Tách dòng và biểu hiện interleukin 3 người lái tổ hợp trong chủng escherichia coli

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
..........

..........

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài : Tách dòng và biểu hiện Interleukin-3 người tái tổ hợp
trong chủng Escherichia coli

Người hướng dẫn

: TS. Lê Thị Thu Hồng

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Vân
Lớp

: 11-04

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thu Hồng,
phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học là người hướng dẫn đã luôn quan tâm
giúp đỡ, chỉ bảo và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian
thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Khóa luận là một phần nội dung của đề tài khoa học công
nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất
lượng cao dùng trong y học (điều trị)” do GS.TS. Trương Nam Hai làm chủ nhiệm.
Với những tình cảm chân thành, em cũng xin được cảm ơn sự hướng dẫn và giúp
đỡ của toàn thể cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt là

ThS. Dương Thu Hương, NCS. Nguyễn Thị Quý, KS. Đặng Thị Ngọc Hà và NCS. Nguyễn
Minh Giang, những người đã hướng dẫn, hỗ trợ và chỉ bảo nhiệt tình về chuyên môn và kĩ
năng trong suốt quá trình em hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin được bày tỏ sự biết ơn đối với các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ
sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt bốn năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đã luôn ở
bên, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Vân

i


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Interleukin-3 ................................................................................................. 3
2.1.1 Giới thiệu chung....................................................................................... 3
2.1.2 Đặc tính phân tử và cấu trúc của IL-3 ....................................................... 4
2.1.3 Vai trò và ứng dụng của IL-3 ................................................................... 5
2.1.4 Nghiên cứu sản xuất IL-3 tái tổ hợp ......................................................... 6
2.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng IL-3 trong nước ................................. 6
2.2 Tách dòng gen............................................................................................... 7
2.2.1 Chủng vi khuẩn E. coli dùng để tách dòng ............................................... 8
2.2.2 Vector tách dòng pJET1.2 ........................................................................ 8

2.3 Hệ biểu hiện E. coli ..................................................................................... 10
2.3.1 Chủng biểu hiện E. coli ...........................................................................10
2.3.2 Vector biểu hiện pET 22b(+) ...................................................................12
PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 14
3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................... 14
3.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid ...........................................................14
3.1.2 Hóa chất và enzyme ................................................................................14
3.1.3 Các môi trường và dung dịch ..................................................................14
3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16
3.2.1 Phương pháp PCR ...................................................................................16
3.2.2 Phương pháp điện di trên gel agarose .....................................................17
3.2.3 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ...19
3.2.4 Tách chiết ADN plasmid từ tế bào E. coli ...............................................20
3.2.5 Phương pháp xử lý ADN plasmid bằng enzyme hạn chế .........................21

ii


3.2.6 Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột Qiagen ......................................22
3.2.7 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào ADN plasmid.................................23
3.2.8 Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp.......................................................23
3.2.9 Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE).............................24
3.2.10 Phương pháp lai Western blot ...............................................................25
3.1 Nhân gen il-3 bằng kỹ thuật PCR .............................................................. 27
3.2 Thiết kế vector tách dòng pJET1.2_il-3 .................................................... 28
3.2.1 Ghép nối gen il-3 vào vector tách dòng pJET1.2 blunt ............................28
3.2.2 Tạo tế bào E. coli DH10B mang vector tách dòng pJET1.2_il-3 ..............28
3.2.3. Tách chiết ADN plasmid từ các dòng biến nạp pJET1.2_il-3..................30
3.2.4 Kiểm tra sự có mặt của gen il-3 trong vector tách dòng pJET1.2 bằng
enzyme hạn chế và giải trình tự ........................................................................31

3.3 Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen il-3 ................................. 33
3.3.1 Nối ghép gen il-3 vào vector pET 22b(+) ................................................33
3.3.2 Tạo tế bào E. coli DH10B mang vector biểu hiện pET22_il-3 .................34
3.3.3 Tách chiết ADN plasmid từ các dòng biến nạp pET22b_il-3 ...................34
3.3.4 Kiểm tra sự có mặt của gen il-3 trong vector biểu hiện pET22b(+) bằng
enzyme hạn chế ...............................................................................................35
3.4 Biểu hiện gen il-3 tái tổ hợp trong chủng E.coli JM109 (DE3) ................. 36
3.4.1. Tạo tế bào E. coli JM109(DE3) mang vector biểu hiện pET22b_il-3 ..................36
3.4.2 Biểu hiện gen il-3 tái tổ hợp trong chủng E. coli JM109 (DE3) ...............37
3.4.3 Kiểm tra tính kháng nguyên của IL-3 tái tổ hợp bằng phản ứng lai
Western blot.....................................................................................................38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 40
Kết luận ............................................................................................................. 40
Kiến nghị ........................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 41
iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit deoxyribo nucleic

Amp

Ampicillin

Bp

Base pair

CSF

Colony-stimulating factor

dNTP

2’- deoxyribonucleotit 5’- triphossphat

EDTA

Ethylen diamin tetra axit axetic

EtBr

Ethidium bromide

E. coli

Escherichia coli

GM-CSF

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

IPTG

Isopropylthio –β–D – galactoside

IL-3

Interleukin - 3

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

PCR

Polymerase Chain Rection

SDS

Sodium dodeccyl sunfate

TAE

Tris- axetat- EDTA

iv


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Cấu trúc gen của vector tách dòng pJET1.2 ...............................................10
Bảng 2. Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE ............................................16

Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR ........................................................................17
Bảng 4. Công thức lai .............................................................................................23

v


DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-3 [10].............................................. 5
Hình 2. pJET 1.2 blunt vector [24] ........................................................................ 10
Hình 3. Vector pET 22b(+) ................................................................................... 13
Hình 4. Sơ đồ tách dòng và biểu hiện gen mã hóa IL-3 người tái tổ hợp trong chủng
E. coli .................................................................................................................... 26
Hình 5. Điện di kiểm tra sản phẩmPCR nhân gen il-3 trên gel agarose 0,8%......... 27
Hình 6. Điện di kiểm tra kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen il-3........................ 28
Hình 7. Tế bào khả biến E. coli DH10B được trải trên đĩa LB thường (a) và LB có
bổ sung ampicillin 100 µg/µl (b) ........................................................................... 29
Hình 8. Kết quả biến nạp ADN plasmid pJET1.2_il-3 vào tế bào E.coli DH10B... 30
Hình 9. Điện di sản phẩm tách chiết ADN plasmid từ các dòng biến nạp E. coli DH10B . 30
Hình 10. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid bằng enzyme BglII .......... 31
Hình 11. So sánh trình tự gen il-3 thiết kế với trình tự gen của ngân hàng gen quốc tế.
.............................................................................................................................. 32
Hình 12. Điện di sản phẩm tinh sạch plasmid pET22b(+) và gen il-3 đã xử lý với
cặp enzyme NdeI và NotI ....................................................................................... 33
Hình 13. Đĩa biến nạp sản phẩm nối ghép gen pET22_il-3 vào tế bào khả biến
DH10B .................................................................................................................. 34
Hình 14. Điện di kiểm tra ADN plasmid tách từ các dòng biến nạp pET22_il-3
trong tế bào E. coli DH10B ................................................................................... 35
Hình 15. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt các dòng ADN plasmid bằng cặp enzyme
hạn chế NdeI và NotI ............................................................................................. 36

Hình 16. Đĩa biến nạp pET22b_il-3 vào tế bào E. coli JM109 (DE3) .................... 37
Hình 17. SDS-PAGE kiểm tra biểu hiện protein IL-3 tái tổ hợp trong chủng E. coli JM109
.............................................................................................................................. 38
Hình 18. Western blot xác định protein tái tổ hợp IL-3 biểu hiện từ dòng E. coli
JM109 tái tổ hợp mang gen il-3 ............................................................................. 39

vi


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và áp dụng các kỹ thuật mới của công
nghệ sinh học vào lĩnh vực y dược ngày càng được quan tâm và phát triển mạnh mẽ. Các
kỹ thuật ADN tái tổ hợp trở nên phổ biến và là cơ sở cho một loạt các kỹ thuật và phương
pháp hiện đại khác được áp dụng trong việc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe của con người.
Liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gen đã được biết đến như là một phương pháp hữu hiệu
thay thế hoặc bổ sung cho các phương pháp truyền thống khác trong lĩnh vực điều trị các
bệnh. Trong liệu pháp miễn dịch, các protein tái tổ hợp có giá trị như insulin, interferon,
interleukin, các cytokine, protein enzyme, kháng nguyên, kháng thể được sử dụng để điều
trị cho các bệnh nhân ung thư, các bệnh nhân tiểu đường và các bệnh nhân bị mắc các
chứng bệnh hiểm nghèo khác. Việc sản xuất các protein này bằng con đường tái tổ hợp đã
góp phần giải quyết bài toán của thực tiễn nhằm giảm chi phí giá thành, nâng cao năng lực
chữa trị và tăng cường khả năng chống lại bệnh tật của con người.
Với bản chất là protein hoặc glycoprotein, Interleukin ( IL) là một trong bốn nhóm
của cytokine (Interferron, Interleukin, nhân tố hoại tử ung thư, nhân tố sinh trưởng). Tính
đến thời điểm hiện tại, số lượng Interleukin được phát hiện lên tới hơn 37 loại. Trong thực
tế, hầu hết các loại IL đã phát hiện đều có thể được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp và
chúng được sử dụng không chỉ trong việc điều trị bệnh mà còn dùng vào các mục đích
chẩn đoán và nghiên cứu khác. Chính vì vậy, việc tạo ra các loại sinh phẩm IL và phát triển
các phương thức điều trị hữu hiệu nhất dựa trên loại sản phẩm này đang là hướng nghiên
cứu được quan tâm.

Trong số các IL, IL-3 là loại cytokine có phổ tác dụng rộng nhất trong hệ thống tạo
máu do nó tham gia vào nhiều chức năng trong cơ thể. Chính vì sự đa dạng về chức năng
đó, hoạt tính của IL-3 đã được nghiên cứu trên nhiều dòng tế bào khác nhau. Ở người, IL-3
là một yếu tố tăng trưởng tạo máu, có vai trò quan trọng trong việc tăng sinh và hoạt hóa
các tế bào tiền thân tạo máu. Ngoài ra, IL-3 còn có phổ hoạt động rộng ảnh hưởng đến các
tế bào trưởng thành, đặc biệt trong các đáp ứng miễn dịch và phản ứng dị ứng của cơ thể.
Một vài nghiên cứu còn chứng minh vai trò của IL-3 làm gia tăng số lượng tế bào bạch
cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit, bạch cầu đơn nhân, hồng cầu lưới và tiểu cầu.
Hiện nay, ở nước ta vẫn chưa sản xuất được IL-3 tái tổ hợp. Các sản phẩm IL-3 đều
phải nhập khẩu với chi phí rất đắt đỏ ví dụ như hãng Invitrogen (691 USD/100 µg), hãng
CST (585 USD/50 µg), hãng Sigma-Aldrich có cả IL-3 được tạo từ tế bào E. coli (204

1


USD/ 10 µg, do đó khó khăn trong việc chi trả kinh phí đối với nhiều đối tượng bệnh nhân.
Vì vậy, để chủ động nguồn nguyên liệu trong nước và giảm giá thành sản phẩm IL-3, Viện
Công nghệ sinh học đang được nhà nước đầu tư cho chủ trì đề tài: Nghiên cứu sản xuất
Interleukin-3 và Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng trong y học (điều trị). Trong
đó, nội dung tách dòng và biểu hiện IL-3 là một trong những nội dung quan trọng của đề
tài cấp nhà nước nêu trên. Tôi đã được hướng dẫn thực hiện nội dung này cho khóa luận tốt
nghiệp với tên đề tài khóa luận “Tách dòng và biểu hiện Interleukin - 3 người tái tổ hợp
trong chủng Escherichia coli”. Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng Kỹ thuật di
truyền - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp từ tháng 6 năm 2013 đến tháng 6 năm 2015.
Mục tiêu của đề tài là tách dòng và biểu hiện thành công protein IL-3 người tái tổ
hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli, tạo cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất IL-3 người tái tổ
hợp dùng trong hỗ trợ điều trị các bệnh về máu.

2

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Interleukin-3
2.1.1 Giới thiệu chung
Interleukin được xác định là chất tác động giữa các bạch cầu, hoạt hóa lympho bào.
Nó có thể là sản phẩm của dòng tế bào T hỗ trợ nhưng cũng có thể tiết ra bởi đại thực bào
hay các tế bào khác trong hệ miễn dịch. Các IL này có vai trò trung gian trong việc liên kết
với các thụ thể đặc hiệu để điều khiển quá trình hoạt động của tế bào, quá trình chết của tế
bào theo chương trình (apoptosis) và các quá trình phân chia của tế bào. Mỗi nhóm IL có
vai trò khác nhau trong hệ thống miễn dịch và chúng có thể được tạo ra bởi các tế bào khác
nhau. Ví dụ, IL-1 tác dụng hoạt hóa tế bào Th, tăng sinh và trưởng thành tế bào B; IL-2 có
tác dụng kích thích phát triển tế bào T, đồng kích thích tế bào B phát triển và biệt hóa, tăng
cường tế bào NK (natural killer) và LAK (Lymphokine-activated killer); IL-3 kích thích sự
biệt hóa của tế bào gốc tạo máu đa năng thành các tế bào tiền thân dòng tủy cũng như kích
thích sự phân chia của tất cả các tế bào thuộc dòng tủy; IL-4 có tác dụng tăng sinh và biệt
hóa lên nhiều loại tế bào T, B, đại thực bào, tế bào mast; IL-5 tác dụng hiệp đồng với IL-4
để sản xuất kháng thể IgE, kích thích sự sinh trưởng và biệt hóa của bạch cầu ái toan; IL-7
tăng cường sự tiết IL-2, kích thích tăng sinh của tế bào B; IL-11 có tác dụng kích thích tủy
xương tạo tiểu cầu, giúp cải thiện tình trạng giảm tiểu cầu do quá trình hóa trị liệu [1].
Do có tác động đa hướng, đa năng và đa dạng, đã có nhiều loại IL đã được nghiên
cứu và tạo ra theo con đường tái tổ hợp. Chúng có nhiều chức năng ví dụ như cho mục
đích điều trị lâm sàng, IL-2 tái tổ hợp sử dụng trong điều trị hắc tố ác tính, ung thư biểu mô
tế bào thận, IL-3 thúc đẩy sự phục hồi dòng bạch cầu của tủy xương sau khi ghép tủy
xương hoặc phục hồi dòng bạch cầu trong suy tủy xương thứ phát do thuốc/hóa chất độc
hại. IL-11 kích thích sự gia tăng của tiểu cầu trong tủy xương, và được sử dụng cho bệnh
nhân giảm tiểu cầu sau xạ trị, sau hóa trị liệu... [2]. Hơn nữa, các loại IL còn có thể được
dùng kết hợp để đạt hiệu quả điều trị tốt nhất, ví dụ IL-2, IL-5, IL-7 trong điều trị bệnh
nhân HIV, IL-4 và IL-13 trong điều trị bệnh ung thư [3].
Trong các IL thì IL-3 có phổ tác dụng rộng với hệ tạo máu và trong cơ thể, nguồn

sản xuất IL-3 chính là tế bào lympho T đã hoạt hóa [4]. Tế bào mast và bạch cầu ái toan
(eosinophil) cũng có thể tiết ra IL-3 khi được kích thích và hoạt hóa [5]. Sản phẩm IL-3
tạo ra theo con đường tế bào mast có ý nghĩa quan trọng với quá trình biệt hóa các phân

3


dòng tế bào tua [6]. Sự hoạt hóa tế bào mast và việc tiết ra IL-3 cũng giúp tăng nhanh hoạt
động sản xuất histamine.

2.1.2 Đặc tính phân tử và cấu trúc của IL-3
Ở người, gen mã hóa cho IL-3 được định vị trên nhiễm sắc thể số 5, tại vị trí 5q31.1
[7]. Sau quá trình phiên mã, tiền thân của IL-3 (152 amino acid) được hình thành từ 5 đoạn
exon với kích thước amino acid tương ứng là 54, 14, 30, 14 và 40. Tiếp theo là quá trình
biến đổi sau dịch mã để loại bỏ đoạn peptide tín hiệu (19 amino acid), IL-3 có hoạt tính
bao gồm 133 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 15,1 kDa. Về cấu trúc, protein này
cũng bao gồm 4 chuỗi xoắn α A, B, C, D, có một cầu nối lưu huỳnh giữa amino acid Cys16
và Cys84. Các vị trí amino acid như Ser17, Asn18, chuỗi D đóng vai trò không thể thiếu
trong quá trình gắn kết giữa IL-3 với thụ thể của nó trên bề mặt tế bào đích. Đặc biệt, nếu
thay thế vị trí Glu22, hoạt tính của IL-3 có thể bị mất hoàn toàn [8]. Ngoài ra, dạng IL-3 tự
nhiên cũng có sự khác biệt so với IL-3 tổng hợp bởi sự đa dạng về thành phần chuỗi
carbonhydrate gắn kết vào trong quá trình hình thành cấu trúc glycosyl hóa. Do đó, kích
thước tự nhiên của IL-3 tiết ra bởi tế bào T hoạt hóa có thể thay đổi từ 22, 28 hay 36 kDa
[9].
IL-3 dạng tự nhiên có sự hình thành cấu trúc glycosyl hóa. Nhưng khi kiểm tra và
so sánh hoạt tính sinh học của IL-3 giữa dạng đã hình thành cấu trúc glycosil hóa đã cho
thấy cấu trúc này không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính sinh học, cũng như thời gian bán
hủy khi tồn tại trong máu. Hơn nữa, sự khác biệt về cấu trúc này cũng không tạo sự sai
khác đối với hiệu quả kích thích các tế bào nguồn tạo máu [9]. Do vậy, có thể coi đây là
một trong những thuận lợi trong quá trình tạo IL-3 dưới dạng tái tổ hợp, không cần quá

trình phức tạp sau dịch mã để tạo nên cấu trúc glycoprotein.
Thụ thể của IL-3 là một heterodimer bao gồm một chuỗi IL-3α đặc hiệu và hai tiểu
đơn vị ßc. Tiểu đơn vị ßc không bám trực tiếp với IL-3 mà hình thành một thụ thể ái lực
cao với IL-3α. Đồng thời, thụ thể ái lực cao ßc cũng tồn tại trên thụ thể của IL-5 và trên
yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt-đại thực bào (GM-CSF).

4


Hình 1. Mô phỏng cấu trúc không gian của IL-3 [10]

2.1.3 Vai trò và ứng dụng của IL-3
Hiện nay, IL-3 vẫn còn đang được tiếp tục nghiên cứu lâm sàng để đánh giá tác
dụng của nó. Đối với cơ thể IL-3 được nghiên cứu hoạt tính trên nhiều dòng tế bào khác
nhau. Sự kích thích của IL-3 mang tính phổ rộng với hàng loạt tế bào trong hệ tạo máu và
với các cytokine khác. Với khả năng kích hoạt các thành viên ban đầu của các con đường
biệt hóa tạo máu, IL-3 có thể ứng dụng trong nhiều mục đích điều trị lâm sàng khác nhau.
Hơn nữa, IL-3 còn có khả năng kích thích đặc hiệu sự phát triển của tế bào gốc sớm, tế bào
nguồn của tế bào mast và nguyên mẫu tiểu cầu hay tế bào nhân khổng lồ
(megakaryocytes). Các kết quả thu được khi sử dụng điều trị lâm sàng cho thấy IL-3 thúc
đẩy sự phục hồi của tủy xương sau khi ghép tủy xương hoặc phục hồi suy tủy thứ phát do
hóa chất độc, kích thích sự gia tăng của tiểu cầu [11] . Các tính chất hay hoạt tính của IL-3
được gắn liền với nhiều tên như yếu tố kích thích tế bào bền vững (Persisting cell –
stimulating factor), yếu tố kích thích tế bào tạo histamine, yếu tố kích thích các dòng bạch
cầu (Multi-CSF), yếu tố sinh trưởng tạo máu đa dòng (multilineage hemopoietic growth
factor), yếu tố kích ứng Thy-1, hoạt tính kích thích CFU, CSF-2α, CSF-2β, yếu tố phát
triển dòng tế bào mast, eosinophil– CSF, megakaryocyte – CSF, erythoid-CSF, hoạt tính
tăng cường bùng nổ (burst-promoting activity), neutrophil granulocyte-CSF, hoạt tính hiệp
đồng (synergistic activity) [4]. Các thử nghiệm lâm sàng trên động vật và người cho thấy
IL-3 kết hợp với G-CSF hoặc GM-CSF có thể kích thích mạnh mẽ khả năng tạo tế bào tủy

xương, ứng dụng trong điều trị bệnh thiếu máu bất sản hoặc là các bệnh thiếu máu khác.
Bên cạnh đó, cũng có nhiều nghiên cứu đã và đang được tiến hành nhằm áp dụng IL-3 để
điều trị các bệnh khác như để kiềm chế một số bệnh nhiễm trùng [12], sử dụng để nâng cao

5


hiệu quả tác động cho tế bào trình diện kháng nguyên trong điều trị ung thư [13], kiểm
soát các bệnh hen phế quản và dị ứng [14].

2.1.4 Nghiên cứu sản xuất IL-3 tái tổ hợp
Để tạo ra IL-3 người tái tổ hợp (rhIL-3), nhiều cơ quan cũng như các công ty sinh
học đã tiến hành nghiên cứu và phát triển. Vì IL-3 không ở dạng glycosyl hóa vẫn mang
hoạt tính sinh học nên sáng chế 5128450 đã đề xuất biểu hiện IL-3 dưới dạng không
glycosyl hóa trong tế bào nấm men Saccharomyces cereviciae [15].
Một số nghiên cứu đã chứng minh, IL-3 tái tổ hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính sinh
học như IL-3 của người nên có thể sử dụng hỗ trợ trong việc điều trị bệnh. Hơn nữa, các
sinh phẩm IL-3 dưới dạng protein tái tổ hợp hoàn toàn có thể sản xuất trong quy mô phòng
thí nghiệm hoặc quy mô công nghiệp dựa trên quy trình công nghệ sẵn có từ các đề tài
nghiên cứu trước đó.
Hiện nay, trên thị trường, cũng có nhiều công ty cung cấp sản phẩm rhIL-3 sử dụng
cho mục đích nghiên cứu. Hầu hết các sản phẩm này đều được biểu hiện trong tế bào vi
khuẩn E. coli. Trình tự amino acid của các sản phẩm đó đều là trình tự đầy đủ. Có thể liệt
kê ra ở đây như: hãng Invitrogen (691 USD/100 µg), hãng CST (585 USD/50 µg), hãng
Prospec (130 UDS/10 µg), hãng Sigma-Aldrich có cả IL-3 được tạo từ tế bào E. coli (204
USD/ 10 µg) và tế bào động vật HEK (264 USD/ 10 µg)…

2.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng IL-3 trong nước
Với tình hình ô nhiễm môi trường hiện nay trên thế giới và đặc biệt là trong nước,
ung thư đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở người. Các bệnh về

máu nói chung và đặc biệt là các bệnh của hệ thống tạo máu ngày càng có xu hướng gia
tăng mạnh mẽ. Nguyên nhân gia tăng các bệnh về máu có thể do ô nhiễm môi trường, hóa
chất, các loại virus, các chất độc từ thời chiến tranh, đặc biệt là chất độc da cam đang phát
tán hậu quả. Điều đáng lo ngại là bệnh thường được phát hiện hầu hết ở các bệnh nhân còn
trẻ ở lứa tuổi lao động và gây tỉ lệ tử vong cao [16].
Hiện nay có 4 phương pháp điều trị ung thư chính là phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, và
liệu pháp miễn dịch, trong đó liệu pháp miễn dịch ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng
rộng rãi nhờ có nhiều ưu điểm là an toàn, hiệu quả và không có tác dụng phụ [17]. Có rất
nhiều các loại cytokine như IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-11 hiện đang được sử dụng trong
điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch như ung thư biểu mô thận, ung thư da ác tính,

6


ung thư máu... [18]. IL-3 là một trong các loại cytokine được sử dụng rộng rãi trong hệ
thống tạo máu như kích thích sự biệt hóa của các tế bào gốc tạo máu đa năng thành các tế
bào tiền thân dòng tủy và kích thích sự phân chia của tất cả các tế bào thuộc dòng tủy [19].
Hiện nay, Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc
tái tổ hợp. Viện Công nghệ sinh học là một trong những đơn vị đi đầu trong lĩnh vực này.
Với kinh nghiệm nghiên cứu và sản xuất thành công IL-2 từ trước, Viện Công nghệ sinh
học đã tiếp tục nghiên cứu sản xuất IL-3 và IL-11 dưới dạng tái tổ hợp. Bên cạnh đó, một
số công ty như công ty vắc xin và sinh phẩm số 1, công ty vắc xin và sinh phẩm Nha Trang
(BioPharco), công ty Nanogen đã sản xuất thành công một số dược phẩm có nguồn gốc
protein tái tổ hợp như interferon alpha 2a, interferon alpha 2b, interferon gamma 1b,
reteplase, Filgrastim, insulin,… dùng trong điều trị một số bệnh về tim mạch, bệnh tiểu
đường, viêm gan siêu vi, viêm gan C, một số bệnh ung thư [20].

2.2 Tách dòng gen
Kỹ thuật ADN tái tổ hợp được Cohen phát triển vào năm 1973 [21] là khởi đầu cho
công nghệ sản xuất các protein tái tổ hợp nói chung và công nghệ sản xuất protein tái tổ

hợp trong dược liệu nói riêng. Nguyên lý chung là bắt đầu từ việc xác định các gen chịu
trách nhiệm cho việc sản xuất các sản phẩm mong muốn. Các gen này được phân lập từ tế
bào người sau đó gắn vào vector và đưa vào các tế bào biểu hiện như vi khuẩn (E. coli,
Bacillus) hoặc nấm men (S. cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) để sản
xuất số lượng lớn các sản phẩm mong muốn [22]. Trọng tâm của công nghệ ADN tái tổ
hợp là quá trình "nhân bản gen" trong đó bao gồm việc sản xuất một đoạn xác định ADN
và khuếch đại nó trong tế bào vật chủ thích hợp.
Công nghệ ADN tái tổ hợp chỉ được phát triển sau khi phát hiện các enzyme hạn
chế, các enzym được sử dụng như máy cắt cho một phân đoạn ADN mong muốn của gen
được gọi là trình tự nhận biết. Một số enzyme quan trọng khác như ADN polymerase,
ligases, kinase, alkaline phosphatases và nucleases là không thể thiếu được trong trong
công nghệ ADN tái tổ hợp [23]. Hầu hết các loại IL đều có thể được nghiên cứu để tạo ra
dưới dạng tái tổ hợp. Tuy nhiên, dựa vào cấu trúc và trình tự khác biệt trong chuỗi amino
acid cấu thành nên phân tử IL mà người ta có thể lựa chọn phương pháp cũng như hệ tế
bào chủ khác nhau để biểu hiện tạo sản phẩm tái tổ hợp đó.
Tách dòng gen (gene cloning), còn được gọi với nhiều tên khác nhau: tạo dòng gen,
nhân dòng gen, phân lập gen… Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen,

7


một đoạn ADN cần thiết (ADN insert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện thích hợp để
các tế bào chủ phân chia thành vô số các tế bào cùng mang một đoạn ADN insert giống
nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách. Quá trình thực hiện có thể
thay đổi phụ thuộc vào nhân tố tham gia và mục đích của quá trình tách dòng.

2.2.1 Chủng vi khuẩn E. coli dùng để tách dòng
E. coli là một vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que với kích thước bộ gen là 4,6 Mb
[24]. E. coli được sử dụng phổ biến trong việc biểu hiện các protein tái tổ hợp do có nhiều
ưu điểm như: thao tác đơn giản, có khả năng tăng trưởng nhanh với mật độ tế bào cao

trong các môi trường cơ chất không đắt tiền (cứ 20-30 phút lại nhân đôi một lần) và điều
đặc biệt là chúng có khả năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ môi
trường ngoài như plasmid, phage.... Các yếu tố di truyền này có thể tồn tại và tái bản nhiều
lần trong tế bào E. coli. Hơn nữa, những đặc điểm di truyền và sinh lý của E. coli đã được
nghiên cứu đầy đủ qua nhiều năm. Vì vậy trên thị trường đã tạo ra nhiều loại vector và các
chủng E. coli đột biến đa dạng, trở thành một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng và
biểu hiện gen [25].
Chủng vi khuẩn E. coli DH10B là một chủng như vậy, nó đã được cải biến để phục
vụ cho mục đích tách dòng gen. Một số gen mã hóa cho enzyme nuclease của chủng này
đã bị loại bỏ, do đó tránh được hiện tượng cắt các đoạn ADN ngoại lai. Mặt khác lớp thành
tế bào cũng được biến đổi với mục đích tăng khả năng tiếp nhận các ADN lạ trong quá
trình biến nạp. So với tế bào E. coli DH5α, tế bào E. coli DH10B có hiệu suất biến nạp cao
hơn, khả năng thu nhận ADN ngoại lai lớn nên được sử dụng rất phổ biến hiện nay. Và với
đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chọn chủng E. coli DH10B làm chủng tách dòng.

2.2.2 Vector tách dòng pJET1.2
Vector tách dòng (vector cloning) là một phân tử ADN có kích thước nhỏ cho phép
cài gắn một đoạn ADN ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn ADN ngoại lai lên với số
lượng lớn.
Các vector tách dòng hiện đại có các marker kháng kháng sinh chọn lọc, cho phép
chỉ những tế bào mang vector mới phát triển được trên môi trường chứa kháng sinh đó.
Ngoài ra, các vector tách dòng cũng có thể chứa các dấu chuẩn hoặc có thiết kế gen gây
chết giúp sàng lọc khuẩn lạc dựa vào màu xanh/trắng trên môi trường có cơ chất X-gal.

8


Điều quan trọng nhất của vector tách dòng là phải dễ biến nạp vào tế bào chủ, đồng
thời dễ dàng nhận biết sự tồn tại của vector tái tổ hợp trong tế bào. Tùy thuộc vào kích
thước các đoạn ADN muốn tạo dòng và mục đích tạo dòng mà chọn lọc vector thích hợp.

Thông thường các đoạn ADN không quá lớn (<10 kb) thì plasmid là vector tách dòng được
sử dụng thông dụng nhất.

pJET 1.2 blunt được thiết kế phục vụ cho việc tách dòng. Vector này có
những đặc điểm sau:
-

Plasmid pJET 1.2 blunt có nguồn gốc từ phiên bản plasmid pUC có kích

thước nhỏ (2974 bp) so với các vector tách dòng thế hệ trước [26]. Do đó mà bản đồ
enzyme hạn chế sẽ đơn giản và vì thế thao tác dễ dàng hơn. Mặt khác, kích thước
nhỏ bé tạo điều kiện thuận lợi cho việc biến nạp và nhân lên với số lượng bản sao
lớn trong tế bào chủ. Vector này có gen kháng kháng sinh là ampicillin làm dấu
chuẩn chọn lọc giúp cho việc chọn lọc được dễ dàng hơn.
-

Vùng đa điểm nối được thiết kế nằm trên một đoạn gen gây chết. Khi gen

này biểu hiện sẽ gây chết các tế bào E. coli. Khi ADN ngoại lai được đưa vào xen
giữa trình tự gen này thì khung đọc mở của gen gây chết bị phá vỡ, do đó các tế bào
có mang plasmid tái tổ hợp sẽ được nhân lên trong tế bào chủ. Ngược lại các tế bào
mang plasmid không được cài ADN ngoại lai thì sẽ bị chết ngay từ những lần phân
chia đầu tiên.

9


Hình 2. pJET 1.2 blunt vector [26]
Bảng 1. Cấu trúc gen của vector tách dòng pJET1.2
Thành phần

Chức năng

gen
rep (pMB1)
Điểm khởi đầu
sao chép
bla (ApR)

eco471IR

Đơn vị sao mã từ plasmid pMB1 tái bản cho pJET1.2
Khởi đầu cho quá trình sao chép
Gen kháng ampicillin, được sử dụng để chọn lọc
khuẩn lạc E.coli chứa ADN tái tổ hợp
Gen gây chết, dùng để chọn lọc tế bào mang plasmid
tái tổ hợp

Vị trí trên
vector
1148-1762
284-328

1922-2782

16-753

Promoter Plac đã được biến đổi cho việc biểu hiện gen
PlacUV5

eco471IR để tăng tính chọn lọc mà không cần cảm

761-892

ứng bởi IPTG
Vị trí nhân
dòng

Vị trí đầu bằng của vector để nối với đoạn ADN
ngoại lai cần cài vào

328-422

2.3 Hệ biểu hiện E. coli
2.3.1 Chủng biểu hiện E. coli
E. coli là chủng được sử dụng rộng rãi để biểu hiện hiệu quả protein tái tổ hợp, có
nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm hay của động vật. Lý do khiến chủng E. coli được lựa chọn là do
đặc điểm di truyền được hiểu biết đầy đủ, hiệu quả biến nạp cao, thao tác đơn giản, môi trường
nuôi cấy rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng nhanh, nhiều loại vector tách dòng và chủng chủ đột biến
đang được thương mại trên thị trường [25].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, hiệu suất tổng hợp nhiều loại protein ngoại lai trong
tế bào E. coli rất cao khi sử dụng các plasmid phù hợp. Các plasmid được chọn thường
chứa vùng promoter mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quá trình tổng hợp protein
ngoại lai. Ngoài ra, các plasmid này phải có số lượng bản sao lớn và tồn tại ổn định trong
tế bào chủ. Tính bền vững của plasmid không những phụ thuộc vào đặc tính di truyền của
tế bào chủ, đặc tính sinh học của gen đích mà còn phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.

10

Như vậy, với việc sử dụng các plasmid phù hợp, nhiều protein quan trọng đã được tổng
hợp trong E. coli một cách nhanh chóng và thuận tiện.
Nhược điểm khi sử dụng hệ biểu hiện này đối với biểu hiện các protein trị liệu là sự
tích lũy của thành phần lipopolysaccharide (LPS), được biết đến là nội độc tố gây ra phản
ứng phụ cho người và các động vật khi dùng. Khi đó, protein dùng cho mục đích trị liệu
phải được tinh sạch lần nữa để loại độc tố [27]. Hệ biểu hiện E. coli còn có một điểm hạn
chế nữa là khó biểu hiện những protein có kích thước phân tử lớn. Sự thủy phân protein
biểu hiện ra cũng là một vấn đề do đó có thể khác phục bằng cách sử dụng chủng biểu hiện
thiếu hụt protease. Việc biểu hiện protein ở mức độ cao thường đi kèm với sự tạo thành các
thể vùi [28]. Ngoài ra, E. coli có khả năng methyl hóa vào 1 số nucleotid trong hệ gene, do
đó gen ngoại lai cũng có thể bị methyl hóa gây ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen đó.
E. coli không có khả năng sửa đổi sau khi dịch mã, dó đó gây hạn chế ở các protein được
phosphoryl hóa, glycosyl hóa…hoặc kết hợp với lipid để tạo lipoprotein.
Hiện tại, có nhiều chủng E. coli và mỗi chủng lại có một đặc điểm khác nhau, tùy
theo đặc tính protein muốn biểu hiện trong vector nào mà lựa chọn chủng biểu hiện E. coli
cho phù hợp với từng mục đích sử dụng. Một số chủng đang được sử dụng phổ biến để
biểu hiện protein ngoại lai như:
Chủng vi khuẩn SoluBL21 E. coli là chủng chủ BL21 được cải thiện đáng kể tính
hòa tan của protein biểu hiện ra trong hầu hết các trường hợp trong khi chủng gốc
BL21(DE3) hầu như không tạo ra protein hòa tan nào ngay cả ở hàm lượng thấp nhất.
Chủng vi khuẩn JM109 (DE3), có nguồn gốc từ JM109, có một bản copy gen mã
hóa cho T7 RNA polymerase. Chủng JM109 (DE3) được dùng để biểu hiện ở mức độ cao
các gen nối vào vector xuôi chiều từ T7 promoter và nó chứa gen cảm ứng bởi IPTG để
tổng hợp T7 RNA polymerase.
Chủng vi khuẩn Origami 2 là chủng có nguồn gốc từ K-12 đã bị đột biến ở gen
thioredoxin reductase (trxB) và gen glutathione reductase (gor), làm tăng đáng kể sự tạo
thành cầu disulfide trong tế bào chất của E. coli. Chủng Origami 2 là chủng nhạy cảm với
kanamycin. Để làm giảm khả năng hình thành cầu disulfide giữa các phân tử, chủng chứa
đột biến ở gen trxB và gor được khuyến cáo chỉ dùng trong trường hợp biểu hiện protein
đòi hỏi sự hình thành chính xác cầu disulfide.

11


2.3.2 Vector biểu hiện pET 22b(+)
Hệ vector pET đã được Studier và các cộng sự thiết kế dựa trên cơ sở hệ điều khiển
promoter mạnh có nguồn gốc từ phage T7 [29]. Gen ngoại lai được biểu hiện dưới sự
phiên mã của T7 RNA polymerase. Hiện nay, vector biểu hiện có hơn 42 loại, được sử
dụng trong 15 vật chủ khác nhau.
Trong nghiên cứu này, vector pET22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện.
Vector pET22b(+) có chiều dài 5493 bp là vector sử dụng chủ yếu cho biểu hiện gen tái tổ
hợp trong E. coli. Về cấu tạo, vector này gồm điểm khởi đầu sao chép, các gen quy định
dấu chuẩn chọn lọc (AmpR), vùng khởi đầu phiên mã, vùng kết thúc phiên mã, vùng đa
nối,...
Mặt khác, hệ vector này có khá nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ biểu hiện
khác là:

- Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7, là một promoter mạnh và
có tính đặc hiệu cao [30].
- Trên vector đã thiết kế sẵn gen quy định đoạn peptide tín hiệu tiết pelB dài
22 axit amin nằm ngay trước đầu tận cùng N của protein tái tổ hợp có tác dụng
hướng protein tái tổ hợp vận chuyển ra khoang chu chất của tế bào [31]. Sau khi
protein ra khỏi màng trong, chuỗi peptide tín hiệu bị cắt bỏ bởi protease. Môi
trường trong khoang chu chất tạo điều kiện cho các enzyme xúc tác quá trình hình
thành và sắp xếp các mối liên kết disulfide, tạo ra cấu trúc không gian đúng cho
chuỗi polipeptide hoàn chỉnh. Các chuỗi polipeptide này khi chuyển vào khoang
chu chất đều không còn chứa gốc methionine hoặc formyl methionine ở đầu tận
cùng N.
- Phía sau vùng đa nối có một đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin Histidine
được gọi là đuôi His-tag [31]. Đuôi His-tag giúp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng

sắc kí ái lực.

12


Hình 3. Vector pET 22b(+)

13


PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid
- Chủng E. coli DH10B được sử dụng cho mục đích tách dòng gen. Chủng
E. coli JM109 (DE3) được sử dụng làm chủng biểu hiện gen.
- Plasmid pJET1.2/ Blunt được sử dụng làm vector tách dòng. Plasmid
pET22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện gen.
- Plasmid pUC il-3 là khuôn ADN cho kỹ thuật PCR nhân gen il-3
3.1.2 Hóa chất và enzyme
- Hóa chất: Các hóa chất thông dụng như EDTA(Serva, Đức), Ethanol,
Ethidium bromide, 2-Mercaptonethanol, Acetic acid, Isoamyl-alcohol, Ammonium
Persulfate (APS), Skimmed milk, Methanol, SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide,
Tris-HCl, Glycine, Glucose, Glycerol, BactorTM agar, BactoTM pepton, BactoTM
Yeast Extract đạt tiêu chuẩn phân tích có xuất xứ từ các hãng Merck và Sigma.
- Enzyme: Các enzyme hạn chế NotI và NdeI; Enzyme T4-ADN ligase được
mua của hãng Fermentas (Đức).
- Trình tự mồi:
Mồi xuôi IL3-NdeI-pET22 (F): 5-agtacatatggctcccatgacccagac-3
Mồi ngược IL3-NotI-pET22 (R): 5- ctaatgcggccgctcaaaagatc-3
3.1.3 Các môi trường và dung dịch

3.1.3.1 Môi trường và dung dịch sử dụng trong biến nạp ADN plasmid vào tế bào
E. coli
- Môi trường Luria Bertani (LB) lỏng: Cao nấm men (0,5%), Bacto trypton
(1%), NaCl (1%).
- Môi trường LB-Amp lỏng: Môi trường LB lỏng bổ sung ampicillin đến
nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.
- Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung thêm 1,5% agar.
- Môi trường chọn lọc LB-Amp đặc: Môi trường LB đặc bổ sung ampicillin
đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ml.

14


-

Dung dịch: CaCl2 0,1 M

3.1.3.2 Các dung dịch sử dụng trong tách chiết ADN plasmid từ tế bào E. coli
-

Dung dịch I (Sol I): Tris-HCl 50 mM, pH=8; EDTA 10 mM, pH=8;

Glucose: 50 mM.
-

Dung dịch II (Sol II): NaOH 0,2 N; SDS 1%.

-

Dung dịch III (Sol III): Kali acetat 3 M, Axit axetic 11,5%.

-

Dung dịch I và III được giữ ở 4°C, dung dịch II được chuẩn bị trước khi

sử dụng.
-

Dung dịch đệm TE: Tris-HCl 10 mM, pH=8; EDTA 1 mM, pH=8.

-

Dung dịch Chloroform/ Isoamylalcohol (24:1).

3.1.3.3 Các dung dịch dùng trong điện di ADN
-

Dung dịch đệm TAE 50 lần (50X) (100 ml): Tris base 24,2 g, Axit acetic

5,71 ml, EDTA 0,5 M (pH=8,0) 10 ml. Bổ sung nước đến 100 ml.
-

Đệm tra mẫu 6X: Bromophenol blue 0,25%, Xylen cyanol FF 0,25%,

Glycerol 30%.
-

Dung dịch nhuộm gel Ethidium bromide (EtBr): 0,5 µg/ml.

3.1.3.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide

-

Bis-acrylamide 30%: Cân 29,2 g acrylamide và 0,8 g Bis-acrylamide hòa

tan trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4ºC.
-

Đệm Tris pH=8,8: Tris 0,75 M ; SDS 0,2% và dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8.

-

Đệm Tris pH=6,8: Tris 0,25 M ; SDS 0,2% và dùng HCl để chỉnh pH đến 6,8.

-

SDS 10%

-

Đệm chạy điện di: Tris 0,05 M; Glycine 0,192 M; SDS 0,1%.

-

Dung dịch nhuộm gel: Comasie brilliant blue 0,025 g ; Methanol 40 ml ;

Acid axetic 10 ml
-

Dung dịch rửa gel: Methanol 5 ml ; Acid axetic 7,5 ml ; thêm nước đến 100 ml.

-

APS 10%: cân 0,1 g Amonium persulphate hòa tan vào 1 ml nước.

-

TEMED: sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ các công ty.

15


-

Đệm xử lý mẫu ( Treatment buffer 6X): Tris HCl 1 M (pH 6,8) 7ml;

Glycerol 3 ml; SDS 1 g; 2-Mecapto-ethanol 0,6 ml; Bromophenol 1,2 mg.
Bảng 2. Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE
Thành phần

Gel tách (15%)

H2 O

600 µl

Tris-HCl 1,5 M (pH=8,8)

2,25 ml

Tris-HCl 0,5 M (pH=6,8)

Gel cô (5%)
1,3 ml

0,5 ml

Glycerol 50%

1,8 ml

Bis-Acrylamide 30%

4,2 ml

0,25 ml

SDS 10%

90 µl

10 µl

APS 10%

60 µl

20 µl

TEMED

6,0 µl

2,0 µl

3.1.3.5 Các dung dịch dùng trong Western blot
- Dung dịch Blotting 10X (1 lít): Tris 30 g; Glycine 144,13 g.
- Dung dịch Blotting 1X (1 lít): blotting 10X 100 ml; Methanol 200 ml; H2O
700 ml.
- Dung dịch TBS 1X (1 lít): Tris-HCl (1 M), pH=7,5: 25 ml; NaCl (5 M): 10 ml.
- Dung dịch TTBS 1X: dung dịch TBS 1X có bổ sung 0,1% Tween-20
- Dung dịch sữa Skimmed milk 5%: 5 g bột Skimmed milk pha trong 100 ml
TBS 1X.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp PCR
Cơ sở lý thuyết của PCR
PCR (Polymerase chain rection) là phương pháp tổng hợp lượng lớn ADN in vitro
trên cơ sở khuân mẫu. Quá trình tổng hợp ADN kéo dài mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp
đặc hiệu của các đoạn ADN có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme bền
nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus ).
PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài

16


chuỗi. Kết quả, sau khoảng 2-3 giờ, lượng ADN sẽ được khuếch đại lên khoảng 200-500
lần.
Quy trình

Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR
STT

Thành phần

Lượng ( µl )

1

H2O

27,6

2

Dream Taq buffer 10X (with MgCl2 20 mM)

5

3

Mồi xuôi IL3-NdeI-pET22 (F) 10 pmol

4

4

Mồi ngược IL3-NotI-pET22 (R) 10 pmol

4

5

dNTP 2mM

5

6

pUC il3 pha loãng 50 lần

4

7

Dream Taq ADN polymerase

0,4

Tổng thể tích

50

Chương trình PCR:
Bước 1: Biến tính sợi ADN ở 95ºC trong vòng 3 phút
Bước 2: 94ºC trong 30 giây
Bước 3: 55ºC trong 30 giây. Nhiệt độ được hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn.
Bước 4: Kéo dài chuỗi ADN ở 72ºC trong 1 phút
Lặp lại 25 lần từ bước 2 đến bước 4
Bước 5: 72ºC trong 8 phút
Bước 6: Giữ mẫu ở 4ºC

3.2.2 Phương pháp điện di trên gel agarose
Cơ sở lý thuyết:

17


Trong môi trường có pH trung tính, ADN mang điện tích âm. Do đó, trong một
điện trường đều thì ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Trên môi trường chất
giá là agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ được tách biệt nhau trong quá
trình điện di. Vị trí của ADN trên gel được xác định trực tiếp qua các băng ADN nhờ thuốc
nhuộm huỳnh quang ethidium bromide phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Quy trình:
a, Chuẩn bị gel agarose

-

Cân 0,8 g agarose rồi hòa tan vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X (

agarose 0,8%)
-

Đun sôi cho đến khi agarose tan hết, để dung dịch agarose nguội đến

khoảng 50ºC thì đổ vào khuôn có cài sẵn răng lược để tạo các giếng nhỏ. Độ dày
của gel tùy từng mục đích sử dụng.
-

Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút.

-

Rút lược ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X tới khi

ngập bản gel.
b, Tra mẫu điện di

- Tùy thuộc vào từng mục đích diện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng
độ ADN cao hoặc thấp.
- Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TAE 1X vào khuôn điện di cho ngập bản gel.
Mẫu được trộn với đệm tra mẫu loading dye 6X rồi được đưa vào giếng gel. Điện di
bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V trong khoảng 30 phút từ cực âm
sang cực dương.
- Trong quá trình điện di, cần quan sát sự dịch chuyển của bromophenol để
biết lúc nào cần dừng điện di.

18