123doc tao dong va xay dung thu vien cdna

BÀI THUYẾT TRÌNH CHƯƠNG 6


NỘI DUNG
TẠO DÒNG VÀ XÂY DỰNG THƯ VIỆN cDNA
I.Tách chiết, tinh sạch, phân tích RNA
II.Tổng hợp cDNA(complementary DNA)
III.Tạo dòng phân tử của cDNA sợi đôi
IV.Các phương pháp tạo dòng cDNA khác
V. Các vector bacteriophage λ dùng trong tạo dòng cDNA
VI.Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm
VII.Xây dựng thư viện cDNA trong bacteriophage λ vector


I. Tách chiết, tinh sạch, phân tích RNA

1.

Tách chiết RNA tổng số

Các
Các nhân
nhân tố
tố ức
ức chế
chế protein
protein của
của Rnase:
Rnase:
Các
Các phức

phức hợp
hợp vanadyl-ribonucleoside
vanadyl-ribonucleoside

Kiểm soát hoạt tính
ribonuclease(RNase)

hoặc
hoặc macaloid
macaloid


+
2. Phân lập RNA poly(A)
_tinh sạch mRNA từ RNA tổng
số


3. Phân tích RNA

Hình.
Phân tích sự biểu hiện của gen bằng lai Northern.

•

Hình phía dưới là điện di RNA tổng số(ở đây là tiểu phần 16S, 18S) trên agarose gel được biến tính bằng
formamide.

•

Hình phía trên là tín hiệu phóng xạ thu được từ phản ứng lai giữa RNA tổng số với mẫu dò được đánh dấu
bằng

32

P.


Lai Dot
Lai Dot được Kafatos và cộng sự (1979) thực hiện đầu tiên bằng cách :
Chấm các mẫu nhỏ của dung dịch RNA lên màng nitrocellulose
 màng được làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA hoặc DNA có đánh dấu

32

P

 ủ với phim X-quang.

 Đơn
Đơn giản
giản để
để nhận
nhận biết
biết cường
cường độ
độ biểu
biểu
hiện
hiện của

của 1
1 gen
gen đặc
đặc biệt
biệt nào
nào đó
đó trong
trong mô
mô
đặc
đặc trưng
trưng hoặc
hoặc tế
tế bào
bào nuôi
nuôi cấy
cấy

 Khó
Khó định
định lượng
lượng kích
kích thước
thước chính
chính xác
xác


II. Tổng hợp cDNA

III.Tạo dòng phân tử cDNA sợi đôi
Plasmid
Plasmid của
của vi
vi
khuẩn
khuẩn
cDNA
cDNA sợi
sợi đôi
đôi được
được phân
phân tách
tách
thành
thành các
các đoạn
đoạn có
có kích
kích thước
thước

Gắn
Gắn

khác
khác nhau
nhau

Bacteriophage
Bacteriophage λ
λ vector
vector

Bổ sung đuôi đồng trùng

Bổ sung các đoạn nối nhân

hợp

tạo


1. Đuôi đồng trùng hợp
1.1 Đuôi dA:dT

Thông thường

50-150
50-150 gốc
gốc dA
dA gắn
gắn vào
vào
DNA
DNA vector
vector

Và

Và 1
1 số
số tương
tương ứng
ứng của
của gốc
gốc dT
dT vào
vào cDNA
cDNA
sợi
sợi đôi
đôi


1.2 Đuôi dC:dG


2. Các linker và adapter nhân tạo

Hình minh họa một linker. (a) Đoạn 5’-CCGGATCCGG-3’ mang vị trí nhận biết cho BamHI. (b) Linker này
được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase. (c) Cấu trúc này sau đó được cắt bằng BamHI để tạo ra đầu 5’
lồi.


Hình 6.7. Minh họa một adapter.
(a) Adapter, có đầu tận cùng 5’ tương ứng với enzyme HindIII, được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA
ligase.
(b) Đầu 5’ của adapter có thể được dephosphoryl hóa để ngăn cản sự tự kết nối lại.

IV. Các phương pháp tạo dòng cDNA khác
1. Tạo dòng mRNA:cDNA
()n

()n

()n

Các gốc dA

Khả
Khả năng
năng thành
thành công
công khi
khi gắn
gắn với
với plasmid
plasmid vector
vector thấp.
thấp.


2.
2. Bổ
Bổ sung
sung cac
cac tuần
tuần tự

tự linker
linker khác
khác nhau
nhau


3.Tạo
3.Tạo dòng
dòng cDNA
cDNA bằng
bằng các
các primer-adapter
primer-adapter


V. Các bacteriophage λ
vector dùng trong tạo dòng cDNA

V. Các bacteriophage λ
vector dùng trong tạo dòng cDNA


1. Các bacteriophage λ được dùng phổ biến

Xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng
các mẫu dò nucleic acid

λgt10
Nhận các DNA ngoại lai trong vùng mã hóa của
2

gen ức chế cI

Chèn được đoạn DNA ngoại lai dài tới 7,6 kb


1. Các bacteriophage λ được dùng phổ biến

Xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng các
mẫu dò miễn dịch

λgt11
Có vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm ở ngược hướng 53
bp của codon kết thúc dịch mã của gen lacZ

Chèn được đoạn DNA ngoại lai dài khoảng 7,2kb


cDNA sợi đôi đầu bằng
mang các liker SalI không
cần phải bảo vệ bằng methyl

Dùng để tạo dòng định
hướng và không định
Nguồn gốc từ vector
λ11. Mang vùng tạo
dòng ở vị trí EcoRI đơn
của λgt11

Vector λgt18 và λgt19

hướng cDNA

hóa trước khi cắt bằng RET


Các vị trí SacI và XbaI
được loại bỏ sao cho vị
trí XbaI ở trong vùng tạo
Vị trí tổng hợp chi
được đưa vào vector
Nguồn gốc từ λgt18
và λgt19.

Vector λgt20 và λgt21


Cho phép tạo dòng định
hướng cDNA vào trong
Chỉ mang 5 vị trí cắt
hạn chế duy nhất: NotI,
XbaI, SacI, SalI và
Nguồn gốc từ λgt18
và λgt19.

Vector λgt22 và λgt23

EcoRI

các vi trí SalI và NotI

Các protein dung hợp có thể được biểu hiện từ các plasmid có số
lượng bản sao lớn

Có thể gắn đoạn cDNA dài khoảng 10kb

Mang vùng tạo dòng cùng hướng với promoter lacZ của E.
coli

Vector λZAP


VI. Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm


PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC

Phương pháp sàng lọc