Nghiên cứu xác định oxalate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

TRẦN ĐĂNG TUẤN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ
DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

TRẦN ĐĂNG TUẤN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH OXALAT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ
DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian nghiên cứu và học tập tôi đã hoàn thành luận văn cao học

của mình với đề tài: “Nghiên cứu xác định oxalate trong mẫu thực phẩm bằng
phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc”
dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Ánh Hường và các thầy cô, anh chị, các
bạn trong bộ môn Hóa phân tích.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Thị Ánh Hường người đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình
hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Công ty 3Sanalysis và đối tác tại Khoa Hóa học,
Trường Đại học Basel, Thụy sĩ đã thiết kế lắp đặt và hỗ trợ các trang thiết bị cũng
như tư vấn kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói
riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong

thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Tôi xin cảm ơn sinh viên Nguyễn Thị Minh Hòa, lớp k57T Tài năng Hóa,
sinh viên Nguyễn Thị Liên, lớp K56A Hóa học đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên
cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên bộ
môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày 24 tháng 10 năm 2015
Học viên
Trần Đăng Tuấn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên viết tắt

Tên đầy đủ

Ace

Acetic

Arg

L- arginine

C4D

Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

CE

Phương pháp điện di mao quản

CHES

Axit 2-(cyclohexylamino) ethanesunlfomic

CTAB

Cetyl trimethyl amonium bromide

EOF

Dòng điện di thẩm thấu

GC

Sắc ký khí

His

Histidine

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Leff

Chiều dài hiệu dụng của mao quản

Ltot

Tổng chiều dài mao quản

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MEKC

Điện di mao quản điện động học Mixen

MES

axit 2-(N-morphonlino)ethane sulfonic

PGTP

Phụ gia thực phẩm

%RSD

% độ lệch chuẩn tương đối

SD

Độ lệch chuẩn

UPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

TAPS

Axit N- [tris(hydroxylmetyl)metyl]-3aminopropansunphonic

MỞ ĐẦU
Hiện nay, tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm ở nước ta đang rất được quan
tâm, với nhiều vụ ngộ độc tập thể xảy ra hàng loạt và ở nhiều khu vực khác nhau.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến mất an toàn thực phẩm, trong đó có nguyên nhân
xuất phát từ việc sử dụng các chất phụ gia thực phẩm. Gần đây, dư luận đặc biệt
quan tâm đến sự xuất hiện của oxalate trong một số sản phẩm thực phẩm như bia,
mỳ tôm,…gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người sử dụng. Theo các nghiên cứu,
oxalate là một trong những tác nhân chính gây nên bệnh sỏi thận [12, 23] do tạo kết
tủa với các ion kim loại như magie, canxi… (kết tủa này chiếm tới 80% về khối
lượng của sỏi thận).
Cùng với oxalate, axit tương ứng của tartrate, citrate là những chất phụ gia

thực phẩm thường xuất hiện đồng thời trong nhiều loại thực phẩm. Sự xuất hiện của
citrate đồng thời với oxalate sẽ làm giảm nguy cơ hình thành sỏi thận do citrate có
khả năng ức chế quá trình kết tinh hình thành canxi oxlate [13]. Vì vậy, ngoài việc
phân tích, kiểm tra hàm lượng oxalate, quy trình sẽ kết hợp phân tích, kiểm tra xác
định đồng thời hàm lượng của tartrate và citrate trong mẫu thực phẩm.
Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng các chất oxalate,
tartrate, citrate như: sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp sắc ký khối
phổ (GC-MS), sắc ký ion [13, 15],....Các phương pháp này thường chỉ được trang bị
ở các phòng thí nghiệm hiện đại với chi phí khá lớn và yêu cầu đội ngũ kỹ thuật cao.
Trong nghiên cứu này, với mục tiêu xây dựng một phương pháp phân tích nhanh,
hiệu quả, đơn giản với chi phí thấp, hướng tới nhu cầu phân tích ở tuyến địa
phương, chúng tôi đã xây dựng, phát triển quy trình phân tích đồng thời các chất

oxalate, tartrate, citrate trong thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử
dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C 4D) trên cơ sở hệ
thiết bị tự chế, bán tự động.
6


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về các chất phụ gia thực phẩm
1.1.1. Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm

Chất phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực phẩm hoặc
một thành phần của thực phẩm; Ít hoặc không có giá trị dinh dưỡng; Bổ sung vì mục

đích công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến… [3].
Như vậy, PGTP không phải là thực phẩm mà nó được thêm vào nhằm đáp
ứng yêu cầu nhất định của sản phẩm. Việc sử dụng PGTP phải tuân theo quy định
hiện hành của các cơ quan chức năng, ở Việt Nam là Bộ Y tế.
1.1.2. Phân loại phụ gia thực phẩm

Tùy vào từng cơ sở mà có nhiều cách phân loại phụ gia thực phẩm khác nhau
như:
1.1.2.1. Phân loại theonguồn gốc
• Dạng tự nhiên: có nguồn gốc động vật và thực vật
• Dạng tổng hợp: Do con người tạo ra
1.1.2.2. Phân loại theo tác dụng

•

Tác dụng trực tiếp: Bao gồm các chất có tác dụng bảo quản (như chống lại
quá trình oxy hóa, chống tác hại của vi sinh vật, côn trùng, ký sinh gây hại…)
và tác dụng cảm quan (như tạo màu, tạo mùi, tăng thêm hương vị tăng thêm
vị ngọt, vị mặn, làm giảm bớt vị đắng, tạo vị chua…)

•

Tác dụng gián tiếp: Bao gồm các loại axit, kiềm, dung môi chiết xuất, các
chất làm trong, làm lắng cặn, chất chống đông đặc, các chất trao đổi ion, chất

men sinh học, các chất chống tạo bọt... [2]
Ngoài ra còn nhiều cách phân loại khác như phân loại theo sức khỏe người sử

dụng, phân loại theo chức năng, phân loại theo nhóm chất…
1.1.3. Lợi ích và tác hại của phụ gia thực phẩm

7


Nếu sử dụng đúng loại, đúng liều lượng, các phụ gia thực phẩm có tác dụng
tích cực, như: tạo được nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu vị của người
tiêu dùng, giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho tới khi sử dụng, tạo sự

dễ dàng trong sản xuất, chế biến thực phẩm và làm tăng giá trị thương phẩm hấp dẫn
trên thị trường, kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm,….
Tuy nhiên, khi sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại
nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại
cho sức khỏe như: Gây ngộ độc cấp tính nếu dùng quá liều cho phép. Gây ngộ độc
mạn tính dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục, một số chất phụ gia thực
phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thương lâu dài. Nguy cơ gây hình thành khối u,
ung thư, đột biến gen, quái thai, nhất là các chất phụ gia tổng hợp. Nguy cơ ảnh
hưởng tới chất lượng thực phẩm như phá huỷ các chất dinh dưỡng, vitamin...[4].
Vì vậy, Khi sử dụng chất PGTP phải tuân thủ các quy định sử dụng dựa trên
các tiêu chuẩn cụ thể theo ISO (International Standard Organization) và Hội đồng
tiêu chuẩn thực phẩm CAC (Codex Alimentarius Commision) gồm hơn 130 nước

thành viên, trong đó có Việt Nam. Mỗi quốc gia sẽ qui định cụ thể về các chất
PGTP được dùng cho nước mình. Tóm lại, ở Việt Nam, các chất PGTP phải nằm
trong danh mục cho phép sử dụng và đảm bảo các yêu cầu về kĩ thuật, hàm lượng và
vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định do Bộ Y tế ban hành.
1.2. Thông tin chung về oxalate, tartrate và citrate

Các chất oxalic, tartric và citric là một trong số các chất phụ gia thực phẩm
nằm trong danh mục được phép sử dụng ở Việt Nam với hàm lượng nhất định.
Bảng 1.1. Thông tin chung về 3 hợp chất oxalic, tartaric và citric
Tên chất
Danh pháp

Axit oxalic

Axit tartaric

Axit citric

Axit etanedioic

Axit 2,3-

Axit 2-

dihidroxibutandioic

hydroxypropan-

(IUPAC)

1,2,3-tricacboxylic
8


Công thức
phân tử

C2H2O4 (khan)

C4H6O6

C6H8O7

150,087

192,123

C2H2O4.2H2O(ngậm

nước)

Công thức
cấu tạo
Khối lượng
phântử (g/mol)

90,03 (khan)
126,07

g/mol(khan)

(ngậm nước)
pKa(1;2;…)
Độ tan trong nước

1,23; 4,19

3,04; 4,37

3,15; 4,77; 6,40

0,143

1,33

1,33

(g/ml ở20°C)
Nhiệt độ

(L hoặc D-tartaric)
157 (thăng hoa)

171-174 (L hoặc D-

153

tartaric, tinh khiết)

nóng chảy (oC)

1.3. Ứng dụng và tác hại của các oxalate, tartrate và citrate
1.3.1. Oxalate
• Ứng dụng

 Là chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, phụ gia thực phẩm
 Axit oxalic được sử dụng trong một số sản phẩm hóa chất dùng trong gia

đình, chẳng hạn một số chất tẩy rửa hay trong việc đánh gỉ sét
 Dung dịch axit oxalic được dùng để phục chế đồ gỗ
 Axit oxalic là một chất được sử dụng trong quá trình nhuộm vải, phân

bón.....
•

Tác hại
 Ở liều cao, axit oxalic (muối oxalate) có khả năng gây ra ngộ độc cấp
tính, có thể dẫn đến tử vong với hàm lượng 4-5g. Liều ngộ độc (LD50)
9

của axit oxalic nguyên chất được ước khoảng 378 mg/kg thể trọng
(khoảng 22,68 g/người 60 kg).
 Sự kết hợp của axit oxalic với canxi tạo ra canxi oxalate, có thể gây kết
tủa lắng đọng tạo thành sỏi ở các cơ quan tiết niệu, gan mật, tụy… [9].
1.3.2. Tartrate
• Ứng dụng
 Phụ gia thực phẩm (ký hiệu: E334) với tác dụng là chất điều vị, chống oxi
hóa
 Ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm
 Ứng dụng trong công nghiệp và nông nghiệp

• Tác hại
 Khi sử dụng quá mức có thể gây ra nhiều tác dụng phụ khó chịu như: nôn
mửa, tiểu chảy và gia tăng khả năng viêm đường tiêu hóa.
1.3.3. Citrate
• Ứng dụng
 Phụ gia thực phẩm (ký hiệu: E330): Điều vị, chống oxi hóa
 Giảm tác hại của nước cứng
 Sử dụng trong công nghệ sinh học, hoạt hóa một số dung dịch tẩy rửa, …
• Tác hại
Axit citric được hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế công nhận là
an toàn để sử dụng trong thực phẩm. Nó hiện diện tự nhiên trong gần như
mọi dạng sự sống, các lượng axit citric dư thừa dễ dàng trao đổi và bài tiết ra

khỏi cơ thể. Tuy nhiên, việc tiếp xúc với axit citric khô hay đậm đặc có thể
gây ra kích ứng da và mắt, vì thế phải sử dụng các trang bị bảo hộ lao động
khi tiếp xúc với axit citric. Việc sử dụng quá nhiều axit citric cũng dễ làm tổn
hại men răng. Tiếp xúc gần với mắt có thể gây bỏng và làm mất thị giác.
Đôi khi hàm lượng quá cao axit citric có thể gây tổn hại cho tóc, do nó
mở lớp cutin của tóc. Nó có thể làm mất các chất cần thiết cho tóc và làm tóc
bị bạc màu.
1.4. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Vấn đề sử dụng oxalate, tartrate và citrate trên thế giới
• Vấn đề sử dụng oxalate trên thế giới

Hiện tại, Ủy ban chuyên gia của FAO/WHO về phụ gia thực phẩm

(JECFA) chưa có nghiên cứu toàn diện về ảnh hưởng của axit oxalic cũng
như muối oxalate trong thực phẩm đối với sức khỏe con người và vẫn đưa
10


axit oxalic vào danh mục các chất hỗ trợ chế biến trong thực phẩm. Trên cơ
sở danh mục của Codex, một số các quốc gia trên thế giới như Nhật Bản,
•

Hàn Quốc…
Vấn đề sử dụng tartrate và citrate trên thế giới
Tartrate và citrate được sử dụng nhiều trong quá trình chế biến nhiều

loại thực phẩm, nước giải khát… Với vai trò là một chất điều vị, chống oxi
hóa... Các chất này được các quốc gia và tổ chức quốc tế cho phép sử dụng

với vai trò là chất phụ gia thực phẩm.
1.4.2. Vấn đề sử dụng oxalate ở Việt Nam
• Vấn đề sử dụng oxalate ở Việt Nam
Việt Nam đã quy định cho phép sử dụng axit oxalic như một chất hỗ trợ chế
biến. Theo Luật an toàn thực phẩm và Danh mục chất hỗ trợ chế biến thực phẩm
ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ
trưởng Bộ Y tế quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực
phẩm, axit oxalic sử dụng trong thực phẩm phải đảm bảo độ tinh khiết, đảm bảo an
toàn thực phẩm, không chứa các chất độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe và đáp ứng

các yêu cầu đối với chất hỗ trợ chế biến, phụ gia sử dụng trong chế biến thực phẩm:
(1) Sản phẩm phải được công bố hợp quy hoặc công bố phù hợp quy định về
an toàn thực phẩm với cơ quan quản lý nhà nước có thẩm quyền.
(2) Sản phẩm phải có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, còn hạn sử dụng.
(3) Sử dụng chất hỗ trợ chế biến, phụ gia thực phẩm phải theo đúng hướng
dẫn của nhà sản xuất (đúng danh mục, đúng liều lượng, đúng đối tượng thực
phẩm…).
Kết quả giám sát đến ngày 19/12/2013 của Cục an toàn thực phẩm cho thấy
22,05% mẫu thực phẩm được kiểm tra có chứa axit oxalic, hàm lượng dao động từ
10,7 đến 1809 mg/kg. Chủ yếu phát hiện trong các sản phẩm rau quả tươi, bột mỳ và
một số sản phẩm chế biến từ bột mỳ (mỳ gói, mỳ sợi). Trong đó hàm lượng axit
oxalic trong các loại mỳ gói từ 31,9 đến 177 mg/kg. Trong một số mẫu rau củ quả

tươi cũng chứa axit oxalic với hàm lượng dao động từ 10,7 - 1809 mg/kg tùy theo
chủng loại.
Từ các thông tin trên, có thể thấy rằng axit oxalic (muối oxalate) tồn tại sẵn
có trong một số loại thực phẩm, khó khăn để phân biệt giữa axit oxalic tồn tại tự
11


nhiên với axit oxalic chủ động cho vào thực phẩm. Do vậy, để bảo đảm an toàn thực
phẩm cho người sử dụng, cần có các biện pháp để kiểm soát.
• Vấn đề sử dụng tartrate và citrate ở Việt Nam
Cũng như hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế, Việt Nam cho phép sử
dụng tartrate và citrate với vai trò là chất phụ gia thực phẩm. Các chất này thường

được sử dụng để điều vị và chống oxi hóa thực phẩm.
1.5. Các phương pháp xác định oxalate, tartrate và citrate
1.5.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động
là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được
biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển
và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.

Hiện nay nó áp dụng trong nhiều lĩnh vực, xác định nhiều loại chất khác nhau trong
đó nhiều tác giả đã dùng phương pháp này để xác định oxalate, tartrate và citrate.
Trong công trình nghiên cứu của Muhammad Iqbal Bhanger và các cộng sự
[13] đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định đồng thời axit oxalic và axit citric
trong nước tiểu để giám sát nồng độ của axit oxalic và axit citric trong quá trình
hình thành sỏi thận. Pha động trong phương pháp gồm KH 2PO4 (25%) và
(C4H9)4NHSO4 (2,5 mmol) ở pH 2,0. Hiệu suất thu hồi cho axit oxalic và axit citric
tương ứng là 97% và 102%.
Bằng cách sử dụng phương pháp HPLC, Ruben Rellan-Alvarez [19] đã xác
định đồng thời 10 axit hữu cơ có phân tử lượng thấp trong đó có axit oxalic với giới
hạn phát hiện 255pmol, P < 0,05, hiệu suất thu hồi đạt 108%. Phương pháp đã được

12


áp dụng xác định đồng thời 10 axit hữu cơ trong mẫu chiết xuất từ lá củ cải đường,
cà chua và nước cam ép thương mại.
Trong công trình nghiên cứu của Fengwu Wu, Zhike He, Qingyao Luo,
Yun'e Zeng, sự phát quang hóa học của Ru được áp dụng trong phương pháp HPLC
để xác định axit oxalic. Axit oxalic được tách bởi cột C 18 pha đảo với pha động 0,02
mol/l NAc. Sau đó axit oxalic được trộn lẫn với 0,25 mol/l Ru, 2,0mmol/l trong
0,08mol/l , axit oxalic được xác định dựa vào sự phát quang của phản ứng oxi hóa khử của Ce(IV) với Ruvà axit oxalic. Giới hạn phát hiện của axit oxalic là 6,2.10-6M
(tại S/N=3), độ lệch chuẩn tương đối là 5,6%, khoảng tuyến tính từ 1.10 -5M đến
4.10-5M. Phương pháp đã được áp dụng để xác định axit oxalic trong rau bina [22].

Việc xác định đồng thời các axit oxalic, fumaric, maleic, succinic, tartaric và
malic trong dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được trình bày
trong nghiên cứu của các tác giả HZ Liana, L. Mao, X.L. Ye, J. Miao. Nghiên cứu
đã sử dụng cột Nova-Pak C18 và sử dụng nước với axit pecloric để điều chỉnh pH
2,10 - 2,15. Detector UV được lựa chọn ở bước sóng 210 nm. Phương pháp có hệ số
tương quan của các axit cao hơn 0.999 và giới hạn phát hiện nhỏ hơn 0,0005
mg/ml. Khoảng tuyến tính đạt được là 0,005-0,05 mg/ml và thời gian lưu của các
axit nhỏ hơn 5 phút [23].
1.5.2. Phương pháp Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Sắc ký lỏng khối phổ là sự ghép nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao với
detector khối phổ. Sau khi ra khỏi cột sắc ký dung dịch được hóa hơi và bị ion hóa

thành các mảnh ion mang điện tích. Sau đó, các ion này được đưa sang bộ phận
phân tích khối lượng để định tính và được định lượng.
B.G. Wolthers và các cộng sự [7] đã xác định oxalate bằng một số phương
pháp khác nhau như ID-MS, HPLC, GC cho thấy có thể sử dụng phương pháp GCMS với độ chính xác và lặp lại cao như là một phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá
các phương pháp hiện có và mới phát triển.
Phương pháp sắc ký khối phổ đã được J. G. March và các cộng sự sử dụng để
xác định hàm lượng oxalate trong sỏi thận. Các bước tiến hành là: hòa tan của
13


oxalate trong sỏi thận bằng HCl, loại bỏ các cation bằng cách sử dụng nhựa trao đổi
cation, bốc hơi nước, pha loãng với ethyl acetate, tạo các este của axit oxalic

trimetylsilyl với chlorotrimethylsilane. Với việc xử lý mẫu hích hợp, phương pháp
này cũng đã được áp dụng cho mẫu nước tiểu và mẫu thực phẩm. Các kết quả thu
được: khoảng tuyến tính là 0,2-5,0 mg oxalate/l, giới hạn phát hiện 0,06 mg
oxalate /l, hệ số biến thiên của phương pháp 1,3%. Hai mươi bảy mẫu sỏi thận đã
được phân tích bằng phương pháp này. Kết quả hàm lượng trung bình của axit
oxalic trong sỏi axit uric là 0,11 mg/g (SD = 0,08, n = 13). Oxalate được tìm thấy
trong sỏi struvite với hàm lượng trung bình là 0,2 mg axit oxalic/g (SD = 0,13, n =
8). Trong sỏi đá hydroxyapatite, hàm lượng oxalate cao nhất, có thể lên đến 0,801
mg axit oxalic/g [24].
1.5.3. Phương pháp sắc ký ion
Sắc ký ion là kỹ thuật tách các cấu tử anion hay cation từ hỗn hợp qua cột sắc
ký dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động.

Để cung cấp thông tin cho quá trình chuẩn đoán và điều trị bệnh liên quan
đến chuyển hóa oxalate. Bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký ion, Hoppe B và
các cộng sự [10] đã xác định đồng thời oxalate, citrate và sulfate trong huyết tương
của các mẫu được lấy từ 50 trẻ sơ sinh và trẻ em (23 nam, 27 nữ độ tuổi từ 0,2 đến
17 tuổi) với chức năng thận bình thường. Máu được lấy vào ống Li-Heparin, đặt
trong nước đá. Sau khi lấy, mẫu máu ngay lập tức bảo quản bằng HCl với tỷ lệ
40µM/ml. Mẫu được phân tích bằng hệ thống sắc ký ion với pha động là dung dịch
NaOH. Khoảng tuyến tính thu được từ 5mM đến 52,5mM với thời gian phân tích là
hơn 21 phút. Kết quả thu được về hàm lượng oxalate là (6,43 +/- 1,06 µmol/L),
citrate (79,3 +/- 27,4 µmol/L) và sulfate (235,0 +/- 85,3 µmol/L). Kết quả cũng cho
thấy không có sự khác biệt cụ thể về độ tuổi và giới tính. Phương pháp cho độ tin
cậy cao và tái lặp tốt (hệ số phương sai 1,95-4,75%).

Cũng sử dụng phương pháp sắc ký ion, tác giả Zongbao (Kent) Zhao và các
cộng sự [21] đã xác định đồng thời 29 anion gồm có 19 anion của axit hữu cơ (trong
14


đó có oxalate, tartrate, citrate) và 10 anion của axit vô cơ với hiệu xuất thu hồi trong
khoảng 88% - 105%, RSD < 7%. Phương pháp có thể áp dụng trong các nền mẫu
phức tạp, trong đó có mẫu hỗn hợp lên men.
1.5.4. Các phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách chất phân tích là các ion hoặc các chất
không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một mao quản hẹp chứa

đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường; do độ linh động điện di của các ion khác
nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [1].
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu
quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít.
Tác giả Coral Barbas và cộng sự [20] đã sử dụng phương pháp điện di mao
quản kết nối với detector UV để tách và định lượng 18 anion trong đó có oxalate và
citrate, với mao quản silica (57cm x 50 µm i.d.), thành phần đệm: H3PO4 0,5M,
CTAB 0,5mM (pH = 6,25), thế áp vào hai đầu mao quản là -10kV. Kết quả thu
được về giới hạn phát hiện và độ lệch chuẩn tương đối tương ứng với oxalate và
citrate là: LOD mM (0,71 và 1,26), RSD (5,0% và 3,6%);
Ph. Puig và các cộng sự [17] đã xác định thành công đồng thời 11 anion của
các axit hữu cơ và vô cơ trong đó có oxalate, tartrate và citrate bằng phương pháp

điện di mao quản vùng kết hợp với detector UV với độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
nhỏ hơn 1%. Giới hạn phát hiện của các ion trong khoảng 0,006-1,072 mg/l. Phương
pháp có thể dễ dàng áp dụng xác định đồng thời 11 anion trong đó có oxalate,
tartrate và citrate trong các mẫu nước giải khát và mẫu thực phẩm với thời gian phân
tích ngắn và độ nhạy tốt.
Trong nghiên cứu của Michael Trevaskis V. Craige Trenerry [12], việc phân
tích được thực hiện bằng cách sử dụng một máy điện di mao quản loại Isco Mode1 3
140 Electropherograph (Isco Inc., Lincoln, NE, USA) hoạt động ở -20 kV và ở 28
°C với mao quản 75 cmx75 id (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) có
chiều dài hiệu dụng là 50cm. Chất phân tích được phát hiện bằng cách sử dụng kỹ
thuật hấp thụ gián tiếp. Giữa mỗi lần phân tích mao quản được rửa trong 2 phút
bằng dung dịch đệm chứa 10% methanol, 10 mM natri cromat tetrahydrate và 4 mM

15


OFM Anion-BT. Giới hạn định lượng đạt được là 0,01g/100 g. Nghiên cứu này
được áp dụng để xác định axit oxalic trong rau và một số loại đồ uống.
Một nghiên cứu đáng tin cậy khác của Corinne Rivasseau [8] sử dụng
phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) với detector UV đã định lượng được
axit citric, malic, succinic, oxalic, formic, fumaric, acetic, và phosphoric chứa trong
thực vật với thời gian tích ngắn trong khi vẫn giữ độ phân giải tốt bằng cách tối ưu
chiều dài mao quản, điện áp tách, thành phần và pH của dung dịch đệm. Quá trình
phân tích được thực hiện trong một mao quản không tráng silica, chiều dài hiệu
dụng 30cm, đảo ngược dòng điện di thẩm thấu và thế điện di là -30 kV. Dung dịch

đệm chứa 3.10-4 mol/L tetradecyltrimethylammonium và 10- 2 mol/L trimellitate pH
= 9,0. Quá trình tách đạt được trong 100s. Khoảng tuyến tính đối với oxalate từ
6.10- 5 đến 10- 3 mol/L.
1.6. Phương pháp điện di mao quản
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác
nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất
điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường nhất định do thế (V) đặt
vào hai đầu mao quản sinh ra. Cấu tạo của hệ điện di được cho trong hình 1.1 [1].

Hình 1.1 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản

Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di

Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cường
độ điện trường (E):
16


v = μ. E

(1.1)

Trong đó:
v: tốc độ di chuyển của ion
μ: là độ diện di

E: là điện trường ngoài
Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích
điện từ phía điện trường ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng:
q.E= fe.v
(1.2)
Trong đó: q: là điện tích hạt nhân
fe: là lực ma sát, fe = 6.π.η.r (η: là độ nhớt của dung dịch, r là bán
kính ion)
Từ các công thức trên có thể suy ra công thức tính độ linh động của ion như
sau:
μ = v/E = q/(6.π.η.r)
(1.3)

Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích
và tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn (bán kính
hydrat r) của ion chất phân tích.
1.6.1. Mao quản

Mao quản là một bộ phận quan trọng trong phương pháp điện di mao quản.
Đây chính là một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu.
Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica. Trong một số
trường hợp cũng có thể dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp,
ví dụ mẫu có ion F- và tách ở pH thấp [1].

Hình 1.2 Mặt cắt ngang của mao quản

•

Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu

17


Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở
sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di.

Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản
Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện

trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn,
ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm
hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển
cùng tốc độ với dòng EOF.

Hình 1.4 Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di

Do vậy, để có được hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm được điều kiện tối ưu
và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và khống chế (như thêm các chất hoạt hóa,
thay đổi bề mặt mao quản,…) sao cho dòng EOF có cường độ phù hợp với chất
phân tích trong điều kiện nghiên cứu cụ thể.
1.6.2. Dung dịch đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản

Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích. Do
yếu tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong
18


thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng. Hơn nữa, chúng
cũng ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất [1, 5].
Bảng 1.2. Các chất thường dùng làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng
Tên chất

Giá trị pK

Tên chất

Giá trị pK

Formate

3,75

Tricin

8,05

Acetate

4,76

Bicin

8,25

Citrate

3,12; 4,76; 6,40

Tris

8,30

MES

6,13

TAPS

8,40

ACES

6,75

Borat

9,14

MOPSO

6,79

CHES

9,55

BES

7,16

CAPS

10,40

MOPS

7,20

Phosphate

2,14; 7,10; 13,30

DIPSO

7,50

Histidine

1,78; 5,97; 8,97

HEPFS

7,51

Lysine

2,20; 8,90; 10,28

HEPPSO

7,9

Arginine

2,18; 9,09; 13,20

1.6.3. Nguồn điện thế cao

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều

nhất định đặt vào hai đầu mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và dòng
điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất.
Trong điện di mao quản, điện thế V một chiều thường được dùng để đặt vào
hai đầu mao quản là từ 15 - 40 kV/1m, hay là từ 150 – 550 V/1cm mao quản. Tuy
nhiên, thế V được dùng phải làm sao không cho dòng điện I quá lớn trong mao
quản, dòng điện I này chỉ nên nằm trong vùng từ 10 – 75 µA. Việc chọn điện thế V
là bao nhiêu tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, chất nền của mẫu, giá trị pH
của pha động điện di,… [1].
1.6.4. Kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

Trong điện di mao quản có ba phương pháp thường dùng nạp mẫu phân tích
vào trong mao quản, bao gồm:

19


•

Phương pháp thủy động lực học dùng áp suất

•

Phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông

•

Phương pháp điện động học

Hình 1.5 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản
* Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động học kiểu xiphông
Trong kĩ thuật này, mẫu được bơm vào mao quản nhờ áp lực (hình 1.5 A, B).
Khi đó, lượng mẫu bơm vào trong mao quản phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất,
lực hút chân không hoặc chiều cao bơm mẫu) và thời gian bơm mẫu. Trong đó bơm
mẫu theo nguyên lý xiphông (hình 1.5B): mẫu được dẫn vào mao quản nhờ chênh
lệch độ cao giữa vị trí đặt lọ mẫu và vị trí đặt lọ đựng dung dịch đệm. Đây là giải
pháp bơm mẫu đơn giản nhất, và được sử dụng cho các hệ điện di mao quản xách
tay vận hành thủ công.

* Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học
Kĩ thuật này sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để bơm
mẫu vào mao quản (Hình 1.5 C). Phương pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic
phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm rất lớn là

20


diện tích pic (dùng để định lượng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do
đó thường chỉ dùng để định tính [1, 2].

1.7. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc

(CE - C4D)
Trong phương pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những
loại detector rất được chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa
khác nhưng lại có ưu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất
phân tích khác nhau. Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao
quản có đường kính hẹp, thậm chí với các microchip mà không ảnh hưởng đến độ
nhạy và các tính chất khác của detector.
•

Giới thiệu chung
Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C 4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục
xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm

nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ) đã
phát triển thành công dòng sản phẩm C 4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều
cao (HV-C4D, 200V). Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm
nghiên cứu của GS.Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C 4D thương phẩm dựa

•

trên nghiên cứu này [1].
Nguyên lý hoạt động C4D
Nguyên lý hoạt động của C4D được minh họa trong hình 1.6.

21

Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc
Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ nhất. Tại
điện cực thứ hai, tín hiệu đo được ở dạng cường độ dòng điện (I). Theo đó, dòng
điện thu được tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f.

Hình 1.7 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc (A) và mạch điện tương đương (B) của cảm biến
đo độ dẫn không tiếp xúc
Tín hiệu đầu ra thu được ở dạng cường độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ
được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua
việc sử dụng một điện trở khuếch đại (R feedback). Vôn thế xoay chiều sau đó được

chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi
thành tín hiệu số hóa trước khi được hiển thị và lưu trữ trên máy tính.
Như vậy, detector đo độ dẫn không tiếp xúc ngoài ưu điểm là phân tích đa
năng còn có ưu điểm là không nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện
cực với dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong
mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hưởng
của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và
không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích.

22

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu xác định oxalate đồng thời với tartrate
và citrate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng
detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE – C4D).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
• Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xác định đồng thời oxalate, tartrate và citrate.
 Khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di: thành phần, pH ứng với các nồng độ

đệm khác nhau, các chất hoạt hóa bề mặt mao quản (nếu cần),…
 Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều
cao bơm mẫu,…
 Khảo sát một số chất có thể gây ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích
•



•

trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp CE-C4D

Đánh giá phương pháp nghiên cứu:
Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn.
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
Đánh giá độ chụm, độ đúng của phương pháp phân tích.
Áp dụng phân tích một sỗ mẫu thực tế như: bia lon, bia hơi, mì tôm gói, mẫu bia,
mẫu trà túi lọc và mẫu trà vỉa hè.
2.2. Phương pháp xử lý mẫu
Các mẫu phân tích được lựa chọn gồm mẫu bia lon, bia chai, mỳ tôm dạng
gói, trà túi lọc được mua tại các cửa hàng ở Hà Nội và nước trà vỉa hè tại khu vực
Hoàn Kiếm Hà Nội.
Các mẫu dạng lỏng (bia, nước trà khô vỉa hè) được lọc qua màng lọc 0,45µm,
sau đó pha loãng với tỉ lệ thích hợp trước khi thực hiện phân tích trên thiết bị CEC4D.

23


Mẫu mì gói được nghiền nhỏ, trộn đều, cân một lượng nhất định trên cân
phân tích (khoảng 0,5 g), thêm 4ml nước deion, rung siêu âm trong 30 phút, ly tâm
(8000 rpm) trong 30 phút, lọc qua màng lọc 0,45µm, pha loãng với tỉ lệ thích hợp
(nếu cần) rồi phân tích bằng thiết bị CE-C4D.
Mẫu trà nhúng Lipton: Xác định khối lượng trung bình của một túi trà. Lựa
chọn ngẫu nhiên 01 túi trà, ngâm 3 phút trong 150 ml nước deion đã đun sôi. Lọc
qua màng lọc 0,45µm, pha loãng với tỷ lệ thích hợp và phân tích trên thiết bị CEC4D.
2.3. Hóa chất và thiết bị
2.3.1. Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân
tích (P.A.).
2.3.1.1.

Chất chuẩn
Natri citrate (Fluka, 99%)
Axit oxalic (Fluka, 99%)
Axit tartaric (Fluka, 99%)
Axit butyric (Fluka, 99%)
Axit formic (Fluka, 99%)
Axit clohydric (HCl) (Merck, Đức)

2.3.1.2.

Hóa chất dung môi
Cetyl trimetylamoni bromine (Fluka, 99%)
L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lượng > 99,5%)
L- Histidine ( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lượng 99,5%)
Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Fluka, 99%)-Tris
Axit 2-(cyclohexylamino) ethanesunlfomic (Fluka, 99%)
24

2-(N-morphonlino)ethane sulfonic axit (Fluka, 99%)
Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức)
Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
Axit axetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
Nước siêu tinh khiết: là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết
có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 µm.
2.3.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
• Pha dung dịch chuẩn

Các dung dịch chuẩn oxalate, tartrate và citrate được pha nước siêu tinh
khiết có nồng độ ban đầu là 10-2M. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.
• Pha dung dịch đệm

Các dung dịch đệm điện di được cân và pha trực tiếp vào bình định mức
bằng nước siêu tinh khiết. Tất cả các dung dịch đều được rung siêu âm và chuẩn lại
giá trị pH trước khi sử dụng. Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày.
2.3.2. Thiết bị dụng cụ
• Thiết bị
 Thiết bị phân tích sử dụng trong nghiên cứu là hệ CE-C 4D tự chế, bán tự động (hình
2.1) được thiết kế lắp đặt với sự tài trợ của Công ty 3Sanalysis và đối tác tại Khoa
Hóa học, Trường Đại học Basel, Thụy sĩ.

Hình 2.1 Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động
(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc
(C4D), 4: Bộ phận kết nối bán tự động, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển,

7: Bình khí nén)
 Bộ lọc nước đêion (Mỹ)
25