Nghiên cứu thu nhận pectic oligosacchiaride từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase

i

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ,
đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn đồng nghiệp và các cơ quan.
Trƣớc hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nguyễn
Thị Xuân Sâm và GS. TS. Đặng Thị Thu – Bộ môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử,
Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội đã
tận tình hƣớng dẫn và định hƣớng cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành
bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ
thực phẩm, Trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong
quá trình học tập và nghiên cứu.
Nhân dịp này cho tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp và các bạn bè đồng nghiệp, Trƣờng đại học Lâm nghiệp đã hết sức giúp đỡ và
tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các giáo sƣ, phó giáo sƣ, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng, phản biện, thƣ
ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án
với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung
nghiên cứu của luận án.
Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức nhiệt tình của
gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận án nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày

tháng

Vũ Kim Dung

năm 2015

ii

LỜI CAM ĐOAN
Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất
Pectic oligosaccharide (POS) bằng enzyme ứng dụng trong chế biến thực phẩm chức năng”
mã số ĐT.04.14/CNSHCB, thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong
lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 của Bộ Công thƣơng.
Là ngƣời tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài đƣợc trình bày trong luận án
này, tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng
đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và đã đƣợc chủ nhiệm đề tài cho phép sử
dụng vào luận án này. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã đƣợc thực hiện trích dẫn và
ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

GVHD 1

GVHD 2

Tác giả

Nguyễn Thị Xuân Sâm

Đặng Thị Thu

Vũ Kim Dung

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... i
MỤC LỤC ........................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................... ix
DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1.

TỔNG QUAN ................................................................................................................ 4
1.1.

Prebiotic và pectic oligosaccharide ..................................................................... 4

1.1.1.

Prebiotic ....................................................................................................... 4

1.1.2.

Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm năng ........................ 5

1.1.2.1. Cấu tạo...................................................................................................... 5
1.1.2.2. Đặc tính sinh học của POS ....................................................................... 6
1.2.

Cơ chất pectin ...................................................................................................... 8

1.2.1.

Cấu tạo ......................................................................................................... 8

1.2.2.

Pectin từ vỏ chanh leo ................................................................................ 11

1.2.3.

Enzyme thủy phân pectin ........................................................................... 12

1.3.

Endopolygalacturonase ..................................................................................... 13

1.3.1.

Vai trò và nguồn thu .................................................................................. 13

1.3.2.

Các yếu tố ảnh hƣởng đến thu nhận endopolygalacturonase ..................... 14

1.3.2.1. Ảnh hƣởng của cơ chất cảm ứng và nguồn carbon .................................. 14
1.3.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ...................................................................... 15
1.3.2.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố khác ............................................................... 16
1.3.3.

Đột biến cải tạo chủng ............................................................................... 16

1.3.4.

Tách và tinh sạch enzyme .......................................................................... 18

1.3.4.1. Thu chế phẩm endopolygalacturonase thô ............................................. 18
1.3.4.2. Các phƣơng pháp kết tủa và lọc ............................................................. 18


iv

1.3.4.3. Tinh sạch endopolygalacturonase .......................................................... 19
1.3.5.
1.4.

Đặc tính xúc tác ......................................................................................... 20

Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS).......................................... 21

1.4.1.

Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình thủy phân ........................................... 23

1.4.2.

Tách, tinh sạch ........................................................................................... 24

1.4.3.

Sấy tạo sản phẩm ....................................................................................... 26

1.5.

Các phƣơng pháp đánh giá pectic oligosaccharide (POS) ................................ 26

1.5.1.

Phân tích định tính ..................................................................................... 26

1.5.2.

Phân tích định lƣợng .................................................................................. 27

1.5.3.

Đánh giá hoạt tính sinh học ....................................................................... 29

1.5.3.1. Đánh giá hoạt tính prebiotic trong điều kiện in vitro ............................. 29
1.5.3.2. Đánh giá hoạt tính prebiotic trong điều kiện in vivo .............................. 30
1.5.3.3. Các chỉ số định lƣợng hoạt tính prebiotic .............................................. 30
2.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................... 32
2.1.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị.............................................................................. 32

2.1.1.

Vật liệu ....................................................................................................... 32

2.1.2.

Môi trƣờng ................................................................................................. 32

2.1.3.

Hóa chất và enzyme ................................................................................... 33

2.1.4.

Thiết bị ....................................................................................................... 34

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 35

2.2.1.

Phƣơng pháp vi sinh .................................................................................. 35

2.2.1.1. Phân lập chủng sinh endopolygalacturonase .......................................... 35
2.2.1.2. Xác định nấm sợi bằng hình thái ............................................................ 35
2.2.1.3. Cải tạo chủng A. niger sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao ........ 35
2.2.1.4. Xác định điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp EPG cao ............................. 36
2.2.1.5. Xác định hoạt tính sinh học của POS ..................................................... 37


v

2.2.1.6. Xác định vi sinh vật tổng số hiếu khí ..................................................... 37
2.2.1.7. Xác định Escherichia coli ...................................................................... 37
2.2.1.8. Xác định Staphylococcus aureus............................................................ 37
2.2.1.9. Xác định Salmonella .............................................................................. 37
2.2.1.10. Thử nghiệm độc tính cấp của pectic oligosaccharide ........................... 37
2.2.2.

Phƣơng pháp hóa lý – sinh ......................................................................... 38

2.2.2.1. Định lƣợng đƣờng khử bằng DNS ......................................................... 38
2.2.2.2. Xác định hàm lƣợng POS bằng Kit D-Galacturonic ............................. 38
2.2.2.3. Xác định hàm lƣợng POS bằng HPAEC ................................................ 40
2.2.2.4. Xác định hoạt độ polygalacturonase ...................................................... 40
2.2.2.5. Xác định hoạt độ endopolygalacturonase............................................... 40
2.2.2.6. Xác định hàm lƣợng protein ................................................................... 40
2.2.2.7. Tinh sạch endopolygalacturonase .......................................................... 40
2.2.2.8. Điện di protein ........................................................................................ 42
2.2.2.9. Khảo sát đặc tính của endopolygalacturonase........................................ 42
2.2.2.10. Phƣơng pháp thu pectin từ vỏ chanh leo .............................................. 43
2.2.2.11. Xác định hàm lƣợng pectin .................................................................. 43
2.2.2.12. Xác định chỉ số este hóa của pectin ...................................................... 43
2.2.2.13. Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS ........................ 44
2.2.2.14. Xác định thành phần POS bằng sắc ký bản mỏng ................................ 44
2.2.2.15. Phƣơng pháp tinh sạch POS ................................................................. 44
2.2.2.16. Chế độ sấy phun ................................................................................... 44
2.2.2.17. Bảo quản POS ...................................................................................... 44
2.2.2.18. Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS................................ 44
2.2.3.

Phƣơng pháp toán học................................................................................ 45

2.2.3.1. Tối ƣu hóa sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 ....................... 45


vi

2.2.3.2. Tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS ....................... 46
3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 48
3.1.

Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase ................................................... 48

3.1.1.

Phân lập, tuyển chọn chủng A. niger sinh tổng hợp EPG cao ................... 48

3.1.2.

Cải tạo chủng A. niger CNTP 5037 có khả năng sinh tổng hợp EPG cao . 51

3.1.2.1. Sàng lọc dòng đột biến sinh endopolygalacturonase cao ....................... 53
3.1.2.2. Cải tạo chủng bằng kỹ thuật chiếu UV nhiều lần ................................... 55
3.1.3.

Thu nhận và đặc tính của endopolygalacturonase từ A. niger UV06-12-23 .. 56

3.1.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp EPG ......... 56

3.1.3.2. Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 .............. 60
3.1.3.3. Tách và tinh sạch EPG từ chủng A. niger UV06-12-23 ......................... 63
3.1.3.4. Đặc tính của EPG từ chủng A. niger UV06-12-23 ................................. 66
3.2. Sản xuất pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo ........................................ 72
3.2.1.

Thu nhận và chuyển hóa HM pectin thành LM pectin .............................. 72

3.2.2.

Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS ........ 76

3.2.2.1. Lựa chọn nồng độ pectin ........................................................................ 77
3.2.2.2. Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp ............................................................. 78
3.2.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ......................................................................... 79
3.2.2.4. Ảnh hƣởng của pH ................................................................................. 80
3.2.2.5. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy ................................................................. 81
3.2.2.6. Ảnh hƣởng của thời gian ........................................................................ 82
3.2.2.7. Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân pectin tạo POS .............................. 84
3.2.3.

Thu hồi và tinh sạch POS từ dịch thủy phân ............................................. 88

3.2.3.1. Tinh sạch POS bằng kỹ thuật lọc màng ................................................. 88
3.2.3.2. Tinh sạch POS qua cột sắc ký ................................................................ 89
3.2.4.

Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm POS ...................................................... 91

vii

3.3.

Nghiên cứu đánh giá hoạt tính và thăm dò khả năng ứng dụng của POS ....... 100

3.3.1.

Hoạt tính sinh học .................................................................................... 100

3.3.1.1. Ảnh hƣởng của POS đến sự phát triển của vi khuẩn có lợi và có hại .. 100
3.3.1.2. Khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi bởi POS và các prebiotic khác .... 103
3.3.1.3. Xác định điểm hoạt tính prebiotic của POS ......................................... 104
3.3.2.

Đánh giá chất lƣợng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS .. 105

3.3.2.1. Kiểm tra chất lƣợng sản phẩm ............................................................. 105
3.3.2.2. Thử nghiệm độc tính cấp của sản phẩm trên chuột .............................. 107
3.3.3.

Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS ................................... 109

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 112
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 112
3.4.

Kiến nghị ......................................................................................................... 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 115
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 128


viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú thích

DE

Mức độ este hóa (Degree of esterication)

DP

Mức độ trùng hợp (Degree of polymerization)

EPG

Endopolygalacturonase

FPLC

Sắc ký nhanh protein lỏng hiệu năng cao (Fast performance liqiquid
chromatography)

G1

Monogalacturonic acid

G2

Digalacturonic acid

G3

Trigalacturonic acid

HGA

Homogalacturonan

HM

Pectin có mức độ methyl hóa cao (High methyl este)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liqiquid chromatography)

kDa

Kilo Dalton

Kdo

2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic

LM

Pectin có mức độ methyl hóa thấp (Low metyl este)

NAOS

Neoagaro oligosaccharides

PMG

Polymethylgalacturonase

PMGL

Polymetylgalacturonate lyase

PG

Polygalacturonase

PGL

Polygalacturonate lyase

POS

Pectic oligosaccharide

PE

Pectinesterase

RG I

Rhamnogalacturonan I

RG II

Rhamnogalacturonan II

TE

Transelimilase

TLC

Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

v/v

Thể tích/ thể tích (Vol/vol)

w/v

Ttrọng lƣợng/ thể tích (Weight/vol)

w/w

Trọng lƣợng/ trọng lƣợng (Weight/weight)

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Hàm lƣợng pectin trong các loại trái cây ............................................................... 8
Bảng 1.2 Thành phần của vỏ chanh leo .............................................................................. 12
Bảng 1.3 Khả năng tổng hợp polygalacturonase trên các nguồn cơ chất khác nhau .......... 15
Bảng 1.4 Đặc tính của endopolygalacturonase ................................................................... 20
Bảng 2.1 Hóa chất, dụng cụ chính và enzyme .................................................................... 33
Bảng 2.2 Máy, thiết bị ......................................................................................................... 34
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp ....................................................................... 38
Bảng 2.4 Thành phần và trình tự thí nghiệm định lƣợng galacturonic acid theo................ 39
Kit D-galacturonic ............................................................................................................... 39
Bảng 2.5 Các yếu tố tối ƣu trong nghiên cứu sinh tổng hợp endopolygalacturonase từ
chủng A. niger UV06-12-23 ................................................................................................ 45
Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm tối ƣu hóa sinh tổng hợp EPG từ A. niger UV06-12-23 .. 46
Bảng 2.7 Các biến số trong nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin tạo
POS ...................................................................................................................................... 47
Bảng 2.8 Ma trận thực nghiệm tối ƣu hóa quá trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo
tạo POS ................................................................................................................................ 47
Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của các chủng nấm mốc phân lập từ nguồn vỏ quả ...... 48
Bảng 3.2 Giá trị bán kính vòng thủy phân của các chủng nấm mốc thử nghiệm ............... 49
Bảng 3.3 Hoạt độ polygalacturonase của các chủng nấm mốc thử nghiệm ........................ 50
Bảng 3.4 Hoạt độ endopolygalacturonase của 7 chủng nấm mốc thử nghiệm ................... 51
Bảng 3.5 Ảnh hƣởng của thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống của A. niger CNTP 5037 ......... 52
Bảng 3.6 Khả năng tổng hợp endopolygalacturonase của chủng xử lý bằng UV............... 53
Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của chủng cải tạo qua các lần
cấy truyền ............................................................................................................................ 54
Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của dòng xử lý bằng UV nhiều
lần qua các lần cấy truyền.................................................................................................... 55

x

Bảng 3.9 Khả năng sinh EPG của A. niger UV06-12-23 qua các lần cấy truyền ............... 56
Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độ EPG thu đƣợc trong
các điều kiện nuôi cấy khác nhau ........................................................................................ 61
Bảng 3.11 Kết quả phân tích phƣơng sai mô hình tối ƣu bằng phần mềm DX7.1.5 .......... 62
Bảng 3.12 Hoạt độ EPG tại các phân đoạn tƣơng ứng với đỉnh thu đƣợc khi tinh sạch..... 64
Bảng 3.13 Các bƣớc tinh sạch EPG từ A. niger UV06-12-23 ............................................ 65
Bảng 3.14 Vận tốc phản ứng endopolygalacturonase tại các nồng độ cơ chất khác nhau .. 70
Bảng 3.15 Thành phần của pectin tách chiết từ vỏ chanh leo ............................................. 75
Bảng 3.16 Ảnh hƣởng của thời gian đến chuyển hóa HM pectin thành LM pectin ........... 76
Bảng 3.17 Ma trận thực nghiệm quá trình thủy phân pectin tạo POS ................................ 84
Bảng 3.18 Kết quả phân tích phƣơng sai ANOVA của mô hình ........................................ 85
Bảng 3.19 Hiệu quả của quá trình thủy phân pectin vỏ chanh leo bằng enzyme................ 88
Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang ....................................................... 89
Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau khi lọc gel ............................................................... 90
Bảng 3.22 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng chất khô dịch POS trƣớc khi sấy phun .................. 92
Bảng 3.23 Ảnh hƣởng của chế độ sấy đến hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm.................... 93
Bảng 3.24 Kết quả đánh giá mức độ nhiễm của vi sinh vật sau 7 ngày bảo quản .............. 95
Bảng 3.25 Kết quả đánh giá chất lƣợng POS lỏng sau 6 tháng bảo quản ........................... 96
Bảng 3.26 Chất lƣợng của POS dạng bột sau 12 tháng bảo quản ....................................... 96
Bảng 3.27 Ảnh hƣởng của POS tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và gây hại ............. 100
Bảng 3.28 Ảnh hƣởng của POS tới sự phát triển đồng thời của vi khuẩn có lợi và có hại
........................................................................................................................................... 101
Bảng 3.29 Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS thô dạng bột ........................... 102
Bảng 3.30 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong POS thành phẩm ...... 106
Bảng 3.31 Bảng theo dõi trọng lƣợng chuột khi cho ăn POS ........................................... 108
Bảng 3.32 Xác định công thức bánh quy xốp bổ sung POS ............................................ 110

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Số cơ sở sản xuất và số lƣợng sản phẩm prebiotic ở Việt Nam............................ 5
Hình 1.2 Cấu tạo của D - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide ......................... 6
Hình 1.3 Cấu tạo của Pectic polysaccharide ......................................................................... 9
Hình 1.4 Công thức của Homogalacturonan......................................................................... 9
Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của pectinesterase ..................................................................... 12
Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của polymethylgalacturonase.................................................. 13
Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của polygalacturonase ............................................................. 13
Hình 1.8 Cơ chất và sản phẩm phân cắt của endopolygalacturonase ................................. 21
Hình 1.9 Sơ đồ qui trình chung sản xuất POS bằng pectinase .......................................... 22
Hình 1.10 Bản sắc ký TLC của dịch thủy phân polygalacturonic acid của
endopolygalacturonase từ A. kawachii. ............................................................................... 27
Hình 1.11 Sắc ký đồ dịch POS đƣợc phân tích bằng hệ thống HPAEC – PAD ................. 28
Hình 3.1 Khuẩn lạc, hệ sợi và bào tử chủng CF1 trên môi trƣờng Czapeck ...................... 49
n

Khuẩn lạc A. niger CNTP 5037 với thời gian chiếu UV khác nhau .................... 52

Hình 3.3 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng pectin đến khả năng sinh tổng hợp
endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 .............................................................. 57
Hình 3.4 Ảnh hƣởng của độ dày môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 .............................................................. 57
Hình 3.5 Ảnh hƣởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của
A. niger UV06-12-23 ........................................................................................................... 58
Hình 3.6 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp endopolygalacturonase của
A. niger UV06-12-23 ........................................................................................................... 59

Hình 3.7 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi đến khả năng sinh tổng hợp
endopolygalacturonase của A. niger UV06-12-23 .............................................................. 59
Hình 3.8 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ƣu nuôi cấy thu EPG từ A. niger UV06-12-23 .... 62
Hình 3.9 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp thu nhận đến hiệu suất thu hồi EPG ..................... 63
Hình 3.10 Sắc ký đồ tinh sạch EPG bằng cột Q-sepharose FF trên hệ thống FPLC .......... 64
Hình 3.11 Kết quả điện di SDS-PAGE protein endopolygalacturonase ............................. 65


xii

Hình 3.12 Ảnh hƣởng của pH đến hoạt độ EPG từ A. niger UV06-12-23 ......................... 66
Hình 3.13 Ảnh hƣởng của pH đến độ bền của endopolygalacturonase từ A. niger UV0612-23 và A. niger CNTP5037 .............................................................................................. 67
Hình 3.14 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ EPG từ A. niger UV06-12-23 ................. 67
Hình 3.15 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ bền của endopolygalacturonase từ A. niger
UV06-12-23 và A. niger CNTP5037 ................................................................................... 68
Hình 3.16 Ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt độ của EPG từ A. niger UV06-12-23 .... 69
Hình 3.17 Ảnh hƣởng của điều kiện tách chiết đến hiệu suất thu pectin chanh leo ........... 72
pH, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ ethanol: dịch lọc................................................................. 72
Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo ............................................... 73
Hình 3.19 Pectin vỏ chanh leo tím trƣớc và sau khi chuyển hóa ........................................ 76
Hình 3.20 Ảnh hƣởng của nồng độ pectin đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch
thủy phân pectin chanh leo .................................................................................................. 77
Hình 3.21 Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lƣợng và thành phần POS trong
dịch thủy phân pectin chanh leo .......................................................................................... 78
Hình 3.22 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy
phân pectin chanh leo .......................................................................................................... 79
Hình 3.23 Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân
pectin chanh leo ................................................................................................................... 80
Hình 3.24 Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy
phân pectin chanh leo .......................................................................................................... 82

Hình 3.25 Ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy
phân pectin chanh leo .......................................................................................................... 83
Hình 3.26 Bề mặt đáp ứng của hàm lƣợng POS ................................................................. 86
Hình 3.27 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ƣu để tạo POS và sản phẩm thủy phân giới hạn
pectin tạo POS sau khi tối ƣu ............................................................................................. 86
Hình 3.28 Bản sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân pectin chanh leo bằng EPG từ A. niger
UV06-12-23 ......................................................................................................................... 87
Hình 3.29 Các phân đoạn POS khi lọc gel và TLC sản phẩm khi tinh sạch....................... 90
Hình 3.30 Các dạng chế phẩm POS .................................................................................... 94


xiii

Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nhận các loại chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo ......... 97
Hình 3.32 Một số hình ảnh của quá trình thu nhận POS trên quy mô pilot ....................... 99
Hình 3.33 Khả năng tăng sinh của các chủng vi khuẩn có lợi thử nghiệm trong môi trƣờng
chứa các loại prebiotic khác nhau...................................................................................... 103
Hình 3.34 Điểm hoạt tính các loại prebiotic đối với các chủng vi khuẩn có lợi............... 104
Hình 3.35 Sắc ký đồ dịch POS khi ủ với enzyme tiêu hóa ............................................... 105
Hình 3.36 Sắc ký đồ HPAEC dịch thủy phân pectin chanh leo ........................................ 107
Hình 3.37 Kiểm tra thành phần POS trong bánh quy xốp ............................................... 110


-1-

MỞ ĐẦU
Trong vài thập kỷ qua, do chế độ ăn thiếu dinh dƣỡng, hút thuốc lá và uống rƣợu đã
cho thấy sự gia tăng đáng báo động về tỷ lệ bị bệnh tật và tử vong của con ngƣời. Số lƣợng
ngƣời bị mắc các căn bệnh nhƣ: bệnh béo phì mãn tính, rối loạn tiêu hóa, bệnh tiểu đƣờng,
bệnh mạch vành, ung thƣ và các bệnh do sự thoái hóa dần tăng lên. Do vậy, xu hƣớng dùng

thực phẩm chức năng không chỉ để cung cấp dinh dƣỡng thiết yếu mà đồng thời phòng
chống bệnh tật đƣợc tăng cƣờng. Điều này đã thúc đẩy mạnh nhu cầu sử dụng prebiotic và
nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới.
Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới đƣợc nghiên
cứu trong thời gian gần đây. POS là một hợp chất carbohydrate, bao gồm từ 2 – 10 đơn
phân D - galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 – 4) glucoside và có nhiều đặc
tính quý.
Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS mang tính acid tƣơng tự
nhƣ một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây
bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại
oligosaccharide trung tính. Bên cạnh đó, POS đƣợc lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi
trong đƣờng ruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe
của vật chủ, tham gia vào quá trình điều hòa trao đổi lipid, glucose, làm giảm lƣợng
glycemic và mức cholesterol trong máu, chống ung thƣ, điều biến miễn dịch, chống béo
phì, có tính kháng khuẩn và chống oxi hóa…. Với các hoạt tính sinh học có lợi nhƣ vậy,
POS đƣợc ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức năng và thức ăn chăn nuôi.
Hiện nay POS đƣợc tạo ra bởi một số phƣơng pháp nhƣ: tổng hợp hóa học, phân cắt
pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzyme thủy phân. Trong đó, phƣơng pháp sử dụng
enzyme thủy phân đƣợc coi là có hiệu quả tốt nhất do điều kiện phản ứng enzyme ở nhiệt
độ thấp, thân thiện với môi trƣờng và cƣờng lực xúc tác của enzyme mạnh.
Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) là enzyme thuộc họ pectinase, có nhiều ứng
dụng quan trọng trong công nghiệp thực phẩm. Enzyme này xúc tác thủy phân liên kết
α-(1, 4) – D – galacturonic trong phân tử pectin để tạo thành pectic oligosaccharide (POS)
và acid galacturonic. Bên cạnh đó, Việt Nam là nƣớc nông nghiệp, có các nguồn nguyên
liệu dồi dào từ phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin: vỏ cam, chanh, bƣởi, chanh leo... Vỏ
quả chanh leo chiếm khoảng 60% trọng lƣợng quả và chứa 2 – 3% pectin, là một nguồn phụ


-2-

phẩm đáng kể để thu nhận pectin. Việc chuyển hóa nguồn pectin chanh leo thành POS sẽ góp
phần gia tăng thêm giá trị của nguồn nông sản này và làm phong phú thêm một nguồn
prebiotic mới cho Việt Nam
Tuy nhiên cho tới nay, chƣa có công trình nào trong nƣớc công bố về công nghệ
thủy phân pectin tạo POS bằng enzyme. Từ những mối quan tâm trên, chúng tôi tiến hành
thực hiện luận án: “Ng iên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo
bằng endopolygalacturonase”.
 Mục tiêu nghiên cứu
- Thu nhận đƣợc nguồn endopolygalacturonase
- Xây dựng đƣợc quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo bằng phƣơng pháp
thủy phân giới hạn nhờ endopolygalacturonase.
- Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu đƣợc
trong sản xuất thực phẩm chức năng.
 Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, luận án gồm các nội dung chính sau đây:
1 - Thu nhận endopolygalacturonase
+ Phân lập và tuyển chọn chủng A. niger có khả năng sinh tổng hợp
endopolygalacturonase cao
+ Cải tạo chủng và tối ƣu hóa điều kiện sinh tổng hợp endopolygalacturonase của
chủng cải tạo
+ Thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme từ chủng cải tạo
2 - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo
+ Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo
+ Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS
+ Tách, tinh sạch và bảo quản chế phẩm POS
3 - Đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu đƣợc trong sản xuất thực
phẩm chức năng
+ Đánh giá hoạt tính sinh học
+ Đánh giá chỉ tiêu chất lƣợng, an toàn vệ sinh thực phẩm
+ Ứng dụng POS trong sản xuất bánh chức năng

-3-

 Những đóng góp mới của luận án
1 – Tạo đƣợc chủng Aspergillus niger UV06-12-23 có khả năng sinh tổng hợp
endopolygalacturonase cao góp phần làm phong phú thêm nguồn chủng giống và pectinase.
2 - Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống quá trình thủy
phân giới hạn pectin vỏ chanh leo bằng enzyme thu nhận pectic oligosaccharide (POS) và
chứng minh đƣợc khả năng tăng sinh vi khuẩn có lợi, giảm vi khuẩn có hại, đảm bảo vệ
sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS thu đƣợc, góp phần làm phong phú thêm một
nguồn prebiotic mới cho Việt Nam.


-4-

1.

TỔNG QUAN

1.1.

Prebiotic và pectic oligosaccharide

1.1.1. Prebiotic
Prebiotic là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm carbohydrate mà cơ thể vật chủ không tiêu
hóa đƣợc, chúng kích thích sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong ruột. Nhƣ
vậy, nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do đó
cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ [42].
Hiện nay, nhu cầu sử dụng prebiotic tăng dần theo từng năm dẫn tới sự phát triển

mạnh mẽ số lƣợng công ty sản xuất các chế phẩm prebiotics và nghiên cứu sản xuất các thế
hệ prebiotic mới. Năm 2006 trên thị trƣờng thế giới chỉ có 160 sản phẩm prebiotic nhƣng
hiện nay đã có hơn 400 loại từ hơn 20 công ty sản xuất. Sản lƣợng prebiotic trên toàn thế
giới đạt 167 triệu tấn năm 2008 [10].
Theo báo cáo của các nhà phân tích, thị trƣờng dành cho prebiotic ở Châu Âu và
Mỹ dự kiến đạt 1,17 tỷ và 225,31 triệu USD tƣơng ứng vào năm 2015 [135]. Nhu cầu
prebiotic trên toàn thế giới ƣớc đạt 4,5 tỷ USD trong năm 2018 và tốc độ tăng trƣởng đạt
11,4% từ năm 2012 đến 2018 [122]. Trong khi thị trƣờng châu Âu thúc đẩy ứng dụng
prebiotic vào lĩnh vực mới nhƣ thịt và các sản phẩm ăn nhẹ, thị trƣờng Mỹ tiếp tục thúc
đẩy sản xuất loại prebiotic có nguồn gốc fructans, vì đó là phân khúc sản phẩm lớn nhất
trong thị trƣờng prebiotic của Mỹ [135].
Báo cáo của GIA cũng dự đoán nhu cầu prebiotic bổ sung vào thực phẩm và đồ
uống dự kiến sẽ đạt 3,7 tỷ USD trong năm 2018 [122]. Bổ sung prebiotic vào sữa công
thức cho trẻ sơ sinh cũng là một hƣớng phát triển mạnh. Phân tích cho thấy rằng thị trƣờng
sữa công thức cho trẻ sơ sinh đƣợc dự kiến sẽ tăng trƣởng với tốc độ 11,3% từ năm 2012
đến 2018. Các ứng dụng mới nhất của prebiotic trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi đã trở
thành một thị trƣờng sinh lợi cao. Nhu cầu prebiotic cho các ứng dụng thức ăn chăn nuôi
dự kiến sẽ vƣợt qua 70.000 tấn vào năm 2018 [122].
Việc nghiên cứu phát hiện, đánh giá và thƣơng mại hóa các sản phẩm mới có những
thuộc tính ƣu việt nhƣ khả năng điều biến hệ vi sinh vật cao, giảm nguy cơ ung thƣ ruột
hiệu quả đang giành đƣợc sự quan tâm ngày một tăng của cả giới khoa học lẫn giới doanh
nghiệp.

Xylooligosaccharide

(XOS),

soya

oligosaccharide

(SOS)

và

oligosaccharides (POS) là những ví dụ đại diện cho các dòng sản phẩm dạng này.

Pectic


-5-

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nƣớc nghiên cứu và
đƣa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic. Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, Trịnh Thị
Kim Vân và Nguyễn Hoàng Anh đã thực hiện các đề tài nghiên cứu sản xuất
fructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm chức
năng [6]. Lê Thị Hồng Ánh (Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh) cũng đã áp
dụng kỹ thuật lọc pha loãng với màng lọc DS-5-DL để nâng cao độ tinh khiết của sản
phẩm FOS [4]. Nguyễn Thị Vân Anh đã nghiên cứu ứng dụng endoxylanase để sản xuất
arabinoxylan từ cám gạo làm thực phẩm chức năng [5]. Nhóm nghiên cứu của Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụng
endo-1,4-β-mannosidase từ Aspergillus niger BK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chế
phẩm đƣờng chức năng Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩm
chức năng [1]. Với các đặc tính ƣu việt của enzyme tái tổ hợp, cùng hiệu suất biểu hiện
cao, quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đã
đƣợc nghiên cứu bổ sung vào thức ăn nuôi tôm [2]….

Hình 1.1. Số cơ sở sản xuất (A) và số lượng sản phẩm prebiotic ở Việt Nam (B) [3]

Tuy nhiên với nhu cầu trong nƣớc ngày một gia tăng, sản lƣợng và chủng loại

prebiotic không đủ cung cấp cho thị trƣờng [3]. Do đó, việc nghiên cứu các sản phẩm mới
không chỉ để cung cấp dinh dƣỡng thiết yếu mà còn có thể đồng thời phòng chống bệnh tật
đƣợc khuyến khích và tăng cƣờng.
1.1.2. Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm năng
1.1.2.1. Cấu tạo
Pectic oligosaccharide là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ 2 10 đơn phân D - Galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside (hình 1.1)
[93].


-6-

Hình 1.2 Cấu tạo của D - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide

POS có phân tử lƣợng không lớn lắm và chúng có một số tính chất của một acid
hữu cơ. Chúng dễ tan trong nƣớc và khi thủy phân giải phóng các đơn phân galacturonic
acid và oligosaccharide mạch ngắn hơn. POS mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít
năng lƣợng.
1.1.2.2. Đặc tính sinh học của POS
Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy POS có tính chất của một
prebiotic nhƣ: đƣợc lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi đƣờng ruột và sản phẩm của sự
lên men này có ảnh hƣởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ [51].
Theo Olano-Martin E. và cộng sự, POS có khả năng kích thích sự tăng sinh của vi
khuẩn Bifidobacterium lactis, B. infantis, B. pseudolongum, B. adolescentis, Lactobacillus
casei shirota, L. acidophilus, L. casei subsp cremoiris LC5, làm giảm sự phát triển của vi
khuẩn Bacteroides distasonis, B. ovatus, B. fragilis, Clostridium perfringens, Enterococcus
faecalis và ức chế sự sinh trƣởng của Bacteroides thetaiotaomincrom, Clostridium
ramosum, C. inocuum [92]. POS kích thƣớc nhỏ (DP<5) có khả năng tăng sinh số lƣợng vi
khuẩn có lợi, giảm số lƣợng vi khuẩn Clostridia [110]. POS tạo bởi quá trình thủy phân
pectin bằng endopolygalacturonase có DP 2 – 7 có thể đƣợc sử dụng dễ dàng bởi các vi
sinh vật có lợi đƣờng ruột và ức chế E. coli [70]. Digalacturonic acid và trigalacturonic

acid (POS có DP = 2 và 3) có khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic
Lactobacillus plantarum, ngăn cản sự bám dính của E. coli vào tế bào biểu mô ruột ngƣời
[58, 111].
Thử nghiệm trên các tình nguyện viên trong giai đoạn đầu nhiễm HIV-1 uống một
hỗn hợp của prebiotic oligosaccharides (GOS, FOS, POS) cho thấy có sự thay đổi hệ vi
sinh vật đƣờng ruột nhƣ tăng số lƣợng Bifidobacteria và giảm số lƣợng vi khuẩn gây bệnh
Clostridium lituseburense/ Clostridium histolyticum [44].
Ngoài ra, mức độ methyl hóa của pectin đóng một vai trò quan trọng quyết định các
tính chất lên men POS. POS có mức methyl hóa thấp đƣợc lên men bởi vi khuẩn tốt hơn
POS có mức methyl hóa cao [33, 93].


-7-

POS là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên mang tính acid tƣơng tự
nhƣ một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây
bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại
oligosaccharide trung tính, ví dụ digalacturonic acid ngăn ngừa sự bám dính của các tế bào
vi khuẩn E. coli trong điều kiện in vitro [51]. Đây sẽ là một lợi thế cho dòng sản phẩm này
để tăng cƣờng hiệu quả cho các loại sữa bột trẻ em khi chúng đƣợc bổ sung cùng với các
prebiotic trung tính thông dụng khác nhƣ FOS, GOS, MOS...
Thử nghiệm bổ sung 15 – 25% POS vào sữa của trẻ sơ sinh cho thấy POS giúp trẻ
tiêu hóa tốt hơn, hệ vi sinh đƣờng ruột thay đổi và hạ thấp pH phân [36, 73]. Năm 2010,
Westerbeek E.A.M. đã thử nghiệm bổ sung hỗn hợp 80% GOS/FOS và 20% POS với hàm
lƣợng 1,5 g/kg/ngày cho 113 trẻ sơ sinh. Kết quả cho thấy những trẻ này có khả năng hấp
thụ và tiêu hóa tốt hơn, giảm mắc các bệnh do nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa hơn nhóm đối
chứng [127]. Vì vậy, POS có thể sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm sữa cũng nhƣ các
loại sản phẩm thực phẩm khác.
Một số nghiên cứu ảnh hƣởng của POS in vivo và in vitro khác cũng đã đƣợc tiến
hành. Kết quả cho thấy POS ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất, tăng trƣởng của vi

khuẩn trong ruột kết, giảm nguy cơ ung thƣ, điều hòa hệ thống miễn dịch và giảm
cholesterol [90, 104].
Olano - Martin E. và cộng sự cũng cho thấy rằng POS có vai trò bảo vệ bằng cách
ức chế độc tố Shiga tiết ra bởi E. coli O157: H7 [95]. Ngoài ra, một số tác dụng chống ung
thƣ đã đƣợc báo cáo. POS có khả năng thúc đẩy quá trình apoptosis của các tế bào ung thƣ
tuyến HT-29 [94]. Các kiểm tra trên dòng tế bào tủy và các tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt
cũng cho thấy tác dụng này [95].
POS làm tăng miễn dịch của cơ thể khi kết hợp với GOS và FOS [124]; bảo vệ cơ thể
chống lại bệnh tim mạch, giảm thiệt hại do kim loại nặng, chống béo phì, chống độc, kháng
khuẩn và chống oxy hóa [69].
POS mang điện tích âm do đó có thể kết hợp với các oligosaccharide điện tích dƣơng
khác nhƣ chitosan oligosaccharide để tạo ra sự tƣơng tác tĩnh điện ứng dụng trong sản xuất
màng y tế, túi phân hủy sinh học hoặc trong điều trị vết thƣơng [28]….
POS có độ nhớt thấp nên thuận lợi trong việc bổ sung vào thực phẩm, ví dụ nhƣ kết
cấu của sữa chua có thể đƣợc cải thiện. Do độ nhớt thấp nên POS cũng có thể đƣợc sử
dụng nhƣ là chất giữ ẩm.


-8-

Ngoài ra, POS ít ngọt hơn đƣờng saccharose và hàm lƣợng calo thấp nên có thể đƣợc
sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cần độ ngọt thấp và ít béo [28].

1.2.

Cơ c ất pectin

1.2.1. Cấu tạo
Pectin là một polysaccharide mạch thẳng do các acid galacturonic liên kết với nhau
theo liên kết α (1 – 4) glucoside. Ngoài ra, trong phân tử pectin có chứa một số các gốc

đƣờng khác nhƣ L – rhamnose, D – galactose, D – xylose và L – arabinose.
Pectin có nguồn gốc từ thực vật, có nhiều trong vỏ quả táo, cam, chanh, quýt, mận,
đào và thân, lá cây,... (bảng 1.1). Pectin có mặt trong thành tế bào của tất cả các thực vật
bậc cao và chiếm khoảng 22 – 35% khối lƣợng khô của tế bào.
Bảng 1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [27]
Trái cây

àm lƣợng pectin (% trọng lƣợng tƣơi)

Táo (Malus spp.)

0,5 - 1,6

Bã táo

1,5 - 2,5

Bột củ cải đƣờng (Beta vulgaris)
Cà rốt (Daucus carota)
Ổi (Psidium guajava)
Bột chanh (Citrus lemon)
Vải (Litchi chinesis)

1,0
0,2 - 0,5
0,77 - 0,99
2,5 - 4,0
0,42

Xoài (Mangifera indica)

0,26 - 0,42

Vỏ cam (Citrus sinensis)

3,5 - 5,5

Đu đủ (Carcia papaya)

0,66 - 1,0

Chanh leo (Passiflora edulis)

0,5

Cà chua (Lycopersicon esculentum)

0,2 - 0,6

Chuối (Musa acuminata)

0,7 - 1,2

Khế (Averrhoa carambola)

0,66

Vỏ trắng chanh leo

2,1 - 3,0

Đào (Prunus persica)

0,1 - 0,9

Dứa (Ananas comosus)
Dâu tây (Fragaria ananassa)
Me (Tamarindus indica)

0,04 - 0,13
0,6 - 0,7
1,71

Phân tử lƣợng của các loại pectin tách từ các nguồn khác nhau thay đổi trong giới
hạn rộng. Ví dụ từ táo, mận pectin có phân tử lƣợng từ 25.000 – 35.000 g/mol, từ cam phân
tử lƣợng đạt tới 50.000 g/mol.


-9-

Pectin là thành phần vô cùng phức tạp và gồm có ba loại chính: Homogalacturonan
(HGA) và Rhamnogalacturonan (RG) I và II. Sơ đồ minh họa các cấu trúc của HGA và
RG-I đƣợc đƣa ra trong hình 1.3.

Hình 1.3 Cấu tạo của Pectic polysaccharide

Trong đó, homogalacturonan là thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có mặt ở nhiều loại
thực vật nên đƣợc nghiên cứu sâu và rộng hơn các thành phần khác.
Homogalacturonan: là chuỗi bao gồm các phân tử D-galacturonic acid (galA) nối
với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside và thƣờng bao gồm 100 – 200 gốc galA (hình

1.4). HGA đƣợc tổng hợp trong bộ máy Gongi sau đó đƣợc đƣa vào thành tế bào, ở đó có
khoảng 70 - 80% các gốc galA đƣợc methyl este hóa ở cacboxyl C-6. Sự dịch chuyển của
các nhóm methyl este bên trong thành tế bào dẫn đến kết quả HGA có khả năng liên kết
chéo bởi Ca2+ và hình thành các tập hợp và các gel đại phân tử. Các gốc trong HGA có thể
O-acetyl hóa chủ yếu ở đầu C-3 nhƣng cũng có thể xảy ra ở C-2. Galactose của HGA có
thể đƣợc thay thế ở vị trí C-3 với các gốc đƣờng xylose tạo thành xylogalacturonan (XGA)
có nhiều ở vỏ hạt đậu, pectin táo, dừa và cà rốt. GalA cũng có thể đƣợc thay thế bởi apiose
ở vị trí C-2 hoặc C-3 tạo ra apiogalacturonan (trong bèo tấm Lemna minor và Spiodela
polyrhise). Các dạng cấu trúc này có thể làm thay đổi các tính chất chức năng của dạng
HGA.

Hình 1.4 Công thức của Homogalacturonan


-10-

Rhamnogalacturonan I: cấu tạo từ mạch thẳng là do acid galacturonic và rhamnose
liên kết với nhau: αDGalpA(1 - 2) - αLRHap(1 - 4) với các mạch bên là các phân tử đƣờng
trung tính nhƣ arabinan, galactan và các phân tử acid galacturonic bị acetyl hóa hoặc
methyl este hóa.
Rhamnogalacturonan II: là thành phần phức tạp nhất của pectic polysaccharides.
RG-II đƣợc cấu tạo chuỗi mạch thẳng là sự lặp lại của liên kết α(1 - 4) DGalpA nhƣ
Homogalacturonan, nhƣng mạch bên chứa rất nhiều phân tử đƣờng rhamnose và các phân
tử khác nhƣ: apiose, 2-O-methylxylose, 2-O-methylfucose, 2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic.
Acid polygalacturonic đƣợc este hóa từng phần với các gốc methyl và các nhóm
acid tự do có thể đƣợc trung hòa từng phần hoặc toàn bộ với các ion Na+, K+ hoặc NH4+.
Tỷ lệ các nhóm acid galacturonic đƣợc este hóa so với tổng số acid galacturonic
đƣợc gọi là mức độ este hóa, ký hiệu là DE (Degree of esterication). Mức độ este hóa ảnh
hƣởng lớn đến các tính chất của pectin, đặc biệt là tính hòa tan và khả năng tạo gel.
Khả năng este hóa của pectin chia làm 2 nhóm:

- Pectin este methyl hóa cao: (high methyl este - HM) với số gốc acid của pectin
đƣợc methyl hóa lớn hơn 50%.
- Pectin este methyl hóa thấp: (low methyl este - LM) với số gốc acid của pectin
đƣợc methyl hóa nhỏ hơn 50%.
Khả năng este hóa cao nhất có thể đạt đƣợc ở các dịch chiết nguyên liệu thô tự
nhiên khoảng 75%.
Pectin đƣợc xem là một trong những phụ gia thực phẩm an toàn và đƣợc chấp nhận
nhiều nhất [82]. Theo số liệu thống kê năm 2003, tổng tiêu thụ pectin trên toàn cầu là
khoảng 30.000 tấn/năm với tỉ lệ tăng trƣởng 6%. Pectin đƣợc ứng dụng vào các lĩnh vực
nhƣ chế biến quả (15 - 20%), sản xuất sữa và sữa chua (15 - 20%), công nghiệp sản xuất
bánh kẹo (5%), phụ gia thay thế chất béo (20%). Trong công nghiệp chế biến thực phẩm
pectin đƣợc sử dụng làm chất tạo gel cho mứt quả, chất ổn định trạng thái huyền phù trong
sản xuất đồ uống,... Trong dƣợc phẩm, pectin là một loại chất xơ hòa tan trong nƣớc.
Pectin không cung cấp năng lƣợng nhƣng có nhiều giá trị phòng và chữa bệnh nhƣ kéo dài
thời gian tiêu hóa thức ăn trong ruột, có tác dụng tăng hấp thu dƣỡng chất trong thức ăn,
giảm hấp thu lipid, chống táo bón và giảm béo [101].
Mặc dù có nhiều ƣu điểm nhƣ trên nhƣng do pectin có khối lƣợng phân tử lớn
(khoảng 200 kDa, tƣơng đƣơng 800 đơn vị đƣờng đơn) nên thƣờng khó hòa tan, có độ nhớt
cao hoặc dễ gây kết tụ trong một số sản phẩm chứa protein và môi trƣờng pH thấp nhƣ sản


-11-

phẩm sữa chua uống. Do vậy, pectin đã đƣợc chuyển hóa thành những mảnh phân tử có
khối lƣợng thấp hơn, cải thiện đƣợc độ hòa tan, giảm độ nhớt và đƣợc bổ sung vào một số
thực phẩm nhƣ những chất ổn định hoặc sợi thực phẩm (ví dụ các dòng sản phẩm pectin
với tên thƣơng mại GRINDSTED®Pectin của hãng Danisco).
1.2.2. Pectin từ vỏ chanh leo
Chanh leo (chanh dây) là cây leo thân gỗ, thuộc họ Passifloraceae và có nguồn gốc
từ Brazil. Chanh leo vào Việt Nam có hai giống, phân biệt bằng xuất xứ và màu vỏ. Giống

chanh leo vỏ vàng có nguồn gốc từ Sirilanca, Urganda và Hawaii có mặt ở Việt Nam với
tên gọi là chanh dây hay lạc tiên. Giống chanh leo vỏ tím có nguồn gốc từ Australia và Đài
Loan, có tên khoa học là Passiflora edulis, trong đó thịt quả chỉ chiếm 50%, vỏ quả chiếm
50% [102]. Trong vỏ quả chanh leo, hàm lƣợng pectin chiếm khoảng 2 - 3% [27]. Chanh
leo đƣợc trồng nhiều ở các tỉnh phía nam nhƣ trên địa bàn tỉnh Đăk Nông diện tích trồng
khoảng 2.000 ha, ở Đăk Lăk cũng vào khoảng 300 ha. Vài năm gần đây diện tích trồng loại
cây này cũng tăng nhanh ở một số tỉnh phía bắc nhƣ Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An với
năng suất đạt từ 40 - 50 tấn/ha [7]. Nhiều cơ sở sản xuất, chế biến loại quả này đã đƣợc xây
dựng cung cấp cho thị trƣờng trong và ngoài nƣớc những sản phẩm nhƣ nƣớc chanh leo cô
đặc, pure lạc tiên hoặc nƣớc lạc tiên,...Ví dụ ở Đăk Nông có 8 cơ sở sơ chế, đáp ứng nhu
cầu tiêu thụ khoảng 50 tấn chanh leo tƣơi/ngày cho hai Công ty cung ứng giống là Chia
Meei (Đài Loan) và Trƣờng Hoàng (Lâm Đồng). Do vậy, nguồn vỏ quả thải ra từ quá trình
chế biến này là rất lớn và khá tập trung đảm bảo cho việc tận thu nguồn pectin từ nguồn
phụ phẩm này phục vụ cho sản xuất pectic oligosaccharide (POS).
Pectin từ chanh leo đã đƣợc tách chiết từ rất sớm (năm 1949 với vỏ chanh leo tím
và năm 1953 đối với chanh leo vàng). Phân tích thành phần của vỏ chanh leo vàng và tím
cho thấy chúng đều chứa hàm lƣợng carbohydrate cao và lƣợng protein thấp [129, 130].
Báo cáo năm 2008 của Pinheiro E.R. và cộng sự về thành phần vỏ chanh leo (bảng 1.2)
hàm lƣợng chất xơ hòa tan trong vỏ chanh leo chiếm lƣợng rất lớn 19,2% khối lƣợng khô,
do đó từ vỏ chanh leo có thể thu đƣợc hàm lƣợng pectin lớn.


-12Bảng 1.2 Thành phần của vỏ chanh leo [102]

Thành phần

àm lƣợng (% khối lƣợng khô)

Ẩm

9,93 ± 0,12

Tro

7,52 ± 0,02

Protein

4,05 ± 0,61

Lipid

< 0,10

Chất xơ hoà tan

19,20 ± 0,02

Chất xơ không hoà tan

38,05 ± 0,02

Carbonhydrate

21,28 ± 0,44

Tinh bột

0,75 - 1,36

1.2.3. Enzyme thủy phân pectin
Enzyme phân cắt pectin hay pectinase là một họ bao gồm các enzyme:
pectinesterase,

polygalacturonase và transelimilase. Trong số đó, pectinesterase

và

polygalacturonase là những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng.
- Pectinesterase (PE) (EC 3.1.1.11)
Pectinesterase hay còn đƣợc gọi với một số tên khác nhƣ pectin methylesterase,
pectase, pectin methoxylase và pectin demethoxylase, thuộc nhóm enzyme thủy phân.
Pectinesterase xúc tác quá trình thủy phân liên kết este để tách nhóm methoxyl (OCH3)
trong phân tử pectin, giải phóng ra methanol và acid pectic (hình 1.4). Pectinesterase đƣợc
ứng dụng làm trong nƣớc quả trong sản xuất rƣợu vang, sâm panh.

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của pectinesterase