Bài giảng công nghệ di truyền chương 4 thư viện DNA bộ gene (DNA genomic library)

Thư viện DNA bộ gene
(DNA genomic library)


DNA genomic library là gì?
• Tập hợp tất cả các đoạn DNA của bộ gene sinh
vật.
• Các đoạn DNA được tạo dòng trong các vector
• Sử dụng nhằm phân lập một đoạn DNA hoặc
xác định vị trí của đoạn DNA trên bộ gene


Thực hiện (phage hoặc cosmid)
RE
Siêu âm
-----------



B1. Cắt bộ gene bằng RE
• Sử dụng các RE có trình tự nhận biết gồm 4 nu
• Cắt từng phần để thu được lượng lớn gene
nguyên vẹn.
• Sử dụng DNA tách từ các loại mô khác nhau
• Cắt vector với cùng RE để tạo đầu cố kết
• Có thể sử dụng 2 RE để tránh tự kết nối.


B2. Tạo dòng
• Plasmid: hạn chế đối với đoạn DNA kích thước
lớn, hiệu suất biến nạp tương đối thấp.

• Phage : phổ biến nhất, mang DNA ~ 20 kb
• Cosmid: mang đoạn DNA ~ 40 – 50 kb
• BAC : hữu hiệu nhất
–
–
–
–

Mang đoạn DNA lớn 100 – 300 kb
Ít hình thành thể khảm
Hiệu quả trong tạo dòng và thu hồi DNA
Duy trì sự ổn định của DNA gắn trong vector

• YAC : nhận đoạn DNA lớn, khó thao tác.


B3. Chuyển nạp vào tế bào chủ
• Hóa biến nạp
• Điện biến nạp
• Đóng gói DNA tái tổ hợp (phage  hoặc
cosmid) và cho xâm nhiễm tế bào vi khuẩn


cDNA library
Tại sao cần xây dựng thư viện cDNA ?


Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA
1) Tách chiết RNA tổng số
-

Nguyên lý: tách rời RNA ra khỏi hỗn hợp DNA ,
protein,…
Kiểm soát ribonuclease (RNase) = chất ức chế

2) Tách chiết mRNA
-

Đuôi poly A
Tách bằng sắc ký ái lực oligo dT
Thu nhận bằng ly tâm




Tổng hợp cDNA theo pp RNaseH



Tổng hợp cDNA self priming



Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp



Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC

Tạo dòng cDNA bằng 1 linker


Tạo dòng cDNA bằng 2 linker



Tạo dòng cDNA bằng adapter
HindIII


Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter