Nghiên cứu công nghệ sản xuất "chất bảo quản sinh học bacterioxin" bằng phương pháp vi sinh có ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.82 MB, 196 trang )
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Tên
Đề
tài:
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC
BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG
CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
MÃ
SỐ:
04/2008/HĐ-NĐT
Cơ
quan
chủ
trì
đề
tài:
VIỆN
CÔNG
NGHIỆP
THỰC
PHẨM
Chủ
nhiệm
đề
tài
:
TS.
NGUYỄN
LA
ANH
8722
Hà
Nội
–
2010
BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG
NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Tên
Đề
tài:
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC
BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG
CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
MÃ
SỐ:
04/2008/HĐ-NĐT
Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài
TS.
Nguyễn
La
Anh
Bộ Khoa học và Công nghệ
(
ký
tên
đóng
dấu
trước
gửi
lưu
trữ)
Hà
Nội
–
2010
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………….……………………………….1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………… 3
1.1. Giới thiệu về bacterioxin và vi khuẩn lactic……………………………… ………3
1.1.1. Giới thiệu về bacterioxin……………………………………………………3
1.1.2. Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin…………………………….…….5
1.2. Giới thiệu về nisin………………………………………………………… … ….7
1.2.1. Vi sinh vật sinh tổng hợp nisin………………………………………….… 7
1.2.2. Cấu trúc phân tử của nisin………………………………………………… 9
1.2.3. Tính chất của nisin… ………………………………………… … ……10
1.2.4. Cơ chế tác dụng của nisin……………………………… 11
1.2.5. Sinh tổng hợp và điều hòa phiên mã…………………… 14
1.2.6. Sự liên hệ giữa các tính trạng lên men sucrose, sinh tổng hợp nisin và kháng
nisin……………………………………………… ……………………….16
1.2.7. Sự ổn định tính trạng Suc-Nis…………………………………………… 17
1.2.8. Sự sắp xếp lại plasmid của Lactococcus trong quá trình ít dinh dưỡng kéo
dài………………………………………………………………… …… 18
1.3. Ứng dụng bacterioxin và nisin………………………………………… … ….…21
1.4. Công nghệ sản xuất sản xuất nisin…………………………………… …… ….26
1.4.1. Công nghệ lên men……………………………… ………………………26
1.4.2. Công nghệ lên men kết hợp hấp phụ nisin…………………….………… 28
1.4.3. Công nghệ thu hồi ………………………………………….……….…28
1.5. Giới thiệu một số công nghệ tinh chế và thu nhận protein ……….…………….32
1.5.1. Chiết pha rắn ………………………………………………… …………32
1.5.2. Phương pháp lọc tiếp tuyến - cắt phân đoạn ……………….……….……35
1.5.3. Phương pháp sấy phun………………………………………….…………39
1.5.4. Phương pháp sấy phun xung đốt………………………………… ………42
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 45
2.1. Nguyên vật liệu…………………………………………………… …………….45
2.1.1. Các chủng vi sinh vật………………………… …………………………45
2.1.2. Môi trường………………………………………… …………………….45
2.1.3. Các nguyên vật liệu hấp phụ ………………………….………………….46
2.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………… 47
2.2.1. Phân lập vi sinh vật……………………………………………………… 47
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống……………………….…………………… 47
2.2.3. Phân loại bằng hình thái tế bào và khuẩn lạc………………….………… 47
2.2.4. Phương pháp xác định kiểu hình axit lactic……………………………….48
2.2.5. Phương pháp xác định meso- DAP trong thành tế bào…………………….48
2.2.6. Phương pháp xác định kiểu hình lên men của vi khuẩn lactic…… …… 48
2.2.7. Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường…………………48
2.2.8. Kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin…………… ………48
2.2.9. Kiểm tra tính nhậy cảm của bacterioxin với protease……………….…….49
2.2.10. Kiểm tra tính bền nhiệt của bacterioxin……………………………….… 49
2.2.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacterioxin……………………… … 49
2.2.12. Phương pháp tách DNA tổng số……………………………………… ….50
2.2.13. Phương pháp đinh tên bằng đọc trình tự đoạn gen V1-V3 16S r.DNA… 50
2.2.14. Phương pháp tách plasmid……………………………………………… 51
2.2.15. Phương pháp PCR để tách dòng gen nis………………………………… 51
2.2.16. Tinh sạch sản phẩm DNA gen nis…………………….………………… 52
2.2.17. Xác định trình tự gene nis bằng phương pháp đọc trình tự trực tiếp…… 52
2.2.18. Xác định trình tự gene nis thông qua AT cloning…………………………53
2.2.19. Phương pháp xác định kích thước phân tử bacterioxin……………………53
2.2.20. Phương pháp Điện di Tricine –SDS – PAGE…………………………… 54
2.2.21. Phương pháp đọc trình tự amino acid từ N- terminus…………………… 54
2.2.22. Xác định hoạt tính bacterioxin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch….55
2.2.23. Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch …… 55
2.2.24. Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp HPLC……………………….56
2.2.25. Phương pháp xác định sinh khối………………………………………… 57
2.2.26. Phương pháp xác định đường tổng……………………………………… 57
2.2.27. Phương pháp xác định đạm………………………………… ……………57
2.2.28. Phương pháp lên men………………………………………………….… 57
2.2.29. Phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ bằng tế bào chủng sản xuất …… 58
2.2.30. Phương pháp kết tủa bằng amonium sulphate………………… ……… 58
2.2.31. Phương pháp thu hồi bằng vật liệu hấp phụ …………………….……….59
2.2.32. Các phương pháp tinh sạch nisin……………………………………… 60
2.2.33. Các thiết bị cần cho công đoạn thu nhận sản phẩm …………………… 60
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………… 61
3.1. Phân lập, sưu tập, trao đổi, lưu giữ bảo quản các chủng giống có hoạt tính sinh
bacterioxin…………………………………………….……………………… 61
3.2. Nghiên cứu khảo sát, tuyển chọn các chủng giống có đặc tính sinh
bacterioxin……………………….………………………… ……………….….63
3.2.1. Sự nhạy cảm của bacterioxin với enzym proteinase … …… ….……… 64
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của bacterioxin… 65
3.3. Nghiên cứu định tên chủng giống………………………………… …………….65
3.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá………………………….65
3.3.2. Nghiên cứu đọc trình tự đoạn gen 16SrDNA…………………….……… 68
3.3.3. Khảo sát tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin… 69
3.4. Nghiên cứu đặc điểm bacterioxin………………………………… ……….…….70
3.4.1. Khảo sát sự có mặt gen mã hóa nisin ở các chủng vi khuẩn ……….…….70
3.4.2. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa nisin ………………………….………….71
3.4.2.1. Đặc điểm gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp. lactis DSM
20729…………………………… ………………………………… 71
3.4.2.2. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae BV20…………….72
3.4.2.3. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae Tn63………….….73
3.4.2.4. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp. lactis PĐ14… 74
3.4.3. Nghiên cứu đọc trình tự amino axit từ N-terminus…………….………….78
3.5. Ổn định hoạt tính chủng giống……………………………………….……………80
3.5.1. Sàng lọc phân lập chủng giống sinh tổng hợp nisin cao……….………….80
3.5.2. Xác định vị trí gen mã hóa nisin……………….………………………… 83
3.5.3. Nguyên nhân gây đến sự giảm hoạt tính…………….…………………….86
3.5.4. Ảnh hưởng quá trình hoạt hóa đến hoạt lực chủng giống…… …….……94
3.5.5. Quy trình biện pháp duy trì hoạt tính chủng ………………….………….96
3.6. Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp bacterioxin (nisin)……………… ……… 98
3.6.1. Nghiên cứu thành phần môi trường………………………………….…….98
3.6.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men……………… 105
3.6.3. Nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ………………………………… 107
3.6.4. Nghiên cứu quá trình lên men tiếp dần nồng độ………………… …… 110
3.6.5. Nghiên cứu quá trình lên men kết hợp hấp phụ bacterioxin…………… 114
3.6.5.1. Nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ kết hợp với hấp phụ…… ……115
3.6.5.2. Nghiên cứu quá trình lên men tiếp dần nồng độ kết hợp với hấp phụ…118
3.7. Tiến hành lên men quy mô thực nghiệm……………………… ….…………….122
3.8. Nghiên cứu công nghệ thu hồi sản phẩm………………………………….…… 124
3.8.1. Nghiên cứu các biện pháp tách sản phẩm khỏi dịch canh trường ……124
3.8.1.1. Thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ - phản hấp phụ tế bào…… 124
3.8.1.2. Thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bằng amonium sulphate…… 125
3.8.1.3. Thu hồi nisin bằng phương pháp sử dụng vật liệu hấp phụ……………125
3.8.1.3.1. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silicone ……………………126
3.8.1.3.2. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng diatomite……………… 127
3.8.1.3.3. Thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ là hạt trao đổi cation……….130
3.8.1.3.4. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silica gel…………………… 133
3.8.1.3.5. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng axit silicic……………………136
3.8.1.3.6. Kết luận nghiên cứu thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ……… 141
3.8.1.4. Kết quả so sánh các phương pháp thu hồi nisin……………………… 142
3.8.2. Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch……………………… …………143
3.8.2.1. Lọc và cô đặc dịch phản hấp phụ………………………………………143
3.8.2.2. Tinh sạch bằng SPE……………………………………………………145
3.8.3. Nghiên cứu các phương pháp tạo sản phẩm…………………………… 146
3.8.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt lực nisin trong dung dịch…….146
3.8.3.2. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của nisin………………………………146
3.8.3.3. Tạo sản phẩm bằng phương pháp sấy phun……………………………146
3.9. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bacterioxin……………………… … 150
3.10. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, phân tích tính vệ sinh an toàn thực phẩm của sản
phẩm ……………………………………………………………………………153
3.10.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho phụ gia thực phẩm - Chế phẩm Firisin T…………153
3.10.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho phụ gia thực phẩm - Chế phẩm Firisin P………….154
3.11. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất………………………………………… 156
3.11.1. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất nước mắm……………………… 156
3.11.1.1. Khảo sát một số loại nước mắm trên thị trường……………… 156
3.11.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng ức chế Staphylococcus
aureus và Bacillus cereus của nisin…………… ……… ………157
3.11.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian…159
3.11.1.4. Lựa chọn nồng độ nisin thích hợp cho việc ứng dụng trong quá trình
sản xuất nước mắm……………………………………………….159
3.11.1.5. Ảnh hưởng của nisin đến S. aureus và B. cereus trong giai đoạn lên
men nước mắm……………………………………………………161
3.11.1.6. Ảnh hưởng của nisin đến Staphylococcus aureus CNTP6083
và
Bacillus cereus CNTP6089 bổ sung trong nước mắm thành
phẩm…162
3.11.1.7. Ứng dụng nisin trong quá trình chế biến nước mắm và trong bảo
quản nước mắm thành phẩm tại cơ sở sản xuất………………… 163
3.11.2. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất sữa……………………………… 165
3.11.2.1. Xác định kháng khuẩn của nisin đối với chủng kiểm định
Listeria monocytogenes
ATCC13932…………………………………… 165
3.11.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức
chế Listeria monocytogenes ATCC13932……………………… 166
3.11.2.3. Ảnh hưởng của chất nhũ tương hóa đến khả năng nisin ức chế
Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa…… 167
3.11.2.4. Ảnh hưởng của nisin và polysorbate 80 0,1% đến Listeria
monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa…………… 169
3.11.2.5. Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi trong điều
kiện phòng thí nghiệm……………………………………………170
3.11.2.6. Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi tại cơ sở
sản xuất………………………………………………………… 172
CHƯƠNG IV. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC………………………………………… 173
4.1. Hoàn thành các nội dung nghiên cứu với kết quả có độ tin cậy cao ……………173
4.2. Sản phẩm của đề tài được thực hiện đầy đủ và cụ thể như sau………………… 174
4.3. Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường………………………………….175
4.4. Một số hạn chế của đề tài……………………………………………………… 175
KẾT LUẬN……………………………………………………………………… …… 177
KIẾN NGHỊ………………………………………………………………………… ….179
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………… 180
PHỤ LỤC
Chữ
viết
tắt
Chữ
viết
tắt
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic
acid
ACN
Acetonitrile
AU
Arbitary
Unit
bp
Base
pair(s)
CFU
Colony
Forming
Unit
CNTP
Ký
hiệu
chủng
giống
thuộc
Bộ
sưu
tập
giống,
Viện
Công
nghiệp
thực
phẩm
DAP
Diaminopimelic
acid
DNA
Deoxyribonucleic
acid
DSM
Ký
hiệu
chủng
giống
thuộc
Bộ
sưu
tập
Vi
sinh
vật
và
Tế
bào
của
Đức,
Deutsche
Sammlung
von
Mikroorganismen
und
Zellkulturen
GmbH
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic
acid
FAO
Food
and
Agriculture
Organization
HPLC
High-performance
liquid
chromatography
or
high-pressure
liquid
chromatography
IU
International
Unit
JCM
Japanese
Collection
of
Microorganism
kDa
Kilodalton
LAB
Lactic
acid
bacteria
–
Vi
khuẩn
lactic
MDa
Megadalton
MIC
Minimal
Inhibitory
Concentration
MRS
CT1
Môi
trường
MRS
cải
tiến
số
1
MRS
CT2
Môi
trường
MRS
cải
tiến
số
2
NCBI
National
Centerfor
Biotechnology
Information
NFRI
National
Food
Research
Institute,
Japan
OD
Optical
density
RNA
Ribonucleic
acid
SDC
Sodium
deoxycholate
SDS
Sodium
dodecyl
sulfate
SDS-PAGE:
Sodium
Dodecyl
Sulphate
Polyacrylamide
Gel
Electrophoresis
SPE
Solid
phase
extraction
STG
Sưu
tập
giống
vi
sinh
vật
công
nghiệp,
Viện
Công
nghiệp
thực
phẩm
TCVN
Tiêu
chuẩn
Việt
Nam
TFA
Trifluoroacetic
acid
w/v
Weigh/volume
v/v
Volume/volume
WHO
World
Health
Organisation
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số bacterioxin từ vi khuẩn lactic……………… ………… ……………4
Bảng 1.2. Sự đa dạng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin… ……………… ……6
Bảng 1.3. So sánh đặc điểm máy sấy phun xung với các dạng sấy phun khác…….……44
Bảng 3.1. Thống kê các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin………………61
Bảng 3.2. Một số đặc điểm của chủng LAB mới phân lập………… ………………… 62
Bảng 3.3. Một số đặc điểm các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh …63
Bảng 3.4. Sự nhậy cảm của bacterioxin với enzym proteinase………… …………… 65
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của bacterioxin…………………….……65
Bảng 3.6. Một số đặc điểm sinh trưởng, sinh hóa………………………………….……66
Bảng 3.7. Một số đặc điểm hình thái, sinh trưởng, sinh hóa…………………………….66
Bảng 3.8. Một số khả năng lên men đường…………………….……………………… 67
Bảng 3.9. Sự tính nhảy cảm với clindamycin của các chủng nghiên cứu…………… …70
Bảng 3.10. Sự phát triển của chủng kiểm định khi có mặt bacterioxin với pH khác nhau 76
Bảng 3.11. Phổ kháng khuẩn của bacterioxin từ chủng 0-5 và DSM 20729…………… 76
Bảng 3.12. Tinh chế bacterioxin từ chủng 0-5… ……………………………………… 77
Bảng 3.13. Trình tự 18 amino acids từ đầu N-terminus của bacterioxin từ chủng 0-5……78
Bảng 3.14. Hoạt lực còn lại của các chủng dẫn xuất sau sàng lọc so với thời điểm bắt đầu
bảo quản (%)……………………………………………… ………….…… 87
Bảng 3.15. Khả năng sống sót của các chủng dẫn xuất sau sang lọc kể từ thời điểm bắt đầu
bảo quản……………………………………………………………………….89
Bảng 3.16. So sánh hoạt lực chủng giống bằng các phương pháp hoạt hóa khác nhau… 95
Bảng 3.17. So sánh các phương pháp bảo quản và hoạt hóa các chủng giống dẫn xuất từ
DSM 20729 về khả năng sinh tổng hợp nisin……………………………… 97
Bảng 3.18. Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin…….100
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nguồn phospho lên sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin…… 101
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của tỉ lệ NH
4
H
2
PO
4
…………………………………………… 102
Bảng 3.21. Hàm lượng đạm hòa tan trong các nguyên liệu nguồn nitơ………………….103
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ khác nhau………………………………103
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của tỉ lệ đạm trong sữa gầy…………………………………… 104
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ…………………………………………………… 105
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy…………………………………….106
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống………………………………………………… 107
Bảng 3.27. Điều kiện bổ sung cơ chất của các mẫu thí nghiệm khác nhau…………… 111
Bảng 3.28. Động học của quá trình lên men tiếp dần nồng độ…………………….…….111
Bảng 3.29. Hiệu suất thu hồi nisin khi lên men kết hợp với hâp phụ với thời điểm bổ sung
acid silicic khác nhau……………… ………………………………………117
Bảng 3.30. Kết quả thu hồi nisin trong lên men tiếp dần nồng độ 50% cơ chất so với ban
đầu, kết hợp với hấp phụ……………………………………………………119
Bảng 3.31. Điều kiện bổ sung cơ chất với các nồng độ khác nhau …………………120
Bảng 3.32. Kết quả thí nghiệm lên men tiếp dần nồng độ kết hợp thu hồi với nồng độ bổ
sung cơ chất khác nhau………………………………………………… …121
Bảng 3.33. Động học của quá trình lên men theo mẻ quy mô thiết bị lên men………….122
Bảng 3.34. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ tế bào…… 124
Bảng 3.35. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bởi amonium sulphate…….125
Bảng 3.36. Ảnh hưởng của tỷ lệ silicone tới khả năng hấp phụ nisin……………………126
Bảng 3.37. Ảnh hưởng của chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ diatomite 128
Bảng 3.38. Kết quả thu hồi nisin khi sử dụng diatomite với các tỷ lệ khác nhau……… 129
Bảng 3.39. Ảnh hưởng của nồng độ SDS tới hiệu quả phản hấp phụ nisin từ diatomite 129
Bảng 3.40. Ảnh hưởng của tỷ lệ hạt trao đổi cation tới khả năng hấp phụ nisin … … 131
Bảng 3.41. Ảnh hưởng của pH dịch canh trường tới khả năng hấp phụ nisin của hạt trao
đổi cation……………………… ………………………………………… 132
Bảng 3.42. Ảnh hưởng của các chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ hạt trao
đổi cation…………………………………… …………………………… 132
Bảng 3.43. Ảnh hưởng của tỷ lệ silica gel tới khả năng hấp phụ nisin………………… 133
Bảng 3.44. Ảnh hưởng pH dịch canh trường tới sự hấp phụ nisin của silica gel……… 134
Bảng 3.45. Ảnh hưởng thành phần dịch phản hấp phụ tới sự phản hấp phụ từ silica gel 135
Bảng 3.46. Xác định thành phần phù hợp của dung dịch NaCl 1M và ethanol………….135
Bảng 3.47. Ảnh hưởng của tỷ lệ axit silicic tới khả năng hấp phụ nisin…………………136
Bảng 3.48. Ảnh hưởng pH dịch canh trường khả năng hấp phụ nisin của axit silicic… 137
Bảng 3.49. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch phản hấp phụ so với dịch lên men ban đầu
khi sử dụng axit silicic làm chất hấp phụ……………………………………138
Bảng 3.50. Hiệu suất thu hồi nisin với các chất phản hấp phụ………………………… 139
Bảng 3.51. Xác định thành phần tỷ lệ dịch phản hấp phụ đối với axit silicic……………140
Bảng 3.52. Ảnh hưởng của thời gian phản hấp phụ…………………………………… 140
Bảng 3.53. So sánh các phương pháp thu hồi bằng vật liệu hấp phụ…………………….141
Bảng 3.54. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ bởi axit silicic 6% w/v …141
Bảng 3.55. Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong lọc dòng tiếp tuyến cô đặc……… 144
Bảng 3.56. Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong SPE………………………………146
Bảng 3.57. Sự bền hoạt tính của nisin ở các pH khác nhau theo thời gian………………147
Bảng 3.58. Khảo sát nhiệt độ đầu vào trong việc tạo sản phẩm sấy phun……………….148
Bảng 3.59. Tinh sạch và thu nhận sản phẩm nisin thô và tinh………………… ………148
Bảng 3.60. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin thô……………………………….153
Bảng 3.61. Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin thô……………………………………… 153
Bảng 3.62. Hàm lượng kim loại nặng của nisin thô…………………………………… 153
Bảng 3.63. Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin thô …………………….154
Bảng 3.64. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin tinh………………………………154
Bảng 3.65. Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin tinh……………………………………… 154
Bảng 3.66. Hàm lượng kim loại nặng của nisin tinh…………………………………… 155
Bảng 3.67. Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin tinh………………………155
Bảng 3.68. Một số chỉ tiêu hóa học của nước mắm…………………………………… 156
Bảng 3.69. Chỉ số vi sinh của các mẫu nước mắm……………………………………….156
Bảng 3.70. Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế S. aureus CNTP6083 157
Bảng 3.71. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế B. cereus
CNTP6089 ………………………………………………………………….158
Bảng 3.72. Khả năng ức chế B. aureus CNTP6089 và S. aureus CNTP6083 của nisin
ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện hàm lượng muối 20% 160
Bảng 3.73. Khả năng nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932….……………165
Bảng 3.74. Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức chế
Listeria monocytogenes ATCC13932……………………………………….166
Bảng 3.75. Ảnh hưởng của lecithin đến khả năng nisin ức chế L.monocytogenes ATCC
13932 trong môi trường sữa…………………………… ………………… 168
Bảng 3.76. Ảnh hưởng của Polysorbate 80 đến khả năng nisin ức chế L.monocytogenes
ATCC 13932 trong môi trường sữa…………… ………………………… 168
Bảng 3.77. Ảnh hưởng của nisin và polysorbate80 đến sự ức chế Listeria monocytogenes
ATCC13932 trong môi trường sữa………………………………………… 169
Bảng 3.78. Chỉ tiêu vi sinh trong sữa tươi có bổ sung nisin và polysorbate 80………….171
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử nisin (Gross và Morell, 1971)………………………………10
Hình 1.2. Mô hình nisin tấn công làm thủng màng tế bào………………………………13
Hình 1.3. Các gen tham gia vào sản xuất nisin Z, điều hòa và đề kháng………… … 15
Hình 1.4. Điện di agarose gel plasmid DNA…………………………………………….17
Hình 1.5. Điện di thành phần plasmid………………………………………………… 18
Hình 1.6. Sơ đồ phương pháp lọc dòng chảy ngang…………………………………….35
Hình 1.7. Dòng tuần hoàn của phương pháp lọc dòng chảy ngang…………………… 36
Hình 1.8. Phân loại các dạng lọc dòng chảy ngang theo kích cỡ lỗ trên vật liệu lọc……38
Hình 1.9. Mô hình, thiết bị và vật liệu trong lọc dòng chảy ngang…………………… 39
Hình 1.10. Sơ đồ hoạt động của máy sấy phun………………………………………… 41
Hình 1.11. Các loại đầu phun của máy sấy phun SDX®…………………………………42
Hình 1.12. Sơ đồ máy sấy phun xung đốt…………………………………………………43
Hình 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin………… 63
Hình 3.2. Kiểm tra hoạt lực tính bacterioxin của vi khuẩn lactic bằng phương pháp
khuếch tán đĩa thạch với chủng kiểm định JCM 1149……………………… 64
Hình 3.3. Phát hiện gen mã hóa prenisin………… ……………………………………69
Hình 3.4. Các cấu tử bacterioxin do chủng 0-5 sinh tổng hợp………………………… 77
Hình 3.5. Điện di trên Tricine-SDS-PAGE bacterioxin từ các chủng nghiên cứu…… 78
Hình 3.6. Xác định trình tự amino acids từ N-terminus của chủng 0-5…………………79
Hình 3.7. Tỷ lệ sống sót của tế bào Lactococcus lactis sp. lactis DSM 20729 trên môi
trường MRS- sucrose có bổ sung nisin ở các nồng độ 300-1200IU/ml… …81
Hình 3.8. Tỷ lệ các chủng dẫn xuất từ DSM 20729 dưới áp lực tuyển chọn nisin có hoạt
lực sinh tổng hợp nisin khác nhau…………………………………………….82
Hình 3.9. Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 thay đổi theo thời gian lên men….84
Hình 3.10. Điện di sản phẩm PCR gen nis với khuôn là các băng DNA cắt ra từ gel trên
hình 3.16 A……………………………………………………………………85
Hình 3.11. Sự thay đổi hoạt lực sinh tổng hợp nisin của các chủng dẫn xuất từ DSM 20729
theo thời gian, được bảo quản bằng phương pháp cấy truyền, tại 40C, trên các
môi trường khác nhau………………………………………… ……………88
Hình 3.12. Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 ở các điều kiện bảo quản khác
nhau………………………………………………………………………… 90
Hình 3.13. Kiểu hình plasmid của chủng DSM 20729 ở các điều kiện không có dinh
dưỡng với các điều kiện môi trường khác nhau trong 24 giờ…………… ….93
Hình 3.14. Ảnh hưởng môi trường lên men tới sinh tổng hợp nisin…………………… 98
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh tổng hợp nisin của DSM 20729….99
Hình 3.16. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin của chủng dẫn xuất DSM 20729
hoạt lực mạnh đã qua quy trình ổn định hoạt lực………………….……… 108
Hình 3.17. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 gốc….108
Hình 3.18. Sinh tổng hợp nisin trong lên men tiếp dần nồng độ với cơ chất khác nhau 113
Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 đã qua quy trình ổn định
hoạt lực chủng giống trên quy mô bình tam giác và thiết bị lên men……….123
Hình 3.20. So sánh hiệu quả của các phương pháp thu hồi nisin……………………… 143
Hình 3.21. Điện di về các mẫu thu nhận và tinh sạch nisin từ DSM 20729…………… 146
Hình 3.22. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nisin từ chủng vi khuẩn Lactococcus
lactis subsp. lactis DSM 20729 ( hay CNTP 6520)…………………… ….150
Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lưc của nisin ức chế Bacillus cereus
CNTP6089 và Staphylococcus aureus CNTP6083………………………….158
Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian…………….159
Hình 3.25. Nồng độ nisin và khả năng ức chế Bacillus cereus CNTP6089 và
Staphylococcus aureus CNTP6083 ……………………………………… 160
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nisin đến B. cereus CNTP6089 và S. aureus CNTP6083 trong
lên men nước mắm………………………………………………………… 161
Hình 3.27. Ảnh hưởng của nisin đến S.aureus CNTP6083 và B.cereus CNTP6089 bổ sung
trong nước mắm thành phẩm……………………………………………… 162
Hình 3.28. Sơ đồ ứng dụng nisin trong quá trình chế biến và bảo quản nước mắm tại Công
ty Cổ phần Thủy sản Nghệ An………………………………………………164
Hình 3.29. Đường cong chuẩn của nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 166
1
MỞ ĐẦU
Bacterioxin
là
chất
bảo
quản
thực
phẩm
mới,
nếu
so
sánh
với
chất
bảo
quản
tổng
hợp
hóa
học
truyền
thống.
Nhu
cầu
về
chất
bảo
quản
tự
nhiên
này
đang
tăng
nhiều
vì
xu
hướng
sử
dụng
thực
phẩm
gần
với
thiên
nhiên
trở
nên
phổ
biển.
Việc
sử
dụng
chất
kháng
sinh
có
nguốn
gốc
hoá
học
trong
công
nghiệp
thực
phẩm,
thức
ăn
chăn
nuôi
hiện
nay
đã
bị
hạn
chế,
thậm
chí
là
nghiêm
cấm
sử
dụng
do
khó
bị
phân
huỷ,
để
lại
dư
lượng
trong
thực
phẩm,
dẫn
tới
hiện
tượng
nhờn
kháng
sinh
cho người
và
động
vật,
làm
thay
đổi
hệ
vi
sinh
vật
đường
ruột.
Do
đó
chất
bảo
quản
thực
phẩm
có
nguồn
gốc
sinh
học
đã
trở
thành
mối
quan
tâm
lớn
của
các
nhà
khoa
học
và
sản
xuất.
Hiện
nay
các
chất
bảo
quản
này
được
sản
xuất
chủ
yếu
bởi
các
công
ty
ở
Châu
Âu,
Mỹ
và
gần
đây
ở
Trung
Quốc.
Trên
thế
giới
bacterioxin
được
sản
xuất
bằng
công
nghệ
lên
men
vi
sinh
bởi
vi
khuẩn
lactic
vì
vi
khuẩn
này
được
sử
dụng
rộng
rãi
trong
công
nghiệp
thực
phẩm
và
được
coi
là
an
toàn.
Tìm
kiếm
các
dạng
khác
nhau
của
bacterioxin
là
hướng
nghiên
cứu
được
nhiều
nhà
khoa
học
tham
gia,
nhằm
tìm
ra
các
bacterioxin
có
đặc
tính mới,
ứng
dụng
cao,
nhằm
cung
cấp
các
thông
tin
trong
việc
giải
thích
mối
liên
hệ
giữa
cấu
trúc
và
chức
năng
của
bacterioxin
–
một
vấn
đề
đến
nay
còn
chưa
được
sáng
tỏ
hoàn
toàn.
Bacterioxin
được
nghiên
cứu
nhiều
nhất
là
nisin
được
sinh
tổng
hợp
bởi
Lactococcus
lactis
subsp.
lactis
.
Việc
các
nhà
khoa
học
phát
hiện
ra
nisin
-
chất
bảo
quản
sinh
học
có
giá
trị
vào
đầu
thế
kỉ
20
được
xem
là
có
ý
nghĩa
rất
lớn.
Ngoài khắc
phục
được
những
nhược
điểm
của
phương
pháp
sử
dụng
hoá
chất,
chất
kháng sinh
có
nguồn
gốc
hoá
học,
nhiệt
độ,
chiếu
xạ
nisin
còn
có
nhiều
ưu
điểm
khác như
phạm
vi
ứng
dụng
của
nisin
khá
rộng
bao
gồm
các
sản
phẩm
tươi
sống
như
thịt, cá,
sữa,
rau
quả,
các
thực
phẩm
lên
men,
đồ
hộp
;
nisin
giúp
làm
giảm
thời
gian
và nhiệt
độ
thanh
trùng
của
các
sản
phẩm
dẫn
tới
hiệu
quả
kinh
tế
cao,
đảm
bảo
chất lượng,
giá
trị
dinh
dưỡng,
cảm
quan
vị
sản
phẩm;
nisin
không
ảnh
hưởng
tới
sức khoẻ
con
người,
có
khả
năng
phân
huỷ
trong
cơ
thể
con
người
nhờ
tác
dụng
của
enzym
pancreatin
trong
tuyến
tuỵ
ở
37
0
C
trong
15
–
30
phút.
2
Trên
thế
giới,
sự
phát
triển
mạnh
mẽ
của
ngành
công
nghệ
sinh
học
cũng
như
công
nghệ
vi
sinh
vật,
việc
nghiên
cứu,
sản
xuất
và
ứng
dụng
bacterioxin
đã
đạt được
nhiều
thành
công
trong
các
lĩnh
vực
khác
nhau
như
trong
công
nghiệp
thực
phẩm,
nông
nghiệp,
y
học.
Các
hướng
nghiên
cứu
trên
thế
giới
hiện
nay
là
tìm kiếm
các
bacterioxin
mới,
nghiên
cứu
sản
xuất
và
ứng
dụng
các
bacterioxin
trong
các
lĩnh
vực
cải
tạo
chủng
giống,
xây
dựng
và
áp
dụng
các
kỹ
thuật
lên
men
hiệu quả,
nâng
cao
hiệu
suất
thu
hồi,
xây
dựng
các
phương
pháp
đơn
giản,
hiệu
quả
cao.
Tại
Việt
nam,
các
nghiên
cứu
về
bacterioxin
ở
vi
khuẩn
lactic
chỉ
mới
bắt
đầu
trong
những
năm
gần
đây
và
đạt
được
một
số
kết
quả
ban
đầu.
Với
chủ
trương
của
Nhà
nước
là
ưu
tiên
phát
triển
công
nghệ
sinh
nhằm
hình
thành
và
phát
triển
ngành
công
nghiệp
sinh
học
nội
địa
trong
cả
bốn
lĩnh
vực
gồm
nông
nghiệp,
công
nghiệp
chế
biến,
y
dược
và
bảo
vệ
môi
trường,
sự
quan
tâm
của
các
khoa
học
đến
nghiên cứu
bacterioxin
từ
vi
khuẩn
lactic
với
mục
đích
ứng
dụng
trong
các
lĩnh
vực
khác nhau
là
hiện
tượng
đáng
khích
lệ.
Để
thực
hiện
được
nhiệm
vụ
này,
việc
hợp
tác quốc
tế
trong
lĩnh
vực
nghiên
cứu,
đặc
biệt
với
các
nước
có
ngành
công
nghệ
sinh học
phát
triển
là
rất
cần
thiết.
Giáo
sư,
tiến
sĩ
Jun
Shima
nguyên
là
trưởng
nhóm nghiên
cứu
thuộc
Khoa
Vi
sinh
vật
ứng
dụng,
thuộc
Viện
Nghiên
cứu
Thực
phẩm Quốc
gia
(Tsukuba,
Nhật
Bản),
đến
4/2010
ông
giữ
trách
nhiệm
Chủ
nhiệm
Bộ phận
nghiên
cứu
về
lĩnh
vực
các
khoa
học
Vi
sinh,
trường
Đại
học
Tổng
hợp
Kyoto. Ông
là
chuyên
gia
có
nhiều
năm
nghiên
cứu
về
các
hoạt
chất
kháng
sinh,
hoạt
chất kháng
khuẩn
từ
vi
sinh
vật,
đã
thực
hiện
nhiều
hợp
tác
nghiên
cứu
với
doanh
nghiệp,
tham
gia
hướng
dẫn
đào
tạo
các
nghiên
cứu
viên
trong
và
ngoài
nước.
Do đó
chúng
tôi
đã
cùng
hợp
tác
với
GS.TS.
Shima
và
các
đối
tác
Nhật
Bản
thực
hiện đề
tài
nghị
định
thư
“
Nghiên
cứu
công
nghệ
sản
xuất
chất
bảo
quản
sinh
học
bacterioxin
bằng
phương
pháp
vi
sinh
có
ứng
dụng
trong
công
nghiệp
thực
phẩm”
với
các
mục
tiêu
như
sau:
(i)-
Có
được
bộ
chủng
vi
khuẩn
lactic
có
khả
năng
sinh
một
số
bacterioxin
với
các
đặc
điểm
được
xác
định;
(ii)-
Có
được
quy
trình
công
nghệ
sản
xuất
nisin
bằng
phương
pháp
sinh
tổng
hợp
hiệu
suất
đạt
30%;
(iii)-
Có
kết
quả
ứng
dụng
nisin
trong
cơ
sở
sản
xuất
sữa
và
nước
mắm
.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.
Giới
thiệu
về
bacterioxin
và
vi
khuẩn
lactic
1.1.1.
Giới
thiệu
về
bacterioxin
Bacterioxin
là
một
nhóm
chất
được
tạo
ra
bởi
vi
khuẩn,
có
bản
chất
là
polypeptide,
có
đặc
tính
tiêu
diệt
các
vi
khuẩn
có
quan
hệ
họ
hàng
với
chủng
sinh
ra
nó
(Cleveland
và
cs.
2001)
.
Bacterioxin
có
hoạt
tính
kháng
khuẩn,
được
sản
sinh
ra
bởi
nhiều
nhóm
vi
khuẩn
đa
dạng,
có
thể
khác
nhau
bởi
phương
thức
và
phổ
hoạt
động,
phân
tử
lượng,
đặc
điểm
sinh
hóa
và
nguồn
gốc
gen
(Klaenhammer
1993).
Bacterioxin
được
biết
đến
đầu
tiên
là
colicin
-
tạo
bởi
một
chủng
vi
khuẩn
Gram
âm
E.
coli
có
tác
dụng
chống
lại
các
chủng
E.
coli
khác.
Đến
năm
1953
Jacob
và
các
cộng
sự
đã
gọi
bằng
thuật
ngữ
“Bacterioxin”
để
chỉ
chung
các
protein
có
khả
năng kháng
khuẩn.
Bacterioxin
được
phát
hiện
ở
cả
vi
khuẩn
Gram
dương
và
âm,
nhưng
bacterioxin
từ
vi
khuẩn
lactic
nhận
được
sự
quan
tâm
đặc
biệt
bởi
hiệu
quả,
mức
độ
an
toàn
và
khả
năng
ứng
dụng
làm
chất
bảo
quản
tự
nhiên
trong
công
nghiệp
thực
phẩm.
Bacterioxin
được
ứng
dụng
làm
chất
kháng
khuẩn
trong
chế
biến
thực
phẩm.
Trên
thế
giới
bacterioxin
được
sản
xuất
bằng
công
nghệ
lên
men
vi
sinh
bởi
vi
khuẩn
lactic.
Bacterioxin
từ
vi
khuẩn
lactic
được
xác
định
là
các
peptide
mang
điện
dương,
có
kích
cơ
nhỏ,
được
tổng
hợp
tại
ribosome
và
có
khả
năng
thấm
qua
màng
tế
bào (Klaenhammer
1993,
Jack
và
cs.
1995).
Bacterioxin
từ
vi
khuẩn
lactic
bao
gồm
các
nhóm
sau
đây
(Klaenhammer
1993):
-
Nhóm
I:
Gồm
các
lanbiotics
hoặc
các
bacterioxin
nhỏ,
kích
thước
phân
tử
lượng
thường
nhỏ
hơn
5Kda,
chịu
nhiệt,
có
chứa
Lanthionine
hoặc
β
-methyllanthionine
s
và
một
số
axit
amin
dehydrat
(2,3-didehydroalanine
do
serine
khử
nước);
có
cấu
tạo
từ một
hoặc
hai
peptide.
-
Nhóm
II:
Bacterioxin
nhỏ,
kích
thước
phân
tử
thường
nhỏ
hơn
10Kda,
chịu nhiệt
không
chứa
Lanthionine
;
bao
gồm
các
nhóm
nhỏ:
(IIa)-
bacterioxin
chống
4
Listeria
;
(IIb)-
bacterioxin
gồm
2
peptide;
(IIc)-
bacterioxin
vòng,
được
kích
hoạt
bởi nhóm
thiol.
-
Nhóm
III:
Bacteriolysin
hoặc
protein
có
kích
thước
lớn,
không
chịu
nhiệt, thường
có
tính
thủy
phân
murein.
-
Nhóm
IV:
Bacterioxin
có
cấu
tạo
phức
giữa
peptide/
protein
với
các
nhóm
khác.
Trong
nhiều
báo
cáo
phân
loại
bacterioxin
đôi
khi
người
ta
gộp
nhóm
III
và
nhóm IV
vào
cùng
một
nhóm
(De
Vuyst
&
Leroy,
2007).
Sự
đa
dạng
về
bacterioxin
được
thể hiện
ở
bảng
1.1.
Về
cơ
chế
hoạt
động,
bacterioxin
thuộc
nhóm
I
và
II
thường
là
các peptide
mang
điện
dương
và
có
khả
năng
thấm
qua
màng
tế
bào,
gây
thủng
màng
tế bào
và
làm
thất
thoát
các
ion,
ATP
và
thành
phần
nội
bào,
dẫn
đến
tiêu
diệt
tế
bào (Klaenhammer
1988,1993;
Jack
và
cs.
,1995).
Nhóm
lantibiotics
là
nhóm
được
chú
ý nhất
trong
các
nghiên
cứu
hiện
nay.
Đây
là
nhóm
gồm
các
bacterioxin
có
khả
năng phân
tử
nhỏ
hơn
5
kDa,
có
khả
năng
chịu
nhiệt,
chứa
các
axit
amin
bất
thường (Lanthionine,
β
-methyllanthio
n
Đến
nay
bacterioxin
do
vi
khuẩn
lactic
sinh
ra
được
phát
hiện
có
đặc
tính
ức
chế một
số
vi
khuẩn
Gram
dương,
trong
đó
có
các
vi
khuẩn
gây
bệnh,
gây
hỏng
thực
phẩm như
Clostridium
botulinum,
Staphylococcus
aureus,
Listeria
monocytogenes,
Bacillus cereus
Bacterioxin
cũng
được
chứng
minh
có
tác
dụng
lên
vi
khuẩn
Gram
âm
như
E. coli
và
Samonella
nhưng
chỉ
khi
màng
ngoài
của
tế
bào
bị
tổn
thương
bởi
các
yếu
tố sau:
sốc
thẩm
thấu,
pH
thấp,
sự
có
mặt
của
chất
bề
mặt
(EDTA),
chất
có
tính
chất chelat,
sốc
bởi
xung
điện
trường
hoặc
áp
suất
cao
(Stevens
và
cs.,
1991).
Bảng
1.1.
Một
số
bacterioxin
từ
vi
khuẩn
lactic
Bacterioxin
Chủng vi sinh vật
Phổ tác
dụng
Kích thước (số
axit amin)
Nhóm I: Lantibiotics
Nisin (A và Z) Lactococcus lactis Rộng 34
Lacticin 481 Lactococcus lactis Rộng 27
Lactocin S Lactococcus sake Rộng 37
5
Bacterioxin
Chủng vi sinh vật
Phổ tác
dụng
Kích thước (số
axit amin)
Carnocin U149 Carnobacterium pisicola Rộng 37-37
Variacin Micrococcus varians Rộng 25
Nhóm II: Phi-lantibiotics , kích thước nhỏ, bền nhiệt
Lactococcin A Lactococcus lactis Hẹp 54
Lactococcin B Lactococcus lactis Hẹp 47
Lactococcin M Lactococcus lactis Hẹp 48
Mesenterocin 52B
Leuconostoc
mesenteroides
Hẹp
32
Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus Trung bình 31
Bacterioxin giống Pediocin
Sakacin A Lactobacillus sake Trung bình 41
Sakacin P Lactobacillus sake Trung bình 41
CarnoBacterioxin A,B Carnobacterium piscicola Trung bình 48; 53
Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici Trung bình 44
Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum Trung bình 37
Enterocin 1146/A Enterococcus faecium Trung bình 47
Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola Trung bình 44
Mesenterocin Y105
Leuconostoc
mesenteroides
Trung bình
37
Nhóm III: Kích thước lớn, kém bền nhiệt
Helveticin J Lactobacillus helveticus Hẹp 333
Bacterioxin
thường
nhạy
cảm
với
ít
nhất
một
enzym
thuỷ
phân
protein
(De
Vuyst
và
Vandamme,
1994).
Một
số
bacterioxin
không
nhạy
cảm
với
dịch
vị
thường
được
sử
dụng
trong
sản
xuất
phomat.
Một
số
bacterioxin
như
helvetixin
J
và
plantarixin
B
của
Lactobacillus
helveticus
và
Lb.
plantarum
không
bị
ảnh
hưởng
bởi
tác
dụng
của
một số
enzym
như
lipase,
amylase
hay
phospholipase
(Desmazeaud,
1996).
1.1.2.
Vi
khuẩn
lactic
sinh
tổng
hợp
bacterioxin
Các
nghiên
cứu
gần
đây
đã
công
bố
những
phát
hiện
mới
về
bacterioxin
ở
các loài
thuộc
chi
Lactococcus
,
Lactobacillus,
Carnobacterium
,
Enterococcus
và
Pediococcus
.
Các
bacterioxin
được
phát
hiện
là
brevicin
ở
chủng
Lb.
brevis
(Filipov,
1979;
Benoit
và
cs.,
1997),
bacterioxin
từ
P.
acidilactici
(Bhunia
và
cs.,
1988;
Chikindas
và
cs.,
1993;
Martinez
và
cs.
,1998),
từ
Lb.
fermenti,
Lb.
buchneri
(Filipov,
1979),
từ
Lb.
pentosus
(Okkers
và
cs.,
1999),
divercin
từ
Carnobacterium
divergen
(
Metivier
và
cs.,
1998),
lactoccocin
từ
Lactococcus
lactis
(Martinez
và
cs.
,1999;
6
Ivanova
và
cs.,
2000),
mundticin
từ
Enterococcus
mundtii
(Kawamoto
và
cs.,
2002),
enterocin
từ
Enterococcus
faecium
(Đỗ
Thị
Huyền,
2009)
Những
vi
khuẩn
này
thường
có
mặt
trong
thực
phẩm
lên
men,
rau
quả
muối
chua
và
sản
phẩm
từ
sữa
(Diop
và
cs.,
2007;
Leroy
&
De
Vuyst,
2004;
Ennahar
và
cs.,
1999).
Tìm
kiếm
các
dạng
khác
nhau
của
bacterioxin
là
hướng
nghiên
cứu
được
nhiều nhà
khoa
học
tham
gia
theo
đuổi,
nhằm
tìm
ra
các
bacterioxin
mới
và
có
đặc
tính
ứng dụng
cao;
nhằm
so
sánh
các
bacterioxin
để
cung
cấp
các
thông
tin
quý
báu
trong
việc giải
thích
mối
liên
hệ
giữa
cấu
trúc
và
chức
năng
của
bacterioxin
–
một
vấn
đề
đến
nay còn
chưa
được
sáng
tỏ
(Tagg
và
cs.,
1976;
Eijsink
và
cs.,
1998;
Sato
và
cs.,
2002;
Sakayori
và
cs.,
2003).
Bacterioxin
có
hoạt
tính
mạnh
nhất
thường
phát
hiện
ở
vi khuẩn
Lactococcus
,
ở
các
chi
khác
thường
yếu
hơn.
Sự
đa
dạng
vi
khẩn
lactic
sinh bacterioxins
thể
hiện
trên
bảng
1.2.
Vi
khuẩn
lactic
đựơc
coi
là
an
toàn
(GRAS-
genrally
regarded
as
safe),
do
vậy
đã
có
nhiều
công
trình
về
xây
dựng
các
công
cụ
gen
để
biểu
hiện/sản
xuất
các
protein
quan
trọng
trong
vi
khuẩn
lactic.
Chẳng
hạn
như
việc
sử
dụng
gen
khởi
động
cấu
trúc
(consitutive
promotor)
của
Lac.
lactis
để
sản
xuất
protein
có
năng
suất
cao
(de
Vos,1999)
và
hiện
tại
thông
dụng
và
hiệu
quả
nhất
là
hệ
biểu
hiện
được
kiểm
soát
bởi
gen
khởi
động
cảm
ứng
bởi
nisin
(NICE-
nisin
controlled
gen
expression
system) (Kuipers
và
cs.,
1998;
Zhou
và
cs.,
2006).
Bảng
1.2.
Sự
đa
dạng
vi
khuẩn
lactic
sinh
tổng
hợp
bacterioxin
Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp
bacterioxin
Tên bacterioxin Trích dẫn
Lactobacillus
Lb. plantarum plantaricin A Nissen-Meyer và cs., 1993
Lb. plantarum plantaricin EF Anderssen và cs., 1998
Lb. plantarum plantaricin JK Anderssen và cs., 1998
Lb. plantarum plantaricin S Jimenez-Diaz và cs., 1995
Lb. plantarum LL441 plantaricin C Gonzalez và cs., 1994
Lb. acidophilus acidocin B Leer và cs., 1995
Lb. acidophilus JCM1132 acidocin J1132 Tahara và cs., 1996
Lb. acidophilus TK9201 acidocin A Kanatani và cs., 1995
Lb. heleveticus helveticin J Joerger & Klaenhammer, 1986
Lb. helveticus helveticin V-1829 Vaughan và cs., 1992
7
Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp
bacterioxin
Tên bacterioxin Trích dẫn
Lb. sake Lactocin S Mortvedt và cs., 1991
Cintas và cs., 1998
Lb. sake sakacin A Holck và cs., 1992
Guyonnet và cs., 2000
Lb. sake sakacin P Tichaczek và cs., 1992
Guyonnet và cs., 2000
Lb. brevis brevicin Filipov, 1979;
Benoit và cs., 1997
Lb. bavaricus bavaricin A Larsen & Norrung, 1993
Lb. curvatus LTH1174 curvacin A Eijsink và cs., 1998
Lb. johnsonii lactacin F Allison và cs., 1994
Lactococcus
Lac.lactis subsp.lactis Nisin Hurst 1981
Lac.lactis Lacticin 481 Piard và cs., 1992
Lac.lactis lacticin 3147 Ryan và cs., 1996
Lac.lactis lactococcin MMFII Ferchichi và cs., 2001
Lac.lactis lactococcin G Nissen-Meyer và cs., 1992
Lac.lactis
Lac.lactics subsp. cremoris
lactococcin M
Lactostrepsin
Van Belkum và cs., 1991
Martinez và cs.,1999
Ivanova và cs., 2000
Zajdel et al., 1985
Pediococcus
Pediococcus acidilactici pediocin PA-1/AcH Bhunia và cs., 1988;
Henderson và cs., 1992;
Motlagh và cs., 1992
Pediococcus pentosaceous Pediocin Piva & Headon, 1994
Pediococcus acidilactici PAC
1.0
pediocin PA-1 Cintas và cs., 1998
Eijsink và cs., 1998
Chikindas và cs., 1993;
Martinez và cs.,1998
Carnobacterium
Carnobacterium spp. Carnocin Stoffels và cs., 1992
Carnobacterium piscicola Piscicolin Schillinger và cs., 1993
Carnobacterium divergen divercin Metivier và cs., 1998
Enterococcus
E. faecium enterocin Aymerich và cs., 1996;
Đỗ Thị Huyền, 2009
E. mundtii mundticin Kawamoto và cs., 2002
8
1.2.
Giới
thiệu
về
nisin
1.2.1.
Vi
sinh
vật
sinh
tổng
hợp
nisin
Bacterioxin
được
nghiên
cứu
nhiều
nhất
là
nisin
được
sinh
tổng
hợp
bởi
Lactococcus
lactis
subsp.
lactis.
Lần
đầu
tiên
nisin
được
phát
hiện
năm
1928
từ
hiện
tượng
Streptococcus
lactis
gây
ức
chế
Lactobacillus
bulgaricus
(Rogers
và
Whittier,
1928).
Tên
nisin
được
Mattick
và
Hirsch
(1947)
đặt
xuất
phát
từ
ý
nghĩa
“chất
ức
chế
N”
(N
inhibitory
substance)
vì
Lactococcus
lactis
ban
đầu
đươc
phân
vào
nhóm
N
Streptococcus
.
Khi
được
phát
hiện
vào
năm
1928,
theo
hệ
thống
phân
loại
kinh
điển
của
Lancefield
thì
nisin
được
xếp
là
chất
ức
chế
sinh
học
do
Streptococcus
lactis
sinh
tổng
hợp.
Năm
1985,
theo
khoá
phân
loại
của
Schleifert
và
cộng
sự,
các
chủng
Streptococcus
lactis
được
phân
thành
2
nhóm
là
Streptococcus
mesophiles
(ưa
ấm)
và
Streptococcus
thermophiles
(ưa
nhiệt).
Nhóm
Streptococcus
mesophiles
bao
gồm
2 loài
chủ
yếu
là
Lactococcus
lactis
và
Lactococcus
cremoris
.
Trong
đó
chủng
sinh
tổng hợp
nisin
thuộc
loài
Lactococcus
lactis
(Schleifert
và
cs.,
1985).
Theo
khóa
phân
loại chi
Lactococcus
có
7
loài
và
dưới
loài
có
thể
phân
biệt
được
bằng
các
phản
ứng
sinh lý.
Trong
đó
loài
Lactococcus
garvieae
và
Lactococcus
lactis
rất
xa
nhau
về
mặt
phả hệ
là
nhưng
lại
rất
tương
tự
nhau
về
mặt
kiểu
hình.
Sự
phân
biệt
rõ
ràng
các
loài
này đựơc
thực
hiện
bởi
các
kỹ
thuật
DNA
homology
(Garvie
và
cs.,
1981),
phân
tích
trình tự
r.RNA
(Collins
và
cs.,
1989),
kiểu
hình
rRNA
cắt
hạn
chế
(Rodrigues
và
cs.
1991), hoặc
các
phương
pháp
khác
như
xác
định
sự
kháng
với
clindamycin
(Collins
và
cs.,
1989),
phân
tích
protein
bộ
của
tế
bào
(
Elliott
và
cs.,
1991),
PCR
đặc
hiệu
với
Lac.
garvieae
(Zlotkin
và
cs.,
1998).
Theo
Elliott
và
Facklam
(1996),
MIC
clindamycin (µg/ml)
đối
với
Lac.
lactis
là
≤
0,12
µg/ml
và
đối
với
Lac.
garvieae
là
≥
8µg/ml.
Lactoccocus
lactis
là
vi
khuẩn
Gram
âm
được
sử
dụng
phổ
biến
trong
sản
xuất
bơ
và
pho
mát
.
Lac.
lactis
là
vi
khuẩn
có
dạng
hình
cầu
hoặc
chuỗi
ngắn,
đường
kính
tế bào
từ
0,5-1,5µm
tuỳ
thuộc
vào
điều
kiện
sinh
trưởng.
Chúng
bị
ức
chế
trên
môi
trường
chứa
6%
NaCl
hoặc
môi
trường
quá
kiềm
tính
(pH
9,6
trở
lên)
và
có
thể
sinh
trưởng
trong
môi
trường
sữa
chứa
0,1%
xanh
metylen.
Chúng
mang
các
đặc
tính chung
của
vi
khuẩn
lactic
đó
là
không
có
khả
năng
tạo
bào
tử,
không
di
động
và
là
vi khuẩn
Gram
(+).
Trong
điều
kiện
nuôi
cấy
trong
phòng
thí
nghiệm,
Lac.
lactis
sinh
trưởng
trên
môi
trường
thạch
dưới
dạng
khuẩn
lạc
màu
vàng
sáng.
Chúng
thực
hiện qúa
9
trình
lên
men
đồng
hình,
sinh
ra
axít
lactic
L(+).
Tuy
nhiên
trong
vài
trường
hợp chúng
cũng
có
thể
sinh
axít
lactic
D(-)
khi
nuôi
cấy
trong
điều
kiện
pH
thấp.
Khả
năng tạo
axít
lactic
là
lí
do
tại
sao
loài
Lac.
lactis
là
một
trong
những
vi
sinh
vật
đóng
vai
trò quan
trọng
nhất
trong
công
nghiệp
sữa.
Lac.
lactis
là
loại
vi
khuẩn
có
vai
trò
quan
trọng
chủ
yếu
trong
công
nghiệp
sữa
như
sản
xuất
nước
sữa
(buttermilk),
sữa
chua, pho
mát.
Khi
Lac.
lactis
được
thêm
vào
sữa,
chúng
sử
dụng
enzym
để
sinh
năng
lượng ATP
từ
đường
lactose.
Axit
lactic
sinh
ra
bởi
tế
bào
vi
khuẩn
làm
đông
sữa
và
được
sử dụng
để
sản
xuất
pho
mát
và
sữa
tương
(whey).
Ngoài
ra,
loài
vi
khuẩn
này
cũng
đã
được
ứng
dụng
trong
công
nghệ
sản
xuất
các
loại
rau
muối
chua,
bia,
rượu
vang,
một
số
loại
bánh
mỳ
và
các
sản
phẩm
thực
phẩm lên
men
khác.
Ngày
nay,
các
nhà
nghiên
cứu
tin
tưởng
rằng
việc
hiểu
biết
về
đặc
tính sinh
lý
và
di
truyền
của
loài
vi
khuẩn
này
sẽ
cung
cấp
cho
ngành
chế
biến
thực
phẩm cũng
như
dược
phẩm
nguồn
lợi
quý.
1.2.2.
Cấu
trúc
phân
tử
của
nisin
Công
thức
hoàn
chỉnh
của
nisin
A
vào
năm
1971.
Khối
lượng
phân
tử
nisin
là
3353
Da
gồm
34
axit
amin
trong
đó
có
một
số
axit
amin
dị
thường
như
sự
khử
nước
ở
serinee
và
threonine
tạo
axit
amin
dehydroalanine
và
dehydrobutyrine.
Các
axit
amin
liên
kết
nhau
qua
cầu
nối
lưu
huỳnh
tạo
5
vòng
đặc
trưng
(Gross
và
Morell,
1971)
.
Nisin
thuộc
nhóm
lantibiotics,
do
có
chứa
các
gốc
axit
amin
đặc
biệt dehydroalanine,
dehydrobutyrine,
lanthionine
và
3-methyllanthionine
(Klaenhammer,
1993).
Đến
nay
người
ta
đã
phát
hiện
ra
4
dạng
của
nisin,
đó
là:
nisin
A
(Gross
và
Morell,
1971),
nisin
Z
(Mulder
và
cs.
,
1991),
nisin
Q
(Zendo
và
cs.,
2003)
và
nisin
F
(Kwaadsteniet
và
cs.,
2008).
NisA
và
NisZ
khác
nhau
ở
vị
trí
axit
amin
thứ
27
(NisA
-
histidin;
NisZ
–asparagin).
NisA
và
NisF
khác
nhau
ở
2
vị
trí
axit
amin
thứ
27
(NisA-
histidin;
NisF-
asparagin)
và
vị
trí
30
(NisA-
isoleucine
và
NisF-
valine).
NisQ
khác biệt
hơn
cả,
khác
NisA
ở
4
axit
amin
(ở
vị
trí
thứ
tự
15,
21,
27
và
30)
và
khác
nisin
Z
10
ở
3
axit
amin
(ở
vị
trí
thứ
tự
15,
21
và
30).
Tìm
kiếm
các
dạng
khác
nhau
của bacterioxin
là
hướng
nghiên
cứu
được
nhiều
nhà
khoa
học
tham
gia
theo
đuổi,
nhằm
tìm
ra
các
bacterioxin
có
đặc
tính
ứng
dụng
cao;
nhằm
so
sánh
các
bacterioxin
để
cung
cấp
các
thông
tin
quý
báu
trong
việc
giải
thích
mối
liên
hệ
giữa
cấu
trúc
và
chức
năng
của
bacterioxin
–
một
vấn
đề
đến
nay
còn
chưa
hoàn
toàn
được
sáng
tỏ
(Tagg
và
cs.,
1976;
Eijsink
và
cs.,
1998;
Sato
và
cs.,
2002;
Sakayori
và
cs.,
2003).
Ala-S-Ala : Lanthionine ; Abu-S-Ala: 3-methyllanthionine ;
DHA : dehydroalanine
DHB : Dehydrobutyrine
( β-metyldehydroalanine)
Hình
1.1.
Cấu
trúc
phân
tử
nisin
(Gross
và
Morell,
1971)
Nisin
có
cấu
trúc
xoắn
α
tương
tự
colixin,
khoảng
cách
của
cầu
nối
C
–
S
là
1,83
A¨
và
góc
C
–
S
–
C
là
103
A¨.
Phân
tử
nisin
có
gốc
amino
và
cacboxyl
ở
cuối
nhóm,
năm
vòng
bên
trong
được
tạo
bởi
liên
kết
thioether.
Vòng
đầu
tiên
Ala-S-Ala
là
lanthionine,
4
vòng
còn
lại
là
Abu-S-Ala
là
các
β
-methyllanthionine.
Ngoài
cầu
nối disulfide
giữa
dạng
lanthionine
với
methyllanthionine,
mạch
peptide
còn
nối
với
nhau bằng
–NH
−
tạo
ra
dạng
polymer
hay
nhiều
monomer
(Hurst,
1981).
Nisin
không
hấp phụ
ở
bước
sóng
260
nm
hay
280
nm
do
trong
cấu
trúc
phân
tử
của
nó
không
chứa
các axit
amin
thơm.
Nisin
thường
xuất
hiện
ở
dạng
dimer
và
tetramer
với
trọng
lượng phân
tử
khoảng
7000
và
14000
Da
(Bailey
và
Hurst,
1971).
1.2.3.
Tính
chất
của
nisin
Nisin
tương
đối
bền
nhiệt.
Độ
bền
và
khả
năng
hoà
tan
của
nisin
phụ
thuộc
nhiều
vào
pH.
Khi
thanh
trùng
ở
115
0
C
nisin
vẫn
bền
ở
pH
2,
bị
mất
hoạt
tính
40%
ở
pH
5
11
và
mất
hơn
90%
ở
pH
6,8.
Khi
pH
>7
xảy
ra
hiện
tượng
mất
hoạt
tính
không
thể
khắc
phục
kể
cả
ở
nhiệt
độ
thường
(Hurst,
1981).
Khả
năng
hoà
tan
của
nisin
tốt
nhất
ở
pH
2,
tại
pH
2,5
giảm
xuống
còn
60%,
tại
pH
5,0
giảm
xuỗng
còn
4%
và
hầu
như
không
tan
ở
pH
trung
tính
và
kiềm.
Khi
hoà tan
nisin
trong
HCl
pH
2,5
(hoặc
thấp
hơn),
tại
nhiệt
độ
sôi
mà
không
mất
hoạt
tính
và thậm
chí
khi
thanh
trùng
cũng
không
mất
hoạt
tính.
Nisin
có
độ
hoà
tan
thấp
ở
pH
sinh lý
(Hurst,
1981).
Nồng
độ
muối
cũng
ảnh
hưởng
đến
độ
bền
của
nisin.
Hoạt
tính
nisin
tăng
lên
khi
có
mặt
NaCl
từ
0%
đến
4%.
Trong
dung
dịch
4
–
10%
NaCl,
hoạt
tính
nisin
còn
giữ
được
80%
(Phan
Thị
Khánh
Hoa,
2003).
Tính
chất
này
cho
thấy
tiềm
năng
áp
dụng
nisin
trong
bảo
quản
các
sản
phẩm
thực
phẩm
có
nồng
độ
muối
cao.
Nisin
bị
phá
huỷ
bởi
một
số
protease
như
α
-chymotripsin,
proteinase
K
của
Bacillus
cereus
và
nisinase
của
Streptococcus
thermophilus
.
Nisin
thường
bị
hạn
chế bởi
một
số
protease
đặc
biệt
là
protease
của
dạ
dày
và
của
tuyến
tuỵ.
Nisin
không
tìm thấy
trong
nước
bọt
của
con
người
sau
hơn
10
phút
ăn
thực
phẩm
có
chứa
nisin.
Đây
là yếu
tố
quan
trọng
giúp
nisin
trở
thành
một
trong
những
chất
bảo
quản
thực
phẩm
an
toàn
đối
với
con
người
được
tin
tưởng
sử
dụng
hiện
nay.
1.2.4.
Cơ
chế
tác
dụng
của
nisin
Nisin
có
tác
dụng
ức
chế
vi
khuẩn
gram
dương,
đặc
biệt
là
các
vi
khuẩn
gây
bệnh,
gây
hỏng
thực
phẩm
như
Clostridium
butiricum
và
Cl.
Tyrobutiricum,
Staphylococcus
aureus,
Bacillus
cereus
.
(Chinachoti,1997;
Desmazeaud,1996;
Dodd
và
Gasson,
1994;
Hurst,
1981;
Rauch
và
De
Vos,
1992).
Đối
với
bào
tử,
nisin
có
khả
năng
ức
chế
sự
nảy
mầm
của
chúng.
Mặc
dù
không
có
khả
năng
ức
chế
và
tiêu
diệt
vi
khuẩn
Gram (-
)
nhưng
khi
kết
hợp
với
EDTA
hoặc
một
vài
nhân
tố
khác
như
nhiệt
độ,
axit
thì nisin
có
khả
năng
ức
chế
sự
phát
triển
của
vài
loại
vi
khuẩn
này
(Blackburn
và
cs.,1989;
Stevens
và
cs.,
1991).
Nisin
được
xem
là
một
chất
kháng
khuẩn
có
khả
năng
ức
chế
hoặc
tiêu
diệt
vi
khuẩn
Gram
(+).
Tác
dụng
của
nisin
lên
tế
bào
tại
pha
sinh
trưởng
thường
mạnh
hơn
12
rất
nhiều
so
với
tế
bào
tại
pha
cân
bằng
(Desmazeaud,
1996).
Nguyên
nhân
do
sự
phá
vỡ
các
tổ
chức
cục
bộ
trên
màng
tế
bào
nhạy
cảm
với
nisin,
sau
đó
phá
vỡ
màng
tế bào,
xâm
nhập
vào
tế
bào
chất
và
làm
chết
tế
bào
vi
sinh
vật
đó
(
Garriga
và
cs.,
1993; Tagg
và
cs.,
1976).
Nisin
cũng
như
phần
lớn
các
bacterioxin
khác
không
có
khả
năng
ức
chế
và
tiêu
diệt
vi
khuẩn
Gram
(-),
trừ
Salmonella
typhimurium
,
E.
coli
bị
ức
chế
khi
có
mặt
của
EDTA.
Ngoài
ra
bất
kỳ
sự
ức
chế
nào
của
vi
khuẩn
lactic
đối
với
vi
khuẩn
Gram
(-) đều
do
các
nguyên
nhân
khác
chẳng
hạn
như
pH
thấp,
H
2
O
2
,
cạnh
tranh
về
dinh
dưỡng,
hay
do
tính
kỵ
nước
của
chúng.
Điều
này
được
giải
thích
là
do
sự
khác
nhau của
thành
tế
bào
của
vi
khuẩn
Gram
(+)
và
Gram
(-).
Bacterioxin
chỉ
tạo
được
lỗ
thủng trên
thành
tế
bào
Gram
(+)
mà
không
tạo
được
lỗ
thủng
trên
thành
tế
bào
Gram
(-)
(Desmazeaud,1996).
Tác
dụng
của
nisin
lên
vi
sinh
vật
nhạy
cảm
bao
gồm
2
kiểu
hình
(Hình
1.2). Kiểu
tác
dụng
không
đặc
trưng:
nisin
bám
dính
lên
bề
mặt
của
tế
bào
nhạy
cảm
mà
không
cần
phải
có
bất
kỳ
một
thụ
thể
đặc
biệt
nào
của
vi
khuẩn
Gram
(+)
và
phá
thủng
màng
tế
bào
làm
thoát
các
thành
phần
nội
bào
dẫn
đến
tiêu
diệt
vi
khuẩn
(Dodd
và
cs.,
1994;
Gao
và
cs.,
1991).
Kiểu
hình
thứ
2:
nisin
tương
tác
đặc
hiệu
với
lipid
II
tiền
tố
peptidoglucan
để
phá
thủng
màng
tế
bào
đích
(Wiedemann
và
cs.,
2001)
và
sự
tương tắc
đặc
hiệu
có
sự
tham
gia
của
2
peptide
và
lipid
II
tiền
tố
thành
tế
bào
(Wiedemann và
cs.,
2006).
Mức
độ
tác
động
của
nisin
lên
các
loại
vi
khuẩn
rất
khác
nhau,
phụ
thuộc
vào
thành
phần
của
màng
phospholipid
của
tế
bào
vi
khuẩn
(Ruhr
và
Sahl,
1985).
Ở
vi khuẩn
Gram
(+),
peptidoglycan
chiếm
90%
khối
lượng
thành
tế
bào,
số
lớp peptidoglycan
có
thể
lên
tới
25
lớp.
Trong
khi
đó
ở
vi
khuẩn
Gram
(-)
lượng peptidoglycan
chỉ
chiếm
10%
tổng
khối
lượng
thành
tế
bào,
ngoài
ra
chúng
còn
có
một lớp
màng
ngoài
quan
trọng
(outer
membrane
–
OM).
Lớp
màng
ngoài
này
có
cấu
tạo lipid
kép
tương
tự
màng
nguyên
sinh
chất
nhưng
không
chỉ
có
phospholipid
hình
thành nên
cấu
trúc
mà
còn
có
polysaccharide
và
protein.
Lipid
và
polysaccharide
liên
kết chặt
chẽ
với
nhau
tạo
thành
một
cấu
trúc
lipopolysaccharide
đặc
biệt
bên
ngoài
thành
