Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy của người

Style Definition: TOC 1: Space
Before: 6 pt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG

Hà Nội - 2013


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Phan Lê Thanh Hương, Trưởng Khoa Vi Khuẩn, Trưởng Phòng Vi
khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã tận tình hướng dẫn, động
viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thanh Thủy –
Trưởng Khoa An toàn sinh học - Quản lý chất lượng, Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ương và tập thể Khoa đã tạo mọi điều kiện về thời gian cho tôi thực
hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Vi khuẩn hô hấp, Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ương học đã chỉ bảo, giúp đỡ, chia sẻ tận tình cho tôi những kinh
nghiệm chuyên môn trong quá trình làm thực nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong Khoa sinh
học, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong
quá trình học tập.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn luôn động viên tinh thần để tôi
hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2013
Học viên

Đặng Thị Kiều Oanh

Formatted: Space After: 0 pt

Đặng Thị Kiều Oanh

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................ 3

Formatted: Line spacing: single

1.1. GIỚI THIỆU VỀ S.suis....................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung................................................................................ 3
1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán ... 5
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis ............................................................... 7
1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis..............................................15
1.3. BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG..........................................................................19
1.3.1. Đường lây truyền ............................................................................ 19
1.3.2. Triệu chứng..................................................................................... 19

1.3.3. Biện pháp phòng bệnh ..................................................................... 20
1.3.4. Biện pháp chống dịch ...................................................................... 21
1.3.5. Nguyên tắc điều trị .......................................................................... 21
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM..................22
1.4.1. Nuôi cấy phân lập........................................................................... 22
1.4.2. Nhuộm Gram................................................................................... 22
1.4.3. Phản ứng catalase ............................................................................ 22
1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ: ..................................................... 23
1.4.5. Phát hiện vi khuẩn S. suis bằng phản ứng Realtime PCR ................. 23
1.5. PHƯƠNG PHÁP PCR ...................................................................................24
1.5.1. Giới thiệu về phương pháp khuếch đại gen (polymerase chain reaction
– PCR) ...................................................................................................... 24
1.5.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR ................................................ 24
1.5.3. Giới thiệu về phản ứng PCR đa mồi ................................................ 28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 34
2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ..........................................................................34
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 34
2.1.2. Dịch não tủy nền ............................................................................. 34
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não
cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được
xây dựng trong đề tài): .............................................................................. 35

Đặng Thị Kiều Oanh

Cao học K18

Deleted: 22


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu ..................................................................... 35
2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ .................................................................... 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: ................................................................38
2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng ............................................. 38
2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố
chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn .............................................. 44
2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt .................................................... 46
2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia phản ứng...................... 47
2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc
lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong nghiên
cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi............................................................ 48
2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với
những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S.
suis ........................................................................................................... 48
2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis 49
2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP...................50
2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính .................... 50
2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4]..... 51

Deleted: 45

Deleted: 47

Deleted: 48

Deleted: 50
Formatted: Line spacing: single

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................... 53
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN ......53
3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng ............................................................... 53
3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: ............................... 54
3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng PCR đa mồi phát hiện S. suis
và một số yếu tố độc lực phổ biến ............................................................. 56
3.1.4. Tối ưu hóa các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi phát hiện
vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến.................................... 58
3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR được xây dựng (khả năng
lặp lại kết quả) .......................................................................................... 62
3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu) với
những vi khuẩn phổ biến gây bệnh cảnh lâm sàng giống S. suis ................ 64

Đặng Thị Kiều Oanh

Cao học K18

Deleted: 52

Deleted: 52
Deleted: 52
Deleted: 53

Deleted: 55

Deleted: 57

Deleted: 61

Deleted: 63


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ BỆNH PHẨM ĐƠN GIẢN, DỄ THỰC
HIỆN ĐỂ BỘC LỘ DNA CỦA VI KHUẨN Streptococcus suis ĐẠT HIỆU
QUẢ (ĐÁNH GIÁ BẰNG KẾT QUẢ PHÁT HIỆN CỦA PCR ĐA MỒI) ........65
3.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA

Deleted: 64

MỒI KHI ÁP DỤNG VỚI BỆNH PHẨM LÂM SÀNG......................................69

Deleted: 68

3.3.1. Kết quả nuôi cấy phân lập/xác định được vi khuẩn từ bệnh phẩm: .. 69

Deleted: 68

3.3.2. Các chi số đánh giá độ chính xác và giá trị hữu ích của các phương
pháp .......................................................................................................... 70

Deleted: 69
Formatted: Line spacing: single

KẾT LUẬN .................................................................................................. 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 76

Đặng Thị Kiều Oanh

Cao học K18

Deleted: 73
Deleted: 74


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử ............................ 3

Deleted: liên cầu lợn

Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa...... 4
Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis ............................................................... 20
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR ...................................................................... 25
Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8) ............ 54

Formatted: Line spacing: single
Deleted: 53

Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ hợp 16) ........... 55

Deleted: 54

Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện trực tiếp S. suis
trong bệnh phẩm ..................................................Error! Bookmark not defined.

Deleted: 57

Hình 3.4. Thử nghiệm hàm lượng các mồi với nồng độ mỗi mồi là 20pmol/µl ..... 59
Hình 3.5. Thử nghiệm hàm lượng mồi với nồng độ mồi khác nhau ..................... 60
Hình 3.6. Thử nghiệm Quy trình PCR đã xây dựng trên mẫu bệnh phẩm ............. 61
Hình 3.7. Mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và 2 yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi
PCR đa mồi đã hoàn thiện (kết quả với bệnh phẩm mô phỏng) ........................... 62
Hình 3.8. Kiểm tra tính đặc hiệu của tổ hợp mồi & quy trình PCR đa mồi ........... 64
0

0

Hình 3.9. Xử lý mẫu bệnh phẩm dịch não tủy ở nhiệt độ 85 C và 90 C trong 60
phút............................................................................................................... 66
Hình 3.10. Hiệu quả xử lý dịch não tủy ở nhiệt độ 800C với thời gian ủ khác nhau.... 67
Hình 3.11. Hiệu quả xử lý dịch não tủy của bệnh nhân ở 800C/60’(đánh giá bởi PCR đơn
mồi) ....................................................................Error! Bookmark not defined.
Hình 3.12. Hiệu quả xử lý dịch não tủy bằng Kit và bằng nhiệt độ 800C/60’ ........ 67
Hình 3.13. Ứng dụng quy trình PCR đa mồi đã được xây dựng trên mẫu bệnh
phẩm ............................................................................................................. 69

Deleted: 58
Deleted: 59
Deleted: 60

Formatted: Line spacing: single

Deleted: 61
Formatted: Line spacing: single
Deleted: gen mồi
Deleted: 63
Formatted: Line spacing: single
Deleted: 65
Formatted: Line spacing: single
Deleted: 66
Deleted: 66
Deleted: 66

Formatted: Line spacing: single
Deleted: 68
Formatted: Line spacing: single

Formatted: Space After: 0 pt

Đặng Thị Kiều Oanh

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis................................... 4

Formatted: Font: Not Bold

Deleted: 4

Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong nghiên
cứu [11,25,39,41] ......................................................................................... 37

Formatted: Justified

Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm.......................... 44

Deleted: 46

Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm ............................... 46

Deleted: 51

Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số................................... 51
Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR - liên quan đến khả năng mắc bệnh và không mắc
bệnh ............................................................................................................. 52
Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm mẫu ........ 53
Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp được lựa chọn trong thí nghiệm ........... 55
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chu trình PCR đến khả năng phát hiện S.suis. 56
Bảng 3.4. Khả năng phát hiện vi khuẩn và các yếu tố độc lực khi thay đổi điều
kiện quy trình PCR đa mồi ........................................................................... 57
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi được khảo sát.......... 58
Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm63
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không
dùng kit ........................................................................................................ 65
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so với
phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144............................ 70
Bảng 3.9. So sánh kết quả ba phương pháp: PCR đơn mồi, đa mồi và NCPL71

Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính xác và sự hữu ích của phương pháp
PCR đa mồi và nuôi cấy phân lập (n=153) .................................................. 71

Đặng Thị Kiều Oanh

Cao học K18

Deleted: 37
Deleted: 44

Deleted: 51

Deleted: 53
Deleted: 55
Deleted: 56
Deleted: 57
Deleted: 58
Deleted: 63
Deleted: 65
Deleted: 70
Deleted: 71
Deleted: 71
Deleted: Bảng 1.1. Hệ gen của một số
chủng Sreptococcus suis 4¶
Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu
(primer) được sử dụng trong nghiên cứu
37¶
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng
trong thử nghiệm 44¶
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được

thử nghiệm 46¶
Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán
các chỉ số 51¶
Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR - liên quan
đến khả năng mắc bệnh và không mắc
bệnh 51¶
Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính
của vi khuẩn dùng làm mẫu 52¶
Bảng 3.2. Các tổ hợp mồi thích hợp được
lựa chọn trong thí nghiệm 54¶
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các chu trình
PCR đến khả năng phát hiện S.suis 55¶
Bảng 3.4. Khả năng phát hiện vi khuẩn và
các yếu tố độc lực khi thay đổi điều kiện
quy trình PCR đa mồi 56¶
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng
PCR đa mồi được khảo sát 57¶
Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR
khi thực hiện trên mẫu bệnh phẩm 62¶
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương
pháp xử lý bệnh phẩm dùng/không dùng
kit 64¶
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của
phương pháp PCR đa mồi so với phương
pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n
= 144 69¶
Bảng 3.9. So sánh kết quả hai phương
pháp: PCR đa mồi và nuôi cấy phân
lập 70¶
Bảng 3.10. Các chỉ số đánh giá độ chính

xác và sự hữu ích của phương pháp PCR
đa mồi và nuôi cấy phân lập (n=153) 70¶


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Deleted: b

Bp

Base pair

C (-)

Chứng âm

C (+)

Chứng dương

Cps

Capsular polysaccharide

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNT

Dịch não tủy

Ef

Extracellular factor

Mrp

Muramidase-released protein

NCPL

Nuôi cấy phân lập

PCR

Polymerase chain reaction

Pư

Phản ứng

Sly

Suilysin

S.suis

Streptococcus suis

VMN

Viêm màng não

VK

Vi khuẩn

Formatted Table

Deleted: e
Deleted: r

Formatted: Font: Not Italic

Đặng Thị Kiều Oanh

Deleted: is

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á
trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng của
vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm cho
người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch.
Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở người do S. suis đã và đang được coi là
một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao. Rất
nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm khuẩn
huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm trùng
nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện lớn như
Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện
Trung ương Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây
bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở người lớn tại Việt Nam.
Ở các nước có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S. suis bởi các kỹ thuật
nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng các kỹ
thuật miễn dịch học, thậm chí các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến.
Ở Việt Nam, vì sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng như sự
không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thí ngiệm, những phương
pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp dụng rộng
rãi. Tuy nhiên trong các phương pháp hiện đại, nhanh và chính xác, phương pháp
PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tính khả thi hơn cả về mặt kinh tế
và kỹ năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng (Real time PCR). Với
phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát hiện được sự có mặt của
vi khuẩn S. suis, xác định được typ huyết thanh (typ 2) và có thể một hoặc vài gen
độc lực của vi khuẩn. Phương pháp này giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian, công
sức và có độ đặc hiệu cao.

Đặng Thị Kiều Oanh

1

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển và hoàn
thiện quy trình PCR đa mồi để phát hiện trực tiếp Streptococcus suis từ dịch
não tủy của người” với 2 mục tiêu chính sau đây:
- Xây dựng quy trình PCR đa mồi phát hiện trực tiếp S. suis ở bệnh phẩm
người;
- Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm đơn giản, dễ thực hiện để bộc lộ DNA
của S. suis.

Đặng Thị Kiều Oanh

2

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Deleted: .suis

1.1. GIỚI THIỆU VỀ Streptococcus suis
1.1.1. Giới thiệu chung
Streptococcus suis là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy tiện, kích thước
khoảng 1µm, không có lông, không sinh nha bào. Trong bệnh phẩm, chúng thường
xếp thành chuỗi hoặc thành đôi (Hình 1.1). S.suis có yếu tố quyết định kháng
nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về mặt di
truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm này.
Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc nhóm R,
S và T tương ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhưng đến năm 1995,

Formatted: Danish
Deleted: 36

dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu được S.suis có tổng cộng 35
type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhưng typ 32 và 34 vừa được

Formatted: Danish
Deleted: 48

chứng minh là Streptococcus orisratti. Mặc dù vậy, các chủng gây bệnh cho người
đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và theo thời gian [50].

Formatted: Danish
Deleted: 50

Nhưng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là kiểu huyết thanh phổ
biến nhất ảnh hưởng đến con người rộng rãi trên toàn thế giới, có rất ít trường hợp
gây bệnh ở người do typ 1 và typ 14.

Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử

( />
Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trường có 5- 10% CO2, mọc
trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng như môi trường thạch máu,
thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ thích hợp

Đặng Thị Kiều Oanh

3

Cao học K18

Formatted: Space Before: 0 pt,
After: 0 pt, Line spacing: single
Deleted: liên cầu lợn
Formatted: Font: 10 pt, Not Bold,
Italic
Formatted: Font: 10 pt, Not Bold,
Italic, Danish


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

370C, nhưng có thể phát triển được ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH
thích hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn,
lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.
S. suis gây tan huyết dạng alpha trên môi trường thạch máu cừu và tan huyết
dạng beta trên môi trường thạch máu ngựa (Hình 1.2).

Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và thạch máu ngựa

Mặc dù chức năng của 20-30% bộ gen chưa được biết nhưng nhiều gen
đóng vai trò trong bệnh sinh nhiễm trùng đã được nghiên cứu. Đó là những
gen chịu trách nhiệm sản xuất polysacarit, vận chuyển vỏ, các yếu tố hạn chế
sắt, yếu tố ly giải, các protein liên quan đến độc lực, các enzym, hệ thống
arginine deminase và các protein gắn IgG. Có 17 chủng S. suis đã được giải
trình tự gen. Tùy từng chủng, bộ ben có kích thước từ 2,01 đến 2,18 Mb với
tỷ lệ GC từ 41 đến 41,7%. Trong bộ gen của 17 chủng chứa từ 1607 đến 2427
gen và có từ 1559 đến 2334 loại protein (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis
Chromosomes [13]

TT

Vi sinh vật

1 S. suis 05ZYH33
2 Streptococcus suis P1/7
Streptococcus suis
3
BM407
4 Streptococcus suis

Đặng Thị Kiều Oanh

Tình
trạng

Scaffolds or contigs [3]

SRA or Traces [0]

KT GC
(Mb) %

No data [1]

Chr

Plasmids

1
1

-

2.1 41.1 2,254 2,186
2.01 41.3 2,011 1,824

1

1

2.17

1

-

2.1 41.1 2,253 2,185

4

Gene Protein

41 2,136 1,947

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

TT

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Vi sinh vật

Vi sinh vật học
Tình
trạng

98HAH33
Streptococcus suis A7
Streptococcus suis D12
Streptococcus suis D9
Streptococcus suis GZ1
Streptococcus suis JS14
Streptococcus suis SC84
Streptococcus suis SS12
Streptococcus suis ST1
Streptococcus suis ST3
Streptococcus suis
05HAS68
Streptococcus suis
89/1591
Streptococcus suis R61
Streptococcus suis S735

KT GC
(Mb) %

Gene Protein

-

2.04

2.18
2.18
2.04
2.14
2.1
2.1
2.03
2.03

2,064
2,190
2,196
2,047
2,174
2,068
2,161
2,097
2,053

-

-

1.64 41.7 1,607 1,559

-

-

2.14 41.1 2,162 2,119

-

-

2.39 41.2 2,427 2,334
-

Chr

Plasmids

1
1
1
1
1
1
1
1
1

41.2
41.3
41
41.4
41.2
41.1
41.2
41.4

41.3

1,974
2,078
2,074
1,977
2,066
1,898
2,079
1,987
1,952

Nguồn: NCBI > Genomes & Maps > Genome
1.1.2. Một số yếu tố độc lực chính của vi khuẩn liên quan đến chẩn đoán

*Vỏ polysacarit của vi khuẩn
S. suis có lớp vỏ polysacarit chắc chắn (capsular polysaccharide - cps). Việc
định typ huyết thanh vi khuẩn dựa trên cấu trúc kháng nguyên của lớp vỏ này.
Trong các loại typ huyết thanh, các typ 1,2,7 và 9 được cho là có liên quan nhiều
hơn đến bệnh nhiễm trùng liên cầu khuẩn lợn. Tuy nhiên, khả năng nhiễm đa typ
cũng có thể xảy ra. Lớp vỏ typ 1 bao gồm các loại đường: Galactose, glucose, Nacetyl glucosamine, N-acetyl galactosamine và sialic acid. Ở typ 2, N-acetyl
glucosamine được thay thế bằng rhamnose. Đặc điểm cấu trúc của lớp vỏ các typ
khác chưa được nghiên cứu sâu.
*Suilysin
Suilysin là một yếu tố gây tan huyết được mã hóa bởi gen sly của S. suis.
Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tương đồng
cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae).

Đặng Thị Kiều Oanh

5

Cao học K18

Deleted: liên cầu lợn


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002) cho
rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn thương tế
bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thí nghiệm được tiến hành in
vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch). Ngoài ra, suilysin còn có
thể "khởi động" cho quá trình sản xuất và tác động của các cytokine. Thí nghiệm sử
dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh hưởng khác nhau của suilysin
tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến.
Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm
gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không phải
là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn.
*Hệ thống Arginine deminase
Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định được 2 protein bề mặt vi
khuẩn có kích thước 47 kDa và 53 kDa. Hai protein này có mức độ tương đồng cao
với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. pyogenes. Protein 47 kDa tương
đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tương đồng với streptococcal
acid glycoprotein (SAGP).
ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trình biến đổi arginine thành
ornithine. Hoạt động của ADS có thể xảy ra ở độ pH thấp. Hệ thống ADS có mặt
trong tất cả các chủng vi khuẩn S. suis

*Protein được giải phóng do muramidase (muramidase-released protein; mrp) và
yếu tố ngoại bào (extracellular factor- ef)
Hai yếu tố mrp và ef hiện diện ở hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập từ động
vật bị bệnh nhưng tần số xuất hiện của chúng không cao ở các động vật truyền
bệnh. Ở các chủng gây bệnh trên người, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ 69, 6% số
chủng phân lập được mang gen mrp.
Mrp và ef cũng được coi là các yếu tố chỉ thị cho S. suis typ 2. Các chủng vi
khuẩn có độc lực yếu cũng có khả năng sản sinh mrp và biến thể của ef (ký hiệu là
ef*). Với các chủng thuộc typ 2, 5 allen của gen mã hóa ef đã được xác định. Biến

Đặng Thị Kiều Oanh

6

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

thể mrp nhỏ (small mrp; mrps) hiện diện ở typ 1 và mrp lớn (large mrp; mrp*) có
mặt ở typ 9. Các chủng Canada không có mrp và ef. Đã có nghiên cứu gây nhiễm
trên lợn cho rằng typ 1 và 2 do đột biến thiếu hoàn toàn hai protein này có độc lực
chẳng khác gì vi khuẩn thể hoang dại. Tuy vậy vai trò của chúng trong đáp ứng
miễn dịch vẫn cần được làm sáng tỏ bằng các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm.
*Các yếu tố độc lực khác
Chúng ta đã biết rằng rất nhiều yếu tố có liên quan và chịu ảnh hưởng ở những
giai đoạn khác nhau của quá trình bệnh lý. Cũng như vậy, đối với vi khuẩn S. suis,
gần 40 gen khác nhau đã được tìm thấy (theo Smith và cs, 2001). Các gen này mã

hóa cho các protein có chức năng như: yếu tố điều hòa, vận chuyển, đảm nhận chức
năng đối với quá trình sinh lý của bản thân vi khuẩn và cả các nhóm chưa xác định
được chức năng. Một nghiên cứu gây nhiễm bằng chủng S. suis có độc lực yếu và
bổ sung thêm các gen từ các chủng gây bệnh đã tìm thấy chuỗi nucleotide có kích
thước 3kb mang thông tin quan trọng liên quan đến độc lực của vi khuẩn.
Năm 2004, Allen và cs. đã xác định yếu tố làm tan có khả năng hỗ trợ cho sự
xâm nhập của vi khuẩn qua tác động đến acid hyaluronic (tương tự như tác động
của nhiều loại vi khuẩn khác).
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis
Quá trình xâm nhập
Cơ chế xâm nhập của S. suis vào vật chủ ít được biết đến. Các tác nhân gây
bệnh có thể tồn tại trong amidan lợn trong thời gian dài. Mô lympho của amidan
được bao phủ bởi các biểu mô niêm mạc. Đặc biệt ở lợn, diện tích bề mặt vòm
miệng tăng đáng kể do biểu mô lõm sâu trong các mô bạch huyết hình thành rất
nhiều phân nhánh [49]. Có thể là sau khi bám dính và xâm nhập vào các tế bào biểu
mô amidan, vi khuẩn vẫn chưa bị phát hiện bởi hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, vẫn
chưa có nghiên cứu nào giải thích việc làm thế nào S. suis có thể vượt qua hàng rào
bảo vệ đầu tiên của vật chủ để gây bệnh. Giả thuyết được chấp nhận nhất hiện nay
là các tác nhân gây bệnh làm thủng biểu mô niêm mạc trong đường hô hấp trên của

Đặng Thị Kiều Oanh

7

Cao học K18

Formatted: Vietnamese
Deleted: 49

Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

lợn [21]. Tương tự như vậy, đối với con người, S. suis có thể tương tác với các tế

Formatted: Vietnamese

bào biểu mô ở bề mặt biểu bì hoặc trong ruột [22, 31]. Có rất ít nghiên cứu về cơ

Deleted: 22

chế tương tác giữa S. suis và các tế bào biểu mô, ngoại trừ tế bào biểu mô của đám

Deleted: 31

rối màng mạch. Nó đã được báo cáo rằng các chủng độc lực của S. suis có thể bám
vào các tế bào biểu mô đường hô hấp của người [6, 32, 44]. Các chất bám dính trên
bề mặt của S. suis có thể bị cản trở bởi vỏ polysaccharide (CPS) của chúng. Sự bám

Deleted: 21

Formatted: Font color: Black,
Vietnamese
Formatted: Font color: Black,
Vietnamese
Deleted: (hình 1)
Formatted: Vietnamese

dính và sự xâm nhập của S.suis vào tế bào biểu mô HEP-2 ở người diễn ra mạnh mẽ

Deleted: 6

hơn ở những chủng không có vỏ đã được báo cáo bởi Benga et al [6]. Vì vậy, điều

Formatted: Vietnamese

đó có thể được đưa ra giả thuyết rằng S. suis giảm sự biểu hiện của CPS trong các
bước đầu của quá trình lây nhiễm. Giả thuyết này cần được nghiên cứu sâu hơn.
S. suis tương tác với các thành phần của chất nền ngoại bào (ECM) như
fibronectin và plasminogen [16]. Các protein Fbps liên kết với fibronectin của

Deleted: 32
Formatted: Vietnamese
Deleted: 44
Formatted: Vietnamese
Deleted: 6
Formatted: Vietnamese
Deleted: 16

người và fibrinogen khi thực hiện trong phòng thí nghiệm [14]. Tuy nhiên, khi làm

Formatted: Vietnamese

đột biến gen fbps không làm giảm khả năng liên kết với fibronectin của người [16],

Deleted: 14

điều này cho thấy tồn tại khả năng dự phòng của vi khuẩn này trong quá trình liên

Formatted: Vietnamese
Deleted: 16

kết với các ECM. Thử nghiệm lây nhiễm các chủng đột biến fbps cho thấy Fbps
không cần thiết cho sự xâm nhập của vi khuẩn vào amidan của lợn (bước đầu tiên
của nhiễm trùng) nhưng nó có thể đóng vai trò trong quá trình xâm nhập vào cơ
quan khác [14]. Enolaza ở bề mặt của vi khuẩn có vai trò trong sự liên kết giữa vi

Formatted: Vietnamese
Deleted: 14

khuẩn và plasminogen [42]. Enolaza của S. suis không chỉ liên kết với plasminogen

Formatted: Vietnamese

mà còn liên kết với cả fibronectin. Enolaza của S. suis biểu hiện cao trong cơ thể

Deleted: 42

lợn bị bệnh sẽ gây đáp ứng sản xuất kháng thể, mặc dù tiềm năng để enolaza được
biết đến như là một kháng nguyên bảo vệ vẫn còn gây tranh cãi [15, 58]. Gần đây,

Formatted: Vietnamese
Deleted: 15

một dipeptidylpeptidase (DppIV) của S. suis cũng được chứng minh là tương tác

Formatted: Vietnamese

với fibronectin của người, tính độc hại của một chủng bị đột biến thiếu dppIV bị suy

Deleted: 58

yếu đáng kể [18]. Sự liên kết của S. suis với collagen cũng đã được báo cáo [16].

Formatted: Vietnamese
Deleted: 18

Chủng S. suis bị đột biến mất sortase SrtA cũng làm giảm khả năng bám dính với

Formatted: Vietnamese

protein ECM [55], điều này cho thấy các peptidoglycan cũng rất quan trọng đối với

Deleted: 16
Formatted: Vietnamese

sự tương tác của các tác nhân gây bệnh này với các protein ECM.

Đặng Thị Kiều Oanh

8

Deleted: 55

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng sự bám dính của vi khuẩn vào tế bào biểu
mô như là một mô hình để đánh giá các yếu tố độc lực. Một loại enzyme với hoạt
tính 6-phosphogluconate-dehydrogenase, amylopullulanase, tất cả đều góp phần vào
sự bám dính của S. suis vào tế bào biểu mô [17]. Đột biến mất các yếu tố điều hòa 2

Deleted: 17
Formatted: Vietnamese

thành phần CiaRH hoặc điều hòa phiên mã RevSC21 và CovR cũng làm cho sự
bám dính của S.suis vào tế bào biểu mô bị suy giảm đáng kể [46, 57]. Tuy nhiên, cơ
chế của hiện tượng này vẫn chưa được biết đến.

Deleted: 46
Deleted: 57
Formatted: Vietnamese
Formatted: Vietnamese

Ngoài các chất bám dính như trên thì suilysin rất độc hại cho tế bào [21].

Deleted: 21

Suilysin là một hemolysin 54-kDa, là một chất độc có hoạt tính thiol tác dụng vào

Formatted: Vietnamese

cholesterol trong màng của các tế bào có nhân điển hình [20]. Tuy nhiên, các chủng

Formatted: Vietnamese

Deleted: 20

không sản xuất suilysin cũng có thể để đi đên các mạch máu và khuếch tán trong cơ
thể vật chủ.
IgA đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại các tác nhân gây
bệnh ở niêm mạc. Vi khuẩn có khả năng sản xuất IgA protease để hạn chế số lượng
của IgA chức năng. Chúng cũng có thể tận dụng lợi thế của các mảnh Fab sinh ra để
tăng cường sự kị nước bề mặt (và do đó bám dính vào tế bào vật chủ) và ngăn sự
xâm nhập của các kháng thể còn nguyên vẹn [42]. Gần đây, một báo cáo đã cho

Deleted: (hình 1)
Formatted: Vietnamese

thấy S. suis sản xuất IgA1protease có khả năng hiệu quả trong việc phá hủy IgA1

Deleted: 42

của người [59].

Formatted: Vietnamese
Deleted: 59

Sự tồn tại của vi khuẩn trong máu và sự lây nhiễm
Như đã đề cập ở trên, sự xâm nhập của vi khuẩn hoặc làm tổn thương tế bào
có thể được coi là bước đầu tiên của sự phát triển bệnh. Giả thuyết cho rằng S. suis
có thể xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn chủ yếu qua các amiđan vòm miệng, sau
khi bám dính và xâm nhập vào các tế bào biểu mô và tương tác với các tế bào tủy
[42]. Khi S. suis xâm nhập vào các mô bên trong và máu, đó là nguyên nhân chính
để kích hoạt sự hoạt động của các tế bào thực bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh.
Tuy nhiên, khi kháng thể đặc hiệu không có mặt, S. suis có thể chống lại thực bào

và tồn tại trong máu ở nồng độ cao và gây viêm. Vi khuẩn tồn tại chủ yếu phụ thuộc

Đặng Thị Kiều Oanh

9

Cao học K18

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

vào việc sản xuất các CPS. CPS bảo vệ S. suis khỏi bạch cầu trung tính và thực bào
đơn nhân/đại thực bào [19]. Nghiên cứu về cấu trúc CPS của S. suis týp huyết thanh
2 gần đây cho thấy sự có mặt của galactose (Gal), Gal liên kết 6, Gal liên kết 3, 4,
N-acetyl-glucosamine (GlcNAc4) liên kết 4, và rhamnose liên kết 3, 4. CPS của S.
suis tương tự như liên cầu khuẩn nhóm B (GBS), cũng có chứa N-acetyl-neuraminic
acid (sialic acid) liên kết với phía cuối của chuỗi CPS. Tuy nhiên, trong khi axit
sialic của GBS là liên kết 2-3 Gal, S. suis là 2-6 Gal [42]. Acid sialic đã được chứng

Formatted: French (France)
Deleted: 42

minh là quan trọng trong việc ngăn ngừa sự bám dính của protein C3 trên bề mặt
của GBS và cho phép cho GBS kháng lại sự tiêu giệt trong tế bào phụ thuộc
opsonin [42]. Một vai trò như vậy vẫn chưa được chứng minh đối với axit sialic của

Deleted: 42
Formatted: French (France)

S. suis. Một thí nghiệm tạo ra chủng đột biến mất gen neuC đã được thực hiện
(neuC mã hóa epimerase UDP GlcNAc cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp acid
sialic), kết quả là ngăn cản toàn bộ quá trình lắp ráp, biểu hiện của CPS. Điều đó đã
chứng minh rằng axit sialic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của
S.suis [42].Các chủng type huyết thanh khác mà lớp vỏ capsit cũng chứa axít sialic

Formatted: French (France)

như các type huyết thanh 1 và 16, đôi khi cũng gây bệnh ở người [42]. Axít sialic

Deleted: 42

cũng đã được chứng minh liên quan đến việc bám dính của S. suis với bạch cầu đơn

Deleted: 42

Formatted: French (France)

nhân, vì thế giả thuyết được đặt ra là các tác nhân gây bệnh sẽ di chuyển trong máu
mà không liên kết với các tế bào thực bào này [21] . Cuối cùng, một giả thuyết về

Formatted: French (France)
Deleted: 21

sự bắt chước cấu trúc phân tử đã được đề xuất [19], dựa trên thực tế là axit sialic
liên kết 2-6 được tìm thấy trong vỏ capsit của type huyết thanh 2 và 14 [42] tương

Formatted: French (France)

tự như đường epitope trên bề mặt của tất cả các tế bào động vật có vú [22]. Điều

Formatted: French (France)

này có thể dẫn đến việc nhận biết kháng nguyên của vật chủ bị ảnh hưởng. Trong

Deleted: 42

Deleted: 22

thực tế, S. suis kiểu huyết thanh 2 đã được báo cáo là khi nhiễm vào vật chủ gây đáp
Deleted: 42

ứng miễn dịch kém ở cả lợn và ngựa. [42].

Formatted: French (France)

Mặc dù vai trò của CPS rất quan trọng góp phần vào sự hình thành nên tính
độc của S.suis. Nhưng thực tế là một chủng có vỏ capsit không có nghĩa là chủng có
độc tính. Điều này đã chỉ ra rằng sự tồn tại trong máu của S.suis không chỉ dựa vào
lớp vỏ capsit mà còn dựa vào nhiều yếu tố khác. Thực tế, những chủng có vỏ nhưng

Đặng Thị Kiều Oanh

10

Cao học K18

Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

không có độc lực có thể chỉ tồn tại trong máu trong vòng 48h, các chủng có độc lực
có thể tồn tại trong vài ngày. Khả năng chống lại sự thực bà của vi khuẩn còn liên
quan đến quá trình biến đổi thành tế bào peptidoglycan bằng N-deacetylation. Một
chủng đột biến có vỏ capsit nhưng không có PgdA deacetylase, chịu trách nhiệm
làm biến đổi peptidoglycan bị giảm khả năng kháng lại bạch cầu trung tính khi thí
nghiệm trên các mô hình lây nhiễm ở chuột và lợn. Tương tự như vậy, Dalanylation của axít lipoteichoic (LTA) đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại
của tác nhân gây bệnh này [42]. Một chủng đột biến không có D-alanine của LTA
nhạy cảm hơn với peptide kháng khuẩn và bị giết chết bởi bạch cầu trung tính của

Deleted: (hình 2)
Formatted: French (France)
Deleted: 42

lợn, chuột. Ngoài ra các cấu trúc thành tế bào lớn, nhiều protein bề mặt làm tăng
khả năng tạo các kháng thể và tăng khả năng bị thực bào [42, 58]. Tuy nhiên, các cơ
chế hoạt động của các protein này, vai trò của chúng vẫn còn chưa biết. Mặc dù
chủng không có suilysin có thể là chủng độc lực và tồn tại trong máu, nhưng các

Formatted: French (France)
Deleted: 42
Formatted: French (France)
Deleted: 58

chủng có suilysin có tính độc cao hơn với bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính

[42]. Hơn nữa, sự tồn tại của suilysin làm giảm thực bào và giết chết S. suis [42].
S. suis yêu cầu các chất dinh dưỡng bao gồm cả các nguyên tố kim loại, có

Formatted: French (France)
Deleted: 42
Formatted: French (France)
Deleted: 42

hàm lượng tương đối thấp trong vật chủ. AdcR, một yếu tố phiên mã liên cầu khuẩn
tương đồng với Zur điều hòa sự hấp thu kẽm và Fur điều hòa sự hấp thu sắt điều. Cả
hai yếu tố này quan trọng cho sự sống còn S. suis trong cơ thể [42]. Ngoài ra, một

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42

dòng đột biến không có yếu tố vận chuyển sắt (FeoB) đã bị suy giảm khả năng sống
sót trong một mô hình thí nghiệm trên chuột lây nhiễm. [42]. Sử dụng trong công

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42

nghệ biểu hiện trong cơ thể sống đã khám phá các gen cpsA, mã hóa một yếu tố giả
định điều hòa sinh tổng hợp của CPS và IRI-7, đồng đẳng với rpgG của liên cầu,
một gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp vỏ capsit [ 52]. Giả thuyết được đề

Formatted: Vietnamese
Deleted: 52

xuất là CPS của S. suis trở nên dày hơn sau khi tăng trưởng trong cơ thể, sắt tự do
khan hiếm, làm tăng cường sự điều hòa biểu hiện của cps2A và rpgG có thể xảy ra

[52]. Mặc dù đây là một giả thuyết hấp dẫn, một sự liên quan rõ ràng giữa sự thiếu

Formatted: Vietnamese
Deleted: 52

sắt và sản xuất CPS vẫn còn phải được xác minh. Trong thực tế, có báo cáo cho
rằng S. suis có thể thích nghi với môi trường bị hạn chế sắt bằng cách thay đổi trong
chuyển hóa của nó, thay thế sắt bằng mangan, magiê [42]. Ngoài ra, lipoprotein

Đặng Thị Kiều Oanh

11

Cao học K18

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

TroA cần thiết cho sự tăng trưởng S. suis trong các môi trường có mangan thấp,
lipoprotein này rất quan trọng cho sự sống còn của vi khuẩn trong cơ thể. Gần đây,
các nhà nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm làm bất hoạt làm mất lipoprotein tham
gia trong sự hấp thu kẽm, kết quả độc tính bị giảm 50 lần so với chủng ban đầu.
Superoxide dismutase (Sod) là một yếu tố độc lực của vi khuẩn gây bệnh bằng
cách làm giảm quá trình oxy hóa của tế bào thực bào. Khung đọc mở SSU1356 của
một chủng SS2 lâm sàng ZJ081101 mã hóa một loại protein trên 201 axit amin khác

81 – 88% so với các Streptococcus spp. Thí nghiệm đột biến làm mất gen sod
(∆sod) từ chủng lâm sàng được thực hiện. Kết quả cho thấy, các chủng bị đột biến
mất gen sod dễ bị oxy hóa hơn các chủng hoang dại. Một thí nghiệm khác cũng
chứng minh độc lực của chủng SS2 bị suy giảm đáng kể ở chuột khi bị đột biến mất
Deleted: 42

gen sod [42].

Formatted: Vietnamese

Hiện tượng viêm và sốc nhiễm trùng
Hoạt động của hệ thống miễn dịch trong khi vật chủ bị lây nhiễm vi sinh vật
nói chung là bảo vệ, sốc nhiễm trùng như là một hệ quả của phản ứng miễn dịch quá
mức hoặc quá yếu của vật chủ. Một phản ứng không cân bằng có thể gây tổn hại
cho vật chủ do quá trình tiết các hợp chất tạo viêm nội sinh không được kiểm soát.
Bằng chứng là hội chứng sốc độc cũng như các trường hợp sốc nhiễm trùng ở châu
Âu và châu Á gây ra do S. suis (với thời gian ủ bệnh ngắn, tiến triển bệnh nhanh
chóng và tỷ lệ tử vong cao), một chất trung gian quan trọng trong giai đoạn tiền
viêm được sản xuất khi toàn bộ hệ thống bị nhiễm S. suis [22]. Như vậy, khả năng

Deleted: 22
Formatted: Vietnamese

sản xuất cytokine của S. suis có thể đóng vai trò quan trọng. Trước đây chủng độc
lực S.suis týp huyết thanh đã được chứng minh có khả năng sản xuất các cytokine
tiền viêm ở lợn, chuột và người. Điều này được chứng minh trong cơ thể sống trên
mô hình chuột bị nhiễm S. suis với giai đoạn sớm là sốc nhiễm trùng và giai đoạn
muộn là viêm màng não / viêm não [42]. Các mức độ cao của cytokine hệ thống
TNF-α, IL-6 và IL-12, IFN-γ và chemoattractants CCL2/MCP-1, CXCL1/KC, và
CCL5/RANTES quan sát thấy trong cơ thể trong vòng 24 giờ sau khi nhiễm được

cho là chịu trách nhiệm về cái chết ban đầu của động vật. Sự tăng cường điều chỉnh

Đặng Thị Kiều Oanh

12

Cao học K18

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

Cytokine IL-10 được thực hiện sau sự sản xuất mạnh mẽ của hầu hết các cytokine
tiền viêm, chỉ ra một cơ chế liên hệ ngược âm tính để kiểm soát mức độ của phản
ứng viêm.
Hầu hết các yếu tố của S.suis liên quan đến hiện tượng viêm ở vật chủ vẫn
chưa được biết. Nhiều nghiên cứu với các đột biến làm mất vỏ capsit chỉ ra các
thành phần thành tế bào vi khuẩn là các yếu tố chính cảm ứng sản xuất cytokine
nhưng cơ chế vẫn chưa được nghiên cứu. Lipoprotein có mặt trong thành tế bào có
thể một phần chịu trách nhiệm về sự nhận dạng của thụ thể trên tế bào [42]. Rất gần

Deleted: 42
Formatted: Vietnamese

đây, nó đã được chỉ ra rằng một prolipoprotein giả định diacylglyceryl transferas có
mặt trong thành tế bào S. suis là cần thiết để kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh

[42]. Tuy nhiên, các yếu tố khác cũng có thể đóng góp vào quá trình gây viêm.

Deleted: 42
Formatted: Vietnamese

Suilysin kích hoạt các đại thực bào và gây ra việc sản xuất các cytokine tiền viêm
[42]. Ngoài ra, suilysin có thể tạo ra hemoglobin từ các tế bào hồng cầu, góp phần

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42

nâng cao mức độ của các yếu tố trung gian tiền viêm bằng cách hoạt hóa các thành
phần của thành tế bào S. suis. Một subtilisin protease (SspA) gần đây đã được
chứng minh liên quan đến việc kích thích việc tiết ra các cytokine tiền viêm và
chemokines khác nhau bởi các đại thực bào. Nồng độ thấp của SspA làm cho CCL5
được tiết ra với hàm lượng cao, trong khi việc sử dụng các protein tương tự ở nồng
độ cao thì hàm lượng CCL5 thấp. S. suis có thể là tăng khả năng tiết các chất trung
gian gây viêm dẫn đến việc thu hút số lượng lớn bạch cầu và tiết các chất trung gian
khác gây viêm nhiễm. Tuy nhiên, S. suis có thể điều chỉnh phản ứng này để phục vụ
cho sự tồn tại của nó bằng cách tích cực làm giảm các chemokines do đó trì hoãn sự
thu hút bạch cầu trung tính vào vị trí bị viêm nhiễm.
Sự xâm nhập hệ thần kinh trung ương và viêm màng não
Nếu bệnh nhân không bị tử vong do nhiễm trùng huyết hoặc hội chứng sốc
độc, nhưng mức độ nhiễm trùng huyết vẫn còn cao, S. suis có thể gây ra bệnh viêm
màng não [7, 8]. Đáng chú ý, trong một số trường hợp nhiễm trùng có thể không
xuất hiện và viêm màng não có thể xảy ra bất ngờ. Giống như các tác nhân gây

Đặng Thị Kiều Oanh

13

Cao học K18

Deleted: 7
Formatted: Vietnamese
Deleted: 8
Formatted: Vietnamese


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

bệnh khác, S. suis phải vượt qua hàng rào máu não (BBB) và / hoặc chất dịch máu não tủy (CSF) để gây ra nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương. BBB là một rào cản
duy nhất về giải phẫu và chức năng ngăn cách giữa não và nội mạch bằng cách duy
trì sự cân bằng nội môi của môi trường hệ thần kinh trung ương [42]. Các loại tế

Formatted: Vietnamese
Deleted: 42

bào chính của hàng rào máu não là tế bào nội mô vi mạch của não(BMEC). S.suis
bám dính nhưng không xâm nhập vào các tế bào BMEC của người. Các yếu tố vi
khuẩn liên quan đến sự bám dính không được làm sáng tỏ và không có sự tham gia
của CPS vào quá trình này. S. suis có thể tồn tại 7 h trong tế bào BMEC của lợn.
Các thành phần huyết thanh cũng có thể tham gia vào sự tương tác giữa S. suis và
các tế bào BMECs của lợn. Trong số đó, fibronectin đóng một vai trò quan trọng
trong sự tương tác này; Ngoài ra, các kháng thể chống lại enolase (protein liên kết
fibronectin quan trọng của S. suis) làm giảm đáng kể sự bám dính và sự xâm nhập
của S.suis vào tế bào BMEC của lợn [42]. Các chủng có Suilysin cũng có thể phá vỡ
hàng rào máu não thông qua các hiệu ứng độc tế bào, với hàm lượng cao của các

chủng có Suilysin gây độc cho các tế bào BMEC của lợn. Tuy nhiên, suilysin không
phải là yếu tố quyết định vì các chủng đột biến mất suilysin vẫn có thể xâm nhập
vào các tế bào này.
Một cách khác để S. suis có thể xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương cho
có thể là các tế bào biểu mô đám rối thần kinh màng mạch của hàng rào máudịch não tủy. Thật vậy, mặc dù hàng rào máu-dịch não tủy có một diện tích bề
mặt nhỏ hơn so với hàng rào máu não, nó có thể đóng một vai trò quan trọng
trong sự di chuyển của vi khuẩn cũng như trong luân bạch cầu. Gần đây, một thử
nghiệm về sự xâm nhập và di chuyển của S. suis qua hàng rào máu-dịch não tủy
đã được thực hiện. Sự di chuyển của S.suis qua hàng rào máu-dịch não tủy đã
kích hoạt bạch cầu trung tính. S. suis gây ra hoại tử tế bào CPEC, mặc dù
apoptosis cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình làm chết tế
bào. Suilysin đó đóng một vai trò quan trọng như là một chất độc ảnh hưởng đến
chức năng hàng rào máu-dịch não tủy, tuy nhiên, các yếu tố hòa tan khác cũng có
thể tham gia vào quá trình này.

Đặng Thị Kiều Oanh

14

Cao học K18

Deleted: 42
Formatted: Vietnamese


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

Viêm màng não, chấn thương não và chết tế bào thần kinh là triệu chứng liên

quan đến phản ứng của vật chủ với các yếu tố của vi khuẩn. Một thí nghiệm thực
hiện trên cơ thể sống cho thấy rằng những con chuột bị nhiễm bệnh sống sót sau
giai đoạn nhiễm trùng máu có thể phát triển các dấu hiệu nghiêm trọng của tình
trạng viêm ở hệ thần kinh trung ương. S. suis có thể kích thích các tế bào BMEC tiết
acid arachidonic, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào hệ thần kinh
trung ương [135]. Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng S. suis có thể kích thích tế
bào BMEC của người và lợn tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokines, tiểu thần
Deleted: 42

kinh đệm và các tế bào hình sao ở chuột [42].

Formatted: Vietnamese

1.2. SỰ LÂY NHIỄM TRÊN NGƯỜI CỦA S.suis
Streptococcus suis (S. suis) hay còn gọi là liên cầu khuẩn lợn là một trong

Deleted: liên cầu lợn

những vi sinh vật gây bệnh ở lợn làm tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh xảy ra ở nhiều
nơi trên thế giới và hầu hết ở các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển. Các biểu
hiện bệnh lý của lợn bao gồm viêm màng não, viêm khớp, viêm phổi, nhiễm trùng
huyết, viêm nội tâm mạc, các ổ áp xe. Nghiêm trọng hơn, vi khuẩn có thể gây bệnh
cho người với các biểu hiện của viêm màng não, nhiễm trùng máu, viêm nội tâm
mạc. v.v. Chính vì vậy, bệnh được xếp vào nhóm các bệnh chung của người và
động vật.
S. suis lần đầu tiên được báo cáo bởi các bác sĩ thú y năm 1954, sau khi bùng
phát dịch viêm màng não, viêm khớp nhiễm khuẩn huyết, và có mủ xảy ra ở lợn con
[23]. Sau đó, vào năm 1968, bệnh do S. suis được ghi nhận ở người qua mô tả lần

Formatted: Vietnamese

Deleted: 23

đầu tiên về 2 trường hợp viêm màng não mủ và một trường hợp nhiễm trùng huyết
nặng tại Đan Mạch. Từ đó, bệnh được ghi nhận ở các nước khác thuộc Châu Âu
Formatted: Vietnamese

(Anh, Hà lan,…) và Hồng kông [23].

Deleted: 23

Tại Anh, trong khoảng từ năm 1975 đến năm 1990, có tất cả 35 trường hợp
nhiễm Streptococcus suis được báo cáo, trong số đó, 34 trường hợp bệnh nhân nam.

Đặng Thị Kiều Oanh

15

Cao học K18


Luận văn thạc sĩ

Vi sinh vật học

25 bệnh nhân đã được xác nhận bị nhiễm Streptococcus suis từ năm 1984 và
1993 ở Hồng Kông. Trong số đó, 15 trường hợp (60%) đã có một tiếp xúc với lợn
hoặc thịt lợn. Xét nghiệm dịch não tủy của 21 bệnh nhân đã xác nhận sự hiện diện
của viêm màng não, 4 bệnh nhân còn lại bị viêm khớp, viêm phế quản phổi, viêm
Deleted: 30

nội tâm mạc và sốt [30].

Formatted: Vietnamese

Có 7 trường hợp nhiễm S. suis ở Nhật Bản từ năm 1994 đến 2006. Tất cả các
trường hợp có tiếp xúc với lợn và 5 người trong số họ đã có tổn thương da tay trong
quá trình tiếp xúc. 5 trường hợp trên có các triệu chứng của viêm màng não, nhiễm
trùng huyết, và có 1 trường hợp đã tử vong. Tất cả S. suis được phân lập thuộc
nhóm D theo phân loại của Lancefield và týp huyết thanh 2. Chúng nhạy cảm với
penicillin G, ampicillin, cefotaxim, và ciprofloxacin. Tuy nhiên, sáu trong số chúng
có khả năng kháng cả erythromycin và clindamycin, và cũng đề kháng với
Deleted: 9

minocycline [9].

Formatted: Vietnamese

Một nghiên cứu hồi cứu đã được tiến hành tại Bệnh viện Đại học Chiang Mai
từ tháng 5 năm 2000 đến tháng 12 năm 2002. Theo nghiên cứu, 41 bệnh nhân (32
nam và 9 nữ, tuổi trung bình là 51 tuổi) được xác định lây nhiễm S. suis. Trong đó,
3 bệnh nhân có tiền sử tiếp xúc với lợn hoặc thịt lợn và 1 bệnh nhân đã ăn thịt bò
Formatted: Vietnamese

sống [56].

Deleted: 56

Từ ngày 1/1/2003-31/7/2005, có 21 trường hợp được xác định là nhiễm S. suis
, trong đó có 1 trường hợp (5%) tử vong, 18 trường hợp (86%) là nam giới và 3
trường hợp (14%) là nữ . Độ tuổi trung bình là 62 tuổi (từ 26-89 tuổi), 12 trường

hợp (57%) khởi phát bệnh trong tháng 5, tháng 6, tháng 7 hoặc tháng 8. Họ sống ở
các huyện khác nhau ở Hồng Kông và không có phân nhóm địa lý [37].
Gần đây, trong tháng 7-8/2005, tại tỉnh Sichuan, Trung Quốc đã xảy ra một
vụ dịch lớn do S. suis lây truyền từ lợn sang người. Tổng số 215 người mắc,
trong đó, 61 (người) 28% trường hợp nhiễm khuẩn huyết có sốc nhiễm trùng
nhiễm độc, 38 người chết (62%), 48% viêm màng não mủ ...Tỷ lệ tử vong trung
bình của tất cả các trường hợp > 20%. Một số trường hợp sau khi khỏi bệnh

Đặng Thị Kiều Oanh

16

Cao học K18

Deleted: 37
Formatted: Vietnamese