Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loại cá biển

VI
VIỆN
ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ
NGH SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN
LU
TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TẠO
O DÒNG
D
VI KHUẨN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
NHƯỢC ĐỘC PHỤC
ỤC VỤ
V CHẾ TẠO VẮC-XIN PHÒNG BỆNH
ỆNH HO
HOẠI
TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOẠI CÁ BIỂN

Giáo viên hướng
h
dẫn : ThS. Nguyễn
n Thị Thu Hiền
Hi
Sinh viên thực
th hiện : Đàm Thận Quảng

Lớ
ớp: 11-02

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa
Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho
em có thể thực tập và hoàn thành đề tài này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn Thị
Thu Hiền Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, người
đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập và
hoàn thành đề tài.
Em không thể quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân, các
anh chị khóa trước, bạn bè đã luôn bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên trong
suốt thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài.
Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính mong
các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu và hoàn
thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015.
Sinh viên

Đàm Thận Quảng


MụC LụC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu chung ........................................................................................... 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể........................................................................................ 2
1.3. Ý nghĩa đề tài ................................................................................................ 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 3
1.4. Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi của đề tài ............................................... 3
CHƯƠNG ITỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4
1.1. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio sp ................................................ 4
1.1.1. Tình hình trên thế giới ............................................................................. 4
1.1.2. Tình hình trong nước ............................................................................... 5
1.2. Giới thiệu về Vibrio parahaemolyticus .......................................................... 7
1.2.1. Đặc điểm của Vibrio parahaemolyticus ................................................... 7
1.2.2. Độc tố của Vibrioparahaemolyticus ........................................................ 9
1.3. Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển do Vibrio .parahaemolyticus
gây ra ................................................................................................................. 11
1.3.1. Cơ chế gây bệnh .................................................................................... 13
1.3.2. Triệu chứng gây bệnh ............................................................................ 13
1.4. Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc ............................................... 14
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc............................. 14
1.4.2. Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn .............................................. 16


1.4.3. Các tác nhân tạo chủng nhược độc ....................................................... 18
1.5. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương .......................................................... 25
1.5.1. Miễn dịch đặc hiệu ................................................................................ 25
1.5.2. Miễn dịch tự nhiên ................................................................................ 25
CHƯƠNG IIVẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 26

2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 26
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................ 26
2.1.3. Môi trường và dung dich nuôi cấy ......................................................... 27
2.1.4. Thiết bị.................................................................................................. 28
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30
2.3.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 30
2.3.2. Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực
nghiệm ............................................................................................................ 30
2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử............................................................... 32
2.3.4. Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm ........................................ 36
CHƯƠNG IIIKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 37
3.1. Kết quả tạo các dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng các tác nhân . 37
3.1.1. Kết quả tạo các dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng tia UV...... 37
3.1.2. Kết quả tạo các dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng kháng sinh
rifampicin ....................................................................................................... 38
3.2. Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng đôt biến. .................... 39
3.2.1. Kết quả thử khả năng dung huyết .......................................................... 40
3.2.2. Kết quả gây nhiễm trên cá ..................................................................... 41
3.2.3. Kết quả chạy PCR xác định gen độc tố .................................................. 43


3.3. Kết quả đánh giá khă năng tạo kháng thể bảo hộ cho cá ........................... 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49


DANH MỤC VIẾT TẮT
Brain Heart Infusion Broth

BHI Broth

Base pair

bp

Brain Heart Infusion

BHI

Deoxyribonucleotide Acid

DNA

Deoxynucleotidetriphosphate

dNTP

Food and Drug Adimistration

FDA

Polymerase Chain Reaction

PCR

Rifampicin

Rif

Thiosulfate Citrae Bile Salt Sucrose

TCBS


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ............................................ 7
Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine. ................................... 20
Hình 1.3. Tác động tia UV làm cho DNA có một chỗ phình trong cấu trúc............ 21
Hình 1.4.Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) ........................................................ 23
Hình 1.5. Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP. .............................................. 23
Hình 1.6. Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB. ............................................ 24
Hình 2.1. Minh họa thí nghiệm chiếu tia UV ......................................................... 31
Hình 3.1. Khuẩn lạc sống sót sau khi chiếu UV ..................................................... 38
Hình 3.2. Khuẩn lạc chịu được trên môi trường TCBS có bổ sung kháng sinh ...... 39
Hình 3.3. Khả năng dung huyết của chủng LBT6 và Dòng 8 ................................. 41
Hình 3.4. Cá sau khi gây nhiễm các chủng đột biến ............................................... 43
Hình 3.6: Sản phẩm PCR xác định 2 gen độc tố Tox R, tlh .................................... 45
Hình 3.7. Cá thí nghiệm sau gây nhiễm 15 ngày .................................................... 47


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR ............................................... 35
Bảng 3.1. Số khuẩn lạc sống sót sau xử lý UV ....................................................... 37
Bảng 3.2. Số khuẩn lạc sống sót sau xử lýkháng sinh rifamycin ............................ 39
Bảng 3.3. Kết quả khả năng dung huyết................................................................. 40
Bảng 3.4. Kết quả gây nhiễm cá sao 15 ngày tiêm. ................................................ 42
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra sự có mặt các gen độc tố ............................................. 44
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá khă năng sinh kháng thể bảo hộ .................................. 46

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây của Biển Đông, có bờ
biển dài hơn 3.260 km trải dài từ Bắc tới Nam tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình
thành và phát triển kinh tế, đặc biệt là nghề nuôi trồng thủy hải sản. Nuôi trồng thủy
sản là ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất trên thế giới,
mang lại những tiềm năng to lớn để chúng ta đẩy mạnh chiến lược phát triển kinh tế
biển.
Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn), tổng sản lượng thủy sản nuôi trồng trong 8 tháng đầu năm 2014 ước đạt 543
nghìn tấn, trong đó sản lượng khai thác 244 nghìn tấn, sản lượng nuôi trồng 299
nghìn tấn, đưa tổng sản lượng thủy sản 8 tháng đầu năm xấp xỉ 4,0 triệu tấn, tăng
4,0%, trong đó sản lượng khai thác 1,9 triệu tấn (tăng 4,9%), sản lượng nuôi trồng
2,1% (tăng 3,1%). Tổng cục Thủy sản cũng cho biết, giai đoạn 2011-2015 ngành
thủy sản sẽ hướng tới sự phát triển bền vững là một ngành xuất khẩu hàng hóa lớn,
có khả năng cạnh tranh cao và hội nhập vững chắc thế giới.
Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong
phú.Trong đó, mô hình nuôi cá lồng đang ngày càng khẳng định được vị trí của
mình. Đây là mô hình được áp dụng cho nhiều loài cá có giá trị kinh tế cao. Cá khi
nuôi trong lồng phải chịu rất nhiều yếu tố gây stress do phải thích nghi với môi
trường sống mới, tập quán sinh sản và kiếm ăn bị đảo lộn, sức đề kháng bị ảnh
hưởng. Vì thế, cá nuôi lồng thường mắc một số bệnh do vi khuẩn và virus gây ra.
Đáng lưu ý nhất là bệnh hoại tử gan thận trên cá biển do chủng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây ra, làm thiệt hại không nhỏ đến người nuôi cá biển.

Bệnh hoại tử gan thận xuất hiện ở hầu hết các loài cá biển (cá mú, cá chẽm,
cá giờ, cá hồng, cá bớp…), đặc biệt là cá nuôi lồng, xuất hiện ít ở cá nước ngọt. Khi
vi khuẩn V.parahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, gây hoại tử lên các nội
quan của cá (đặc biệt là gan, thận), lở loét lớp biểu bì. Gan và thận bị hoại tử, gan từ
màu xám nâu chuyển thành màu vàng, làm cho cá biển chết hàng loạt. Bệnh thường
xảy ra ở các giai đoạn của cá, vì vậy tìm ra phương pháp phòng và trị bệnh có thể
hạn chế những tổn thất do dịch bệnh gây ra là hết sức cần thiết.

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

1


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Thực tế trong nuôi trồng thủy sản, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất
và kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh có thể gây
hiện tượng nhờn thuốc và không mang lại hiệu quả cao. Vi khuẩn này có khả năng
tạo ra màng bảo vệ trước thuốc diệt khuẩn và kháng sinh. Chính vì thế, dịch bệnh
thường bùng phát trở lại rất nhanh sau khi thuốc hết tác dụng. Mặt khác, dư lượng
kháng sinh trong sản phẩm từ cá biển có thể gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt
cá và sức khỏe của con người.
Hiện nay phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất là sủ dụng vắc-xin. Việc
nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là tương đối cần thiết. Một trong những
bước quan trọng để nghiên cứu ra vắc-xin là phải tạo được chủng vi khuẩn nhược
độc, làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận ở cá
biển.

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu tạo dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc phục vụ chế tạo vắcxin phòng bệnh hoại tử thận trên một số loại cá biển.” làm cơ sở ban đầu hướng
đến việc sản xuất vắc-xin bệnh hoạt tử gan thận ở cá biển.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu chung
Tạo được chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc có khả năng
tạo khánh thể bảo hộ ở cá
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
• Tạo được dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc kỹ thuật đột
biến sử dụng tia UV.
• Tạo được dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhược độc bằng kỹ thuật
đột biến sử dụng kháng sinh rifampicine.
• Đánh giá đặc tính của chủng đột biến:
Đánh giá lạikhả năng dung huyết.
Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm trên cá.
Kiểm tra xác định gen độc tố.
Đánh giá khả năng tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc.

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

2


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

1.3. Ý nghĩa đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả tạo vi khuẩn V.parahaemolyticus giảm độc lực bằng phương pháp
gây đột biến cung cấp cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn
nhược độc làm nguyên liệu cho sản xuất vắc-xin.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả tạo chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus giảm độc lực đã được đánh
giá về tính an toàn, khả năng tạo kháng thể bảo hộ là nguyên liệu có chất lượng tốt
để sản xuất vắc-xin bệnh hoại tử gan thận ở cá biển.
1.4. Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi của đề tài
Hiện nay, ở Việt Nam, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus
giảm độc lực sử dụng để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển là
nghiên cứu mới. Thành công của đề tài sẽ góp phần giải quyết một cách đáng kể
việc sử dụng vắc-xin trong việc nuôi cá biển.

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

3


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio sp
1.1.1. Tình hình trên thế giới
Hiện nay trên thế giới ngành nuôi trồng thủy sản rất phát triển, có thể kể đến
các nước đứng đầu về sản lượng nuôi trồng thủy sản theo thứ tự gồm: Trung Quốc,
Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Chile, Nhật Bản, Na Uy và

Philippines. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy hải sản đang bị gây trở ngại bởi nạn
dịch bệnh lây lan khắp nơi. Các dịch bệnh thường xảy ra đối với thủy hải sản là
bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi,… ở tôm nuôi, bệnh xuất huyết do virus,
bệnh Indivirus… ở cá, bệnh do nhóm Vibrio sp., nấm…gây thiệt hại nghiêm trọng
cho ngành nuôi trồng thủy hải sản[32].
Một trong những tác nhân gây bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do
nhóm vi khuẩn Vibriosp. gây ra cho động vật thủy hải sản (tôm, cá). Chúng có thể
gây bệnh qua tất các giai đoạn của động vật thủy sản và được xem là nguồn gốc gây
thiệt hại nghiêm trọng trên giống thủy hải sản. Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã
được phát hiện ở Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan trên
nhiều loài thủy hải sản khác nhau. Các sự giảm sút gần đây trong ngành nuôi trồng
thủy hải sản ở Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc chủ yếu
là do tác động của nhóm vi khuẩn Vibriosp[32].
Nhóm vi khuẩn Vibrio được xác định là tác nhân gây bệnh phổ biến ở các loài
cá biển trên thế giới. Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết khi nhiễm Vibrio
có thể trên 50% trong một đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn mê, màu sắc cơ thể biến
đổi và xuất hiện vùng hoại tử. Khi cá bệnh nặng nội quan có thể xuất huyết
hoặc bên trong chứa đầy dịch lỏng.
V. parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951
tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hàu…Người ta đã xác định
đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho
người gồm V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. Alginolyticus,V.
cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới cả chân Mỹ, gây bệnh dịch tả

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

4

Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

cho một số vùng châu Á, Ấn Độ và Đông Nam Á. Chúng từng gây đại dịch do lây
truyền qua tiếp xúc, nước, sữa, thực phẩm và côn trùng[34].
V. parahaemolyticus là vi sinh vật biển, tồn tại tự nhiên trong nước biển,
thường gặp ở các loại hải sản loại nhuyễn thể và giáp sát trong nước biển.
Năm 2001, Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá
bớp có dấu hiệu lở loét tại Đài Loan. Đến năm 2006 Vibrio vulnificusđược xác định
chính là nguyên nhân gây bệnh trên cá bớp. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chính
thức nào về cá bớp bị lở loét nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong bài báo này,
chúng tôi trình bày kết quả phân lập, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và
xác định độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với vi khuẩn phân lập được
nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị bệnh hiệu quả.
Ngoài ra, những người dân sống ven sông và vùng duyên hải tại Canada
thường có thú đào vớt nghêu sò. Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản
này đôi khi là mối đe dọa về sức khỏe. Cũng như bất cứ loài thủy sản nào khác, sò
ốc cũng có thể bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E. coli spp, Salmonella spp,
Vibrio vulniculus, Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk(
Norovirus) và virus bệnh viêm gan A.
Hiện nay, V. parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều
vụ ngộ độc thức ăn do ăn cá biển và hải sản. Trong khoảng 50 năm qua, người ta đã
nghiên cứu nhiều về loại vi khuẩn này. Các nhà khoa học lo ngại do biến đổi khí
hậu, nhiệt độ tăng lên dẫn đến sự tăng vọt bất ngờ và đột ngột của V.
parahaemolyticus - loại vi khuẩn một thời có vẻ như chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ. Dịch
tễ học của vi khuẩn đã thay đổi và những týp huyết thanh mới phát hiện đã được
thừa nhận là nguyên nhân của sự thay đổi này.
1.1.2. Tình hình trong nước
Việt Nam là một trong những quốc gia trên thế giới có nghề nuôi thủy sản

phát triển và cũng là nước có lịch sử nuôi trồng thủy hải sản lâu đời. Nghề nuôi thủy
sản truyền thống bắt đầu từ thập niên 1960, tuy nhiên trong vòng 10 năm nay, nghề
nuôi thủy sản có tốc độ phát triển rất nhanh chóng. Trong những năm qua,
ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan
trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà [32].

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

5


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Hiện nay, đối tượng nuôi và mô hình nuôi thủy sản ở Việt Nam khá phong
phú. Đặc biệt những năm gần đây, người dân chú ý đến khả năng nuôi cá mú, đặc
biệt là cá mú chấm nâu là loài được nuôi phổ biến ở các tỉnh Phú Yên, Khánh Hòa,
Vũng Tàu, Quảng Ninh, Hải Phòng, do đặc điểm lớn nhanh, thịt thơm ngon và
nguồn giống cung cấp cho người nuôi ổn định. Mặc dù nghề nuôi cá mú đã mang lại
hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi cá biển nhưng rủi ro do dịch bệnh xảy ra cũng
gây ảnh hưởng không nhỏ đến nghề nuôi cá mú. Có nhiều nguyên nhân gây thiệt hại
cho nghề nuôi cá mú, trong đó có nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. gây chết
cá nuôi. Cá mú bị bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. gây ra thường có các biểu hiện khác
nhau như: Hiện tượng mắt lồi và mù mắt hay hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể.
Ngoài ra, vi khuẩn Vibrio sp. còn gây bênh phổ biến trên một số loài cá khác như cá
hồng, cá giò, cá chẽm, cá bớp…Trong đó, hiện tượng lở loét, xuất huyết cơ thể ở cá
là chủ yếu với các biểu hiện da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm đỏ trên thân và tại
các đốm đỏ này bắt đầu lở loét dần dần và lan rộng ra xung quanh. Cùng với đó là

sự xuất huyết miệng, vây, hậu môn và đuôi cá. Cá thường bơi gần mặt nước, sát bờ
ao hay lưới lồng nuôi. Khi giải phẫu nội tạng có thể nhìn thấy gan cá có màu nhợt
nhạt hay có chất dịch trong xoang bụng ở một số trường hợp cá bị bệnh nặng.
V. parahaemolyticus có thể gây ra viêm đường tiêu hóa, nhiễm trùng vết
thương và nhiễm trùng huyết ở người. Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa nghiêm
trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc các độc tố của chúng sinh ra có thể
tồn tại lâu dài và lưu thông trong máu. Tác nhân vi khuẩn Vibrio gây xuất huyết cơ
thể, xuất hiện các vết lở loét ở thân, cuống đuôi và vây thối rữa ở cá mú giống và cá
mú thịt là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, V.alginolyticus, gây hội chứng
đường ruột ở cá mú là do vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. Carchariae, gây triệu
chứng mắt lồi và mù mắt ở cá mú là do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra, chúng phá
hủy cấu trúc đặc trưng của mắt, làm khả năng bắt mồi của cá kém đi, từ đó làm cá
yếu dần và chết [33].
Bệnh lở loét được ghi nhận đã xuất hiện và làm chết cá vào mùa hè năm 2008
- 2009 ở một số cơ sở nuôi cá mú tại Sông Cầu, thuộc tỉnh Phú Yên và Cam Ranh
thuộc tỉnh Khánh Hòa. Trong năm 2010 và đầu năm 2011, bệnh cũng xuất hiện
nhiều ở các vùng nuôi cá mú trong ao và trong lồng nổi trên biển thuộc các tỉnh Phú

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

6


Viện Đại Học Mở Hàà Nội
N

Khoa Công Ngh
Nghệ Sinh Học

Yên, Khánh Hòa và Vũng
ũng Tàu.
T Bệnh xuất hiện nhiều vào
ào mùa hè và nh
nhất là vào lúc
giao mùa, gây tỉ lệ chết
ết cao.
1.2. Giới thiệu về Vibrio parahaemolyticus
1.2.1. Đặc điểm của Vibrio parahaemolyticus
Vibrio parahaemolyticus là một loại vi khuẩnn Gram âm, hình ddấu phẩy, có
tiêm mao ở một đầu,
u, di động,
đ
kỵ khí và ưa môi trường kiềm mặn, thờ
ời gian thế hệ 89 phút [11], thường sống
ng ở các cửa sông và ven biển của hầu hếtt các vùng trên th
thế
giới, đã phân lập đượcc trong cát, bùn và nước
n
biển, cũng như ở hải sảản [27].

AB
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn
khu Vibrio parahaemolyticus
arahaemolyticus
A: Hình thái tế
t bào dưới kính hiển vi quang học
B: Hình thái khuẩn
khu lạc trên môi trường TCBS

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

7


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Vị trí phân loại:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Vibrionales
Họ: Vibrionaceae
Chi: Vibrio
Loài: Vibrio parahaemolyticus
Các đặc tính sinh hóa đặc trưng cho V.parahaemolyticus theo như mô tả trên
gồm phản ứng oxydase, khả năng sử dụng lysin, ornithin, arginine, khả năng lên
men đường arabinose, lactose, sucrose, mannitol, mannose, sống được trong phạm
vi muối từ 3-8%, không mọc ở môi trường không có muối (0%) hoặc muối quá cao
(10%).
Các chủng V. parahaemolyticus phân lập có thể phân biệt nhau bằng kiểu
huyết thanh (serotyping).Hệ thống để xác định các kiểu huyết thanh của
V.parahaemolyticus dựa trên các cấu trúc kháng nguyên khác nhau của các nhóm
lipopolysaccharides (gọi tắt là nhóm O) và các loại nang (gọi tắt là các loại K) [19].
Theo nguồn từ FDA, có 12 nhóm O và 65 loại K đã được xác định.
Các chủng V.parahaemolyticus được phân lập cùng một kiểu huyết
thanhcóthể giống nhau hoặc phân biệt với nhau.

Không phải tất cả các chủng V.parahaemolyticus đều gây bệnh ở người.Thực
tế, phần lớn các chủng phân lập từ môi trường hoặc từ các loài cá biển không gây
bệnh.Các chủng gây bệnh thì sản xuất ra thermostable direct hemolysin (TDH).
TDH là một enzyme có thể làm tan các tế bào hồng cầu trên môi trường thạch máu
Wagatsuma, được gọi là hiện tượng Kanagawa.
Loài vi khuẩn này là một trong những tác nhân gây rất nhiều bệnh cho ngành
thủy sản (bệnh lở loét ở cá, bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, hội chứng chết sớm EMS ở tôm sú và tôm thẻ…). Bên cạnh đó, nó được phát hiện là nguyên nhân gây
ra các vụ ngộ độc thực phẩm khi ăn những hải sản chưa được nấu chín.
Vi khuẩn này có khả năng hình thành màng bao sinh học, sự hình thành các
màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt vật chủ. Sau đó, vi khuẩn

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

8


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

tiết ra các chất hình thành nên một lớp keo giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật
chủ. Khi đã hình thành các màng bao sinh học chắc chắn trên dạ dày tôm, các vi
khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao là hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành có
tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử trùng, các
chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong khi các hoạt
động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
Sự phân bố của V. parahaemolyticus có mối liên quan chặt chẽ với nhiệt độ
nước. Ở những vùng nước có nhiệt độ trên 15ºC, chúng có mặt quanh năm trong
nước, chất lắng cặn và có mật độ tăng cùng với sự tăng lên của nhiệt độ nước [10],

[20]. Ngoài ra, pH của môi trường cũng có ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn
này.
Nghiên cứu của Kazuyuki và cộng sự (1979) cho thấy cả 20 chủng
V. parahaemolyticus thí nghiệm đều phát triển được trên môi trường NB với pH
biến thiên từ 6,0 - 9,0. Tuy nhiên, ở pH 9,0 vi khuẩn không tiết ra hemolysin trong
khi ở các pH khác đều có hiện tượng này. Hơn nữa, khả năng vận động bằng tiên
mao của vi khuẩn bị ức chế trong môi trường kiềm nhưng không bị ảnh hưởng ở
môi trường tru ng tính và axit. Kết quả nghiên cứu này cho thấy pH của môi trường
có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng vận động của V.
parahaemolyticus[21]. Nghiên cứu của Christopher và cộng sự (2011) cho thấy khi
ở độ mặn thích hợp và pH 8,0, vi khuẩn V. parahaemolyticus có khả năng di động
bằng tiên mao với vận tốc 60 µm/s [10].
1.2.2. Độc tố của Vibrioparahaemolyticus
Vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho vật chủ thông qua các loại độc tố (toxin), đây
là các hoạt chất sinh học có bản chất protein hoặc không phải protein do vi khuẩn
tiết ra nhằm gây độc cho tế bào vật chủ. Quá trình gây bệnh của chúng diễn ra theo
trình tự bám dính, xâm nhập vào tế bào vật chủ và tiết ra các độc tố phá vỡ màng tế
bào và gây độc cho tế bào vật chủ. V. parahaemolyticus vào tế bào vật chủ thông
qua phân tử gắn kết đa trị (Multivalent Adhesion Molecule - MAM) chứa 6 hoặc 7
vùng gắn kết [10]. Hoạt tính dung huyết, phân giải protein, lipid, phospholipid,
cytotoxin, yếu tố gây bám dính, ngưng kết đều liên quan tới khả năng gây bệnh của

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

9


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

nhiều loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio và được quy định bởi các gen độc tố đặc
trưng [30].
Cũng như các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio, vi khuẩn V.
parahaemolyticus cũng tồn tại rất nhiều chủng mang các yếu tố gây độc khác nhau.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính dung huyết (haemolysis) là một trong những
yếu tố gây độc của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với vật chủ. Haemolysin là
một exotoxin, chúng bám lên màng tế bào hồng cầu, gây thủng màng và giải phóng
haemoglobin. Kết quả là tạo ra hiện tượng dung huyết hoàn toàn (β-haemolysis)
hoặc không hoàn toàn (α-haemolysis) [30]. Ngày nay, người ta đã phát hiện có 4
nhóm protein độc tố gây ra hiện tượng dung huyết ở vi khuẩn Vibrio bao gồm TDH
(Thermostable direct haemolysin), Hly A (E1 Tor haemolysin), TLH (Thermolabile
haemolysin) và TRH (Thermostable direct related haemolysin). Trong đó, TDH,
TLH và TRH thường gặp ở V.parahaemolyticus trong khi Hly A thường gặp ở V.
cholera [30].
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có ba gen độc tố hemolysin bao gồm tdh và
trh mã hóa các hemolysin bền nhiệt TDH, TRH và tlh mã hóa hemolysin không bền
nhiệt TLH. Cả hai gen tdh và trh đều nằm trên operon độc tố Vp-toxRS, được điều
hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn cao trong loài [25].
Protein TDH và TRH được mã hóa bởi gen tdh và trh tương ứng được coi là
yếu tố độc tính quan trọng của V. parahaemolyticus[26], [17]. Gen tdh, trh lần lượt
có kích thước 250 và 251 bp, cùng nằm trong operon độc tố V. parahaemolyticus
toxRS (Vp-toxRS), được điều hòa bởi gen toxR. Gen toxR là gen điều hòa kiểm soát
sự biểu hiện của các gen mã hóa cho các nhân tố độc lực ngoại bào quan trọng và
các gen liên quan đến các độc tố khác. Gen toxR có kích thước 368 bp là gen điều
hòa cho operon Vp-toxRS [31], tồn tại ở tất cả các chủng V. parahaemolyticus. Gen
toxR có trình tự bảo tồn đặc trưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để
xây dựng phương pháp phát hiện nhanh V. parahaemolyticus trong mẫu thủy sản
bằng kỹ thuật PCR. Gen tlh có kích thước 451bp mã hóa một hemolysin không bền

nhiệt TLD có trình tự amino acid bảo thủ trong họ Vibrionaceae, nên có tiềm năng
làm vaccin điều trị bệnh thủy sản và marker chẩn đoán bệnh do Vibrio.

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

10


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

Nhìn chung, các nghiên cứu về độc tố và cơ chế gây độc của Vibrio, nhất là
V. parahaemolyticus đã được nghiên cứu tương đối sâu, chủ yếu là nghiên cứu các
chủng phân lập từ người. Kết quả đạt được mang lại nhiều ý nghĩa quan trọng trong
y học, giúp chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra. Tuy nhiên, số lượng
công trình nghiên cứu cơ bản về các loại vi khuẩn gây bệnh cho đối tượng thủy sản
vẫn còn hạn chế. Việc tìm hiểu đặc điểm, cơ chế gây độc và tác hại của chúng trên
đối tượng nuôi là rất cần thiết nhằm tìm ra các giải pháp hạn chế thiệt hại do vi
khuẩn gây ra cho đối tượng thủy sản
1.3. Tổng quan về bệnh hoại tử gan thận ở cá biển do Vibrio .parahaemolyticus
gây ra
Vi khuẩn V. parahaemolyticus có thể kí sinh trên rất nhiều loài cá biển có giá
trị kinh tế phân bố ở các vùng biển khác như các loài cá ở vùng biển ấm như cá
chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Lutjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum),
cá mú (Epinephelus spp.). Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra được báo
cáo đã gây thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá biển ở nhiều nước trên thế giới [2], [6],
[15], [24].
Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra đặc trưng bởi sự xuất hiện các

đốm đỏ, xuất huyết (bên ngoài hoặc nội quan bên trong). Vẩy cá bị tróc, rụng, tạo
nên các vết loét ngày càng lan rộng và sâu. Vây cá có thể bị mòn cụt, xơ xác. Giải
phẫu mẫu cá bệnh cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng (đặc biệt là gan và thận)
và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể chết hàng loạt khi bị cấp tính, hoặc
chết rải rác khi ở thể thứ cấp tính.
Đặc điểm bệnh hoại tử ở cá mú chấm cam với các triệu chứng ban đầu là cá
thường bơi gần mặt nước hoặc bơi sát vào lưới, da cá sẫm màu, xuất hiện các đốm
đỏ trên thân. Sau đó, các đốm này tạo thành vết loét rộng ra xung quanh, kèm theo
biểu hiện xuất huyết ở vây, miệng, hậu môn, đuôi. Giải phẫu nội quan thường thấy
gan nhợt nhạt, thận đen bầm, đôi khi tích dịch trong xoang bụng ở một số trường
hợp bệnh nặng.
Bệnh hoại tử gan thận xảy ra ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản
nước lợ và nước mặn. Bệnh lây lan rất nhanh, nếu không phát hiện kịp thời có khả
năng gây chết rất cao. Bệnh thường xuất hiện vào mùa nóng và đầu mùa mưa, khi

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

11


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

môi trường thay đổi đột ngột, làm cá dễ bị sốc. Hơn nữa, vi khuẩn tổng số trong
nước có xu hướng tăng khi nhiệt độ tăng. Đây là điều kiện tốt cho vi khuẩn xâm
nhập gây bệnh và đặc biệt gây chết nhiều đối với cá giống mới thả nuôi. Vi khuẩn
V. parahaemolyticus có ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi thủy sản của hơn 14
nước và gây bệnh trên khoảng 48 loài cá biển.

Bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra được chẩn đoán dựa vào
những dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như đã mô tả ở trên. Nuôi cấy phân lập Vibrio
trên môi trường chọn lọc và phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa [7].
Ngoài ra, nhận biết V. parahaemolyticus bằng các phương pháp sinh học phân tử
như phân tích trình tự gen 16S ribosomal DNA (rDNA) [14] hoặc các gen độc tố
đặc trưng [9].
Để điều trị được bệnh hoại tử gan thận ở cá biển, một số nghiên cứu đã đề
xuất biện pháp trị bệnh Vibriosis cho cá biển bằng cách cho ăn, tắm hoặc tiêm
kháng sinh. Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như trộn tetracyline 75-100
mg/kg cá, streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên
tục trong 7 đến 10 ngày cũng cải thiện được tình trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn
Vibrio [6]. Nhìn chung, kháng sinh là phương pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh
do vi khuẩn. Mặc dù kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định trong một số
trường hợp, nhưng việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng
thuốc gây khó khăn cho quá trình điều trị. Nghiên cứu của Shyne và cộng sự (2008)
về khả năng nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn V.parahaemolyticus phân lập từ
cá mú bệnh. Kết quả cho thấy hầu hết các chủng đều kháng lại sulphadiazine và
amoxicillin, 87% kháng lại gentamycine, 89% kháng lại kanamycine và
oxytetracycline [28]. Ngoài ra, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản còn ảnh
hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trường. Vì vậy, việc sử dụng kháng
sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không nên khuyến khích và cần cân nhắc
thận trọng trong từng trường hợp. Chính vì những mặt trái do sử dụng kháng sinh,
việc phòng bệnh cho cá nuôi vẫn luôn được chú ý trong suốt quá trình nuôi. Phương
pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi áp dụng như sát trùng bể, ao
và dụng cụ trước mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước trước khi đưa vào sử dụng.
Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm cá bị tổn thương trong quá trình vận

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

12


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

chuyển, tắm định kỳ để phòng các loại bệnh ký sinh trùng và chú ý chất lượng thức
ăn. Tuy nhiên, đây chỉ là những biện pháp phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm
thiểu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây
ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển. Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng
cho vật nuôi bằng cách sử dụng các chất gây kích thích miễn dịch và vắc-xin phòng
bệnh là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao, đã và đang được
tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới. Song, để chế tạo ra các loại vắcxin đặc hiệu hay chọn lựa được các hoạt chất kích thích miễn dịch đem lại hiệu quả
bảo hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thử thách không nhỏ đối với khoa học hiện nay.
1.3.1.Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn này có khả năng hình thành màng bao sinh học, sự hình thành các
màng bao sinh học bắt đầu khi vi khuẩn bám trên bề mặt vật chủ. Sau đó, vi khuẩn
tiết ra các chất hình thành nên một lớp keo giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt vật
chủ. Các vi khuẩn bắt đầu nhân lên, màng bao là hợp chất exopolysaccharides sẽ
hình thành có tác dụng bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất
khử trùng, các chất chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp điều trị khác, trong
khi các hoạt động trao đổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
Khi vi khuẩn V. prahaemolyticus xâm nhập vào cơ thể cá biển, vi khuẩn lấy
ion Fe2+ từ tế bào hồng cầu hình thành enzyme protease phục vụ cho quá trình tổng
hợp protein của chúng.
1.3.2.Triệu chứng gây bệnh
Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng
lưng và trên các vết thương tổn da, vây có thể sưng lên và bị lở loét. Cơ nổi hạch,
mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục.

Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại
tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử
này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban
đầu của nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong
khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu
đen [4].

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

13


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

1.4. Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc
1.4.1. Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc
1.4.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Ở các nước có nghề nuôi cá biển phát triển như Na Uy, Mỹ, Nhật Bản, việc
nghiên cứu và sử dụng vắc-xin cho cá được đầu tư nghiên cứu từ rất sớm và đạt
được nhiều thành công. Thử nghiệm vắc-xin vi khuẩn để phòng bệnh cho cá được
công bố đầu tiên bởi Duff (1942) [12]. Trong nghiên cứu này, cá hồi sau khi ăn vi
khuẩn Aeromonas salmonicida bất hoạt bằng chloroform đã có khả năng kháng
bệnh lở loét Furunculosis. Năm 1970, vắc-xin thương mại đầu tiên được sản xuất từ
vi khuẩn Vibrio bất hoạt bằng formalin phòng bệnh lở miệng (ERM) và Vibriosis
đã thành công tại Mỹ và đã làm giảm đáng kể lượng kháng sinh sử dụng cho nghề
nuôi cá hồi tại đây. Tiếp đó, nhằm nâng cao hiệu quả bảo hộ cho cá nuôi, vắc-xin
tiêm có bổ sung chất bổ trợ (adjuvant) ra đời trong những năm đầu 1990 [29]. Ngoài

vai trò như một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu, các chất bổ trợ còn giữ
cho kháng nguyên được phóng thích từ từ trong cơ thể vật chủ, kéo dài thời gian
tiếp xúc của vật chủ với kháng nguyên, xác lập tính nhớ và kích thích sinh kháng
thể đặc hiệu trong thời gian dài. Sau đó, nhiều loại vắc-xin vi khuẩn cho cá với các
phương thức chế tạo khác nhau đã được nghiên cứu như vắc-xin bất hoạt kết hợp đa
kháng nguyên, vắc-xin sống nhược độc, vắc-xin có bổ sung các loại chất bổ trợ
khác nhau…Việc sử dụng vắc-xin phòng bệnh đã đem lại những thành công vượt
bậc cho nghề nuôi cá ở nhiều nước.
Trong vài năm trở lại đây, các nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh cho cá mú bắt
đầu được chú ý, tập trung tại các nước Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung
Quốc, Đài Loan, Thái Lan. Vắc-xin vi khuẩn V. harveyi bất hoạt đã làm giảm tỷ lệ
chết ở nhóm cá mú E. bruneus tiêm vắc-xin (35 %) so với nhóm đối chứng (90 %)
[16]. Vắc-xin tổ hợp từ 2 loài vi khuẩn V. harveyi và V. parahaemolyticus bất
hoạt formalin đã được thử nghiệm trên cá mú chấm cam tại Thái Lan, kết quả cho
thấy hiệu quả bảo hộ đạt đến 77,6 %. Tuy nhiên, vắc-xin từ vi khuẩn bất hoạt
thường cho hiệu quả bảo hộ trong thời gian ngắn.
Nhìn chung, trên thế giới, nhiều loại vắc-xin phòng bệnh cho cá nuôi đã
được nghiên cứu và sản xuất, từ loại vắc-xin đơn giản như vắc-xin bất hoạt

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

14


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

(inactivated), đến vắc-xin có công nghệ sản xuất phức tạp như vắc-xin nhược độc

(live attenuated), vắc-xin đa giá (multivalent), vắc-xin tiểu phần (sub-unit vắc-xin).
Mỗi loại vắc-xin có qui trình sản xuất, cách sử dụng cũng như công hiệu khác nhau
trên các loài cá. Tuy nhiên, có rất ít những loại vắc-xin được thương mại hóa ra thị
trường hiện nay.
1.4.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vắc-xin cho cá vẫn còn
khá mới mẽ. Vài công trình nghiên cứu miễn dịch trên cá chỉ mới bắt đầu thực hiện
trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung trên các đối tượng cá nước ngọt như cá
trắm cỏ, cá tra…Liên quan đến bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
gây ra trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus ở đồng bằng sông Cửu Long, Vũ
Thị Thanh Hương và công sự (2011) thông báo đã tạo được chủng vi khuẩn E.
ictaluri nhược độc thành công bằng phương pháp sử dụng kháng sinh Rifampicin
gây đột biến gen purA [3]. Mặt khác, hai loại protein ngoại mạc của vi khuẩn này là
OmpA và OmpN được chứng minh là có khả năng gây kích thích miễn dịch ở cá và
khuyến nghị sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất vắc-xin tiểu phần phòng bệnh
gan thận mủ ở cá tra. Qua nhiều năm nghiên cứu, vắc-xin Alphaject Panga-1 phòng
bệnh gan thận mủ cho cá tra đã ra đời và thử nghiệm thành công trên cá tra tại 3 tỉnh
Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre. Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vắc-xin này
là an toàn cho cá, giúp cá tạo kháng thể đặc hiệu chống lại vi khuẩn với hệ số bảo
hộ từ 50– 64,7% [2].
Tại An Giang, Trương Ngọc Thùy Liên, Vũ Thị Thanh Hương, Trần Thanh
Tiếng, Nguyễn Quốc Bình (2014), tạo thành công chủng aeromonas hydrophila đột
biến nhược độc Bằng phương pháp knock-out gen aroa,bệnh nhiễm trùng huyết do
aeromonas hydrophila. Chủng M25 A.hydrophila đột biến bất hoạt gen aroA có độc
lực thấp hơn nhiều(>1.000 lần) so với chủng hoang dã ban đầu được kiểm tra lại
bằng cách gây nhiễm lại trên cá hồi.
Nhìn chung, gần đây những nghiên cứu miễn dịch cá và vắc-xin vi khuẩn
phòng bệnh cho cá ở Việt Nam đã được quan tâm nhiều hơn. Tuy nhiên, số lượng
công trình nghiên cứu còn rất hạn chế, các nghiên cứu cơ bản về miễn dịch trên các

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

15


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

đối tượng cá biển có giá trị kinh tế vẫn chưa được thực quan tâm đúng mức, có rất ít
sản phẩm vắc-xin thương mại phòng bệnh cho cá xuất hiện trên thị trường.
1.4.2. Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn
Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vậtđãđượclàmgiảm độclực
khôngcònkhảnănggây bệnh nhưng có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh, thời
gian duy trì đáp ứng miễn dịch dài.
- Giảm độc bằng nhiệt độ. Vi sinh vật gây bệnh thường mẫn cảm với yếu tố
nhiệt độ, nếu nuôi cấy chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực
nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên.
Vắc-xin nhiệt thán: Nuôi vi khuẩn nhiệt thán ở nhiệt độ 42,5- 43ºC từ 15-20
ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống
gốc sản xuất vắc-xin.
Vắc-xin Sabin dạng uống chống bại liệt: Chọn các chủng virus bại liệt đã đột
biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp. Virus có
thể nhân lên trong tuyến nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào
mô thần kinh do đó không gây chứng bại liệt nữa.

-

Giảm độc bằng yếu tố hóa học.

Vắc-xin BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò

Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nuôi cấy trong môi trường có mật
bò trong 13 năm sau 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không còn độc, được sử dụng
để sản xuất vắc-xin BCG phòng bệnh lao cho con người.
Vắc-xin nhiệt thán nhược độc giáp mô được chế bằng cách: Vi khuẩn nhiệt
thán nuôi cấy trong môi trường CO2, vi khuẩn không có khả năng hình thành giáp
mô. Nếu đem vi khuẩn đó nuôi cấy tiếp ở môi trường có đủ O2 thì vi khuẩn lại hình
thành giáp mô, nhưng độc lực yếu không có khả năng gây bệnh được sử dụng làm
vắc-xin.

-

Giảm độc bằng phương pháp sinh vật học.
Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vắc-xin virus sử

dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này. Vi sinh vật gây bệnh
được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn (động vật thí nghiệm hoặc môi
trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm). Vi sinh vật không đủ điều kiện để thực hiện

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

16


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Khoa Công Nghệ Sinh Học

đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi hệ gen để thích nghi với điều kiện sống mới, do đó
vi sinh vật thay đổi về độc lực và khả năng gây bệnh.

-

Giảm độc bằng kỹ thuật gen
Tái tổ hợp hệ gen (genome)
Virus tái tổ hợp hệ genđược tạo ra bởi kỹ thuật gây nhiễm đồng thời hai

chủng virus khác nhau vào cùng một cơ thể vật chủ, virus mới tạo thành sẽ có bộ
gen chứa cả gen của hai chủng virus bố mẹ. Ví dụ chủng Rotaviruses tái tổ hợp sử
dụng làm vắc-xin tiêm phòng cho con người được tạo thành từ sự trao đổi gen của
các chủng gây bệnh trên động vật, hoặc virus cúm tái tổ hợp được tạo ra từ một
chủng virus cúm cung cấp các gen mã hóa các glycoprotein bề mặt miễn dịch
(hemagglutinin và neuraminidase) và một chủng nhược độc. Tuy nhiên, vắc-xin
Rotavirus tái tổ hợp theo phương pháp này có khả năng gây hội chứng lồng ruột với
tỷ lệ cao (1/10.000) ở người được tiêm phòng, vì vậy, vắc-xin này đã bị ngừng cấp
phép sản xuất. Tác dụng không mong muốn này cho thấy an toàn là một thách thức
lớn trong quy trình sản xuất vắc-xin sống.
Xóa hoặc cắt gen độc
Chủng nhược độc tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sửa đổi hoặc xóa bỏ các
gen độc tố vì vậy khó có khả năng tái trở lại tính độc. Đây là giải pháp khắc phục
được nhược điểm của vi sinh vật được gây nhược độc bằng phương pháp truyền
thống. Các kỹ thuật tạo chủng vi khuẩn nhược độc tái tổ hợp phức tạp hơn so với
virus do kích thước lớn hơn của hệ gen vi khuẩn.
Tạo vector tái tổ hợp
Vector tái tổ hợp được tạo ra trên nguyên lý sử dụng một chủng virus làm
vector để gắn đoạn gen mã hóa polypeptid từ các tác nhân gây bệnh khác.
Polypeptid tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào bị nhiễm virus và được vận
chuyển đến bề mặt tế bào để kích thích sản xuất kháng thể dịch thể hoặc bị phá vỡ

thành các mảnh peptid để trình diện cho tế bào lympho T độc. Mục đích của việc tạo
ra vector là để trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch thông qua việc gây
nhiễm với một vi sinh vật tái tổ hợp sống, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra
đáp ứng mạnh hơn, bao gồm cả miễn dịch dịch thể và tế bào.

SV: Đàm Thận Quảng
Lớp: 11-02

17