Bài giảng công nghệ di truyền chương 6 biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở e coli

Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở
E. coli


Protein nguyên thể (native)


Protein dung hợp (fusion protein)
• Đoạn gene mã hóa 2 hoặc nhiều protein.


Vector biểu hiện
• Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.
• Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo
duy trì vector trong tế bào.
• Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc
tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các
gene được tạo dòng.
• Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết
ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi
đầu AUG.
• Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng
chính xác với promoter.


Hệ thống biểu hiện ở prokaryote


Promotor
1. lacZ promotor: pUC, M13 vector, vector
lamda hoặc Bluescript

- Điều hòa bởi lacI repressor
2. Lambda PL promotor
3. T7 promotor
4. araBAD promotor


Hệ thống điều hòa bởi 2 promotor


Vector biểu hiện với lacZ


Vector biểu hiện với lacZ


Trình tự gắn với ribosome
(ribosomal binding site)
• Cần thiết để khởi đầu dịch mã
• ở E. coli thường có trình tự -GAGG- đứng
trước codon khởi đầu dịch mã.
• Trình tự Shine-Dalgarno ở E. coli: AGGAGGU
• Trình tự Kozak ở Eukaryote: (gcc)gccRccAUGG


Lợi thế của protein dung hợp
• Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch
mã nếu dung hợp ở đầu N-ter
• Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn,
tạo cầu nối disulphide
• Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung

hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu
hiện của protein
• Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch


Các thẻ (tag) đánh dấu
• GST (glutathion-S-transferase):
– Kết hợp và bảo vệ protein
– Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực

• Maltose binding protein
– Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài
periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch
– Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose)

• Thioredoxin:
• Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel



Phát hiện protein dung hợp
• Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện
di trên gel.
• Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung
hợp
–
–
–
–

Nuôi dòng vi khuẩn
Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ)
Tách chiết dịch bằng SDS
Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS
PAGE)
– Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting


Protein Ladder

1

2

3

4


Western blot (anti-His tag conjunged HRP)

70kD
40kD

30oC

16oC

-

4oC

30oC

SP2
16oC

-

4oC

SP1


Tinh sạch protein
1. Thể vùi (inclusion)
2. Hòa tan thể vùi
- Phá tế bào
- Tinh sạch thể vùi
- Hòa tan thể vùi
3. Thu nhận protein


Tinh sạch protein