Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Lan Anh

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN
QUAN ĐẾN UNG THƯ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở
NGƯỜI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Hà Nội – Năm 2012

Lê Thị Lan Anh

2

Cao học K18


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lê Thị Lan Anh

SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MLH1 LIÊN

QUAN ĐẾN UNG THƯ RUỘT KẾT KHÔNG POLYP DI TRUYỀN Ở
NGƯỜI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Hà Nội – Năm 2012

Lê Thị Lan Anh
K18

4

Cao học


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hồng Vân - người
thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ThS. Trần Thị Thùy Anh, người
thầy đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong nghiên cứu
khoa học kể từ khi tôi bắt đầu tiến hành nghiên cứu và thực hiện luận văn khoa học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học,

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; các anh, chị, em Phòng Sinh
học thụ thể và phát triển thuốc thuộc phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ
Enzym và Protein đã tạo mọi điều kiện về cơ sở, vật chất và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học và Ban chủ
nhiệm Khoa Sinh học đã chỉ dạy, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quý báu và tạo
cho tôi có một môi trường học tập và nghiên cứu thuận lợi nhất.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình và bạn
bè, những người đã động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Hà Nội, ngày 14 tháng 12 năm 2012
Học viên
Lê Thị Lan Anh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.........................................................................................................12
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................15
1.1. Di truyền ung thư
15
1.1.1. Khái niệm ung thư
15
1.1.2. Gen ung thư và gen ức chế khối u.................................................15
Hình 1. Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3]
17
1.2. Hội chứng ung thư ruột kết
17
1.3. Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)
18
1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC...................................................19

1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC
23
1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair)....25
1.4.4. Gen MLH1
32
1.5. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC
35
Những phương pháp thường được dùng có thể kể đến như RT-PCR
(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction), RAPD-PCR
(Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence
Repeat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), PCRRFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism), PCR-SSCP (Single
Strand Conformation Polymorphisms)....................................................35
1.5.1. Kỹ thuật PCR.................................................................................35
1.5.2. Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)...................................................................36
1.5.3. Kỹ thuật phân tích các trình tự lăp lại đơn giản (SSR - Simple
Sequence Repeat)....................................................................................36
1.5.5. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand
Conformation Polymorphism).................................................................38
1.5.6. Phương pháp giải trình tự ADN....................................................40
1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................41
1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài.....................................................41
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................42
2.1. Vật liệu nghiên cứu
42
2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu...........................................................43
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................49
3.1. Tách chiết ADN tổng số
49
3.2. Phản ứng PCR
51

Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
3.3.Kết quả phân tích SSCP
3.5. Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự
I. KẾT LUẬN
II. KIẾN NGHỊ

58
71
77
78

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Độ thâm nhập của các đột biến MLH1 và MSH2 trong các bệnh nhân ung
thư
Bảng 2. Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC
Bảng 3. Các gen MMR liên quan tới HNPCC
Bảng 4. Cấu trúc các gen MMR
Bảng 5. Tỉ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 ở các bệnh
nhân HNPCC
Bảng 6. Các thành phần phản ứng PCR
Bảng 7. Trình tự mồi tương ứng của các exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19 của gen
MLH1
Bảng 8. Thành phần PAGE 12% cho 10 ml dung dịch
Bảng 9. Thành phần tham gia phản ứng cắt exon 16, 18 và 19 gen MLH1
Bảng 10. Chu trình nhiệt PCR tối ưu của exon 8, 13, 14, 16, 17, 18 và 19 gen
MLH1

Lê Thị Lan Anh

7

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Lê Thị Lan Anh

8

Cao học K18


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng
Hình 2. Các phân nhóm chính của ung thư ruột kết
Hình 3. Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh
Hình 4. Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai ở E.coli
Hình 5. Sửa chữa ADN bắt cặp sai ở người
Hình 6. Con đường dẫn đến ung thư di truyền ở người thông qua đột biến các gen
sửa chữa bắt cặp sai (MMR)
Hình 7. Tỷ lệ các loại đột biến phát hiện ở gen MLH1, MSH2 và MSH6
Hình 8. Vị trí của MLH1 trong NST số 3
Hình 9. Sơ đồ gen MLH1
Hình 10. Sơ đồ các protein được mã hóa bởi MLH1
Hình 11. Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR
Hình 12. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số
từ mẫu máu

Hình 13. Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1 với các nhiệt độ gắn mồi: 600C, 60,50C,
610C, 61,50C
Hình 14. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1
Hình 15. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1
Hình 16. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1
Hình 17. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1
Hình 18. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1
Hình 19. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1
Hình 20. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1


Hình 21. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1
Hình 22. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 13 gen MLH1
Hình 23. (A), (B) Kết quả phân tích SSCP exon 14 gen MLH1
Hình 24. Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1
Hình 25. Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1
Hình 26. Kết quả phân tích SSCP exon 18 gen MLH1
Hình 27. Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1
Hình 28. Kết quả PCR-RFLP các mẫu máu từ 20 thành viên của gia đình mắc hội
chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền ở Nhật Bản
Hình 29. Dự đoán kết quả phản ứng cắt exon 16 gen MLH1 bằng enzym MspI
Hình 30. Sản phẩm cắt exon 16 và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose
2%
Hình 31. Dự đoán sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI
Hình 32. Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide
12%
Hình 33. Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 bằng enzym CviQI
Hình 34. (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên
gel polyacrylamide 12%
Hình 35. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6. (B)

Trình tự ngược của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 203
G>A
Hình 36. (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19.
(B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí
176C>G và một đột biến thay thế ở vị trí 185T>A.
Hình 37. So sánh trình tự exon 18 từ mẫu mô ung thư của bệnh nhân 20 và mô
người bình thường
Hình 38. Kết quả so sánh trình tự exon 18 từ mẫu máu và mẫu mô của bệnh nhân số 19


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
ADN
ARN
RNase
APS
BLB
bp
dNTP
EDTA
FAP

Deoxyribonucleic Acid

Ribonucleic Acid
Ribonuclease
Ammonium persulphate
Blood Lysis Buffer
base pair
Deoxyribonucleotide Triphosphate
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Familial Adenomatous Polyposis

HNPCC

Hereditary Non – Polyposis
Colorectal Cancer
Kilobase
Loss of Heterozygosity
Mismatch Repair
Microsatellite Instability

Kb
LOH
MMR
MSI
NST
PCR
RFLP
RT-PCR
SNP
SSCP
SSR
TLB

TAE
TE
TEMED

Polymerase Chain Reaction
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Reverse Transcription PCR
Single Nucleotide Polymorphism
Single Strand Conformation
Polymorphism
Simple Sequence Repeat
Tissue Lysis Buffer
Tris – Acetic acid – EDTA
Tris – EDTA
N,N,N’,N’- tetramethylenediamine

Axit deoxyribonucleic
Axit ribonucleic
Ribonuclease
Dung dịch đệm phân giải tế bào máu
cặp bazơ nitơ
Deoxyribonucleotit triphotphat
Hội chứng u tuyến polyp theo dòng
họ
Ung thư ruột kết không polyp di
truyền
Kilobazơ
Mất tính dị hợp tử
Sửa chữa bắt cặp sai

Tính bất ổn vi vệ tinh
Nhiễm sắc thể
Phản ứng chuỗi nhờ polymeraza
Tính đa hình độ dài đoạn giới hạn
PCR phiên mã ngược
Tính đa hình đơn nucleotit
Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn
Trình tự lặp lại đơn giản
Dung dịch đệm phân giải tế bào mô

MỞ ĐẦU

Lê Thị Lan Anh

12

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử
đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học. Các kỹ
thuật mới như tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen và nhiều kỹ
thuật sinh học phân tử khác ngày càng được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả
trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thư.
Sự phát hiện ung thư là một bệnh di truyền được coi là một thắng lợi của
sinh y học hiện đại. Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ và hiệu quả đã
giúp xác định chi tiết các biến đổi di truyền là nhân tố trực tiếp gây ung thư,
bắt đầu từ sự hình thành các khối u, sau đó là sự tăng sinh và lan rộng của
chúng.

Tỷ lệ mắc bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên thế
giới. Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 22,4 triệu người
đang sống chung với bệnh ung thư. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng
năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mới mắc ung thư. Các ung thư
hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt
tuyến, gan; Ở nữ giới là ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi.
Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính mỗi năm có khoảng trên 6,7 triệu
người chết do ung thư. Tỷ lệ chết do ung thư chiếm 12% trong số các nguyên
nhân gây tử vong ở người [28]. Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới
khoảng 200.000 người và khoảng 75.000 người chết vì bệnh ung thư [47].
Trong số các bệnh ung thư thường gặp ở người, ung thư đại trực tràng là
loại ung thư tương đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trường hợp
ung thư và chiếm tới 15,2% tổng số các trường hợp tử vong vì ung thư. Loại ung
thư này thường gặp nhiều hơn ở các nước phát triển và có xu hướng tăng nhanh
ở các nước đang phát triển. Nguy cơ ung thư đại trực tràng tăng cao hơn ở những
người có tiền sử viêm đại tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có người bị ung thư
đại trực tràng [3].

Lê Thị Lan Anh

13

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary
Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn được gọi là hội chứng Lynch chiếm 15%
các trường hợp ung thư đại trực tràng. Đây là hội chứng di truyền trội do gen
trên nhiễm sắc thể thường gây ra. Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm

của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2,
MSH6 và PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa
chữa bắt cặp sai là nguyên nhân gây HNPCC. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các
đột biến trong gen MLH1 chiếm khoảng 50% trong số các đột biến xác định
được ở các gen MMR [2, 5]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1
được thực hiện ở rất nhiều quần thể người khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm
di truyền trong chẩn đoán ung thư nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng
hầu như chưa được thực hiện. Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các
gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm
đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và
mở ra hướng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm
ung thư ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư
ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam”.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung
tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và
phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và
Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

Lê Thị Lan Anh

14

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Di truyền ung thư
1.1.1. Khái niệm ung thư
Ung thư không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh
phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trưởng không kiểm soát được, có được sự bất
tử, xâm lấn và khả năng di căn. Thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng để
chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình
thường [17].
Khối u là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau và có khả năng
phân chia một cách không kiểm soát. Sự phân biệt giữa các khối u lành và u ác
tính đơn thuần dựa trên khả năng xâm lấn của chúng. Nếu một khối u ác tính sau
khi xâm lấn tiếp cận được với mạch máu hoặc mạch bạch huyết, thì tế bào của nó
có thể di căn và phát triển tại các mô ở xa tại nơi chúng di chuyển tới. U di căn
có thể gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong. Quá trình
tăng trưởng của một khối u bắt đầu từ tế bào bị biến đổi di truyền bất thường
này được gọi là quá trình hay sự phát sinh ung thư. Vì các khối u thường bắt
nguồn từ những khối u nhỏ lành tính, rồi sau đó chuyển sang trạng thái ác tính
và di căn, nên trong quá trình phát sinh ung thư, những tế bào hình thành khối u
có xu hướng tích lũy các biến đổi di truyền và qua đó có những đặc tính mới.
Sự tích lũy các gen ung thư ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung
thư [17].
1.1.2. Gen ung thư và gen ức chế khối u
Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng
nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư cũng
có thể được coi như các dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do
kết quả của đột biến [3].
Các cá thể được truyền các gen ung thư phát sinh từ các tế bào mầm sinh

Lê Thị Lan Anh

15

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
dục (còn gọi là các gen ung thư bẩm sinh) từ bố, mẹ sẽ mang gen ung thư này
trong hầu hết các tế bào của cơ thể, ở cả các tế bào sinh dưỡng và các tế bào
sinh dục (những cá thể này được gọi là các thể mang). Ngược lại, các gen ung
thư phát sinh từ các tế bào sôma sẽ không được truyền cho các thế hệ sau [17].
Các khối u tích lũy dần các gen ung thư khi chúng tăng trưởng. Sự tích
lũy các gen đột biến gây ung thư có thể diễn ra theo ba con đường: 1) Được
truyền qua dòng sinh dục, 2) Do đột biến tự phát trong tế bào sôma và 3) Do sự
lây nhiễm của virut.
Các gen ung thư quan trọng có thể được nhóm lại theo chức năng bình
thường của chúng trong một tế bào. Các tiền gen ung thư (Proto-oncogenes) là các
gen có vai trò quan trọng, ví dụ điều hòa sự sinh trưởng tế bào, sinh sản và biệt hóa
tế bào. Các gen tiền ung thư có thể được kích hoạt và trở thành gen ung thư thông
qua đột biến điểm, sao chép hoặc chuyển đoạn. Các gen ung thư được di truyền trội,
vì chỉ có một đột biến là đủ gây ra thay đổi chức năng tế bào, tuy nhiên, các gen ung
thư hiếm khi là nguyên nhân gây ra sự nhạy cảm di truyền ung thư.
Mặt khác, gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế
sự sinh sản của tế bào có thể gây tổn thương ADN và do đó cung cấp cho các khối u
một lợi thế tăng trưởng. Knudson quan sát thấy rằng các gen ức chế khối u là các
gen lặn, cần phải có “cú đánh thứ hai” (cả hai alen trở thành bất hoạt) cho sự phát
triển của bệnh ung thư. Sự ức chế khối u đã được mô tả trong một số hình thức di
truyền của bệnh ung thư, “đòn thứ nhất” được di truyền và “đòn thứ hai” xảy ra ở tế
bào soma [28]. Hơn nữa, các gen ức chế khối u có thể được chia thành gen gác cổng
(Gatekeeper), gen trông giữ (Caretaker) và gen làm cảnh (Lanscaper). Gen gác cổng
trực tiếp ức chế sự phát triển hoặc thúc đẩy tế bào chết, ví dụ gen APC khi bị đột
biến sinh u tuyến polyp theo dòng họ (FAP). Ngược lại, các gen trông giữ, không

trực tiếp thúc đẩy sự phát triển khối u, nhưng sự bất hoạt của chúng dẫn đến sự mất
ổn định di truyền là nguyên nhân gia tăng tỷ lệ đột biến trong cả gen ung thư và gen
ức chế khối u, góp phần cho sự tạo thành các khối u. Một ví dụ về gen trông giữ là

Lê Thị Lan Anh

16

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) mở đường cho hội chứng Lynch. Gen “làm
cảnh”, như tên của nó, gián tiếp gây ra ung thư bằng cách thay đổi cảnh quan, có
nghĩa là vi môi trường, tạo thuận lợi đối với sự hình thành khối u. Hiện tượng này
đã được quan sát thấy trong ung thư ruột kết, nơi các môi trường mô đệm bất
thường ảnh hưởng đến sự phát triển và tăng trưởng của các tế bào biểu mô, dẫn đến
sự hình thành ung thư (Hình 1).

Hình 1. Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3]

1.2. Hội chứng ung thư ruột kết
Ung thư ruột kết hay còn gọi là ung thư đại trực tràng là một loại ung thư
biểu mô rất thường gặp. Đây là một trong những bệnh ung thư biểu mô phổ biến
nhất trên thế giới, là ung thư gây tử vong đứng thứ hai ở Mỹ và đang có xu hướng
tăng lên ở các nước đang phát triển [8, 19]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực
tràng chỉ sau ung thư dạ dày. Tương tự như các loại ung thư khác, nguyên nhân gây
ra ung thư đại trực tràng có thể là do đột biến phát sinh trong quá trình phát triển cá

Lê Thị Lan Anh

17

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
thể (ung thư thứ phát) hoặc được di truyền từ cha mẹ. Rất khó xác định chắc chắn
sự di truyền các gen ung thư góp bao nhiêu phần vào sự phát sinh ung thư trực
tràng, nhưng con số ước tính về tỉ lệ ca ung thư trực tràng liên quan đến các gen ung
thư bẩm sinh vào khoảng 15 - 50%. Độ tuổi mắc bệnh trung bình khoảng 45 – 50,
nhưng cũng có thể sớm hơn ở giai đoạn thanh thiếu niên và gần đây có xu hướng trẻ
hoá với nhiều trường hợp mắc bệnh ở độ tuổi 18 - 20 [47].
Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng
chính là rải rác, gia đình và di truyền. Trong đó, ung thư ruột kết rải rác (không di
truyền) chiếm 65-85%, ung thư ruột kết gia đình chiếm tỉ lệ 10%-30% và ung thư
đại trực tràng di truyền chiếm khoảng 5% trong tổng số các dạng ung thư ruột kết
(Hình 2).

Hình 2.
Các
phân
nhóm
chính
của ung
thư ruột
kết [11]

Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh
polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền

(HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch. Hội chứng Lynch được
lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này.
1.3. Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)
Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) là một
bệnh di truyền tương đối phổ biến. Sự nhận biết chậm trễ hội chứng này xảy ra
do ung thư đại trực tràng rất phổ biến trong quần thể, và vì các cá thể bị ảnh

Lê Thị Lan Anh

18

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
hưởng bởi HNPCC không có các tính trạng có thể phân biệt được, ngoài việc có tỷ
lệ mắc phải ung thư tăng cao. Các nhân tố này đóng góp vào những khó khăn của
việc xác định chắc chắn bệnh [14].
1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC
HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, gây
nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ
thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ
yếu là gen MLH1 và MSH2 [14]. Đa số các đột biến ở gen MLH1 và MSH2 là đột
biến vô nghĩa, nhầm nghĩa hoặc đột biến dịch khung cũng như các thay đổi ảnh
hưởng đến vị trí ghép nối. Tuy nhiên, gần đây hơn, sử dụng kỹ thuật mới cho thấy
trong một số quần thể, một tỷ lệ tương đối lớn của việc thay đổi tác nhân gây bệnh
là sắp xếp lại bộ gen, mất các vùng đa exon, đơn exon, tái bản của gen MLH1 hoặc
gen MSH2. Các đột biến đã biết được phân bố rải rác ở khắp các vùng mã hóa của
các gen này. Mặc dù vậy, ở một vài quần thể (ví dụ Phần Lan, Ba Lan và Hoa Kỳ)
một số thay đổi lặp lại đã được tìm thấy và được mô tả như các đột biến khởi phát.

Cho đến nay, hơn 300 đột biến gen MMR khác nhau đã được xác định trong khoảng
500 gia đình HNPCC [42]. Những bệnh nhân HNPCC hình thành ung thư ở tuổi
còn trẻ, điển hình là khoảng giữa tuổi 40, nhưng cũng có thể sớm hơn ở giai
đoạn thanh thiếu niên [34].
Bước đầu tiên có thể tiến hành xét nghiệm đối với các cá thể có nguy cơ mắc
bệnh cao từ các quần thể được phân lập [44]. Tuy nhiên, trong số các gia đình được
chẩn đoán lâm sàng với hội chứng Lynch, tỷ lệ đột biến MMR thay đổi đáng kể
giữa các nghiên cứu khác nhau, dao động khoảng từ 30 - 90% [32]. Trong các gia
đình âm tính với đột biến MMR, nguyên nhân vẫn chưa được giải thích rõ ràng,
nhưng có thể giải thích do sự thay đổi cấu trúc phức tạp nhất định cũng như những
thay đổi điều hòa trong các vùng không mã hóa [53]. MSI được sử dụng để kiểm tra
trực tiếp xem tình trạng thiếu hụt MMR (một kiểu hình đột biến) tham gia vào các
loại ung thư cụ thể.

Lê Thị Lan Anh

19

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
Mặc dù, tất cả các tế bào ở những bệnh nhân mắc hội chứng Lynch mang
một đột biến gen MMR ("cú đánh đầu tiên"), nhưng sự phát triển khối u yêu cầu
thêm sự bất hoạt thể soma của các alen kiểu dại còn lại ("cú đánh thứ hai") trong
một mô đích. Đột biến dòng mầm trong gen MMR dẫn đến sự tích lũy các lỗi sao
chép, chủ yếu là tại các trình tự ADN ngắn lặp đi lặp lại trong các tế bào khối u và
làm phát sinh các dấu hiệu phân tử của hội chứng Lynch. Sự bất ổn vi vệ tinh (MSI)
đóng góp đối với ung thư thông qua sự tăng tỷ lệ đột biến trong cả trình tự vi vệ tinh
và các gen quan trọng trong ức chế ung thư. ADN từ các khối u HNPCC cho thấy

có sự bất ổn vi vệ tinh. Các báo cáo cho thấy bệnh nhân HNPCC có tiên lượng tốt
hơn so với bệnh nhân ung thư đại trực tràng rải rác [17].
Trong khi, HNPCC được nhận biết như là một thực thể bệnh bằng việc
xác định một số lượng lớn thành viên trong gia đình bị ảnh hưởng, nhiều
người mang các đột biến gen HNPCC khác cũng được xác định trong quần thể
dựa vào những sàng lọc di truyền. Xét nghiệm di truyền đã cho thấy rằng các
đột biến gen MMR có độ thâm nhập khá cao trong các cá thể mang ung thư
nội mạc tử cung và đại trực tràng di truyền, hầu hết trong số đó không phải là
thành viên của các gia đình có HNPCC (Bảng 1).
Bảng 1. Độ thâm nhập của các đột biến MLH1 và MSH2 trong các bệnh nhân ung thư
[54]
Lịch sử gia đình

Ung thư đại trực tràng (< 50 tuổi)
Ung thư đại trực tràng (> 50 tuổi)
Ung thư nội mạc tử cung (< 50 tuổi)
Các ung thư khác liên kết HNPCC

Tỷ lệ những người trong họ

Tỷ lệ những người bị

không bị bệnh (%)
9,1
<5
11
6,5

bệnh ≥ 1
22

15
23
16

Xét nghiệm di truyền dự đoán cho các đột biến dòng mầm trong các gen
MMR như MLH1 hoặc MSH2 có thể cho phép xác định HNPCC theo dòng họ, tạo
điều kiện thuận lợi cho việc điều trị sớm và giảm tỷ lệ tử vong. Vì vậy, sàng lọc các

Lê Thị Lan Anh

20

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
đột biến gen MMR có tầm quan trọng lâm sàng trực tiếp cho tư vấn và quản lý các
gia đình HNPCC.
Việc xác định thể mang bệnh thường dựa trên các thể được sàng lọc từ các
gia đình đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế cho hội chứng này, cụ thể là tiêu chuẩn
Amsterdam I và II hoặc tiêu chuẩn ít nghiêm ngặt hơn được gọi là chỉ dẫn Bethesda
[52].
1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u
Khi hội chứng Lynch được mô tả lần đầu tiên, nó được coi là một hội chứng
dòng họ đặc trưng bởi sự gia tăng của bệnh ung thư nội mạc tử cung và trực tràng.
Tuy nhiên, các khối u có nguy cơ tương đối cao so với quần thể chung được coi là
các khối u của hội chứng Lynch [54]. Vì vậy, thuật ngữ ung thư ruột kết không
polyp di truyền có thể là quá hạn chế và hội chứng Lynch đã được đề xuất như một
tên thích hợp hơn để bao phủ hội chứng này [49, 50].
Việc chẩn đoán của HNPCC có thể được thực hiện trên cơ sở các tiêu chuẩn

lâm sàng Amsterdam hoặc bằng cách kiểm tra di truyền phân tử của các đột biến
dòng mầm trong một gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR). Năm 1990, tập đoàn hợp tác
quốc tế về ung thư đại trực tràng không polyp di truyền đã thành lập các tiêu chí với
mục đích chẩn đoán lâm sàng các gia đình có HNPCC (tiêu chuẩn Amsterdam I).
Theo tiêu chuẩn Amsterdam I những gia đình đáp ứng các điều kiện sau đây được
coi là mắc HNPCC: (1) Có tối thiểu ba người trong phả hệ mắc ung thư đại trực
tràng; (2) Một người là trực hệ của một trong hai người còn lại; (3) Ít nhất có một
người bị ung thư đại trực tràng ở độ tuổi dưới 50. Sau đó, các tiêu chí này được coi
là quá hạn chế cho các mục đích lâm sàng và được sửa đổi để phù hợp với các bệnh
ung thư khác có liên quan đến HNPCC (tiêu chuẩn Amsterdam II) [51, 52]. Độ
chính xác của một chẩn đoán dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng phụ thuộc vào tính chính
xác của các báo cáo về lịch sử gia đình nghiên cứu.
Không giống với FAP, HNPCC không được đặc trưng bởi số lượng tăng lên
của các polyp. Ở các bệnh nhân HNPCC, thường thì số các u tuyến giống với

Lê Thị Lan Anh

21

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
tỉ lệ chung của quần thể. Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân
HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn nhiều. Không như nhiều loại
khối u khác, các khối u trực tràng rất dễ tiếp cận. Bằng thiết bị nội soi, các khối u
này có thể quan sát được bằng mắt thường ở hầu hết các giai đoạn phát triển và lan
rộng của nó. Những khối u này có một số đặc điểm đặc thù. Mức độ biệt hóa về
mặt tế bào học của những khối u này thường thấp hơn so với các khối u đơn phát
có cùng kích thước; điều này cho thấy mức độ trầm trọng của thương tổn là cao

hơn. Đối lập với tiên lượng tiêu cực như vậy, các khối u ruột già ở các bệnh
nhân HNPCC điển hình có biểu hiện tốt hơn so với các bệnh nhân ung thư đơn
phát. Điều này phần nào cho thấy các khối u ruột già liên quan đến bệnh HNPCC
tiến hóa theo cách khác với các khối u đơn phát [17, 36].
1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng
Những bệnh nhân mắc HNPCC thường hình thành ung thư khi còn khá trẻ,
trung bình là 40 tuổi, có những trường hợp còn phát bệnh sớm hơn. Những người
mang đột biến HNPCC dòng mầm không những có nguy cơ cao phát sinh bệnh ung
thư trực tràng mà còn làm tăng nguy cơ mắc một số bệnh ung thư khác như nội mạc
tử cung, dạ dày, buồng trứng, ruột non, gan, đường tiết niệu trên, não, da... 80%
người mắc HNPCC có nguy cơ sẽ mắc ung thư đại trực tràng. Tuổi trung bình của
người mắc bệnh ung thư đại trực tràng đơn phát là 61 tuổi, trong khi các bệnh nhân
HNPCC đều phát triển ung thư ở độ tuổi trung bình là 42, tức là sớm hơn khoảng 20
năm. Đối với phụ nữ, 20 - 60% bệnh nhân HNPCC có nguy cơ mắc ung thư nội
mạc tử cung. Tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư nội mạc tử cung là 46 - 62
tuổi. Trong số những phụ nữ có HNPCC phát triển thành cả ung thư ruột kết và ung
thư nội mạc tử cung khoảng 50% xuất hiện ung thư nội mạc tử cung trước [23].
Trong HNPCC, tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư dạ dày là 56 tuổi, với ung
thư u biểu mô đường ruột là loại bệnh lý phổ biến nhất được báo cáo. HNPCC kết
hợp với ung thư buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán trung bình là 42,5, khoảng 30%
được chẩn đoán trước tuổi 40 (Bảng 2) [33].

Lê Thị Lan Anh

22

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011

Bảng 2. Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC [33]
Ung thư liên quan đến
HNPCC

Tỷ lệ mắc
HNPCC

Nguy cơ
mắc bệnh

Tuổi phát
bệnh

Đại trực tràng

5,5%

80%

44

Nội mạc tử cung

2,7%

20-60%

46

Dạ dày

< 1%

11-19%

56

Buồng trứng

1,6%

9-12%

42,5

Đường tiết niệu

< 1%

4-5%

55

Ruột non

< 1%

1-4%

49

Não bộ, hệ thần kinh TƯ

< 1%

1-3%

50

Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán lâm sàng đang được sử dụng như:
khám lâm sàng, thăm dò cận lâm sàng góp phần xác định khả năng mắc hay không
mắc ung thư của bệnh nhân. Tuy nhiên, các phương pháp này không giúp chúng ta
xác định chắc chắn nguyên nhân ung thư hoặc nếu phát hiện ra thì bệnh nhân cũng
ở giai đoạn muộn. Vì thế, để xác định chính xác khả năng mắc ung thư cũng như
xác định được loại ung thư, từ đó đưa ra phác đồ điều trị bệnh ung thư nhất thiết
phải dùng các phương pháp sàng lọc sớm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử: chẩn
đoán tế bào học, các xét nghiệm huyết học, chẩn đoán mô bệnh học... Khi chẩn
đoán, các mẫu mô trực tràng có thể được phân lập để phân tích ADN. Nhờ tính phổ
biến và dễ tiếp cận, các khối u trực tràng là mô hình lí tưởng để nghiên cứu về các
gen đóng góp vào sự phát sinh khối u.
1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC
Nghiên cứu về cơ sở phân tử của HNPCC bao gồm các hướng tiếp cận
bổ trợ được áp dụng bởi nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau. Năm 1993, việc
khám phá một sai hỏng mới và ít gặp trong sửa chữa ADN ở các tế bào ung thư
đại trực tràng cung cấp một mấu chốt quan trọng. Một nhóm đứng đầu là
Manuel Perucho, trong khi nghiên cứu những đột biến mất đoạn và đột biến
khuếch đại gen để có thể chỉ ra những gen ung thư và các gen ức chế khối u mới,
thay vào đó đã tìm thấy những biến đổi soma về độ dài của các yếu tố lặp lại

Lê Thị Lan Anh

23

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
cao đã được biết như là các vi vệ tinh. Một nhóm độc lập do Stephen
Thibodeau đứng đầu cũng đã tìm thấy những trình tự vi vệ tinh bị biến đổi và thấy
rằng chúng có thể liên quan đến các khối u ở đoạn đầu ruột kết. Quan sát này
đã cung cấp một sự kết nối tiềm tàng giữa những bất thường về các vi vệ tinh
với HNPCC. Gần đây, một nhóm hợp tác do Albert de la Chapelle và Bert
Vogelstein đứng đầu đã nỗ lực lập bản đồ vị trí các locus ức chế khối u ở những
bệnh nhân Lynch sử dụng các phương pháp tách dòng vị trí. Trong khi lập bản đồ
các vùng LOH, nhóm của de la Chapelle/ Vogelstein đã phát hiện được các đột
biến ở các trình tự vi vệ tinh [35, 37, 59].
1.4.1. Tính bất ổn định vi vệ tinh
Ung thư đại trực tràng (CRC), như tất cả các ung thư khác, dường như có
liên quan đến sự bất ổn định về mặt di truyền. Sự không ổn định di truyền có thể
chia hai loại: Bất ổn định nhiễm sắc thể (CIN) và sự bất ổn định vi vệ tinh (MSI).
Các vi vệ tinh được lặp lại đơn giản, thường là hai nucleotit, trên vùng không
mã hóa của ADN, cũng có thể nằm trong gen hoặc ở giữa gen. Các trình tự vi vệ
tinh ở các tế bào sai hỏng MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu hướng mở rộng hoặc thu
hẹp chiều dài của trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này sang thế hệ khác (Hình 3). Dạng
siêu đột biến dễ phát hiện này được gọi là tính bất ổn vi vệ tinh (microsatellite
instability - MSI) [25, 55]. MSI phản ánh tình trạng đột biến tăng cao ảnh hưởng lên
toàn bộ hệ gen. Quan sát về các MSI ở các tế bào ung thư đại trực tràng cho thấy
một cơ chế hình thành khối u hoàn toàn mới. MSI không chỉ bị hạn chế đối với các
khối u đại trực tràng mà nó có thể phát hiện ở các khối u ngoài ruột kết như dạ dày,
nội mạc tử cung... [57].

Một thang chuẩn được sử dụng để đánh giá sự bất ổn vi vệ tinh trong mô
khối u và mô bình thường [10]. Một khối u được phân loại như sau:
- MSI cao nếu có nhiều hơn 30% sự bất ổn.
- MSI thấp nếu ít hơn 30% sự bất ổn.

Lê Thị Lan Anh

24

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011
- MSI ổn định nếu không có sự bất ổn.

Hình 3. Sửa chữa bắt cặp sai ở trình tự vi vệ tinh [10]

MSI có thể được phát hiện trong hơn 90% các khối u HNPCC. Khoảng 12 17% các khối u ngẫu nhiên cũng cho thấy MSI [5, 47]. Khoảng 10 - 20% ung thư
đại trực tràng xảy ra ở những cá thể không được biết là có hoặc nghi ngờ có
HNPCC có MSI gây ra bởi sự im lặng của gen MLH1 do sự methyl hóa hoặc gây ra
do đột biến soma ở các gen sửa chữa bắt cặp sai [22]. Do đó, MSI trong một u tuyến
đã được xác định là một yếu tố dự báo tốt về đột biến sửa chữa bắt cặp sai dòng
mầm tiềm ẩn [16, 30]. Tuy nhiên, vì nhiều u tuyến liên quan đến HNPCC không thể
hiện MSI nên sự vắng mặt của MSI trong các mẫu này không loại trừ HNPCC [31].
1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair)
Trong quá trình sao chép ADN, các bazơ bắt cặp sai ngay lập tức được sửa
chữa bằng phức hợp ADN polymeraza sao chép, có chức năng đọc sửa. Kết quả là
tỷ lệ lỗi của quá trình sao chép ADN theo thống kê chỉ là 10-12 bazơ. Mức độ chính
xác này cho thấy chỉ dưới 1% tế bào sẽ mang bazơ bắt cặp sai trong một pha S hoàn
chỉnh. Bên cạnh cơ chế sửa lỗi của ADN polymeraza, các bazơ bắt cặp sai còn được

xử lý nhờ cơ chế sửa chữa bắt cặp sai (MMR). Rất hiếm trường hợp các bazơ bắt
cặp sai tránh được sự phát hiện của MMR trong quá trình sao chép ADN [3].
Khoảng 15% các trường hợp ung thư đại trực tràng được thống kê là mang các sai

Lê Thị Lan Anh

25

Cao học K18