NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG một số HOẠT CHẤT THUỐC KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ kế HỒNG NGOẠI gần và TRUNG BÌNH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
.....o0o…..

Vũ Thị Huệ
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT THUỐC
KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHỔ KẾ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------

Vũ Thị Huệ
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT THUỐC
KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHỔ KẾ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Tạ Thị
Thảo đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị
máy móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã
số 39/2014/HD- NĐT.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân cùng các
thầy cô, cán bộ trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị em học viên K23
chuyên ngành Hóa phân tích đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều trong
suốt quá trình nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 16 tháng 6 năm 2015
Học viên

Vũ Thị Huệ


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Mục Lục
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam………….2
1.1.1. Định nghĩa về thuốc giả ............................................................................ 2
1.1.2. Hiện trạng sử dụng thuốc giả .................................................................... 2
1.2. Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid…………………………….3

1.2.1. Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid .................................................................. 3
1.2.2. Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid ........................................................... 4
1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid ........................................... 6
1.2.4. Phân loại sulfamid..................................................................................... 6
1.2.5. Dược động học .......................................................................................... 7
1.2.6. Độc tính của sulfamid ............................................................................... 7
1.2.7. Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim............. 8
1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid.............10
1.3.1. Phương pháp định tính sulfamid ............................................................. 10
1.3.2. Phương pháp định lượng ......................................................................... 11
1.3.1.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích ........................................................ 11
1.3.1.2. Phương pháp trắc quang .................................................................. 12
1.3.1.3. Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến .... 12
1.3.1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................... 13
1.4. Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật
toán hồi quy đa biến..............................................................................................14
1.4.1. Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại .................................... 14
1.4.1.1. Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại ............. 14
1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại ......................................... 14
1.4.1.3. Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại .............................................. 16
1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại ................... 16
1.4.1.5. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại ........................... 17

Chuyên ngành hóa phân tích

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

1.4.1.6. Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại ....................... 18
1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung
bình kết hợp với chemometrics ......................................................................... 19
1.4.2.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến ........................... 19
1.4.2.2. Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng
ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ...................... 27
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM................................................................................ 30
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu……………………………………...30
2.1.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 30
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 30
2.2. Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid.............................32
2.2.1. Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin .................................... 32
2.2.2. Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim ... 32
2.3. Hóa chất và thiết bị…………………………………………………………34
2.3.1. Hóa chất .................................................................................................. 34
2.3.2. Thiết bị và phần mềm máy tính .............................................................. 34
2.4. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến......................35
2.4.1. Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS) ...................... 35
2.4.2. Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo ( ILS) .......................... 36
2.4.3. Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS) ............................ 37
2.4.4. Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) ............................................... 38
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 41
3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol
và trimethoprim trong cùng hỗn hợp....................................................................41
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của các hoạt chất .................................................. 41
3.1.2. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu / KBr ...................................................... 44
3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên ................................................ 44
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược ...................................................... 45

Chuyên ngành hóa phân tích

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

3.2. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng từng hoạt chất nhóm
sulfamid khi có mặt các tá dược………………………………………………...48
3.2.1. Xây dựng mô hình hồi quy đa biến gồm hoạt chất sulfaguanidin và các
tá dược………………………………………………………………………..48
3.2.2. Đánh giá phương pháp phân tích sulfaguanidin ..................................... 50
3.3. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính PCR xác định đồng thời
sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim……………………………….58
3.3.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn đa biến xác định sulfaguanidin,
sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp PCR.............................. 58
3.3.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy đa biến ...................... 61
3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi
quy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP và tá dược .................. 64
3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế……………………………………………65
3.4.1. Phương pháp xác định một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm
Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình ................. 66
3.4.1.1. Định tính mẫu thực tế ...................................................................... 66
3.4.2. Định lượng mẫu thực tế .......................................................................... 72
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN ...................................................................................... 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………83

Chuyên ngành hóa phân tích

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin trên hai loại thiết bị khảo sát .............41
Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol tren hai thiết bị khảo sát ...............42
Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim trên hai loại thiết bị khảo sát .............42
Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của ba hoạt chất Sulfaguanidin, sulfamethoxazol và
trimethoprim ............................................................................................43
Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của Canxiphosphat ..........................................................46
Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của Tinh bột sắn ..............................................................46
Hình 3.7: Phổ hồng ngoại của Maltodextrin .............................................................46
Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie Stearat............................................................47
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talcum ......................................................................47
Hình 3.10: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 25 mẫu
chuẩn ........................................................................................................54
Hình 3.11: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 30 mẫu
chuẩn ........................................................................................................60
Hình 3.12: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin .........................................................66
Hình 3.13: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol .....................................................66
Hình 3.14: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim .........................................................67
Hình 3.15: Kết quả định tính mẫu tự tạo ...................................................................67
Hình 3.16: Kết quả định tính mẫu thực tế S1 ............................................................68

Hình 3.17: Kết quả định tính mẫu thực tế S2 ............................................................68
Hình 3.18: Kết quả định tính mẫu thực tế S3 ............................................................69
Hình 3.19: Kết quả định tính mẫu thực tế S4 ............................................................69
Hình 3.20: Kết quả định tính mẫu thực tế ST1 .........................................................70
Hình 3.21: Kết quả định tính mẫu thực tế ST2 .........................................................70
Hình 3.22: Kết quả định tính mẫu thực tế ST3 .........................................................71
Hình 3.23: Kết quả định tính mẫu thực tế ST4 .........................................................71

Chuyên ngành hóa phân tích

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến ......................................5
Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang
tại các số sóng đặc trưng ..........................................................................44
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các lần ép viên ......................................45
Bảng 3.3: Ma trận hàm lượng bốn cấu tử SFT, Tbot, Malt, Ca3(PO4)2 trong hỗn hợp .......49
Bảng 3.4: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, Tbot, Ca3(PO4)2 và Malt để
đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy .....................................50
Bảng 3.5: Hàm lượng SFG tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra ....................51
Bảng 3.6: Hàm lượng Tbot tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra ....................52
Bảng 3.7: Hàm lượng Ca3(PO4)2 tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra ...........52
Bảng 3.8: Hàm lượng Malt tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra ....................53

Bảng 3.9: Hàm lượng SFG và ba tá dược tìm được trong hỗn hợp các mẫu kiểm tra
.................................................................................................................56
Bảng 3.10: Hàm lượng SFG và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm
tra theo phương pháp PCR.......................................................................57
Bảng 3.11: Ma trận chuẩn hàm lượng bốn cấu tử SFG, SFM, TMP và tá dược trong
hỗn hợp ....................................................................................................59
Bảng 3.12: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, SFM, TMP và tá dược để
đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy .....................................62
Bảng 3.13: Hàm lượng SFT, SFM, TMP và tổng tá dược tìm được trong các hỗn
hợp mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR ..............................................63
Bảng 3.14: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng
thời SFG, SFM, TMP và tá dược.............................................................65
Bảng 3.15: Mẫu thực tế .............................................................................................65
Bảng 3.16: Khối lượng bột viên và tá dược tinh bột trộn thêm vào các mẫu ...........73
Bảng 3.17: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế...........................74
Bảng 3.18: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế ............74

Chuyên ngành hóa phân tích

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

BẢNG KÍ HIỆU NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Bình phương tối thiểu thông thường
(classical least square)

CLS

Bình phương tối thiểu nghịch đảo
(inverse least square)

ILS

Bình phương tối thiểu từng phần
(partial least square)

PLS

Cấu tử chính (Principal component)

PC

Dược điển Anh 2009

BP 2009

Dược điển Mỹ 34

USP 34

Dược điển Việt Nam 4

DĐVN 4

Khối lượng trung bình viên

KLTB

Hồi qui cấu tử chính (principal
component regression)
Maltodextrin

PCR

Sulfaguanidin

SFG

Sulfamethoxazol

SFM

Tinh bột

Tbot

Trimethoprim

TMP

Malt

 Ghi chú: Trong luận văn này chúng tôi sử dụng các tên hóa chất và hoạt
chất theo quy định trong Dược điển Việt Nam 4 [1]

Chuyên ngành hóa phân tích

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

MỞ ĐẦU
Từ xưa đến nay, việc sử dụng thuốc trong phòng, chữa bệnh và tăng cường
sức khỏe đã trở thành nhu cầu tất yếu quan trọng đối với đời sống con người. Cùng
với sự tiến bộ và phát triển của xã hội loài người các loại mặt hàng thuốc được
nghiên cứu, sản xuất và đưa ra thị trường cũng ngày một phong phú và đa dạng.
Tuy nhiên bên cạnh các loại thuốc chính hãng đảm bảo chất lượng thì trên thị
trường thuốc cũng tồn tại không ít các mặt hàng thuốc giả, thuốc kém chất lượng
của một bộ phận các cá nhân hay doanh nghiệp đưa ra thị trường vì mục đích trục
lợi. Việc kiểm soát chất lượng của các loại mặt hàng này thường đòi hỏi thời gian
dài với nhiều công đoạn phức tạp và chi phí kiểm định khá cao. Vì vậy ngày nay thế
giới đang có xu hướng tìm kiếm những phương pháp và thiết bị cho phép kiểm định
nhanh thuốc đang lưu thông trên thị trường.
So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất bằng phương pháp quang
phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm đơn giản trong quá trình tiền xử lý
mẫu, phân tích trực tiếp mẫu rắn nhanh, giá thành rẻ do không tốn dung môi và nếu
kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến thì không phải tách riêng các chất trước khi
phân tích nên có thể phân tích đồng thời các thuốc trong cùng nhóm thuốc. Đây
chính là lí do chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất
thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần
và trung bình”. Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa
Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ

hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến
tính để kiểm định nhanh chất lượng thuốc. Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định
xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh
trong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng
tính thời sự của công tác giám định chất lượng.

Chuyên ngành hóa phân tích

1

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam

1.1.1. Định nghĩa về thuốc giả
Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thuốc giả là sản phẩm
được sản xuất và dán nhãn dưới dạng thuốc với ý đồ lừa đảo về nguồn gốc và lai
lịch sản phẩm. Các sản phẩm giả mạo có thể có dược chất sai hoặc không có dược
chất, không đủ lượng dược chất hoặc bao gói giả mạo [38].
Theo định nghĩa của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA):
Thuốc giả bao gồm bất kỳ dược phẩm nhái hoặc kém chất lượng nào không đáp ứng
được tiêu chuẩn của FDA nhưng cố tình che giấu sự thật [36]. Thuốc giả có thể có

một hoặc nhiều hay tất cả các yếu tố sau:
-

Quá mạnh hoặc quá yếu.

-

Thiếu các thành phần chính.

-

Được sản xuất từ các thành phần nguy hiểm.

-

Nhiễm chất lạ, thậm chí có chất độc.

-

Được sản xuất trong điều kiện mất vệ sinh hoặc không vô trùng.

-

Được tạo ra theo các tiêu chuẩn không an toàn.

-

Được dán nhãn, cất giữ hay bảo quản không đúng cách.

-

Quá hạn sử dụng (hết hạn).

1.1.2. Hiện trạng sử dụng thuốc giả
Theo thống kê của WHO, đã có sự bùng nổ thuốc giả trên phạm vi toàn cầu.
Thuốc giả chiếm tới 10% thị trường dược phẩm thế giới với doanh thu 45 tỉ
euro/năm, trung bình mỗi năm có khoảng 200.000 người tử vong do thuốc giả [35].
Tại Việt Nam, theo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, năm 2011, trong
số hơn 31.000 mẫu thuốc được kiểm tra gần đây thì đã có hơn 1.000 mẫu không đạt
tiêu chuẩn chất lượng như nhiễm khuẩn, không đủ độ hòa tan, không đủ định lượng.
Nguồn tin từ Bộ Y tế cũng cho biết, trong hơn 10 ngày đầu tháng 2/2012, hầu như
ngày nào Bộ cũng phát hiện thuốc giả, thuốc kém chất lượng.[3]
Chuyên ngành hóa phân tích

2

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Các thuốc giả, thuốc nhái có thể chứa bất cứ thành phần nào từ phấn bảng,
bê-tông nghiền, acid boric hoặc những gì tệ hơn thế và được bán như thuốc thật.
Thuốc giả không chỉ đánh lừa người tiêu dùng, chúng còn vô hiệu hóa các liệu pháp
điều trị để cứu sống bệnh nhân. Trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại
to lớn như gây ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh
nhân dễ kháng thuốc [23]. Tuy nhiên, việc phát hiện thuốc giả lưu thông trên thị
trường gặp rất nhiều khó khăn. Thông thường, do doanh số bán (lượng tiêu thụ) của

một mặt hàng thuốc nào đó giảm nghiêm trọng, nhà sản xuất hoặc nhà phân phối
hàng chính hãng mới đặt vấn đề với cơ quan chức năng về hiện tượng làm giả thuốc
này và khi đó cơ quan chức năng mới tiến hành xác minh (kiểm tra đột xuất tại các
cơ sở sản xuất kinh doanh; niêm phong mẫu và đem phân tích theo các phương
pháp tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm, rồi đưa ra kết luận) [3]. Quá trình này
thường rất tốn kém và mất thời gian, do đó đòi hỏi cần phải nghiên cứu tìm ra một
phương pháp kiểm nghiệm mới, nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm để kiểm định
nhanh được chất lượng thuốc ngoài hiện trường.
1.2.

Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

1.2.1. Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid
Ngay từ những năm đầu thế kỉ các nhà khoa học nhận thấy rằng các phẩm
nhuộm có tác dụng kháng khuẩn, tuy nhiên các phẩm nhuộm thường rất độc. Trong
những cố gắng tìm những thuốc kháng khuẩn trên cơ sở các thuốc nhuộm năm
1913, người ta đã tìm thấy phẩm azoic cryzoidin có tác dụng diệt khuẩn và tương
đối ít độc [28]. Đồng thời khi thêm nhóm –SO2NH2 các phẩm nhuộm thường rất
bền vì gắn chặt vào protein, vì vậy người ta cũng gắn thêm vào phân tử cryzoidin
nhóm sulfamido, kết quả là cho một chất có khả năng chống tụ cầu và liên cầu
prontosil. Đây là chất kháng khuẩn đầu tiên thu được bằng phương pháp tổng hợp
toàn phần. Prontosil khó tan trong nước nên người ta thêm vào đó nhóm COOH từ
đó có thể tạo muối dễ tan. Năm 1935, Domagk, Trefouel và Levaditikhisi dùng
prontosil kháng khuẩn thì nhận thấy: mặc dù có kết quả tốt trên liên cầu trên in vivo
nhưng lại không có tác dụng trên in vitro, như vậy có thể khi vào cơ thể, prontosil
Chuyên ngành hóa phân tích

3

Trường ĐHKHTN

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

đã chuyển hóa thành chất khác có tác dụng kháng khuẩn [15]. Khi phân tích công
thức của prontosil ta thấy đó là các azoic được điều chế bằng cách diazo hóa pamino benzene sulfonamid(sulfanilamid) ngưng tụ với m-phenylendiamin. Khi thay
m-phenylendiamin bằng các amin hoặc các phenol khác chúng ta thu được các dẫn
chất có tác dụng kháng khuẩn nhưng khi thay sulfanilamid bằng các anilin khác
nhau thì thu được các chất không có tác dụng kháng khuẩn. Như vậy, có thể các
sulfanilamid là phần có tác dụng kháng khuẩn. Thật vậy, khi thử tác dụng của
sulfanilamid cho thấy có tác dụng kháng khuẩn tốt. Khi kiểm tra nước tiểu của
người uống prontosil thấy có mặt sulfanilamid dưới dạng acetyl hóa. [6, 13]
Sulfanilamid đã trở thành sulfamid đầu tiên trong lịch sử. Việc phát hiện ra
prontosil và sulfanilamid đã mở ra một kỉ nguyên mới cho việc hóa trị liệu các bệnh
nhiễm khuẩn. Dựa trên cấu trúc của sulfanilamid người ta đã tổng hợp rất nhiều
sulfamid, trong đó có khoảng 40 loại được sử dụng làm thuốc. Ngày nay, việc ra đời
của các kháng sinh có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh nên các sulfamid được sử
dụng ít hơn. Tuy nhiên việc sử dụng các sulfamid có ưu điểm:
 Có thể sản xuất lớn, giá thành rẻ
 Nhiều sulfamid có tác dụng khác: lợi tiểu, hạ đường huyết
 Các tác dụng phụ của sulfamid đã được khắc phục tốt
1.2.2. Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid
Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid, có
công thức cấu tạo chung là:
R2

HN

SO2

NH

R1

Trong đó thường gặp R2 là H, và cũng chỉ khi R2 là H thì sulfamid mới có
hoạt tính kháng khuẩn, khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng,
dị vòng. Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông
thường là các dị vòng 2 – 3 dị tố. Khi R1 và R2 đều là gốc hidro thì thu được
sulfamid là có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid) [6].

Chuyên ngành hóa phân tích

4

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Sulfamid có công thức cấu tạo gần giống với PABA (para amino benzoic
acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng hợp acid folic để phát triển.
Do đó sulfamid tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vi
khuẩn. Ngoài ra, sulfamid còn ức chế dihydrofolat synthetase, một enzym tham gia
tổng hợp acid folic. Về mặt lý thuyết, phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, gồm
hầu hết các cầu khuẩn, trực khuẩn gram (+) và (-). Hiện nay, tỷ lệ kháng thuốc và
kháng chéo giữa các sulfamid đang rất cao nên đã hạn chế việc sử dụng sulfamid rất

nhiều. Mặt khác do có nhiều độc tính và đã có kháng sinh thay thế, sulfamid ngày
càng ít dùng một mình, thường dùng dạng phối hợp sulfamethoxazol với
trimethoprim để tăng khả năng điều trị của thuốc. Dưới đây là công thức cấu tạo của
một số sulfamid phổ biến
Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến
Tên

Công thức

R1

R2
NH2

Sulfaguanidin

C7H10N4O2S

-H
NH
N

Sulfadiazin

C10H10N4O2S

-H
N

CH3

Sulfamethoxazol

C10H11N3O3S

-H
O
N

N
N

Sulfadoxin

C12H14N4O4S

-H
H3OC

Chuyên ngành hóa phân tích

5

OCH3

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid


Tính chất vật lý
Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, không

mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform. Sulfamid tan trong dung dịch
acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [6]. Các sulfamid có các
thông số xác định về: độ chảy, phổ IR, phổ UV (do có chứa nhân thơm).


Tính chất hóa học
Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: [6]

-

Tính acid (trừ sulfaguanidin): do có H ở N- amid linh động

-

Tính bazơ: Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung
dịch acid.
Các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá do có nhóm amin thơm tự

do (có thể tham gia phản ứng ghép đôi với 2-naphtol/kiềm để cho sản phẩm màu đỏ
da cam).
Tác dụng với một số muối kim loại (CuSO4, CoCl2) tạo thành phức màu tủa
với Cu2+, Co2+ đặc trưng cho từng sulfamid, nên thường được dùng để phân biệt các

sulfamid với nhau. Đốt khô trong ống nghiệm, sulfamid bị phân huỷ, để lại cặn có
màu điển hình cho từng sulfamid, ví dụ, đốt sunfanilamid sẽ giải phóng ammoniac
và cho cặn màu xanh tím.
1.2.4. Phân loại sulfamid
Sulfamid là một trong những kháng sinh tổng hợp đầu tiên được loài người
phát hiện và sử dụng. Việc tìm thấy sulfamid đã mở ra một kỷ nguyên mới của các
thuốc chống nhiễm khuẩn trước khi có penicilin. Khi phân loại kháng sinh theo tác
dụng, nhóm sulfamid được xếp vào nhóm các loại kháng sinh có tác dụng kìm
khuẩn. Do tác dụng của sulfamid đều giống nhau, việc điều trị dựa vào dược động
học của thuốc cho nên người ta chia các sulfamid làm 4 loại: Loại hấp thu nhanh,
thải trừ nhanh: nồng độ tối đa trong máu sau uống là 2 - 4h. t1/2 =6-8h, thải trừ 95%
trong 24h. Dùng điều trị nhiễm khuẩn theo đường máu như sulfadiazin, sulfisoxazol
(Gantrisin), sulfamethoxazol (Gantazol). Loại hấp thu rất ít: dùng chữa viêm ruột,
Chuyên ngành hóa phân tích

6

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

viêm loét đại tràng như sufaguanidin (Ganidan). Loại thải trừ chậm: duy trì được
nồng độ điều trị trong máu lâu, t1/2 có thể tới 7 - 9 ngày nên chỉ cần uống 1 lần/ngày.
Hiện dùng sulfadoxin (Fanasil), phối hợp với pyrimethamin trong Fansidar để dự
phòng và điều trị sốt rét kháng cloroquin. Loại để dùng tại chỗ: ít hoặc khó tan
trong nước. Dùng điều trị các vết thương tại chỗ (mắt, vết bỏng) dưới dạng dung
dịch hoặc kem. Có sulfacetamid, silver sulfadiazin, mafenid. [2]

Hiện nay hầu hết các vi khuẩn đều kháng với sulfamid nên thuốc này rất ít
được sử dụng. Để khắc phục nhược điểm này người ta thường dùng sulfamid ở dạng
phối hợp. Dạng phối hợp phổ biến nhất của sulfamid là việc kết hợp giữa
sulfamethoxazol và trimethoprim với tỉ lệ 1 trimethoprim và 5 sulfamethoxazol
nhằm tạo ra kháng sinh có khả năng kháng khuẩn, tăng hiệu quả điều trị và giảm tỉ
lệ kháng thuốc của vi khuẩn, thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, t/2 của thuốc từ
9-11 giờ. [2]
1.2.5. Dược động học
Các sulfamid được hấp thu nhanh qua dạ dày và ruột (trừ loại sulfaguanidin),
70 - 80% liều uống vào được máu, gắn với protein huyết tương 40 - 80%, nồng độ
tối đa đạt được sau 2- 4 giờ. Từ máu, sulfamid khuếch tán rất dễ dàng vào các mô,
vào dịch não tuỷ (bằng 1/2 hoặc tương đương với nồng độ trong máu), qua rau thai,
gây độc. Các quá trình chuyển hóa chủ yếu ở gan của sulfamid gồm: Phản ứng liên
hợp với acid glucuronic thành dạng bất hoạt nhưng có tính hòa tan. Phản ứng acetyl
hóa tạo thành dạng bất hoạt và không tan nên thường gây độc (hình thành dạng tinh
thể ở thận). Sau đó các sulfamid được bài thải qua thận là chủ yếu (trừ các sulfamid
kháng khuẩn đường ruột), một ít qua phân, sữa. [2]
1.2.6. Độc tính của sulfamid
Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cá
thể và đối với mỗi loại sulfamid. Dưới đây là một số tác dụng có thể gặp khi sử
dụng sulfamid:
Rối loạn hệ thống tạo máu: cơ chế tác dụng rất khác nhau, có trường hợp là
do mẫn cảm, trường hợp khác do sự tan huyết liên quan đến sự hoạt hóa glucose- 6
Chuyên ngành hóa phân tích

7

Trường ĐHKHTN

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

photsphat dehydrogenase. Phản ứng này không phụ thuộc vào nồng độ sulfamid mà
vào từng cá thể. Phản ứng thường xảy ra trong tuần đầu dùng thuốc. Triệu chứng có
thể là: buồn nôn, sốt, chóng mặt, vàng da, xanh xao, trong trường hợp nặng có thể là
thiếu máu bất sản. Một số trường hợp có thể gây tím tái do tạo methemoglobin.
Thận: đây là trường hợp không mong muốn thường gặp nhất khi sử dụng
sulfamid. Sulfamid có thể gây kết tinh ở thận, gây tổn thương thận, viêm thận, sỏi
thận, đái ra máu. Nhược điểm này đã được khắc phục dần do tìm được những
sulfamid ít acetyl hóa, ít kết tinh…
Phản ứng tăng nhạy cảm: phản ứng rất khác nhau với từng loại sulfamid và
với từng người, thường xuất hiện khi sử dụng các loại sulfamid tác động chậm.
Triệu chứng có thể là nổi ban đỏ, xuất huyết…Khi dùng ngoài da có thể gây nám da
do sự kích thích sự nhạy cảm của da khi tiếp xúc với tia tử ngoại. [2]
1.2.7. Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim
Trong số những kháng sinh nhóm sulfamid đã được tổng hợp, sulfaguanidin
và sulfamethoxazol là một trong những hoạt chất được sử dụng phổ biến nhất hiện
nay. Tuy nhiên, do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng nên hiện nay
người ta thường sử dụng dạng phối hợp của sulfamid với trimethoprim như
sulfamethoxazol, sulfadiazin với trimethoprim để tăng thêm hiệu quả điều trị [2].
Do đó trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành đi sâu nghiên cứu ba hoạt chất là:
sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (dạng phối
hợp phổ biến với sulfamid).
 Giới thiệu về Sulfaguanidin
Công thức: C7H10N4O2S

KLPT: 214,2
Sulfaguanidin là (4-aminophenylsulfonyl)guanidin, tồn tại ở dạng bột kết

tinh mịn màu trắng hoặc gần như trắng. Rất khó tan trong nước và ethanol 96 %,
Chuyên ngành hóa phân tích

8

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

khó tan trong aceton, thực tế không tan trong methylen clorid, tan trong dung dịch
acid vô cơ loãng. [6]
Sulfaguanidin được sử dụng để trị các bệnh đường ruột như tả, lỵ, viêm ruột.
Là kháng sinh ít tan trong kiềm, không hấp thu ở ruột, ít độc nên có thể dùng với
liều cao. Tuy nhiên sulfaguanidin có ảnh hưởng tới vi khuẩn đường ruột, nên khi
dùng nên uống thêm men tiêu hóa và uống kèm vitamin B1
 Giới thiệu về Sulfamethoxazol
Công thức: C10H11N3O3S

KLPT: 253,3
Sulfamethoxazol là 4-amino-N-(5-methylisoxazol-3-yl)benzensulfonamid,
tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong
nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong dung dịch natri
hydroxyd loãng và dung dịch acid loãng. [6]
Sulfamethoxazol là sulfamid có tác động trung gian dùng trị nhiễm trùng
đường tiểu, sinh dục, nhiễm trùng da.
 Giới thiệu về Trimethoprim
Công thức: C14H18N4O3

KLPT: 290,3
Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin, tồn tại ở
dạng bột trắng hoặc trắng hơi vàng. Rất khó tan trong nước, khó tan trong ethanol
96 %, hơi tan trong cloroform, thực tế không tan trong ether. [6]

Chuyên ngành hóa phân tích

9

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Triemthoprim được sử dụng trong các trường hợp điều trị đợt cấp của viêm
phế quản mạn, dự phòng lâu dài nhiễm khuẩn tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn tiết
niệu dưới cấp tính nhạy cảm với trimethoprim, viêm phổi do Pneumocystis carinii.
Hiện nay so khả năng kháng các thuốc nhóm sulfamid ngày càng cao nên
người ta thường sử dụng dạng phối hợp giữa sulfamethoxazol và trimethoprim để
tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc. Bản chất của sulfamethoxazol là một
sulfonamid, ức chế cạnh tranh sự tổng hợp acid folic của vi khuẩn. Trimethoprim là
một dẫn chất của pyrimidin, ức chế đặc hiệu enzym dihydrofolat reductase của vi
khuẩn. Khi phối hợp trimethoprim và sulfamethoxazol như vậy sẽ ức chế hai giai
đoạn liên tiếp của sự chuyển hóa acid folic, do đó ức chế có hiệu quả việc tổng hợp
purin, thymin và cuối cùng DNA của vi khuẩn. Sự ức chế nối tiếp này có tác dụng
diệt khuẩn. Cơ chế hiệp đồng này cũng chống lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc
và làm cho thuốc có tác dụng ngay cả khi vi khuẩn kháng lại từng thành phần của

thuốc. [2]
1.3.

Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid

1.3.1. Phương pháp định tính sulfamid
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp khá đơn giản được sử
dụng để định tính các sulfamid. Trong phương pháp này người ta thường sử dụng
các hệ dung môi khai triển như dicloromethan- methanol- acid formic khan
(70:20:10) để định tính sulfaguanidin; hệ cloroform - methanol - dimethylformamid
(20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) để định tính sulfamethoxazol; hệ
heptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic băng
tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) để định tính sulfadoxin [1]. Tiến hành chấm riêng biệt mỗi dung
dịch lên bản mỏng silica gel GF254. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được
khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử
ngoại ở bước sóng 254 nm. Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù
hợp về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối
chiếu.
Chuyên ngành hóa phân tích

10

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

 Phương pháp phổ hồng ngoại
Phương pháp phổ hồng ngoại cho phép nhận dạng sự xuất hiện và có mặt của
các nhóm chức đặc trưng [13, 7]. Cụ thể, xác định sự có mặt nhóm sulfoamid bậc 2
(-SO2-NH-) cho các băng sóng hấp thu ở gần 3265 cm-1, dị vòng isoxazol có băng
sóng hấp thụ dao động trong vùng 3500- 3200 cm-1, băng sóng hấp thụ ở 3335 cm-1
thuộc về dao động hóa trị của nhóm N-H (amin bậc 2). Băng sóng hấp thụ ở vùng
3100- 3000 cm-1 thuộc về dao động hóa trị của nhóm C-H thuộc vòng aren. Các dao
động hóa trị của C=N- thuộc vùng 1250-1020 cm-1, vùng 1360- 1250 cm-1 là dao
động hóa trị của C-N (vòng thơm), vùng 1340-1250 cm-1 là vùng dao động hóa trị
của nhóm N-H (amin thơm bậc một).
Để định tính các mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của các mẫu thử sau đó so
sánh với phổ IR của mẫu chuẩn trong các thư viện phổ tham chiếu.
1.3.2. Phương pháp định lượng
1.3.1.1.

Phương pháp chuẩn độ thể tích

- Dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid trong môi trường acid các
Sulfamid được xác định theo phương pháp chuẩn độ nitrit chậm, điểm tương đương
được phát hiện bằng phương pháp chuẩn độ điện thế [1]. Đây là một phương pháp
định lượng rất nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm được áp dụng phổ biến để xác định
các Sulfamid trong dược phẩm
- Nhóm tác giả D. Amin, B. Shaba và các cộng sự đã sử dụng dung dịch

brôm làm thuốc thử để xác định các sulfamid trong dược phẩm bằng phương
pháp chuẩn độ gián tiếp [17]. Theo đó phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng
của các sulfamid với một lượng dư nước brom bão hòa để tạo thành các dẫn xuất
N- bromo tương ứng, quá trình này giải phóng một lượng tương đương của iot
khi phản ứng với iot. Iot tự do có thể được xác định bằng phương pháp chuẩn độ
vởi natri thiosulfat, sử dụng hồ tinh bột làm chỉ thị. Hiệu suất thu hồi của phương

pháp là từ 97,8- 102,1 %, hệ số biến thiên là từ 0,1- 2,2 % tùy thuộc vào hàm
lượng của các sulfamid trong dược phẩm.

Chuyên ngành hóa phân tích

11

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học
1.3.1.2.

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Phương pháp trắc quang

Nhóm tác giả Nagaraja P1, Naik SD và cộng sự đã tìm ra một phương pháp
đơn giản, có độ nhạy cao dùng để xác định một số sulfamid trong các chế phẩm
dược [30]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa của sulfacetamid,
sulfadiazin, sulfaguanidin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol và các liên
kết của chúng với 8-hydroxyquinolin trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm màu
đỏ có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 500 nm. Nồng độ tuân theo định luật Beer từ
0,1 đến 7,0 mg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạn đinh lượng của phương pháp lần
lượt là 0,03- 0,05 và 0,11-0,18 mg/ml. Độ chính xác của phương pháp là từ 97,3100,8 %. Phương pháp này khá thành công trong việc định lượng các sulfamid
trong các mẫu dược phẩm.
Cũng trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid các tác giả Padmarajaiah
Nagaraja, Hemmige S Yathirajan, Kallanchira R Sunitha, Ramanathapura A
Vasantha [31] lại đưa ra phương pháp xác định các sulfamid như sulfathiazol,
sulfadiazine, sulfacetamid, sulfamethoxazol, sulfamerazin, sulfaguanidin và

sulfamethazin trong dược phẩm dựa trên phản ứng diazo hóa các sulfamid trên, sau
đó tiến hành tạo phức với dopamine trong sự có mặt của ion molybdat trong môi
trường acid H2SO4 tỷ lệ (1:1). Sản phẩm của phản ứng này là dung dịch có màu đỏ
có độ hấp thụ trong vùng từ 490-510 nm, các dung dịch này có độ bền trong 48 giờ
tại 27C. Nồng độ tuân theo định luật Beer từ 0,04 đến 8,0 µg/ml. Phương pháp này
được áp dụng thành công trong việc xác định các sulfamid trong các sản phẩm
thuốc viên và thuốc nhỏ mắt. Các tá dược trong thuốc không ảnh hưởng đến kết quả
đo. Do đó đây là phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và có độ nhạy
cao áp dụng để phân tích các sulfamid tron dược phẩm mà không cần chiết tách hay
gia nhiệt.
1.3.1.3.

Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến

Phương pháp trắc quang kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến như: bình
phương tối thiểu thông thường (CLS), bình phương tối thiểu từng phần (PLS ), hồi
qui cấu tử chính ( PCR) là một phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng và tiết
Chuyên ngành hóa phân tích

12

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

kiệm để xác định đồng thời các thuốc kháng khuẩn như sulfamid và trimethoprim
trong dược phẩm. Tập hợp các dung dịch mẫu được hòa tan và pha loãng với dung

dịch ethanol pH = 9,9 đến nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ trong vùng bước
sóng từ 200- 350 nm.

Tiến hành nghiên cứu trên 5 hoạt chất: sulfadiazin,

sulfadimidin, sulfamethoxazol, sulfanilamid and trimethoprim xác định được
khoảng tuyến tính của các đường chuẩn đơn biến đều nằm trong khoảng nồng độ từ
1,0 – 24,0 mg/l, giới hạn phát hiện là 0,2 – 1,0 mg/l. Mô hình chuẩn của ba phương
pháp đa biến được xây dựng trên cơ sở dữ liệu phổ của các mẫu hỗn hợp chứa đồng
thời các hoạt chất trên. Kết quả phân tích cho thấy độ thụ hồi của hai mô hình PCR
và PLS xấp xỉ 100 %, trong khi mô hình CLS có độ thu hồi kém hơn hẳn. Mô hình
PCR dựa trên ma trận dữ liệu thô đã được lựa chọn áp dụng cho việc phân tích xác
định hàm lượng năm hoạt chất nghiên cứu trong các loại thuốc thành phẩm. [39]
1.3.1.4.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có độ
chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định
các sulfamid trong các sản phẩm dược phẩm.
Theo đó Sulfadoxin (trong viên nén Sulfadoxin và pyrimethamin) được định
lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng với hệ pha động là: Dung dịch đệm pH 5,9 acetonitril (4 : 1). Dung dịch đệm pH 5,9: Thêm 1 ml triethylamin và 200 ml
acetonitril vào 700 ml nước, điều chỉnh đến pH 5,9 bằng dung dịch acid acetic 1 %,
sau đó thêm nước vừa đủ 1000 ml, trộn đều, lọc. Điều kiện sắc ký: Cột thép không
gỉ (30 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 m) với detector quang phổ tử ngoại
đặt ở bước sóng 230 nm, tốc độ dòng: 2,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 l. [1].
Theo dược điển Mỹ USP 34- NF 29 [37] Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp
thuốc chứa Sulfamethoxazol và trimethoprim) được xác định với điều kiện sắc ký:
Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc độ dòng: 1,8 ml/ phút,
thể tích tiêm: 20 µl. Pha động: 700ml nước + 200ml Acetonitril + 1ml triethylamin

(điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic 1% hoặc dung dịch natri
hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml.
Chuyên ngành hóa phân tích

13

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

Nhóm tác giả Cemal Akay, Sibel A. Ozkan [16] đã tiến hành nghiên cứu
thành công quy trình định lượng Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa
Sulfamethoxazol và trimethoprim) theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với
pha động là hỗn hợp của methanol : nước (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid
phosphoric 10 %. Điều kiện sắc ký: Cột C18, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước
sóng 213 nm, tốc độ dòng 1,8 ml/min, thể tích tiêm 10 l. Khoảng tuyến tính của
phương pháp là từ 2,0-10,0 µg/ ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 µg/ ml
đối với sulfamethoxazol. Giới hạn phát hiện tương ứng với trimethoprim và
sulfamethoxazol lần lượt là 0,45 và 1,21 µg/ ml.
1.4.

Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với
thuật toán hồi quy đa biến

1.4.1. Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại
1.4.1.1.

Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại

Quang phổ hồng ngoại gần lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1881 bởi
Abney và Festing khi làm việc với các tấm ảnh [25]. Họ đã phát hiện ra sự tồn tại
của các bức xạ nhiệt ở ngoài vùng phổ của ánh sáng nhìn thấy và chứng minh được
sự hấp thụ của các bức xạ này có liên quan đến các thành phần hóa học trong các
hợp chất nghiên cứu. Wiliam W.Coblentz là một trong những người tiên phong đầu
tiên nghiên cứu về quang phổ hồng ngoại. Năm 1905, ông công bố kết quả nghiên
cứu của các hợp chất mà ông ghi lại từ 1000 nm đến 16.000 nm. Việc Coblentz
công bố kết quả đã tạo ra một bước đột phá mới cho các nhà nghiên cứu, có liên
quan đến quang phổ của các nhóm nguyên tử trong phân tử, liên quan đến sự hấp
thụ ở giữa (2500-50,000nm). Từ đó, chúng ta có thể hiểu về liên kết hóa học như
dao động giữa hai hay nhiều nguyên tử, các liên kết sẽ dao động và khi năng lượng
được bổ sung thì các dao động này sẽ mạnh hơn. Dao động hóa trị đòi hỏi năng
lượng cao hơn so với dao động biến dạng.
1.4.1.2.

Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật
phân tích rất hiệu quả. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp
Chuyên ngành hóa phân tích

14

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia
X, cộng hưởng từ điện tử…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc
phân tử nhanh, không đòi hỏi các phép tính toán phức tạp.[27]
Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả
năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại,
các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất
hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. [7]
Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các
nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Bởi vậy,
phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì
cả chuyển dộng dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Bức xạ hồng
ngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùng
viba, vùng này có thể chia thành ba vùng nhỏ:
 Hồng ngoại gần (near infrared): 14000- 4000 cm-1 (0,8- 2,5µm).
 Hồng ngoại trung (medium infrared): 4000- 400 cm-1 (25- 2,5μm).
 Hồng ngoại xa (far infrared): 400- 10 cm-1 (50-100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000650cm-1. Vùng phổ từ 4000-1500 cm-1 được gọi là các vùng nhóm chức vì chứa hầu
hết các vân hấp thụ của các nhóm chức như OH, NH, C=O, C=N, C=C…Vùng phổ
nhóm chức tập trung làm bốn vùng mà mỗi vùng, tần số đặc trưng nhóm có giá trị
thay đổi phụ thuộc vào cấu tạo phân tử. Vùng 3650-2400 cm-1 chứa các vân dao
động hóa trị của X-H (X:O, N, C, S, P…); vùng từ 2400-1900 cm-1 gồm các vân
dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết ba hoặc hai liên kết đôi kề nhau; vùng
1900-1500 cm-1 chứa các vân dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết đôi và
do dao động biến dạng của nhóm –NH2. Vùng phổ từ 1500-700 cm-1, mặc dù chứa
các vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của các liên kết đơn như C-C, C-N,
C-O…và các vân do dao động biến dạng của các liên kết C-H, C-C… nhưng thường
được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định các nhóm chức, vì ngoài
các vân hấp thụ trên còn có nhiều vân hấp thụ xuất hiện do tương tác mạnh giữa các

Chuyên ngành hóa phân tích

15

Trường ĐHKHTN


Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học

Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học

dao động. Các vân hấp thụ này đặc trưng cho chuyển động của các phân tử chứ
không thuộc riêng nhóm nguyên tử nào, và vì vậy, vùng phổ này thường được gọi là
vùng chỉ vân tay. Vùng phổ từ 650-250 cm-1 cung cấp các thông tin có giá trị đối
với hợp chất vô cơ và phức chất, vì chứa các vân phổ liên quan đến dao động hóa trị
của C-Br, C-I và M-X(M- kim loại;O,N,S,C…) nhưng không phải máy hồng ngoại
nào cũng đo được ở vùng này.[7]
1.4.1.3.

Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại

Không phải bất kỳ phần tử nào cũng có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại.
Mặt khác bản thân sự hấp thụ đó cũng có tính chất chọn lọc. Một phân tử chỉ có khả
năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố sau [7]. Một là
tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hoặc nhóm nguyên
tử cấu tạo nên phân tử đó) bằng chính tần số dao động cùng tần số của bức xạ tới.
Hai là phân tử đó phải có momen lưỡng cực, vì khi phân tử lưỡng cực được giữ
trong điện trường, các điện tích trái dấu sẽ chịu ảnh hưởng bởi các lực theo những
chiều ngược nhau, và làm các nguyên tử tích điện này dao dộng, chúng hấp thụ bức
xạ hồng ngoại. Vì vậy các phân tử như O2, N2 không xuất hiện phổ hấp thụ hồng

ngoại.
1.4.1.4.

Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại

Tín hiệu đo phổ hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động của phân tử [7].
Do đó phổ hồng ngoại bị ảnh hưởng bởi các yếu tố chính như sau:
Ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử: do tần số dao động của phân tử phụ
thuộc vào sự bền vững của liên kết, các hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian và
liên kết nội phân tử.
Ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử: ở trạng thái khí các phân tử
chuyển động tự do và hầu như không có tương tác với nhau nên phổ hồng ngoại của
các chất ở thể kí phản ánh khá trung thực cấu trúc của phân tử. Tuy nhiên kỹ thuật
đo mẫu ở thể khí lại rất phức tạp, do đó thường đo mẫu hồng ngoại ở dạng rắn hoặc
dạng lỏng. Các phân tử ở dạng rắn có thế tồn tại dưới dạng các tinh thể khác nhau,
do đó phổ hồng ngoại của chúng có thể sẽ bị thay đổi do tương tác giữa cấc phân tử
Chuyên ngành hóa phân tích

16

Trường ĐHKHTN