức chế ở dưỡng bào, HLA-G biểu hiện trên các sợi lông nhung ngoài dưỡng
bào cũng như trên các tế bào của màng ối và dịch ối. Vai trò của HLA-A, HLA-B,
HLA-C là gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bằng cách trình diện kháng nguyên
cho các tế bào T. Ngược lại, HLA-G lại liên quan đến sự chịu đựng miễn dịch do
chúng làm phối tử (ligand) cho các thụ thể ức chế hiện diện trên tế bào diệt tự nhiên
và đại thực bào [27], [108]. Các tế bào biểu mô màng ối không biểu hiện các kháng
nguyên HLA-A, -B, -C và -DR nhưng biểu hiện HLA-G trên bề mặt. Do đó, sự thải