Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp một số ENZYME thủy phân và oxy hóa liên quan đến chuyển hóa LIGNOCELLULOSE bởi nấm AUREOBASIDIUM PULLULANS

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-·-·-

-·-·-

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP MỘT SỐ ENZYME
THỦY PHÂN VÀ OXY HÓA LIÊN QUAN ĐẾN CHUYỂN HÓA
LIGNOCELLULOSE BỞI NẤM AUREOBASIDIUM PULLULANS

Giáo viên hướng dẫn : TS. ĐỖ HỮU NGHỊ
Sinh viên thực hiện

: ĐỖ THỊ ĐAN PHƯỢNG

Lớp

: K18 CNSH 1104

HÀ NỘI, 2015


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

LỜI CẢM ƠN

Formatted: Font: Not Italic

Formatted: Centered

Trong thời gian làm việc tại Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện hóa học các hợp

Formatted: Indent: First line: 0.38"

chất thiên nhiên, em xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Đỗ Hữu Nghị, người thầy
đã dạy dỗ và hướng dẫn em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các
cán bộ nhân viên của phòng. Mọi người đã yêu quý, tận tình giúp đỡ em, tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập. Khoảng thời gian em không bao giờ
quên với biết bao nhiêu kỉ niệm, khi mới bước vào một môi trường làm việc mới và
khác biệt so với giảng đường Đại học. Những người thầy, người cô em vô cùng yêu
mến và quý trọng, để lại trong lòng em sự biết ơn sâu sắc.
Em cũng xin được chân thành cảm ơn các thầy, cô trong khoa Công nghệ sinh

Formatted: Indent: First line: 0.39"

học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ em trong thời gian học
tập tại trường.
Cuối cùng em kính chúc quý thầy cô, cùng các cô chú, anh chị trong phòng Sinh
học thực nghiệm luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công hơn nữa trong sự
nghiệp nghiên cứu khoa học và truyền đạt tri thức cho thế hệ sinh viên trẻ.
Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân,
em đã nhận được những sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều cá nhân và tập thể.
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến Phòng Sinh học
thực nghiệm-Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, em xin được gửi lời cảm ơn
chân thành tới các cán bộ nhân viên của phòng. Mọi người đã yêu quý, tận tình
giúp đỡ em, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực tập. Đặc biệt,

em cảm ơn TS. Đỗ Hữu Nghị người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình

Đỗ Thị Đan Phượng

2

Formatted: Indent: First line: 0.25", Space
After: 6 pt
Formatted: Font: Not Bold, Not Italic, Font
color: Black, English (United States), Check
spelling and grammar


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt
nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Sinh viên

Đỗ Thị Đan Phượng

Formatted: Indent: Left: 0"
Formatted: Centered, Indent: Left: 0", Line
spacing: single

Đỗ Thị Đan Phượng

3


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

MỤC LỤC

Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold

Contents

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
1.1. Đặc điểm và cấu trúc lignocellulose. ..................................................................... 3
1.1.1. Cellulose .......................................................................................................... 5
1.1.2. Hemicellulose .................................................................................................. 6
1.1.3. Lignin............................................................................................................... 7
1.1.4. Pectin ............................................................................................................... 8
1.2. Enzyme tham gia chuyển hóa lignocellulose ...................................................... 10
1.2.1. Các enzyme thủy phân ................................................................................... 10
1.2.2. Các enzyme oxy hóa ...................................................................................... 14
1.3. Giới thiệu về loài nấm Aureobasidium pullulans ................................................ 16
1.3.1. Phân loại ....................................................................................................... 16
1.3.2. Ứng dụng ....................................................................................................... 17

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................. 19
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 19
2.1.1. Chủng giống và điều kiện nuôi cấy ............................................................... 19
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................ 19
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 19
2.1.4. Môi trường ..................................................................................................... 20
Đỗ Thị Đan Phượng

4


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

2.2. Phương pháp ........................................................................................................ 23
2.2.1. Xác định hoạt độ enzyme ............................................................................... 23
2.2.2. Các điều kiện thích ứng cho sinh tổng hợp enzyme ...................................... 26
2.2.3. Chiết tách enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm A. pullulans ....................... 27
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 28
3.1. Động học sinh tổng hợp enzyme bởi nấm Aureobasidium pullulans .................. 28
3.1.1. Động học sinh tổng hợp acetyl (xylan) esterase ........................................... 28
3.1.2. Động học sinh tổng hợp β-glucosidase ......................................................... 30
3.1.3. Động học sinh tổng hợp laccase bởi nấm Aureobasidium pullulans ............ 32
3.2. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sinh tổng hợp enzyme ................................. 35
3.2.1. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sinh tổng hợp ........................................ 35
enzyme acetyl (xylan) esterase ................................................................................ 35
3.2.2. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sinh tổng hợp enzyme β-glucosidase .... 37
3.2.3. Ảnh hưởng của pH và nhiệt dộ đến sinh tổng hợp enzyme laccase .............. 39
3.3. Bước đầu chiết tách enzyme acetyl (xylan) esterase ........................................... 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 45

Đỗ Thị Đan Phượng

5


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cấu trúc lignocellulose ...................................................................................... 4
Hình 2: Cấu trúc của celulose ......................................................................................... 5
Hình 3: Cấu trúc của arabinoxylan ................................................................................ 7
Hình 4: Các đơn vị cơ bản của lignin ............................................................................. 8
Hình 5: Các phần acetyl hóa và feruloyl trong cấu trúc pectin .................................... 10
Hình 6: Cấu trúc của enzyme cellulase của nấm .......................................................... 12
Hình 7: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch và hình ảnh hiển vi điện tử quét
(SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm ........................................................................ 17
Hình 8: Thủy phân p-nitrophenol acetate thành p-nitrophenol và axit acetic bởi acetyl
esterase. ................................................................................................................... 23
Hình 9: Thủy phân của β-D-glucopyranoside (p-NPGP) thành p-nitrophenol và
glucose bởi β-glucosidase (β-D-Glu). ..................................................................... 24
Hình 10: Quá trình oxy hóa của 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazonline-6-sulphonic
acid) (ABTS) đến gốc ion dương [ABTS]+*............................................................. 26
Hình 11: Dịch enzyme từ môi trường lên men dich thể nấm Aureobasidium pullulans
được lọc bằng hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra
Centrifugal Filters (Millipore, Bedford, USA). ....................................................... 42

Đỗ Thị Đan Phượng

6


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose .................................. 4
Bảng 2: Kết quả chiết tách protein enzyme từ dịch nuôi cấy nấm ................................ 41

Đỗ Thị Đan Phượng

7


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Formatted: Font: Bold, Check spelling and
grammar

Biểu đồ 1: Động học sinh tổng hợp acetyl (xylan) esterase .......................................... 29
Biểu đồ 2: Động học sinh tổng hợp enzyme β-glucosidase ........................................... 31

Biểu đồ 3: Động học sinh tổng hợp enzyme laccase ..................................................... 34
Biểu đồ 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme acetyl
(xylan) esterase. ....................................................................................................... 37
Biểu đồ 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường đến sinh tổng hợp enzyme βglucosidase. ............................................................................................................. 38
Biểu đồ 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường đến sinh tổng enzyme
laccase. .................................................................................................................... 40

Đỗ Thị Đan Phượng

8


Viện Đại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMC

cacboxymethyl cellulose

HEC

hydroxyethyl cellulose

GH

glycoside hydrolase

CBD

cellulose binding domain

EG

β-1,4-endo-glucanase

Formatted: Font: 13 pt

CBH

β-1,4-exo-glucanase/cellobiohydrolase

Formatted: Font: 13 pt

BGL

β-glucosidase

Formatted: Font: 13 pt

Đỗ Thị Đan Phượng

9


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Formatted: Centered, Indent: Left: 0"
Formatted: Left: 1.38", Right: 0.79", Top:
0.98", Bottom: 0.98", Header distance from
edge: 0.39"
Formatted: Font: Bold, Kern at 16 pt

Formatted: Centered, Space After: 3 pt

MỞ ĐẦUMở đầu

Formatted: Font: Kern at 16 pt

Sinh khối thực vật, nguồn carbohydrat có khả năng tái tạo lớn nhất trên trái đất,

Formatted: Font: Kern at 16 pt

được quang tổng hợp khoảng 200 tỷ tấn mỗi năm, trong đó lignocellulose chiếm 60 %
tổng sinh khối (Pérez et al. 2002; Zhang et al. 2007). Lignocellulose ngày càng có vai
trò quan trọng về kinh tế khi được sử dụng như vật liệu thô cho các ứng dụng trong
công nghệ sinh học và công nghiệp. Chúng là cơ sở cho việc thúc đẩy tận dụng sinh
khối trong các mô hình sản xuất tinh chế để thu nhận nhiên liệu sinh học cũng như
chiến lược phát triển bền vững (Jorgensen et al. 2007; Kamm & Kamm., 2004;
Đỗ Thị Đan Phượng

Page 1

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Mapemba et al. 2007). Lignocellulose từ sinh khối thực vật là các polymer sinh học có
ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo lớn nhất
trong sinh quyển (Peters., 2007). Xét về nguồn gốc, thành phần và mức độ polymer
hóa, có thể phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng và gỗ mềm cũng như
các vật liệu từ cây trồng (đặc biệt là cây ngũ cốc, các loại cỏ) và cây thảo. Các loài nấm
được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt sinh khối
lignocellulose. Thật vậy, nấm bao gồm hai hệ enzyme ngoại bào - hệ enzyme thủy
phân có vai trò trong phân hủy polysaccharide; và hệ enzyme oxy hóa và enzyme phân
giải lignin ngoại bào để phân hủy lignin và xúc tác phản ứng mở vòng phenyl. Ngoài
các enzyme oxy hóa đã được mô tả khá kỹ (Hatakka., 2001; Hofrichter., 2002;
Martinez et al. 2005), quá trình chuyển hóa lignocellulose còn cần các enzyme thủy
phân bao gồm các cellulase, xylanase, carbohydrate esterase… có thể hoạt động phối
hợp với các enzyme tấn công cấu trúc polymer (Van Dyk & Pletschke., 2012).
A. pullulans là nấm có tầm quan trọng trong công nghệ sinh học cho sinh tổng
hợp enzyme, siderophore (chất mang Fe3+) và pullulan. Pullulan, được sinh tổng hợp

Formatted: Superscript

ngoại bào bởi nấm A. pullulans, là một biopolymer có giá trị thương mại cao. Ngoài ra,

Formatted: Font: Italic

A. pullulans cũng được quan tâm nghiên cứu cho mục đích sản xuất nhiên liệu sinh học

Formatted: Font: Italic

(Wang et al. 2014) và sinh tổng hợp các enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa
lignocellulose (carbohydrate esterase, cellulase, laccase…) (Rich et al. 2013; Ohta et

Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold

al. 2001). Trên cơ sở đó, tôi đã thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu khả năng sinh

Formatted: Font: Bold

tổng hợp một số enzyme thủy phân và oxy hóa liên quan đến chuyển hóa

Formatted: Font: Bold

lignocellulose bởi nấm Aureobasidium pullulans”.

Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm đánh giá khả năng sinh một số enzyme thủy
phân (acetyl esterase, β-glucosidase) và oxy hóa (laccase) liên quan đến quá trình
chuyển hóa lignocellulose bởi nấm A. pullulans. Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho quá

Formatted: Font: Bold
Comment [A1]: Tên luận văn
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold, Italic

trình lên men sinh tổng hợp enzyme trên cơ chất giàu lignocellulose.

Formatted: Centered
Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 2


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Formatted: Left

1.1. Đặc điểm và cấu trúc lignocellulose.
Về cấu trúc, thành phần chính của lignocellulose bao gồm cellulose (40-50%),
hemicellulose (chủ yếu xylan, 20-40%) và lignin (20-30%) (Eriksson et al. 1990;
Monties & Fukushima., 2001). Ngoài các thành phần này, Lilholt & Lawther (2000)
còn cho rằng pectin cũng là thành phần của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở
các cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ. Hơn nữa, lignocellulose còn có các
liên kết ester giữa các polysaccharide thành tế bào và các đơn vị axit hydroxycinnamic
của lignin.
Ngoài ra, một trong những lý do khó chuyển hóa vật liệu lignocellulose là có sự
có mặt của các gốc acetyl hóa trong thành phần hemicellulose và pectin. Các nhóm
acetyl này có trong hemicellulose của gỗ dưới dạng liên kết mạch nhánh, như O-acetyl4-O-methyl-glucurono-β-D-xylan ở thực vật hạt kín và O-acetyl-galacto-glucomannan

ở thực vật hạt trần (Joseleau et al. 1993; Timell, 1967; Lindberg et al. 1973). Sự acetyl
hóa ở vị trí 3-O của gốc xylosyl liên kết với axit 4-O-methyl-D-glucuronic cũng được
thấy ở xylan của rơm hay bã than cây ngũ cốc (Naran et al. 2009).

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 3


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Formatted: Centered

Formatted: Hình, Left, Line spacing: single,
Tab stops: Not at 0.29"
Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: Centered
Formatted: Centered

Hình 1: Cấu trúc lignocellulose

Formatted: English (United States)

Formatted: English (United States)

Đối với mỗi nguồn khác nhau thì tỉ lệ cellulose, hemicellulose, lignin và các

Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)

thành phần khác cũng khác nhau phụ thuôc vào nguồn gốc của chúng.

Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: Centered

Bảng 1: Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose

Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: English (United States)

(Limayem & Rick.., 2012)

Formatted: English (United States)

Nguồn

Cellulose

Hemicellulose

Lignin

Thành phần

lignocellulose

(%)

(%)

(%)

khác (%)

Gỗ cứng

45-47

25-40

20-25

0,8

Gỗ mềm

40-45

25-29

30-36

0,5

Cỏ

25-40

35-50

-

-

Bột giấy

50-70

12-20

6-10

-

Giấy báo

40-50

25-40

18-30

-

Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: English (United States)
Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 4


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Cỏ mềm

40-45

30-35

12

-

Phế thải n.nghiệp

37-50

35-50

5-15

12-16

Formatted: English (United States)
Formatted: Centered
Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)

1.1.1. Cellulose

Formatted: English (United States)

Cellulose là polysaccharide phổ biến nhất có mặt chủ yếu trong thành tế bào thực.
Về cấu trúc hóa học, cellulose là một mạch thẳng do các β-D-glucopyranosa liên kết

Formatted: English (United States)
Formatted: English (United States)

Formatted: English (United States)
Formatted: Centered

với nhau qua liên kết 1,4-glucoside.

Formatted: Left
Formatted: Centered

Hình 2: Cấu trúc của celulose

Formatted: Left
Formatted: Font: Bold

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành mixel tức là bó sợi có chiều dài

Formatted: Font: Bold, Not Italic

50-100Å. Các mixel lại tạo thành bó microfiril với đường kính khoảng 250Å có thể
thấy được bằng kính hiển vi điện tử, còn fibril tạo thành từ các microfibril có đường
kính 2000Å và có thể quan sát được bằng kính hiển vi thường. Các sợi cellulose chính
là các fibril. Các phân tử cellulose trong các mixel nhờ có rất nhiều liên kết hydro nên
tạo được dạng sợi bền chắc. Cellulose không tan trong nước và dung môi hữu cơ
nhưng tan trong dung dịch Schweitzer là hydroxyd đồng trong dung dịch amoniac
[Cu(CH3)4 ](OH)2, tan trong dung dịch kẽm chlorid đậm đặc. Là thành phần chính tạo
nên lớp màng tế bào thực vật, giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn

Comment [A2]: Tài liệu tham khảo

hồi. Cellulose có nhiều trong bông (95-98%), đay, gai, tre, nứa, gỗ... (Cellulose chiếm

Comment [A3]: Tài liệu tham khảo

khoảng 40-45% trong gỗ) ( Một số nghiên

Formatted: Underline, Font color: Blue

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 5

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa họa động của hệ thống tiêu hóa. Vi
khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vât nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột
của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm cũng có thể phân hủy cellulsoe để
cung cấp nguồn carbon cho sự phát triển của chúng.
1.1.2. Hemicellulose
Các đơn vị mắt xích của hemicellulose thường là vòng anhydro của nhiều
saccharide như D-glucose, D-mannose, D-galactose (thuộc hexose), D-xylose, Larabinose (thuộc pentose). Ngoài ra, còn có các đơn vị axit D-glucuronic, axit 4-Ometyl-D-glucuronic và D-galacturonic. Một số polysaccharide hemicellulose còn liên
kết với nhóm acetyl, làm thành phần của hemicellulose trở nên phức tạp hơn.
Thành phần hemicellulose của cây gỗ cứng chủ yếu là O-acetyl-4-Omethylglucuronoxylan (hay xylan). Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các
nhóm phụ là các gốc acety l,4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết
với bộ khung được tạo bởi các gốc xylopyranose. Bộ khung này liên kết với nhau bằng
liên kết β-1,4-glycoside. Xấp xỉ 60-70% các đơn vị xylose được este hóa với axit acetic

ở nhóm hydroxyl của carbon thứ hai hoặc thứ ba và trung bình thì cứ mười đơn vị
xylose thì có một nhóm axit uronic liên kết với gốc xylose theo kiểu α-1,2-glycoside
(Girio et al. 2010; Sjostrom., 1993).

Comment [A4]: Tài liệu tham khảo????

Ở gỗ mềm, mannan chiếm ưu thế trong thành phần hemicellulose với lượng xấp
xỉ 20% trọng lượng khô. Mannan trong gỗ mềm điển hình là glucomannan với các hàm
lượng D-glucose khác nhau. Mannan với hàm lượng galactose cao đã được đề cập như
galactogluco mannan. Gỗ mềm cũng có chứa arabinoglucuronoxylan, cấu tạo phân tử
gồm L-arabinose, 4-O-methyl-α-D-glucoronic và D-xylose, tỉ lệ 1,3:2:10 (Timell et al.
1967).

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 6


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Formatted: Centered

Hình 3: Cấu trúc của arabinoxylan (cấu tạo chính của hemicellulose). (A): O-5-

Formatted: Font color: Auto

Formatted: Font color: Auto

feruloyl lignin,(B): nhóm O-5-diferuloyl (5-5’ linked dimer), (C): nhóm O-5-diferuloyl

Formatted: Font color: Auto

(8-5’ dimer), (D): nhóm 3-O-acetyl . Theo Mathew & Abraham (2004).

Formatted: Font color: Auto
Formatted: Font color: Auto
Formatted: Font color: Auto

1.1.3. Lignin
Sau cellulose, lignin là một trong những polymer có nguồn gốc sinh học phổ biến
nhất trong tự nhiên. Lignin chiếm khoảng 30% khối lượng gỗ khô ở cây lá kim, khoảng
20% ở cây lá rộng và không tồn tại trong thực vật bậc thấp như rong, tảo, nấm. Tỉ lệ
phần trăm lignin ở cây gỗ cứng và gỗ mềm là khác nhau (Christiernin, 2006). Các đơn
vị hình thành nên cấu trúc của lignin là phenylpropan. Lignin của thực vật có thể được
chia thành ba loại: lignin gỗ lá kim, lignin gỗ lá rộng, lignin cây thân thảo và cây hàng
năm. Lignin gỗ lá kim gồm các đơn vị mắt xích guaiacylpropan còn chứa các đơn vị
mắt xích 3,5-dimetoxy-4-hydroxy phenylpropan. Lignin các loại cây thân thảo, ngoài
các đơn vị mắt xích trên còn có 4-hydroxy phenylpropan. Các nhóm chức ảnh hưởng
lớn nhất đến tính chất của lignin là nhóm hydroxylphenol, nhóm hyroxyl và nhóm
Đỗ Thị Đan Phượng

Page 7

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

cacbonyl. Hàm lượng các nhóm chức thay đổi tùy theo loài thực vật và tùy thuộc vị trí
của lignin ở lớp liền kế, lớp sơ cấp hay thứ cấp của tế bào thực vật.

Formatted: Centered

Hình 4: Các đơn vị cơ bản của lignin (More et al. 2001)
1.1.4. Pectin
Ngoài các thành phần lignocellulose đề cập ở trên, Lilholt & Lawther (2000) trích

Comment [A5]: Liệt kê tất cả các tài liệu tham
khảo có trích dẫn trong luận văn

dẫn rằng pectin là cũng là thành phần lignocellulose thành tế bào thực vật, đặc biệt là
trong các sợi không bao gồm gỗ. Nó thường không được thấy trong các mô gỗ vì sự
dày lên ở vách tế bào thứ cấp thay thế gần như toàn bộ pectin bởi lignin. Pectin là một
polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu
trúc thành tế bào thực vật. Pectin được phân tách và mô tả lần đầu tiên bởi Henri
Braconnot, vào năm 1825. Pectin bao gồm các đơn vị mắt xích axit α-D-galacturonic.
Trong đó, một số gốc axit có chứa nhóm thế methoxyl (-OCH3). Các đơn vị này nối với
nhau bằng liên kết 1,4-glucoside. Mỗi đơn vị mắt xích chứa một nhóm cacboxyl ở vị trí
C6. Trong tự nhiên, pectin không tồn tại độc lập mà thường đi kèm polysaccharide
khác, khi thủy phân tạo ra L-arabinose và D-galactose. Chiều dài của chuỗi
polygalactonic có thể biến đổi từ vài đơn vị đến hàng trăm đơn vị galactunic. Một phân
tử pectin có phân tử lượng từ 50.000 đến 150.000 đvC, tùy thuộc nguồn gốc thực vật
(Whisler & Bemiller., 1997). Các nhóm axit này tồn tại ở trạng thái tự do hoặc dưới

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 8


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

dạng liên kết este (metyl ester). Trong pectin tự nhiên thường có khoảng ¾ số nhóm
axit bị metyl hóa.
Trong thực vật, có thể chia pectin thành hai dạng là protopectin không hòa tan,
tòn tại chủ yếu ở thành tế bào, các lớp gian bào, dưới dạng kết hợp với polysaccharide
araban, dạng pectin hòa tan, tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào. Pectin như một loại keo gắn
chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế người ta gọi chúng là chất ciment trong cấu
trúc tế bào thực vật. Trong cây lanh, rơm rạ có khoảng 0,5-2% pectin. Trong gỗ, hàm
lượng pectin dao động trong khoảng 0,5-1% (Hồ Sĩ Tráng, 2006). Pectin có nhiều
trong tầng phát sinh của gỗ, lớp liên kết các tế bào. Trong thời kì sinh trưởng pectin ở
các lớp này liên tục biến đổi. Có lẽ pectin đảm bảo độ bền và độ dẻo của cây non. Sau
đó, chất pectin chuyển hóa và hàm lượng của chúng giảm đi.

Formatted: Font color: Black

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 9


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Formatted: Left

Hình 5: Các phần acetyl hóa và feruloyl trong cấu trúc pectin. (A) Mạch chính được
hình thành từ gốc khác của axit galacturonic và rhamnose, (B) các phần còn lại của
liên kết α-(1,4) của axit galacturonic, (C) nhóm 2-O/3-O-acetyl, (D) nhóm C-6-methyl,

Formatted: Font: Not Italic
Formatted: Font color: Auto
Formatted: Font color: Auto
Formatted: Font color: Auto

(E) chuỗi liên kết α-(1-5)arabinan, (F) nhóm O-2-diferuloyl, (G) nhóm O-2-feruloyl
được gắn với arabinose, (H) nhóm O-6-feruloyl được gắn với galactose. Theo Mathew
& Abraham (2004).
Formatted: Left

1.2. Enzyme tham gia chuyển hóa lignocellulose
1.2.1. Các enzyme thủy phân
1.2.1.1. Enzyme cellulase
Cellulase là hệ enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành cá sản phẩm
hòa tan thông qua sự bẻ gãy các iên kết β-1,4-glucosid. Hệ enzyme cellulase khá phức
tạp. Một mặt chúng như một enzyme cảm ứng, mặt khác chúng lại chịu sự tác động bởi

sản phẩm cuối và cơ chế kiềm chế dị hóa ( Lê Ngọc Tú & cs., 1982). Hệ cellulase gồm
ba enzyme chính có tên là: β-1,4-endo-glucanase (EG, EC 3.2.1.4), β-1,4-exoglucanase/cellobiohydrolase (CBH, EC 3.2.1.91) and β-glucosidase (BGL, EC
3.2.1.21) (De Vries et al. 2011). Trong đó:

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 10


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

EG có tác động thủy phân lên các liên kết phía trong mạch cellulose một cách

Formatted: Font: Not Bold

ngẫu nhiên làm trương phồng cellulose, dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và
tăng chậm các nhóm khử. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại
hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
CBH giải phóng cellobiose hoặc cellotetrose từ đầu không khử của cellulose.

Formatted: Font: Not Bold

Chúng tác động chủ yếu lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng lại
tác động mạnh lên mạch bên ngoài của cellulsoe kết tinh hoặc cellulose đã bị phân giải
một phần. Hai enzyme exo và endo-glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ

rệt.
BGL là enzyme thủy phân có ở nhiều nguồn bao gồm vi khuẩn, nấm, động-thực

Formatted: Font: Not Bold

vật. Enzyme này biểu hiện phổ hoạt tính cơ chất rộng và có khả năng xúc tác thủy phân
các liên kết glucosidic của các phối tử glucosit và disaccharit. BGL thủy phân
celloligosaccharit và cellobiose thành glucose; enzyme này cũng có khả năng chuyển
hóa anthocyanin – thành phần tạo màu chính được thấy trong thực phẩm nguồn gốc
thực vật. Chức năng của enzym β-glucosidase có lẽ là sự điều chỉnh sự tích lũy các
chất cảm ứng của cellulase. Người ta cho rằng tính đa hình của cellulase là nhằm phù
hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử cellulose, gồm nhiều vùng có hoạt tính
thủy phân khác nhau. Tùy thuộc vào các chủng vi sinh vật cũng như các điều kiện môi
trường nuôi cấy, tỷ lệ các thành phần trong hệ enzyme, hiệu lực phân giải cellulose của
các hệ cellulase là khác nhau, nhưng để phân giải hoàn toàn cellulose, cần có sự tác
dụng hiệp đồng của cả ba enzyme trong hệ cellulase (King., 1996).
Về cấu trúc, enzyme cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là
axit amin đươc nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-. Ngoài ra trong cấu trúc còn
có những thành phần phụ khác như cá ion kim loại hoặc các gốc đường. Ở nấm sợi, cấu
trúc của các loại enzyme nhóm exo/endo-glucanase gồm ba vùng trong đó, một vùng
xúc tác (active donain), một vùng gắn kết với cellulose (CBD-cellulose binding
Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 11


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

domain) và vùng linker peptid có tác dụng nối hai vùng nói trên, CBD sẽ hỗ trợ cho
cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể.
Formatted: Centered

Hình 6: Cấu trúc của enzyme cellulase của nấm (nguồn:
/>Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như cacboxymethyl
cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. Độ bền nhiệt và tính
đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau. Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng tối thích
trong khoảng pH 5-6. Phần lớn các cellulase ở nấm có nhiệt độ tối ưu từ 35-400C. Hoạt
tính cellulase có thể bị phá hủy hoàn toàn tại 800C trong 10-15 phút.
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose và
bị ức chế hoàn toàn bởi Hg. Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác
như Mn, Ag, Zn nhưng ở các mức độ khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme.
Trọng lượng của cellulase thay đổi từ 30-110 Kda (Beguni., 1990; Gilkes et al., 1991).

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 12


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

1.2.1.2. Enzyme hemicellulase.

Formatted: Left

Do cấu trúc không đồng nhất của hemicelluloses, để chuyển hóa sinh học tất cả
các thành phần của polymer này thì đòi hỏi sự tham gia của nhiều loại enzym thủy
phân và chúng được phân thành ít nhất 12 họ GH (glycoside hydrolase) xúc tác thủy
phân liên kết glycosidic của polysaccharide thành tế bào thực vật (Dashtban et al.
2009; De Vries et al. 2011). Endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8), endo-1,4-βmannanases (EC 3.2.1.78), exo-β-mannosidases (EC 3.2.1.25) được quan tâm nghiên
cứu nhiều, ngoài ra có một số enzyme hoạt động phối hợp khác như α-Larabinofuranosidase, α-L-rhamnosidase, β-glucosidase, α-galactosidase và acetyl
(xylan) esterase cũng như feruloyl esterase cần thiết cho xúc tác thủy phân mạch nhánh
ở các vị trí khác nhau trên cấu trúc hemicellulose. Trong nhóm này, với điều kiện thực
hiện khóa luận tốt nghiệp tôi tập chung nghiên cứu một số enzyme thuộc nhóm
carbohydrate esterase, cụ thể là enzyme acetyl (xylan) esterase.
Acetyl (xylan) esterase

Formatted: Font: 13 pt, Bold, English (United
States)

Acetyl (xylan) esterase (EC 3.1.1.6) là các enzyme có thể thủy phân liên kết ester

Formatted: Normal, Left
Formatted: Font: Italic, English (United States)

giữa acetyl và xylose trong xylan. Quá trình deacetyl này làm các đơn vị xylopyranosyl
của mạch chính xylan dễ bị phân hủy hơn bởi endo-β-1,4-xylanases (EC 3.2.1.8). Các
acetyl (xylan) esterase đóng vai trň quan trọng trong thủy phân xylan, ví dụ như các
nhóm acetyl nhánh có thể làm ảnh hưởng cách tiếp cận của các enzym phân cắt mạch
chính bởi trở ngại về không gian và sự bài tiết của enzyme, vì vậy hoạt động của
enzyme endoxylanase sẽ phân cắt các nhóm acetyl nhánh này, giúp enzyme phân cắt

mạch chính được dễ dàng hơn (Javier et al. 2007).
Enzym này sẽ loại bỏ các nhóm O-acetyl ở các vị trí 2/3 trên β-D xylopyranosyl
của acetyl xylan. Acetyl (xylan) esterase đóng vai trò quan trọng trong thủy phân
xylan.
Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 13


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

Đây cũng là một enzyme thủy phân xúc tác giải phóng nhóm acetyl từ polymer
sinh học như pectin và xylan của lignocellulose (Biely., 2012). Cùng với hệ enzyme
thủy phân cellulose và xylan, acetyl (xylan) esterase được biết là có vai trò quan trọng
cho khả năng đồng hóa các vật liệu thành tế bào thực vật. Enzyme này từ một số nấm
ascomycota đã được miêu tả, bao gồm Trichoderma reesi (Sundberg & Poutanen.,
1991), Aspergillus awamori (Sundberg et al. 1990); A. niger (Linden et al. 1994);
Penicillium

purpurogenum

(Gordillo

et

al.

2006);

Fusarium

oxysporum

(Christakopoulos., 1999) và Chrysosporium lucknowense (Pouvreaua et al. 2011).
Formatted: English (United States)

1.2.2. Các enzyme oxy hóa

Formatted: Left

Các enzyme oxy hóa (oxidoreductase) xúc tác chuyển hóa lignocellulose đã
được mô tả khá nhiều (Hatakka., 1994; Hatakka., 2001; Hofrichter., 2002; Martínez et
al. 2005; Mayer & Staples., 2002). Trong đó được quan tâm nhiều nhất là các enzyme
peroxidase và laccase.
Laccase

Formatted: Font: Bold
Formatted: Normal, Left

Laccase (EC 1.10.3.2) là một polyphenol oxidase chứa nguyên tử đồng (Cu2+)

Formatted

trong trung tâm xúc tác. Phần lớn các laccase có khối lượng phân tử (MW) từ 60 kDa
đến 80 kDa. Mỗi laccase từ các chủng khác nhau đều có những isozym riêng (thường

từ 515-619 amino acid) được mã hóa những chuỗi gen giống hoặc khác nhau của
laccase (Archibald et.al. 1997). Một đặc điểm nổi bật khác của laccase là sự oxy hóa
các cơ chất chỉ kèm theo sự khử oxy thành nước, khác với các peroxidase cần tới sự có
mặt của các cofactor (như H2O2). Mặt khác, tuy thế oxy hóa khử của laccase là nhỏ hơn
so với các hợp chất không chứa nhóm phenol, do vậy nó không có khả năng oxy hóa
trực tiếp các hợp chất này, nhưng bằng cách sử dụng các phân tử nhỏ có khả năng đóng
vai trò như là chất vận chuyển electron trung gian, laccase có khả năng oxy hóa được
nhiều cấu trúc không chứa nhóm phenol. Nhờ các đặc tính trên mà laccase có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực đời sống, kinh tế xã hội như trong công nghiệp thực phẩm,
Đỗ Thị Đan Phượng

Page 14

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

công nghiệp giấy, ngành may mặc, xử lí môi trường và gần đây là trong sản xuất
ethanol sinh học từ phụ phẩm nông nghiệp như đã trình bày ở trên. Do khả năng oxy
hóa các hợp chất polyphenol, laccase liên quan tới rất nhiều quá trình sinh hóa. Trong
môi trường, laccase đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy lignin và axit humic
hoặc tổng hợp các hợp chất humic mới, và vì thế có vai trò quan trọng trong vòng tuần
hoàn cacbon cũng như quá trình khử độc môi trường như oxy hóa các chất màu, thuốc
nhuộm, các chất thơm… Laccase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bao gồm
tẩy trắng giấy, tẩy màu của thuốc nhuộm vải và loại bỏ hợp chất phenol trong rượu,
khử độc môi trường do nhiễm hợp chất hydrocacbon thơm. Các laccase liên quan tới

khả năng khử lignin là các laccase ngoại bào được ứng dụng trong phân hủy các phế
thải nông nghiệp giàu lignin, tạo liên kết ngang trong các vật liệu nguồn gốc lignin,
khử độc cho dịch thủy phân lignocellulose trong sản xuất ethanol. Ngoài ra laccase còn
được sử dụng trong ổn định sản phẩm bia, vang, nước uống, trong phát triển tế bào
nhiên liệu (Christopher., 1994). Về mặt phân bố, laccase đã được tìm thấy ở nhiều loại
vi sinh vật. Ở vi khuẩn, hoạt tính laccase cũng đã được tìm thấy trong một số ít trường
hợp. Tuy nhiên, tất cả các laccase hay protein tương tự laccase được tìm thấy ở vi
khuẩn đều là nằm trong nội bào hay vùng ngoại vi tế bào chất (periplasm) khác với các
laccase ở nấm mốc và thực vật bậc cao đều được tiết ra môi trường bên ngoài. Ở nấm
mốc, enzym này đã được tinh sạch và đặc tính hóa từ hàng chục loài khác nhau. Các
gen mã hóa cho nhiều laccase cũng đã được tách dòng và xác định trình tự, giúp cho
việc phân lập các gen mã hóa các laccase mới trở nên dễ dàng hơn. Cũng cần nhấn
mạnh rằng do khả năng sống ký sinh trên gỗ mà các loại nấm mục thường là nguồn gen
để phân lập các gen mã hóa laccase. Một số nấm điển hình có khả năng tổng hợp
laccase như nấm mốc Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus, Botrytis cinerea
(Slomczynski. D; Nakas J. P và Tanenbaum S. W., 1995), Coprinus cinereus hay các

Comment [A6]:

nấm lớn như Pycnoporus cinnabarinus. Các laccase nấm mốc cũng đóng vai trò quan

Comment [A7]: Tài liệu tk???

trọng trong các quá trình sinh lí bao gồm quá trình khử độc cho tế bào, quá trình nhiễm
nấm mốc của thực vật (Roy & Abraham, 2006).
Đỗ Thị Đan Phượng

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Page 15


Viện Ðại học Mở Hà Nội

CNSH 11-04

1.3. Giới thiệu về loài nấm Aureobasidium pullulans

Comment [A8]: Không chấm câu ở tên đề mục
Formatted: Left

1.3.1. Phân loại
A. pullulans thuộc ngành nấm đảm Ascomycota (họ Dothioraceae) nhưng hình
thái giống với nấm men, có màu đen (do bào tử chlamydospore) và có thể tìm thấy loài
này trong các môi trường khác nhau như đất, nước, không khí và đá vôi. Chúng thường
được thấy ở các vùng ôn đới chủ yếu ở Anh, Mỹ nhưng cũng được thấy nhiều ở
Canada, Alaska, Antarctica, Nga và Châu Âu. Trong tự nhiên, chúng được biết là
những loài nội ký sinh của nhiều cây thực vật (như táo, nho, dưa chuột, đậu đỗ, bắp
cải) mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào của bệnh. Thay đổi kiểu hình của A.
pullulans cũng rất đáng chú ý. Hình thái khuẩn lạc có thể bị ảnh hưởng bởi nguồn
carbon, tuổi của khuẩn lạc, nhiệt độ, ánh sáng và cơ chất với các khuẩn lạc thay đổi từ
đồng nhất đến phân cụm. Bên cạnh những A. pullulans hình thái cũng là thích nghi với
điều kiện “stress” môi trường khác nhau: độ muối cao, axit và kiềm, nhiệt độ thấp và
nghèo dinh dưỡng. Do đó chúng được coi là loài có khả năng chịu đa điều kiện khắc
nghiệt.
Hiện nay có bốn loài A. pullulans được công nhận từ các đặc điểm vùng sinh thái
khác nhau là: A. pullulans var. pullulans trên các cơ chất có tính thẩm thấu thấp và lá
cây; A. Pullulans var. melanigenum từ môi trường gần các nguồn nước; A. pullulans
var. subglaciale từ các vùng lạnh và băng giá; và A. pullulans var. namibiae được mô

tả trên với chỉ có một chủng phân lập từ đá cẩm thạch và bột đôlômit ở Namibia (Zalar
et al. 2008).

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,
13 pt, Italic, English (United States)

Đỗ Thị Đan Phượng

Page 16