TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC QUÁ BIỂU HIỆN ACETALDEHYDE DEHYDROGENASE 6 AND ACETYL-COA SYNTHETASE 1 TRONG SẢN XUẤT CÁC SẢN PHẨM XYLITOL BẰNG TÁI TỔ HỢP SACCHAROMYCES CEREVISIAE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

Bài báo cáo :

BÀI DỰ THI

TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC QUÁ BIỂU HIỆN
CUỘC THI TÌM HIỂU
ACETALDEHYDE DEHYDROGENASE 6 AND
ACETYL-COA SYNTHETASE 1 TRONG SẢN XUẤT
CÁC SẢN PHẨM XYLITOL BẰNG TÁI TỔ HỢP
SACCHAROMYCES CEREVISIAE

GVHD: Nguyễn Minh Hải
Nhóm 5:
1. Vũ Thị Thu Hiền

11116027

2.

Trần Thi Thu Hiền

11116026

3.
4.
5.

Nguyễn Thị Anh Thư
Nguyễn Khắc Quí
Đào Quang Minh

11116066
11116052
11116038

1ffgg111111116015

Tp HCM, tháng 3 năm 2014
Mục lục


Trang 2


TÁC ĐỘNG CỦA VIỆC QUÁ BIỂU HIỆN ACETALDEHYDE
DEHYDROGENASE 6 AND ACETYL-COA SYNTHETASE 1 TRONG SẢN
XUẤT CÁC SẢN PHẨM XYLITOL BẰNG TÁI TỔ HỢP SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
TÓM TẮT
Việc cung cấp các NAD(P)H là yếu tố then chốt trong trong việc sản xuất vi sinh
vật của xylitol từ xylose. Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung NAD(P)H,
acetaldehyde dehydrogenase 6 (ALD6) và acetyl-CoA synthetase 1 (ACS1) được biểu
hiện quá mức đưa vào nấm men tái tổ hợp Saccharomyces cerevisiae từ việc lên men
khử Pichia stipitis xylose gen. các hoạt động phân tích bên trong ống nghiệm nhằm
xác nhận biểu thức hàm số của cả hai enzyme. Nuôi cấy mẻ trong lượng glucose giới
hạn cho phép xác định được khả năng lên men của Saccharomyces cerevisiae
BJ3505:dXR chủng biểu hiện tốt ACS1 hoặc ALD6 được thực hiện bằng cách bổ sung

đường 600 g / L trong sự hiện diện của 100 g / L xylose Trong số đó, ACS1 với biểu
hiện quá mức đã cho kết quả tốt nhất trong sản xuất xylitol: Nồng độ xylitol 91,3 g / L
và 1,76 g / L h xylitol, đó là 25% và tăng 11%, so với việc kiểm soát và biểu hiện
chủng giống ALD6 tốt. Xem xét những thay đổi của tăng trưởng tế bào,sản phẩm
ethanol và acetate, một điều đáng chú ý của sản xuất xylitol bằng ACS1 biểu hiện quá
mức dường như được gán cho năng lượng và sự phát sinh ra NAD (P) H thông qua
một quá trình chuyển hóa từ acetaldehyde để acetyl-CoA và chu kỳ TCA
1. Lời giới thiệu

Xylitol là một loại đường thay thế phổ biến với hàm lượng calo thấp, vị mát và
vị ngọt chất lượng cao (Lee et al., 2009). Các xylitol hàng năm trên thị trường được
ước tính là 340,000,000 $ trong năm 2008 (Akinterinwa et al., 2008). Cho đến nay, các
vi sinh vật khác nhau đã được phát triển để sản xuất xylitol từ xylose: Candida
tropicalis Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli và Corynebacterium glutamicum
(Akinterinwa và các cộng sự, 2008;. Kim và cộng sự, 2010;.. Lee và cộng sự, 2000).
Trong số đó, một loại men GRAS là S. cerevisiae (Ries, 2009) không có cách nào trao
đổi chất nên nó nên nó đã được các kỹ thuật di truyền biểu hiện thành các tái tổ hợp
xylitol (XR). Enzyme đầu tiên chuyển hóa xylose (Hình 1) do đó tái tổ hợp S.
cerevisiae có thể sản xuất xylitol với năng suất chuyển đổi gần như 100%
(Akinterinwa et al, 2008;. Lee và cộng sự, 2000;.. Chung và cộng sự, 2002). Trong khi
đó, XR- trung gian chuyển đổi xylose xylitol yêu cầu NAD (P) H như một yếu tố
đông thời, trong đó việc cung cấp đầy đủ là một yếu tố rất quan trọng cho sản xuất
xylitol hiệu quả (Granstr ¨ om et al., 2007)
Trong các nghiên cứu trước đó , điều chế trực tiếp và gián tiếp của NAD(P)H
đã được thực hiện trong S. cerevisiae tái tổ hợp thể hiện gen mã hóa XYL1 với P.
Trang 3


stipites XR. Ví dụ, transhydrogenase hòa tan (EC1.6.1.1) xúc tác chuyển đổi đảo
ngược của NADH thành NADPH và glucose-6-phosphat dehydrogenase là một

enzyme chuyển hóa chính để tạo ra NADPH trong con đường pentose phosphate oxy
hóa được biểu hiện rõ rang S. cerevisiae tái tổ hợp có thể sản xuất xylitol (Jeun et
al.,2003; Kwon et al.,2006) Sự suy giảm đồng thời hoạt động của Phosphoglucose
isomerase (EC5.3.1.9) và cải thiện glucose-6-dehydrogenase phosphate tăng năng suất
xylitol thông qua sự thay đổi của lượng glucose từ đường phân quá trình pentose
phosphate sản xuất NADPH (Oh et al.,2007).Trong khi đó, vì sự vắng mặt của các
enzym chuyển hóa để xúc tác thêm quá trình oxy hóa của xylitol, S. cerevisiae tái tổ
hợp thể hiện XR phải yêu cầu đồng chất cho quá trình sản xuất tăng trưởng tế bào và
xylitol. Theo bối cảnh này, một mức giới hạn glucose của quá trình lên men fed-batch
được thiết kế để duy trì một mức độ cơ bản của nồng độ glucose trong canh trường
nuôi cấy ,canh trường cho quá trình ngăn chặn sự xâm nhập của các chất dị hóa của
sự hấp thu xylose và tạo ra năng lượng và NAD(P)H (Lee etal.,2000; Chung et
al.,2002; Bae et al.,2004). Trong nghiên cứu này, hai enzym chuyển hóa liên quan gián
tiếp sự tái tạo đồng yếu tố, NADPH phụ thuộc vào acetaldehyde dehydrogenase 6 và
acetyl-CoA synthetase 1 (ACS1, EC6.2.1.1) được biểu hiện rõ ràng trong tái tổ hợp S.
cerevisiae có chứa gen XR các stipitis P. để điều tra hoạt động của chúng trong sản
xuất xylitol. Khảo nghiệm hoạt động của chúng đã khẳng định sự biểu hiện chức năng
của cả hai enzym. Lên men fed-batch với một chiến lược để duy trì nồng độ glucose ở
mức cơ bản đã được thực hiện trong sự hiện diện của nồng độ xylose cao để đánh giá
năng lực sản xuất xylitol của các chủng S. cerevisiae tái tổ hợp.
2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1.
Chủng và Plasmid

E. coli TOP10 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) được sử dụng cho thao tác gen.
S. cerevisiae BJ3505: DXR thể hiện P. stipitis xylose reductase (XR) được xây dựng
để sản xuất xylitol trước đây (Chung et al.,2002), trong đó gen mã hóa XYL1 P.
stipitis XR được tích hợp thể nhiễm sắc trong nhiều chuỗi δ và thể hiện một cách chủ
yếu dưới chất hoạt hóa GAPDH. S. cerevisiae CEN.PK2-1D được sử dụng cho việc
cung cấp các DNA nhiễm sắc thể nấm men. Plasmid p426GPD và p424GPD cùng với

chất hoạt hóa GPD và CYC1 terminator được sử dụng cho sự thể hiện của ALD6 và
ACS1. Chủng nấm men và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê
trong Bảng 1.
2.2.

Thao tác di truyền

Các ALD6 gen mã hóa acetaldehyde dehydrogenase 6 và sự ACS1 gen mã hóa
acetyl-CoA synthetase được PCR-khuếch đại từ nhiễm sắc thể DNA S. cerevisiae
.Thủ tục chung cho thao tác DNA theo các báo cáo trước đây . Các oligomer DNA
gen cụ thể được thiết kế như sau: F_ALD6_SpeI and R_ALD6_XmaI for ALD6;
Trang 4


F_ACS1_EcoRI and R_ACS1_XhoI cho ACS1. Các trình tự nucleotide của ADN mồi
được mô tả trong bảng 2. Sau khi xác nhận kích thước ước tính DNA, sản phẩm PCR
với gen ALD6 và gen ACS1. và plasmid p426GPD và p424GPD được điều trị bằng
các enzym giới hạn tương ứng (Bảng 2). Gen ALD6 được lắp vào đầu lasmid
p426GPD và gen ACS1 đã được thực hiện vào plasmid p424GPD kết quả trong việc
xây dựng các plasmid pALD6 và pACS1, tương ứng. Gen ALD6 cũng như các gen
ACS1 được đặt nằm phía sau chất hoạt hóa GDP trong mỗi plasmid. Sự thay đổi của
nấm men theo phương pháp lithium-acetate

Hình. 1. Sơ đồ biểu diễn glucose và chuyển hóa xylose trong tái tổ hợp S. cerevisiae
biểu hiện gen XR. Tên của các enzym được in nghiêng và viết tắt như sau: XR, xylose
reductase; ADH, alcohol dehydrogenase; ALD6, aldehyde dehydrogenase 6; ACS1,
acetyl-CoA synthetase 1
Bảng 1: Chủng S. cerevisiae và plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này

Trang 5

2.3.

Điều kiện môi truờng nuôi cấy

Môi trương LB (10g/Ltryptone, 5g/Ly east extract and 10g/LNaCl) được sự
dụng cho quá trình nuôi cấy E. coli. Môi trường tổng hợp toàn bộ (SC)( 6.7g/Yeast có
nguồn gốc nitơ không có axit amin ) Sigma,St.Louis, USA) và 20g/L glucose) mà
không uracil hoặc tryptophan đã được sử dụng cho lựa chọn các biến nạp. Môi trường
YPD 10g / L chiết nấm men, 20 g / L peptone và glucose 20g / L) đã được sử dụng cho
sự phát triển tế bào tái tổ hợp các chủng S. cerevisiae và sản xuất xylitol. Các Glycerol
của các tế bào nấm men được lưu trữ tại -70 độ C đã được cấy vào các 5ml môi trường
YPD. Sau một đêm môi trường tại 30 độ C và 200 rpm trong một tủ ấm lắc
(Vision,Korea), canh trường nuôi cấy đã được chuyển vào 500 ml bình tqm giác với
100ml môi trường YPD .Sau 12 h nuôi cấy ở môi trường tại 30 độ C và 200 rpm, các
tế bào được thu hoạch và lơ lửng trong 50 ml nước cất và và tế bào huyền phù được
sử dụng như chất cấy vào cho môi trường nuôi cấy chính. Đối với sản xuất xylitol, một
giới hạn glucose trong quá trình lên men fed-batch đã được thực hiện theo các báo cáo
trước đó với 1 số sửa đổi. (Kwon et al.,2006; Oh et al.,2007). 1 3.7 L-scale phản ứng
sinh học (Bioengineering AG,Wald,Switzerland) chứa 1L khối lượng lên men của
môi trường YPD và 100g / L xylose ban đầu. Mật độ quang học ban đầu của canh
trường nuôi cấy được đặt vào khoảng 0.5 bằng cách của tế bào huyền phù trước khi
nuôi. Sau khi sự suy giảm của glucose ban đầu ngày càng tăng, 600g/L dung dịch
glucose được cho vào liên tục theo tỉ lệ 1.8 g / h (Kwon et al.,2006). PH trung bình
được duy trì ở 5,0 bằng cách thêm 2N NaOH hoặc 2 N HCl thông qua việc nuôi cấy.
Tốc độ thổi khí và khuấy trộn đã được cố định lần lượt ở mức 500 rpm và 1vvm.
Bảng 2: PCR primers được sử dụng trong nghiên cứu này

Trang 6

Các trang công nhận các enzym hạn chế được in nghiêng.
2.4.

Các phương pháp phân tích

Khối lượng tế bào khô được ước tính bằng cách đo mật độ quang học ở 600 nm
bước sóng với một quang phổ kế (Ultrospec 2000, Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ, USA) và tính toán bằng cách sử dụng phương trình chuyển đổi sau
đây: khối lượng tế bào khô (g/L) = 0.30 x OD 600nm. Các giá trị nồng độ của glucose,
xylose, xylitol, ethanol và acetate được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
suất cao (Agilent 1100 series LC, USA) trang bị cột phân tích carbohydrate. Cột này
đã được gia nhiệt ở 60oC và tốc độ dòng chảy của dung môi acid sulfuric 5mM đổ vào
là 0.6mL. Phát hiện được thực hiện bởi một máy dò RI (Aligent 1100 series, USA).
Nồng độ protein được xác định bằng bộ kit khảo nghiệm protein (Bio-Rad, Richmond,
CA, USA) và albumin huyết thanh bò (Sigma, USA) được sử dụng làm chuẩn.
2.5.

Phân tích hoạt tính enzyme

Để chuẩn bị chiết xuất lượng protein thô, các tế bào nấm men được thu hoạch
và vo thành viên lơ lửng trong dung dịch đệm phosphate (pH 8.0) 50mM trong đó có
hỗn hợp chất ức chế protein (Roche, Basel, Switzerland). Thể vẩn tế bào đã được pha
loãng để điều chỉnh mật độ quang học của nó ở 20. Sau khi phối trộn một lượng thích
hợp acid có khả năng rửa sạch các hạt thủy tinh(0.45-0.52mm, Sigma, USA) với các
thể vẩn tế bào, ống có chứa thể vẩn được xoáy nước mạnh trong 1 phút và ướp lạnh
trong nước đá trong vòng 3 phút. Sau bốn lần lặp lại, các mảnh vỡ tế bào và hạt thủy
tinh đã được gỡ bỏ bằng cách ly tâm ở 1200 rpm và 4 oC trong 2 phút. Phần nổi lên trên
bề mặt chứa và phần chiết xuất protein thô đưuọc nhặt ra đem đi bảo quản ở 4 oC dành

cho việc phân tích hoạt tính enzyme.
Khảo nghiệm hoạt động của aldehyde dehydrogenase 6 (ALD 6) theo báo cáo trước
đó với một số sửa đổi (Park và các cộng sự, 2011). Hỗn hợp khảo nghiệm gồm có 50
mM potassium phosphate buffer (pH=8.0), 50 mM acetaldehyte, 0.4 mM
dithiothreitol, 5 mM MgCl2, 0.4 mM NADP+. Hoạt tính của nhựa tổng hợp AcetylCoA (ACS1) được xác định khi sử dụng bộ kit R-BioPharm acetate (148261). Hỗp
hợp phản ứng chứa 2.7 mM ATP, 0.2 mM coenzyme A, 10 mM potassium phosphate,
1.1 mM NAD+, 9.4 mM L-malate, 5.5 đơn vị L-lamate dehydrogenase và 1.4 đơn vị
Trang 7


nhựa tổng hợp citrate. Sau khi bổ sung vào hỗn hợp phản ứng các chiết xuất thô,
đưuọc theo dõi ở bước sóng hấp thụ 340 nm. Tất cả các phản ứng được tiến hành ở
30oC. Một đơn vị (U) của ALD6 và ACS1 sẽ xác định được lượng enzyme tham gia
oxi hóa 1µmol NADPH và giảm bớt 1µmol NAD+, tương tự như thế mỗi phút tương
ứng với mỗi điều kiện. Hoạt tính enzyme đặc trưng đưuọc tính bằng cách hoạt động
của enzyme bằng nồng độ protein tế bào.

Fig.2. Glucose limited Fed-Batch fermentation of S. cerevisiae BJ3505: ∆XR/pALD6
+ p424GPD (a,b) và BJ3505: ∆XR/p426GPD + pALD6 (c,d) in YLD medium with
Trang 8


100g/L cxylose at 200 rpm, 1vvm và 30oC. The arrow indicates the start point feeding
of 600g/L glucose at 1.8g/h feed rate. Symbols are denoted as follows:  dry cell
mass;  glucose;  xylitol;  xylose; tam giác đen thuận ethanol; tam giác đen
ngược acetate.
3. Kết quả và bàn luận

Để khẳng định chức năng đã thể hiện của ALD6 và ACS1, các tế bào
S.cerevisiae tái tổ hợp đã được cho phát triển trong môi trường YPD 100 mL đúng

12h và thu protein thô trong mỗi dòng để chuẩn bị cho khảo nghiệm hoạt tính của
protein. S.cerevisiae BJ3505:∆XR/pALD6 + p424GPD cho thấy hoạt tính acetaldehyte
dehydrogenase đặc trưng của 8.0 ± 0.2 mU/mg protein và BJ3505: ∆XR/p426GPD +
pACS1 hoạt động nhựa tổng hợp acetyl CoA đặc trưng của 22.7 ± 0.9 mU/mg protein,
đó là 1.2 và cao hơn so với giá trị tương ứng của các chủng kiểm soát 1,3 lần. Các hoạt
động cải tiến xác nhận các biểu hiện chức năng của cả hai enzyme.
Như đã nêu, S. cerevisiae BJ3505:δXR không có enzyme đặc hiệu để chuyển
hóa xylitol thành năng lượng và sản xuất cofactor. Nhiều nghiên cứu sử dụng xylitol
để nuôi cấy S. Cerevisiae có gen tái tổ hợp, lựa chọn phương pháp nuôi bề mặt trong
môi trường có nồng độ xylose cao. (Akinterinwa et al., 2008; Lee et al., 2000; Chung
et al., 2 002; Jeun et al ., 2003; Kwon et al., 2006; Oh et al., 2007; Bae et al., 2004).
Trong đó, quá trình lên men Fed-batch có giới hạn glucose đặc trưng là phương pháp
hữu ích để tạo ra năng lượng và sản xuất cofactor, đồng thời ngăn cản tích tụ quá
nhiều ethanol có ảnh hưởng tiêu cực để sản xuất xylitol (Lee et al., 2000) và giảm tác
dụng ức chế chuyển hóa xylitol thành glucose (Lee et al., 2002).
Để nghiên cứu ảnh hưởng của ALD6 và ACS1 qua việc sản xuất xylitol, quá
trình lên men Fed-batch giới hạn của glucose được thực hiện. Trong hình. 2 và 3, sau
khi bổ sung glucose lần đầu tiên được tiêu thụ hoàn toàn, ở một nồng độ glucose.
Dung dịch được nuôi liên tục và xylose được chuyển hóa thành xylitol. Nồng độ
glucose được duy trì ở một mức độ cơ bản. Các sản phẩm phụ như ethanol và acetate
tích lũy trong nước dùng nuôi cấy. Kết quả sản xuất xylitol thu được trong quá trình
lên men Fed-batch giới hạn của glucose được tổng hợp trong Bảng 3. Lượng xylitol
dựa trên xylose tiêu thụ ước tính hơn 0,92 (g / g) trong tất cả các quá trình lên men.
Trong trường hợp NADPH phụ thuộc vào ALD6 vượt mức (Hình 2c và d), trên 90%
xylose ban đầu thêm vào được chuyển hóa thành xylitol, trong đó nồng độ cuối cùng là
13% cao hơn so với control strain. Để cải thiện trong sản xuất xylitol cần bổ sung
nhiều NADPH hơn để phản ứng chuyển hóa xylose.

Trang 9

Hình. 3. Giới hạn của glucose trong quá trình lên men fed-batch S. cerevisiae
BJ3505:δXR/pACS1+p426GPD (a,b) và BJ3505:δXR/pACS1+pALD6 (c,d) trong môi
trường 100 g /L xylose tại 200 rpm, 1 VVM YPD và 30oC. Mũi tên chỉ điểm bắt đầu
bổ sung 600 g /L glucose, tốc độ bổ sung 1,8 g/h. Kí hiệu được biểu thị như sau: ,
khối lượng tế bào khô, , đường; , xylose; xylitol; , ethanol;
acetate..
Bảng 3: Kết quả tóm tắt của nuôi mẻ lên men chủng S. cerevisiae BJ3505: δXR

Trang 10


a

lượng xylitol được tính cho nồng độ xylitol từ điểm bắt đầu sản xuất xylitol (lúc 8h)
đến khi kết thúc quá trình lên men (60 giờ).
ALD6 vượt mức tích lũy acetate cao gấp đôi và do đó giảm khối lượng tế bào khô
cuối cùng là 30%. Tác dụng ức chế như acetate vào tăng trưởng tế bào cũng đã được
báo cáo ở những nơi khác (Casey và cộng sự, 2010;.. Pampulha et al, 1990)
Quá trình lên men fed-batch trong điều kiện có nồng độ glucose xác định của
S.cerevisiae BJ3505: XR /pACS1 + p426GPD đã được thực hiện để khám phá tác
động của ACS1 vượt mức. Như hình. 3a, b ACS1 vượt mức tăng tiêu thụ xylose và sản
xuất xylitol đáng kể mà không có một thay đổi đáng kể của tăng trưởng tế bào. Nồng
độ xylitol cuối cùng tăng tương ứng 25% và 11%, so những của người kiểm soát và
dùng chủng ALD6 vượt mức. Đối với sự hình thành sản phẩm phụ với, ACS1 vượt
mức giảm sản xuất ethanol chỉ từ 8,0 g / L đến 5,4 g / L không có bất kỳ ảnh hưởng
tích lũy acetate (khoảng 2,2 g / L) so với đối chứng (Hình 2b) Không có ảnh hưởng
của ACS1 vượt mức trong sản xuất acetate cũng đã được thông báo trong báo cáo khác
(Akamatsu và cộng sự, 2000;. De Jong-Gubbels et al., 1998). Lý do cho sự cải thiện
đáng kể sản xuất xylitol và giảm sản xuất ethanol chỉ ACS1 vượt mức là không rõ

ràng. Như đã đề cập, tuy nhiên, acetyl-CoA synthetase xúc tác chuyển đổi acetate
thành acetyl-CoA, đó là một khối hợp nhất quan trọng đối với năng lượng và NAD (P)
H thế hệ thông qua các chu kỳ TCA (Hình 1) Vì vậy, vượt mức của ACS1 có thể thay
đổi các thông lượng acetaldehyde từ ethanol tạo ra acetate, đó làm gián tiếp sản xuất
hơn của NAD (P) H và acetyl-CoA mà không có tích lũy acetate. Cuối cùng, quá trình
lên men fed-batch trong điều kiện có nồng độ glucose xác định.bằng S.cerevisiae
BJ3505: XR /pACS1 + p426GPD cho các giá trị của nồng độ xylitol 91,3 g / L và
năng suất 1,76 g/Lh.
Trong khi đó, ACS1vượt mức làm giảm cả ethanol và nồng độ acetate đáng kể
39% và 52%, so với những người cho ALD6 vượt mức. Để có tác động hợp lực của
ALD6 và ACS1 vượt mức trong sản xuất xylitol, S. cerevisiae BJ3505: XRcó chứa cả
plasmid pALD6 và pACS1 được nuôi bằng chiến lược quá trình lên men tương tự
Trang 11


nhau cho ACS1 và ALD6 vượt mức. Trái với sự mong đợi, vượt mức của ACS1 và
ALD6 nồng độ xylitol cuối cùng cho 67,9 g / L, trong khi đó 74% và 82% giá trị cho
biểu hiện tương ứng cho ACS1 hoặc ALD6 khi hoạt động đơn độc. Các sự biểu hiện
vượt mức của một gene nào đó giảm khối lượng tế bào cuối cùng vào khoảng 10% và
tăng nồng độ acetate 39%,so với những người cho ACS1vượt mức. Một lý do có vẻ
đúng cho những vượt mức tác động tiêu cực của ACS1 và ALD6 có thể là sự mất cân
bằng của hai enzyme như báo cáo trước (Shiba et al., 2007). Trong đó cân bằng ACS1
và ALD6 biểu hiện mức độ tăng acetyl-CoA hợp nhất và sản xuất amorphadiene bằng
chủng S. cerevisiaes tái tổ hợp. Một khả năng khác có liên quan đến sự định vị của
ACS1. Để giảm hình thành acetate, acetyl-CoA synthetase nên tồn tại trong dung dịch
bào tương. Mặc dù vị trí của acetyl-CoA synthetase được chuyển giao sang tế bào chất
hoặc ty thể, nó vẫn còn lộn xộn (Akamatsu et al., 2000).
Kết quả
Trong một nỗ lực để cải thiện sản xuất xylitol bởi điều biến của mức độ biểu
hiện ALD6 và ACS1, quá trình lên men fed-batch trong điều kiện có nồng độ glucose

xác định của tổ hợp S. cerevisiae BJ3505 chủng P. stipitis XR và cerevisiae ALD6
hoặc/và ACS1 được thực hiện. Trong số đó, S. cerevisiae BJ3505: XR/p424GPD +
pACS1 cho thấy nồng độ xylitol và năng suất là tốt nhất so với các dòng khác, mà có
thể được gán cho một thực tế là quá mức cho phép ACS1 sinh ra nhiều năng lượng và
NAD(P)H cho sản xuất xylitol.
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi trung tâm sinh khối cao cấp R & D (ABC) của
Hàn Quốc Grant (2010-0.029.799) được tài trợ bởi Bộ Giáo dục, Khoa học và Công
nghệ và Hội đồng Nghiên cứu Khoa học cơ bản Hàn Quốc & Công nghệ (KRCF)
Grant , và một phần bởi Bộ Thực phẩm, Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản, Hàn
Quốc.
THAM KHẢO
Akinterinwa, O., et al., 2008. Metabolic engineering for bioproduction of sugar
alcohols. Current Opinion in Biotechnology 19, 461–467.
Akamatsu, S., et al., 2000. Effects of aldehyde dehydrogenase and acetyl-CoA
synthetase on acetate formation in sake mash. Journal of Bioscience and
Bioengineering 90, 555–560.

Trang 12


Bae, S.M., et al., 2004. Production of xylitol by recombinant Saccharomyces
cerevisiae containing xylose reductase gene in repeated fed-batch and cellrecycle
fermentations. Enzyme and Microbial Technology 35, 545–549.
Chung, Y.S., et al., 2002. Stable expression of xylose reductase gene enhances
xylitol production in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial
Technology 30, 809–816.
Casey, E., et al., 2010. Effect of acetic acid and ph on the cofermentation of
glucose and xylose to ethanol by a genetically engineered strain of Saccharomyces
cerevisiae. FEMS Yeast Research 10, 385–393.

de Jong-Gubbels, P., et al., 1998. Overproduction of acetyl-coenzyme A
synthetase isoenzymes in respiring Saccharomyces cerevisiae cells does not reduce
acetate production after exposure to glucose excess. FEMS Microbiology Letters 165,
15–20.
Granstr¨ om, T., et al., 2007. A rare sugar xylitol. Part I: the biochemistry and
biosynthesis of xylitol. Applied Microbiology and Biotechnology 74, 277–281. Jeun,
Y.S., et al., 2003. Expression ofAzotobacter vinelandiisoluble transhydrogenase
perturbs xylose reductase-mediated conversion of xylose to xylitol by recombinant
Saccharomyces cerevisiae. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 26, 251–256.
Kim, S.H., et al., 2010. Production of xylitol fromD-xylose and glucose with
recombinant Corynebacterium glutamicum. Enzyme and Microbial Technology 46,
366–371.
Kwon, D.H., et al., 2006. Elevation of glucose 6-phosphate dehydrogenase
activity increases xylitol production in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Journal
of Molecular Catalysis B: Enzymatic 43, 86–89.
Kang, H.K., et al., 2011. Cloning of levansucrase from leuconostoc
mesenteroides and its expression in Pichia pastoris. Food Science and Biotechnology
20, 277–281.
Lee, E.J., et al., 2009. Preventive effect of sugar-free chewing gum containing
maltitol on dental cariesin situ. Food Science and Biotechnology 18, 432–435.
Lee, W.J., et al., 2000. Characterization of two-substrate fermentation processes
for xylitol production using recombinant Saccharomyces cerevisiae containing xylose
reductase gene. Process Biochemistry 35, 1199–1203.
Lee, W.J., et al., 2002. Kinetic studies on glucose and xylose transport in
Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 60, 186–191.
Trang 13


Oh, Y.J., et al., 2007. Dual modulation of glucose 6-phosphate metabolism to
increase NADPH-dependent xylitol production in recombinant Saccharomyces

cerevisiae. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 47, 37–42.
Park, S.-E., et al., 2011. Expression of aldehyde dehydrogenase 6 reduces
inhibitory effect of furan derivatives on cell growth and ethanol production in
Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology 102, 6033–6038.
Pampulha, M.E., et al., 1990. Activity of glycolytic enzymes of Saccharomyces
cerevisiae in the presence of acetic acid. Applied Microbiology and Biotechnology 34,
375–380.
Ries, E.F., 2009. Progressive screening of thermostable yeasts for phytase
production. Food Science and Biotechnology 18, 655–660. Ryu, H.J., et al., 2011.
Expression, purification, and characterization of human
intestinal maltase secreted from Pichia pastoris. Food Science and Biotechnology 20,
561–565.
Shiba, Y., et al., 2007. Engineering of the pyruvate dehydrogenase bypass in
Saccharomyces cerevisiaefor high-level production of isoprenoids. Metabolic
Engineering 9, 160–168.

Trang 14