Quy trình sản xuất penicillium và sự cải biến tạo kháng sinh mới - Thùy Linh- K23

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
BỘ MÔN VI SINH VẬT HỌC – KHOA SINH HỌC

Tiểu luận môn công nghệ sinh học Vi Sinh Vật
Chủ đề:
GIỚI THIỆU QUI TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN VÀ NHỮNG
CẢI BIẾN TRONG CẤU TRÚC TẠO CÁC PENICILLIN BÁN TỐNG HỢP
CHỐNG LẠI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN

Giảng viên : TS Phạm Thế Hải
Học viên thực hiện : Vũ Thị Thùy Linh
Lớp : K23 - QH 2014 – 2016


Hà Nội, 2016

Nội dung
Lời mở đầu
Chương 1: Lịch sử phát hiện và sản xuất kháng sinh penicillin
………………………………………………………………………… 2
Chương 2: Các VSV sản xuất penicilin và quá trình tổng hợp của chúng
…………………………………………………………………………….. 4
Chương 3: Giới thiệu qui trình công nghệ sản xuất penicillin
………………………………………………………………..………. 11
Chương 4: Cải biến penicillin tạo ra các kháng sinh bán tổng hợp chống lại
khả năng kháng thuốc của vi khuẩn
………………………………………………………………………. 20
Tài liệu tham khảo

2


Lời mở đầu
Từ thế kỷ XIX người ta đã biết các vi sinh vật có thể sống cộng sinh, cũng như có
tác dụng đối kháng giữa chúng với nhau. Đến năm 1929, A.Fleming quan sát thấy những
khuẩn lạc của mốc penicillin notatum ức chế sinh trưởng tụ cầu khuẩn Staphylococus.
Chất có tác dụng ức chế do mốc này tiết ra được gọi là penicillin. Từ đó đến nay việc
nghiên cứu chất có hoạt tính kháng sinh được chú trọng rất nhiều và đạt được nhiều kết
quả rực rỡ.
Ngày nay người ta đã biết trên 2000 chất kháng sinh, nhưng chỉ mới có khoảng 50
chất được dùng vào tư liệu hóa học chữa các bệnh nhiễm vi sinh vật trong y học và một số
ngành khác. Một trong những chế phẩm chất kháng sinh phổ biến là penicillin.
Penicillin là chất kháng sinh được tìm ra đầu tiên và được sản xuất sớm nhất dùng
chữa một số bệnh do vi khuẩn vào những năm đầu của chiến tranh thế giới thứ hai. Ngày
nay chất kháng sinh này được sản xuất với một lượng rất lớn và được dùng khá phổ biến
trong y học.
Vì những lí do như vậy mà em lựa chọn chủ đề “ Giới thiệu quy trình xản suất
Penicillin và các cải biến trong cấu trúc tạo các penicillin bán tổng hợp chống lại khả
năng kháng thuốc của vi khuẩn”

3


CHƯƠNG 1: LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ SẢN XUẤT KHÁNG SINH
PENICILIN
Năm 1928, trong phòng thí nghiệm vi khuẩn học của Bệnh viện Mary ở Luân đôn Thủ đô Vương quốc Anh, nhà bác học Fleming đã tình cờ phát hiện một sự kiện mới lạ đó
là vòng vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh được tạo ra bởi một loại
nấm mốc. Penicillium notatum từ không khí rơi vào đĩa nuôi cấy vi khuẩn. Fleming đã
tách riêng loại nấm mốc đó và nuôi cấy chúng trong các môi trường khác nhau và sau đó

xác định được rằng các dịch nuôi cấy penicillium notatum có hoạt tính kháng lại nhiều loại vi
khuẩn gây bệnh. Từ môi trường nuôi cấy penicillium notatum, ông và các cộng sự đã tách riêng
được một chất có màu trắng có hoạt tính kháng sinh rất mạnh và ông đặt tên chất đó là penicillin.
Nhưng ông chưa tinh chế được chất này vì thời kỳ đó chưa đủ điều kiện để nuôi cấy một lượng lớn
nguyên liệu.
Phải chờ đến năm 1941, các nhà bác học Anh là Abraham, Chain và Florey mới tinh chế
được penicillin dưới dạng ổn định và nghiên cứu được phương pháp lên men để điều chế đủ lượng
cần thiết cho việc thử lâm sàng điều trị hiệu nghiệm các bệnh nhiễm khuẩn đã tạo điều kiện nhanh
chóng việc đầu tư nghiên cứu sản xuất penicillin ở quy mô công nghiệp. Năm 1943 penicillin đã
được sản xuất ở quy mô lớn ở Mỹ để phục vụ chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn cho thương bệnh
binh trong thế chiến thứ hai. Sau đó Nga và một số nước khác cũng đã sản xuất được penicillin G
và penicillin V.
Vài năm sau người ta thấy xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượng này ngày
nay càng phổ biến hơn. Trên con đường nhằm vô hiệu hoá khả năng kháng thuốc của vi khuẩn và
mở rộng thêm tính năng ứng dụng điều trị của penicillin, năm 1959, Batcherlor và đồng nghiệp đã
tách ra được axit 6-aminopenicillanic. Về sau, axit này được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất
ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau. Nguyên lý sản xuất chế phẩm bán tổng
hợp trên đã mở ra con đường mới rất hiệu quả và kinh tế để đấu tranh chống lại sự kháng thuốc.
Ngày nay trên thế giới đã sản xuất được trên 500 chế phẩm penicillin (trong đó chỉ lên men trực
tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và xu thế nghiên cứu sản xuất các chế phẩm
penicillin bán tổng hợp mới vẫn tiếp tục được triển khai.
4


CHƯƠNG 2: CÁC VI SINH VẬT SẢN XUẤT PENICILLIN VÀ QUÁ
TRÌNH TỔNG HỢP CỦA CHÚNG
2.1. Các vi sinh vật sản xuất penicillium và đặc điểm dinh dưỡng của chúng
Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm mốc penicillium và
Aspergillus. Nhưng các chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium
chrysogenum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệp kháng sinh. Những chủng

đầu tiên được nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trên cơ sở chất tự nhiên tạo thành 10-15
đv/ml kháng sinh.
Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc:
 Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét. Khuẩn ty khí sinh mọc tốt
và có màu xanh; theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của những khuẩn ty bạc
trắng không có bào tử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi
trường.
 Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty
cơ chất cũng có màu nâu. Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lự cao, kiểu II thường xuyên cho hoạt
tính kháng sinh thấp. Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này và
thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của
giống.

Chủng penicillium được nuôi cấy trên đĩa petri

5


Các chủng penicillium ở các giai đoạn phát triển khác nhau
Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại kém ổn định. Đặc tính này đặt
cho những nhà vi sinh vật một nhiệm vụ khó khăn: tạo được khả năng sinh kháng sinh
cao nhất, giữ được ổn định trong quá trình nghiên cứu và sản xuất. Nhiệm vụ này có một
ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp .các giống này bảo vệ ở kệ, ở trạng thái đông khô có thể
tới ba năm, ở đất vô trùng là hai năm. Ngày nay nhờ di truyền học đã tạo được những
giống ổn định, ít nhất sau sáu thế hệ không giảm hoạt tính kháng sinh.
Chúng ta cần phải nhận thức rằng các nấm penicillium thường dễ biến đổi về hình
thái và giảm khả năng sinh kháng sinh. Khi xảy ra biến đổi thì sẽ sinh ra hàng loạt những
chủng mới từ giống cơ bản và nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật lúc này là phải chọn lại
những khuẩn lạc khoẻ có nhiều ưu điểm, tiếp theo cần phải tiến hành những biện pháp
bảo quản thích hợp.

Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai
đoạn phát triển:
1. Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế
bào chất chưa phân hoá. Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính.
2. Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trong
không bào dần dần biến mất. Ở cuối giai đoạn này xuất hiện những giọt chất béo nhỏ.
3. Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tế
bào chất rất ưa kiềm.
6


4. Giai đoạn IV: Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung
tính, những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đoạn III, tính ưa kiềm giảm.
5. Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống và có chứa những không bào,ở giữa
có một hoặc một vài hạt lớn. Các hạt chất béo biến mất. Tính ưa kiềm tiếp tục giảm.
6. Giai đoạn VI: Khuẩn ty vẫn giữ được dạng hình trống nhưng không còn
những hạt bắt màu trung tính, các không bào bắt màu da cam hoặc màu hồng đồng đều.
Các hạt chất béo không còn. Xuất hiện những tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân.
Quá trình lên men penicillin cũng thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng
(ứng với những giai đoạn phát triển I, II, III) và pha sinh penicillin (ứng với những giai
đoạn IV, V, VI).
Nguồn carbon trong lên men penicillin bằng nấm Penicillium chrysogenum có thể
là glucoza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, các axit hữu cơ (lactic, axetic, formic), các
axit amin…đường lactoza cho hiệu suất penicillin cao nhất và thường được dùng trong
công nghiệp. Nấm thường sử dụng đường lactoza chậm. Vì vậy, trong thực tế lactoza
được dùng phối hợp cùng đường khác (glucoza, sacaroza…) trong môi trường dinh
dưỡng.
Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucoza và axit lactic
của cao ngô. Sa đó lactoza mới được sử dụng (chủ yếu trong pha tạo penicillin). Khi trong
môi trường cạn lactoza và không bổ sung các chất dinh dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự

phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ giảm, trong thực tế sản xuất cần phải kết
thúc lên men trước thời điểm này.
Nguồn nitơ dùng trong sinh tổng hợp penicillin có thể là những hợp chất hữu cơ
(axit amin, pepton, protein) và vô cơ (amoniac, các muối amon và nitrat).Amoniac được
nấm penicillium chrysogenum đồng hoá nhanh hơn cả. Trong quá trình nuôi cấy N-NH 3
được tạo thành từ cao ngô do phản ứng khử amin các hợp chất nitơ. Nấm mốc sử dụng NNH3 trước tiên và nồng độ của chất này trong thời gian đầu tăng lên, vì tốc độ tạo thành
nó nhanh hơn tốc độ sử dụng, tiếp theo đó được giảm rất nhanh cùng với tốc độ sinh
trưởng, phát triển của nấm mốc và tiếp tục giảm cho đến khi hệ sợi của mốc bị tự phân.
Tốc độ sử dụng amoniac phụ thuộc vào nguồn cacbon trong môi trường. Trong trường
7


hợp nguồn cacbon là glucoza, sacaroza hoặc các nguồn cacbon dễ tiêu hoá khác, amoniac
được sử dụng nhanh hơn khi môi trường có lactoza. Nitrat được nấm mốc đồng hoá khi
trong môi trường không có nguồn nitơ hữu cơ.
Lưu huỳnh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh tổng
hợp của nấm mốc. Nguồn lưu huỳnh thường dùng là muối sunfat của kali, natri và amon.
Các chất này tham gia vào tổng hợp metionin, sixtin, biotin, tiamin…hoặc trạng thái liên
kết yếu là tốt hơn cả. Nhiều công trình nghiên cứu cho biết, khi trong môi trường có mặt
đồng thời L-sixtin và sunfat thì lưu huỳnh của axit amin này dễ đi vào phân tử penicillin
hơn lưu huỳnh của các gốc sunfat. Song, dùng axit amin trong sản xuất không kinh tế cho
nên người ta thường dùng tiosunfat natri (Na 2S2O3). Lưu huỳnh của chất này rất dễ di
động. Trong môi trường dinh dưỡng có tiosunfat cùng với cao ngô hiệu suất penicillin có
thể tăng hai lần.
Cơ chế biến đổi các hợp chất lưu huỳnh từ dạng oxy hoá sang dạng khử có thể theo
sơ đồ của Arnstein (1954) như sau:
Sunfat

Sunfit

Tiosunfit

sixtin

Trong tế bào sixtin dễ biến thành sixtein và ngược lại. Sixtein có một ý nhĩa lớn
như một tác nhân khử nhờ nhóm sunfuhydrin ( -SH ).
pH môi trường thích hợp cho penicillium chrysogenum phát triển nằm trong
khoảng 6 - 6.5. Môi trường kiềm hoặc axit hơn đều làm cho mốc phát triển chậm. Trong
quá trình lên men pH môi trường thay đổi tuỳ thuộc vào tốc độ sử dụng các hợp chất
cacbon và N-NH

2.2. Một số quá trình tổng hợp penicillium:
8


Sự tổng hợp và biến dưỡng penicillin

9


Sự tổng hợp penicillin N và deasetoxycephalosporin C
CHƯƠNG 3: GIỚI THIỆU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN
10


3.1. Đặc điểm chung
Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản
xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai. Ngay cả bằng sáng chế cũng có
giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra công nghệ sản xuất công
nghiệp. Theo hãng gist-brocades, toàn bộ dây chuyền chia làm 4 công đọan chính:

•

Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hay penicillin G).

•

Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.

•

Sản xuất các penicillin bán tổng hợp.

•

Pha chế các loại thuốc kháng sinh.
Nguyên liệu

Giống

Chuẩn bị môi trường
lên men

Nhân giống

Lên men

Thu nhận và tinh chế

Penicillin

Quy trình lên men sản xuất penicillin
3.2. Công nghệ sản xuất :
Hiện nay người ta sản xuất penicillin theo hai phương pháp:
• Phương pháp lên men bề mặt.
11


• Phương pháp lên men chìm.
3.2.1. Phương pháp lên men bề mặt:
Trong những năm 30 đến những năm 50 của thế kỷ XX, phương pháp nuôi cấy bề
mặt được áp dụng rộng rãi để sản xuất kháng sinh từ nấm penicillin chrysogenum…
a) Giống Penicillin chrysogenum: là nấm sợi đơn bào hở. Khi mới phát triển
trong môi trường đặt thì tạo ra 2 khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty dinh dưỡng màu
trắng. Sau 1 ngày nuôi cấy, các khuẩn ty chuyển sang màu xanh sám và đính bào tử bắt
đầu xuất hiện. Thời gian này cũng xuất hiện một ít bào tử trần từ tiền bào tử nằm trong
các đính bào tử. Các bào tử lần lượt tạo thành theo thời gian nuôi cấy và cuối cùng nấm
penicillin có màu sẫm hơn.

Nấm sợi penicillium chrysogenum.
Nấm penicillin: thuộc họ hiếu khí bắt buộc, do đó trong quá trình nuôi phải cung
cấp khí liên tục. Phương pháp bảo quản được dùng nhiều nhất là phương pháp cấy truyền
định kì trên thạch hàng tháng kết hợp với bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản bằng hạt
ngũ cốc bảo quản theo phương pháp đông khô cũng được sử dụng.
b)Nguyên liệu: Cám và hạt ngũ cốc các lọai, nguyên liệu được bổ sung nước sao
cho độ ẩm đạt 55-60%W và được hấp thanh trùng ở 121 oC trong 30-45 phút. Ngay sau
khi kết thúc thanh trùng, chúng được tải vào những khay hình chữ nhật có kích thước dài
1-1.2 m, rộng 0.6-0.8 m, cao 5-6 cm. Lớp môi trường cho vào đấy dày 2-3 cm để đảm bảo
độ thóang khí trên tòan bộ bề mặt và mặt dưới của môi trường. Một số cơ sở dùng nguyên
12

liệu là các hạt ngũ cốc thì lớp môi trường dày hơn (3-4 cm) do các hạt ngũ cốc tạo ra môi
trường có độ thoáng khí hơn.
Trong trường hợp cám quá mịn thì phải trộn thêm trấu xay nhỏ (thêm khoảng 2025%) hoặc cùi bắp xay nhỏ trước khi thanh trùng.
Để làm môi trường nhân giống, người ta cũng làm như trên. Chỉ có một điểm khác
là sau khi làm ẩm môi trường đến độ ẩm nhất định, người ta phân phối chúng vào các
dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng bằng 1/5 hay 1/6
dung tích của dụng cụ, đậy kín bằng nút bông và thanh trùng ở 121 oC(0.5 at) trong 30
phút rồi để nguội mới cấy giống.
c) Quá trình nhân giống: bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm. Trong các nhà
máy, mỗi lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống. Một ống dùng để kiểm tra
trước khi sản xuất, một dùng để sản xuất và một dùng để bảo quản.
Song song đó, người ta chuẩn bị một bình tam giác dung tích 200-250ml và chuẩn
bị 50g môi trường. Môi trường được thanh trùng và làm nguội đến 30oC.
Đổ 10ml đã thanh trùng và làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho
bào tử hòa trộn vào nước. Bằng biện pháp vô trùng (thực hiện trong các tủ cấy vô trùng)
chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên, lắc cho thật đều rồi chuyển chúng sang tủ ấm30-37 oc.
Nuôi ở điều kiện này cho đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môi trường.
Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp 1.Cứ tiếp tục thực
hiện ta có giống cấp 2, cấp 3 cho đến khi đủ 5-10% giống cho sản xuất.
Cứ mỗi một cấp độ nhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng môi trường
tăng từ 10-15 lần. Trong trường hợp vượt quá 1 ký người ta nuôi trên những khay.
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh hiện nay, thường là dùng những chủng
biến đổi gen. Công nghệ biến đổi gen đã tạo ra những chủng siêu tổng hợp kháng sinh.
Theo Talaro (1993), từ chủng penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổng
hợp 6mg/l, hiện nay người ta đã có những chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả năng
sinh tổng hợp 85000ng/l penicillin.

13

d) Quá trình lên men: khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội đến 30 oC,
tiến hành trộn giống với tỉ lệ 5-10%. Các khay được xếp chồng lên nhau trên những giá
đỡ với khoảng cách nhất định để thoáng khí và thoáng nhiệt.
Nấm penicillium trong quá trình phát triển thường tạo ít nhiệt hơn nấm
Aspergillus. Tuy nhiên, để tăng cường khả năng phát triển và sinh tổng hợp, người ta
thường thổi khí bằng quạt gió có lắp hệ thống làm sạch.
Quá trình lên men kéo dài 6-7 ngày ở 24-28oC.
Trong lên men bề mặt, người ta sử dụng môi trường lỏng. Môi trường lỏng dùng
trong nuôi cấy bề mặt thu nhận penicillin bao gồm:
Cao ngô (bắp)

50g

Lactose

30g

KH2PO4

0.5g

MgSO4

0.25g

C6H5CH2COOH

0.2g

ZnSO4

0.044g

NaNO3

3g

Nước

Dung dịch lên men được khử trùng ở 121oC (0.5 at) trong 30 phút, được phân khối vào
các khay giống các khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn. Ở đáy các khay này
không được đục lỗ vì phải chứa môi trường lỏng. Chiều cao của dung dịch môi trường
trong các khay là 3-4 cm. Người ta cũng tiến hành lên men trong khoảng thời gian là 6-7
ngày ở nhiệt độ lên men là 24-28o.
Váng nấm sợi được giữ lại sau khi đã rút hết dịch lên men, được tiếp tục sử dụng cho
những lần lên men kế tiếp. Ở những lần lên mentiếp theo người ta chỉ đổ thêm dịch lên
men vào. Các thí nghiệm cho thấy chỉ nên sử dụng lại 3-4 lần, vì những lần sau hiệu suất
thu nhận kháng sinh sẽ giảm dần.

14


3.2.2.Phương pháp lên men chìm:
Phương pháp lên men chìm là phương pháp được áp dụng nhiều từ những năm
1950 trở lai đây, thay thế dần phương pháp nuôi cấy bề mặt (trong những năm gần đây
thế giới lại quan tâm đến phương pháp nuôi cấy bề mặt vì nó có nhiều ưu điểm)
Trong phương pháp nuôi cấy chìm hay lên men chìm, người ta thường sử dụng
môi trường lỏng. Để làm môi trường lỏng, người ta dùng cao ngô, glucose, hydrol,
lactose, các muối amon, thiosunfat, photphat kali hoặc natri, các muối sunfat magiê,

natri, đồng…
a)Quá trình nhân giống: quá trình lên men chìm người ta nhân giống trong
môi trường lỏng. Mục tiêu của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tế bào
cao (thường tính tổng lượng tế bào/ml).
Môi trường nhân giống trong lên men penicillin khác với môi trường sản xuất
là chúng không chứa lactose (nếu có chỉ cần một lượng nhỏ ), một số khoáng chất và
tiền chất.
Người ta thường nhân giống penicillium trong môi trường có thành phần sau:
Cao ngô 2%

Glucose2%

lactose 0.5%

Nitrat amon 0.125%

Sunfat magiê0.025

sunfat natri 0.05%

Kaliphotphat monoboric 0.2%

CaCO3 0.5%

Môi trường được thanh trùng ở 121 oC trong thời gian 30 phút, để nguội và
nhân giống. Quá trình nhân giống được bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ống
nghiệm sang bình tam giác đã chứa sẵn môi trường nhân giống.
Người ta nhân giống vào các bình lên men với dung tích từ 1lít cho đến hàng
ngàn lít. Dung tích ở những cấp độ nhân giống lớn, thiết bị càng giống với thiết bị sản
xuất công nghiệp. Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì khoảng 26 ± 1oC và thời

gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 72 giờ. Tuy nhiên nhiệt độ này không hoàn toàn
cố định mà có sự thay đổi theo giống vi sinh vật mà ta áp dụng vào sản xuất. Khi nào
ta thấy tổng số lượng tế bào mới bắt đầu đạt được lớn nhất thì ta đưa chúng sang giai
đoạn sản xuất.
b) Quá trình lên men: Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương
pháp lên men chìm để sản xuất penicillin trải qua hai pha:

15


Pha thứ nhất: hệ sợi phát triển rất mạnh, hay còn gọi là pha sinh khối. trong
pha này các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào nấm hấp thu rất mạnh. Tốc
độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh. Sự tạo thành penicillin mới bắt đầu.
Pha thứ hai: hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần và đạt đến giá trị khoảng
7-7.5. Trong pha này penicillin được tạo ra với mức độ cực đại.
Giống nấm mốc penicillin chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc. Hơn thế nữa
quá trình tổng hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí mạnh. Do đó trong suốt
quá trình lên men, việc thổi khí là điều hết sức cần thiết.
• Nhiệt độ nên duy trì khoảng 26 ± 1oC.
• pH duy trì ở 7-7.5
• Chế độ thổi khí 1.2-1.5 thể tích/lít/phút.
Trong lên men để sản xuất penicillin hiện nay người ta sử dụng nhiều loại môi
trường khác nhau, tùy theo giống penicilium được sử dụng.
Bảng 1: Một số môi trường thường được sử dụng:
Thành phần

Môi trường 1

Cao ngô

2.0-2.4

Khô hạt có dầu (lạc, đậu
tương hứơng dương)

-

Môi trường 2
-

Môi trường 3
2.0-3.0

2.0-2.4

Lactose

5.0

5.0

Glucose hoặc hydol

1.0

1.0

Dầu thực vật

0.5-1.0

Amon nitrat

0.4

0.4

0.4

Sulfat natri

0.05

0.05

0.05

Kali photphat

0.4

0.4

0.4

Magie sulfat

0.025

0.025

0.25

Natri hyposunfit

0.2

0.2

0.2

Canxi cacbonat

0.5-1.0

0.5-1.0

0.5-1.0

Tiên chất

0.2-0.4

0.3-0.4

0.3-0.4

0.5-1.0

1.0

1.0
2.5-3.5

16


Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong 30 phút, sau đó làm nguội và tiếp
giống từ quá trình nhân giống vào. Quá trình này được đảm bảo ở tính vô trùng.
Hiệu xuất thu nhận penicillin phụ thuộc vào lượng sinh khối có trong môi
trường. Nhiều kết quả cho thấy khi penicillium phát triển mạnh, tạo nhiều sinh khối
thì hàm lượng penicillin thu được sẽ nhiều. Do đó các muối dinh dưỡng phải được
cung cấp đầy đủ. Mặt khác, còn cần cung cấp nhiều oxy vì nấm penicillin rất cần oxy
ở dạng hòa tan để phát triển. Lượng oxy phụ thuộc rất nhiều vào lượng các chất dinh
dưỡng. Mối quan hệ này thường tỷ lệ thuận với nhau.
Để thu được 100 kg muối natri của penicillin G cần phải cung cấp:
Bảng 2: Nguyên liệu điều chế 100 kg muối natri của penicillin G
1200 kg đường
220
kg
axit
phenylaxetic

60 kg dầu mơ
100kg

770 kg cao ngô

axitphennylaccetic

3000kw giờ điện

50000 m3 không

3

4000 m hơi nước

khí

3.3. Thu nhận và tinh chế kháng sinh:
Có ba phương pháp thu nhân và tinh chế kháng sinh penicillin từ môi trường
nuôi cấy (cả phương pháp bề mặt và phương pháp chìm):
• Trích ly bằng dung môi hữa cơ.
• Hấp thu.
• Trao đổi ion.
Trong ba phương pháp trên, phương pháp chiết bằng dung môi hữa cơ được sử
dụng nhiều hơn cả. Phương pháp này dựa trên những đặc điểm sau:
 Muối của penicillin rất dễ tan trong nước
 Axit penicillin rất dễ tan trong dung môi hữa cơ
Quá trình chiết bằng dung môi hữa cơ được thực hiện qua hai giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: Trộn nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc.
Làm như vậy để các phân tử kháng sinh tiếp xúc chặt chẽ với dung môi. Tiến hành
khuấy liên tục để đảm bảo quá trình tiếp xúc này đạt được mức độ cao nhất.
Giai đoạn thứ hai: Sau khi tiếp xúc giữa kháng sinh và dung môi sẽ tao ra kết
tủa. Để tách kết tủa khỏi dung dịch người ta tiến hành ly tâm.Phương pháp ly tâm vừa
nhanh vừa có hiệu quả nhất.
17


Trong các phòng thí nghiệm và cả trong sản xuất công nghiệp, người ta thường

dùng các dung môi sau để tiến hành thu nhân kháng sinh:
• Các ancol: butanol, isopropanol, propanol.
• Các ester: acetate etyl, butyl, amyl.
• Các ceton: metyl etyl aceton, metyl butyl ceton.
• Các ete: ete isopropylic, dioxan.
• Benzen, phenol, pyridin, dicloetan, clorofoc.
Kỹ thuật thu nhận kháng sinh ngày càng được cải tiến nhờ vào những tiến bộ
không ngừng của kỹ thuật vật lý. Một trong những phương pháp được sử dụng rất
hiệu quả là phương pháp phân tán tĩnh điện.
Phương pháp phân tán tĩnh điện thay thế cho phương pháp trích ly bằng dung
môi hữa cơ.
Do thành phần môi trường rất phước tạp nên sự di chuyển các phân tử
penicillin tới dung môi rất khó khăn và xảy ra rất chậm.
Phương pháp phân tán tĩnh điện nghiên cứu sự trộn dung môi hữu cơ và dịch
lên men bằng cách sử dụng phương pháp phun tĩnh điện.
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng hiệu điện thế cao (lên đến 25 kV)
để tạo những vi giọt của dung dịch chứa penicillin.
Một số lượng rất lớn các vi giọt chuyển động rất nhanh. Kết quả là tạo ra được
vận tốc chuyển động vật chất và tốc độ trích ly sẽ tăng nhanh. Các giọt được tạo ra
bằng phương pháp này sẽ được tăng tốc qua dung môi hữu cơ và kết quả là vận tốc sẽ
cao hơn.
Mặt khác, các giọt tạo thành sẽ được tích điện trường, chúng sẽ xếp thành hàng
tùy theo sử phân cực và lực hấp dẫn giống như lực hấp dẫn giữa hai cực nam châm, do
đó lam tăng khả năng hội tụ của các hạt và kết quả là rút ngắn thời gian tách dung môi
ra khỏi dung dịch lên men sau khi trích ly hoàn toàn.
Phương pháp này có những ưu điểm sau:
 Do thời gian thực hiện ngắn nên không làm thay đôi hoạt chất
sinh hoc của vật chất cần thu nhận
 Giảm chi phí cho quá trình trích ly.
18

CHƯƠNG 4 : CẢI BIẾN PENICILIN TẠO RA CÁC KHÁNG SINH BÁN
TỔNG HỢP CHỐNG LẠI KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
Qua sử dụng đã phát hiện Penicillin tự nhiên có nhiều nhược điểm như sau:
-

Gây dị ứng, sốc nhiều trường hợp bị tử vong sau khi nổi mẩn, viêm tụ huyết ở
xung quanh như tiêm và lan ra toàn thân vì vậy bắt buộc phải thử test dị ứng
trước khi tiêm cho bệnh nhân.
19


-

Ít tác dụng với các bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi các vi khuẩn gram âm. Nhanh
chóng bị nhờn thuốc, kháng thuốc do các loại vi khuẩn ví dụ tụ cầu vàng tiết ra
enzym Penicillinase - enzym này sẽ cắt vòng b – lactam và chuyển Penicillin
thành chất không có tác dụng.

Để cải thiện hoạt tính, các nhà khoa học đã gắn kết các mạch nhánh khác nhau vào
phần 6-APA để nhận được các Penicillin bán tổng hợp có tác dụng mạnh hơn, phổ tác
dụng rộng hơn, có hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do các vi khuẩn gram âm
nguy hiểm gây ra cũng như các chất có hoạt tính cao khi dùng uống. 6-APA cũng có
trong môi trường nuôi cấy Penicillium chrysogerum nhưng với hàm lượng rất thấp.
Trong công nghiệp 6-APA trước hết được điều chế từ Penicillin G bằng phương pháp
hóa học, nhưng sau đó chủ yếu bằng enzym deacylate. Phương pháp này cho hiệu suất
cao và công nghệ đơn giản, giá thành hạ. Sau đó gắn các gốc Acyl R khác nhau vào 6APA thì sẽ nhận được các Penicillin bán tổng hợp.
Các phương pháp điều chế penicillin bán tổng hợp
* Điều chế 6 – APA (axit 6 amino penicilin)

Năm 1950 Sakaguchi thông báo phân lập được enzim penicillin-acylase thủy phân
được penicillin G thành 6-APA:

- Năm 1967 thành công thủy phân được Pencillin G thành 6-APA

20


Axyl hóa 6-amino-penicillamic (điều chế penicillin bán tổng hợp)
Phương pháp chung:

21


Bảng 4: Các đại diện quan trọng nhất của penicilin bán tổng hợp

22


23


- Các kết luận rút ra liên quan đến cấu trúc và tác dụng của các penicillin bán tổng hợp
+ Mạch nhánh có chứa nhóm NH2 => Phổ kháng khuẩn mở rộng đến gram (-).
+ Mạch nhánh có đồng phân D có tác dụng mạnh hơn R.
+ Trong mạch nhánh có nhân phenyl thế thì tác dụng giảm đi, trừ trường hợp OH thế
ở para như amoxicillin.
24

- Cơ chế tác dụng của chế phẩm kết hợp giữa kháng sinh penicillin và axit
clavulamic.

* Các penicillin este
- Các este tiêu biểu của của penicillin đã và đang sử dụng trong điều trị
Bảng 5. Các este quang trọng của penicillin tự nhiên và penicillin bán tổng hợp

25