Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân bị phơi nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (f1, f2) của những nạn nhân bị phơi nhiễm

bộ y tế
trờng đại học y hà nội

chơng trình 33

Báo cáo Tổng kết đề tài nhánh
Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân
bị phơi nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2)
của những nạn nhân bị phơi nhiễm

Chủ nhiệm đề tài nhánh:

TS. Nông Văn Hải

Cơ quan chủ trì:

Viện Công nghệ Sinh học

Thuộc đề tài cấp nhà nớc (CT 33):
Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch,
sinh hoá, huyết học và tồn lu dioxin
trên các đối tợng phơi nhiễm có nguy cơ cao
Chủ nhiệm đề tài:

PGS. TS. Nguyễn Văn Tờng

Cơ quan chủ quản:

Bộ Y tế

Cơ quan chủ trì:

Trờng Đại học Y Hà Nội

Hà nội 2003

5462-5
13/10/2005


bộ y tế
trờng đại học y hà nội

chơng trình 33

Báo cáo
Tổng kết đề tài nhánh

đề tài cấp nhà nớc

Đề tài nhánh:
Nghiên cứu phát hiện các thay đổi gen ở nạn nhân bị phơi nhiễm
dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2) của những nạn nhân bị phơi
nhiễm

Chủ nhiệm đề tài nhánh:

TS. Nông Văn Hải

Cơ quan chủ trì:

Viện Công nghệ Sinh học

Thời gian thực hiện: 2001 2003
Kinh phí đợc cấp: 275.500.000

Hà nội 2003


Danh sách những ngời thực hiện chính
của đề tài Nhánh

Chủ nhiệm đề tài nhánh:

TS. Nông Văn Hải

Th ký đề tài nhánh:

TS. Lê Thị Thu Hiền

Những ngời thực hiện chính:
1. TS. Phan Văn Chi
2. TS. Quyền Đình Thi
3. PGS. TS. Nguyễn Thị Ngọc Dao
4. TS. Nguyễn Thị Bích Nhi
5. TS. Lê Thị Thu Hiền
6. ThS. Nguyễn Huy Hoàng
7. CN. Nguyễn Đăng Tôn
8. CN. Nguyễn Hải Hà
9. CN. Cao Xuân Hiếu
10. CN. Nguyễn Thuỳ Dơng

11. CN. Phạm Thu Thuỷ
12. CN. Nguyễn Đình Cờng
13. CN. Đỗ Quỳnh Hoa
14. CN. Nguyễn Nam Long
15. CN. Lê Thị Thu Giang
16. CN. Nguyễn Thị Thảo
Lời cảm ơn:
Đề tài nhánh chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Lãnh
đạo Chơng trình 33, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc
gia, Viện Công nghệ Sinh học, Trờng Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân y
và đặc biệt là PGS. TS Nguyễn Văn Tờng, GS. TSKH Phan Thị Phi
Phi, GS. TS Trịnh Văn Bảo, GS. TS Lê Bách Quang, GS. TS Nguyễn
Văn Nguyên và các cán bộ Trờng Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân y
trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này.


Mục lục

Trang
I. Đặt Vắn đề
II. Tổng quan tài liệu
III. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
IV. Kết quả và thảo luận
V. Bàn luận
VI. Kết luận
VII. Những hiệu quả của nghiên cứu
VIII. Tàiliệu tham khảo
IX. Phụ lục

1

Các phần trong báo cáo gồm:
I. Đặt vấn đề
Trong thời kỳ chiến tranh tại Việt Nam, từ năm 1961 đến năm 1972, Mỹ
đã sử dụng chất độc da cam (CĐDC) làm thuốc trụi lá (defoliant), trong đó có
chứa dioxin với nồng độ trung bình 2mg/kg (Kramarova et al., 1998). Tính
trên tổng số chất CĐDC, Mỹ đã sử dụng ở nớc ta một lợng lớn dioxin (ớc
tính: 170-500 kg). Theo công bố mới đây nhất của các nhà khoa học tại trờng
đại học Columbia (Mỹ), số lợng chất độc hoá học do Mỹ sử dụng tại chiến
tranh Việt Nam còn cao hơn rất nhiều, trong đó lợng dioxin có thể cao hơn từ
2 đến 4 lần so với các công bố trớc đây (Stellman et al., 2003). Nếu lấy con
số 4 g dioxin khi sử dụng trực tiếp có thể tiêu diệt toàn bộ nhân loại trên trái
đất thì đây là một con số hết sức khủng khiếp.
Ô nhiễm dioxin do chiến tranh hoá học của Mỹ để lại đã và đang gây hậu
quả hết sức nghiêm trọng đối với môi trờng sống, hệ sinh thái và con ngời.
Đặc biệt nghiêm trọng là hàng triệu ngời dân nớc ta đã và đang chịu hậu
quả nặng nề của dioxin. Các thế hệ ngời Việt Nam hiện nay và kế tiếp có thể
còn phải chịu những hậu quả khôn lờng về sự huỷ hoại sức khoẻ, bệnh di
truyền, ung th và nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác... do ảnh hởng trực tiếp
hay gián tiếp của dioxin.
Rất nhiều năm sau chiến tranh, các nghiên cứu của các nhà khoa học
Việt Nam và Mỹ vẫn cho thấy nồng độ dioxin trong cơ thể ngời Việt Nam
sống tại những vùng sinh thái bị nhiễm chất độc hoá học nặng nh sân bay
Biên Hoà, vẫn rất cao (Schecter et al., 2000; Schecter et al., 2001). Các nghiên
cứu này cũng nh nhiều nghiên cứu khác (Wiesmuller & Schlatterer, 1999) đã
củng cố thêm giả thuyết cho rằng dioxin đi vào cơ thể ngời theo chuỗi thức
ăn, chủ yếu là cá.
Các nghiên cứu về dịch tễ học và bệnh học lâm sàng...trên các nạn
nhân CĐDC đã đợc các cơ sở cơ quan của Bộ Y tế (Trờng Đại học Y Hà

Nội, các Bệnh viện), Uỷ ban 10/80 trớc đây và Bộ Quốc phòng (Học viện
Quân y) tiến hành từ hơn 20 năm trở lại đây và đã thu đợc các kết quả rất
quan trọng (Hoàng Đình Cầu, 2000; Phan Thị Phi Phi và CS, 2000).

1


Đồng thời, gần đây ảnh hởng của dioxin trên ngời ở mức độ phân tử
DNA đã bớc đầu đợc quan tâm nghiên cứu ở nớc ta. DNA của một số đối
tợng bị nhiễm độc đã đợc tách chiết và phân tích sơ bộ bằng kỹ thuật PCR
(Lê Đình Lơng và CS; Phan Thị Phi Phi và CS; Nguyễn Văn Nguyên, Lê
Bách Quang và CS; Nguyễn Thị Ngọc Dao và CS; Phan Văn Chi và CS;
Nông Văn Hải và CS; các tài liệu báo cáo đề tài hoặc cha công bố). Mặc dù
vậy, cho đến nay vẫn cha có các nghiên cứu sâu hơn về sự thay đổi cấu trúc
và chức năng của gen ở ngời, đặc biệt việc phân tích trình tự gen các phả hệ
nạn nhân bị nhiễm dioxin, trên cơ sở đó có những kết luận xác đáng về ảnh
hởng của dioxin trên ngời ở mức độ gen.
Từ tháng 8 năm 2001, đề tài nhánh (đề mục) Nghiên cứu phát hiện
các thay đổi gen ở nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ tiếp theo (F1, F2)
của những nạn nhân bị phơi nhiễm do Viện Công nghệ Sinh học chủ trì,
thuộc đề tài do PGS. TS. Nguyễn Văn Tờng (Trờng ĐH Y Hà Nội) làm Chủ
nhiệm Nghiên cứu các biến đổi về mặt di truyền, miễn dịch, sinh hoá, huyết
học và tồn lu dioxin trên các đối tợng bị phơi nhiễm thuộc Chơng trình
33, cấp Nhà nớc, đã đợc phê duyệt và chính thức đợc tiến hành.
Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài nhánh đặt mục tiêu: ứng dụng các kỹ thuật phân tử để phát hiện các
thay đổi về bộ gen nói chung, cũng nh các thay đổi về cấu trúc và chức năng
của một số gen chọn lọc ở các nạn nhân bị nhiễm dioxin và các thế hệ con
cháu của họ. Đa ra các kết luận xác đáng về hiểm hoạ dioxin đối với con
ngời cũng nh có những kiến nghị cần thiết về biện pháp khắc phục những

hậu quả lâu dài.
Nội dung nghiên cứu (đã đăng ký)
Thu thập mẫu (máu toàn phần) của các phả hệ (3-10 phả hệ, mỗi phả hệ 510 cá thể) cựu chiến binh và ngời dân bị ảnh hởng trực tiếp của dioxin
(CĐDC) đã và đang có những biểu hiện bệnh lý và lâm sàng đặc trng và các
thành viên trong gia đình họ (bố, mẹ, anh, chị, em ruột, con, cháu, ) trong
đó có ngời bị ung th máu, dị tật bẩm sinh, hoặc bị một trong những bệnh
đặc trng có liên quan đến dioxin và những ngời khoẻ mạnh bình thờng

2


(đối chứng). Tiến hành tách chiết, tinh chế và xử lý bảo quản lâu dài DNA và
các sản phẩm gen từ các mẫu máu.
Phân lập, xác định và so sánh trình tự nucleotit của các đoạn gen Cyp1A1
và P53 (exon 2-4, exon 5-7, và exon 8-9) từ các mẫu. So sánh sự khác nhau về
trình tự 2 gen này ở các mẫu, qua các thế hệ.
Nghiên cứu tìm các yếu tố gây cảm ứng gen Cyp1A1.
Xử lý số liệu bằng các phơng pháp phần mềm vi tính cho phân tích gen.
Tổng kết, báo cáo khoa học, công bố kết quả về ảnh hởng của dioxin lên
hệ gen và một số gen chọn lọc.

3


II. Tổng quan tài liệu
II. 1. Cơ chế tác động của dioxin ở mức độ phân tử
Dioxin là tên gọi tắt của 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD),
là một chất siêu độc, thờng lẫn tạp trong thành phần của các thuốc bảo vệ
thực vật, cũng nh sinh ra trong chất thải công nghiệp, các quá trình xử lý
(đốt) rác thải, trong khói thuốc lá... Xét về độc tính, dioxin chỉ đứng sau các

chất thải phóng xạ. Thời gian bán huỷ của dioxin trong cơ thể ngời là 8 năm
rỡi, thậm chí lâu hơn.
Tác động của dioxin gây hậu quả hết sức nghiêm trọng đối với môi
trờng sinh thái và đặc biệt là đối với sức khoẻ con ngời.
Những hậu quả trên ngời và động vật do dioxin gây ra bao gồm: các
bệnh ung th, suy giảm miễn dịch, rối loạn chức năng thần kinh, quái thai, dị
tật bẩm sinh và nhiều bệnh tật khác...
Những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của Sinh học phân tử và
Công nghệ gen, ngời ta đã và đang làm sáng tỏ đợc nhiều vấn đề trong cơ
chế phân tử của tác động tức thời (trực tiếp) cũng nh hậu quả lâu dài tiếp theo
(gián tiếp) của dioxin đối với cấu trúc và chức năng của các gen và sản phẩm
của chúng (protein/enzym). Có thể phân biệt các tác động này theo 2 nhóm:
A. Sự rối loạn về chức năng các gen
Theo các số liệu nghiên cứu từ nhiều năm của các nhà khoa học trên thế
giới, dioxin tác động trực tiếp lên tế bào chủ yếu thông qua một chất (protein)
thụ cảm (thụ thể) có tên là aryl hydrocarbon receptor (AhR). Ngoài ra, có thể
tồn tại cơ chế tác động khác (không qua AhR).
Tuy nhiên, cơ chế tác động thông qua AhR đã đợc nghiên cứu rất kỹ và
đã đợc khoa học thừa nhận. Các nghiên cứu cho thấy khi tiếp xúc với dioxin,
trong tế bào xảy ra sự biểu hiện tăng cờng gen mã hoá AhR kèm theo các
rối loạn về sự biểu hiện (thay đổi quá trình phiên mã - transcription) của hàng
loạt gen tham gia vào quá trình điều khiển sự sinh trởng của tế bào (cell
growth control), cũng nh các gen tham gia vào chu trình phân bào (cell
cycle), nh: TGF, cyclin A, c-myc...
Thông qua AhR, dioxin hoạt hoá sự biểu hiện các gen, nh: cytochrome
P4501A1 (Cyp1A1), plasminogen activator inhibitor-2 (PAI-2) Trong khi

4

đó, nó lại làm suy giảm (ức chế) biểu hiện gen mã hoá yếu tố sinh trởng
chuyển hoá TGF-beta2 (transforming growth factor -beta2)... Kết quả là quá
trình phân bào bị rối loạn gây nên các hậu quả tiếp theo rất đa dạng. Dioxin
làm thay đổi (ức chế, giảm biểu hiện) gen mã hoá glucose transporter- 4
(GLUT-4, protein vận chuyển đờng glucose).
Đặc biệt nguy hiểm, dioxin tác động lên các gen của các tế bào sinh
sản.. Nó bám vào chất thụ cảm hormone (hormone receptor) của tế bào, làm
thay đổi chức năng và cơ chế di truyền của tế bào, gây ra hàng loạt hậu quả,
nh: dioxin làm thay đổi biểu hiện gen mã hoá 17-20 lyase... Kết quả là lợng
hormone của tế bào trứng nh progesterone (P) và estradiol (E2) bị giảm dẫn
đến các hậu quả nghiêm trọng. Dioxin tác động lên sự phát triển của tinh hoàn
(gây teo). Có bằng chứng cho thấy, gen mã hoá Src kinase đóng vài trò quyết
định trong quá trình này. Liên quan đến tác động của dioxin, một gen mới
đợc phát hiện mã hoá cho protein có tên là 25-Dx (thuộc siêu họ protein:
cytokine/yếu tố sinh trởng/chất thụ cảm prolactin) có thể gắn với
progesterone (P), là chất thụ cảm của hormone này. Tác động của dioxin lên
các gen nhất định đôi khi còn phụ thuộc vào giới tính: chẳng hạn dioxin làm
tăng hoạt tính tyrosine kinase (TK) ở con đực, trong khi lại làm giảm hoạt tính
này ở con cái. Dioxin có thể liên quan đến sự phát sinh và phát triển của nhiều
bệnh ung th, thông qua các thay đổi ở các gen quan trọng nh p53, p27Kip1,
p21/waf1, cdc2 p34 kinase và cdk4...
Hiện nay, ngời ta đã thừa nhận: dioxin là chất gây ung th!
B. Tác động đột biến (độc gen - genotoxicity)
Mặc dù ngời ta vẫn cho rằng cha có bằng chứng về đột biến gen trên
ngời, các nghiên cứu trên chuột thực nghiệm xử lý dioxin cho thấy, khi xâm
nhập vào tế bào, dioxin có thể chuyển hoá, tơng tác với các protein-enzym và
gen khác, gây nên các thay đổi trong DNA, dẫn đến các đột biến và thậm chí
tử vong sau 34 ngày.
đặc biệt, thí nghiệm trên chuột còn cho thấy dioxin gây ra sự ôxy hoá
các bazơ nitơ trong thành phần nucleic acid, chuyển đổi Guanosine thành 8Hydroxydeoxyguanosine và quá trình sửa chữa phân tử sau đó không thành

công có thể dẫn đến sai lệch ở các vị trí của bazơ này trong gen (Shertzer et
al., 1998). Tình trạng bị ôxy thái quá (oxidative stress) (Shertzer et al.,
5


1998; Hong et al. , 1998; Slezak et al., 2000; Hassoun et al., 2001) có thể
chính là một trong những cơ chế quan trọng gây ra những thay đổi gen (biến
dị và di truyền lại cho các thế hệ con cái) cần phải đợc tập trung nghiên cứu
trên các nạn nhân bị nhiễm CĐDC.
Giả thuyết về cơ chế phá huỷ DNA bởi dioxin thông qua việc tạo ra các
gốc tự do, và ảnh hởng của quá trình sửa chữa DNA bị hỏng lên chu
trình phân bào, sự phát sinh ung th và đột biến gen... đợc trình bày trên
Hình 1 và 2.
DIOXIN

SOD
-

O2

H2O2

Fe2+
Phá huỷ
màng tế bào,
protein, DNA

OH-

Hình 1: Tác động của dioxin lên DNA thông qua việc tạo ra các gốc tự do

DNA bị hỏng

Ngừng chu trình
G2
phân bào

M
G
S

Hoàn chỉnh
Sửa
chữa
DNA

Đột biến
Không
hoàn chỉnh

Sai hình
NST
Chết tế bào

Ung th và các
bệnh di truyền

Hình 2: Các ảnh hởng của sự thay đổi DNA trong tế bào

6

Đây là cơ sở khoa học để chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu phân tích 3 gen
quan trọng, bao gồm:
1. Gen mã hóa p53 (TP53), tham gia quá trình phân bào và áp chế
ung th.
2. Gen mã hóa Cyp1A1, tham gia chuyển hoá các chất độc.
3. Gen mã hoá thụ thể Aryl Hydrocarbon (AhR), là yếu tố cảm ứng
dioxin.

II.2. Tổng quan về các gen đã chọn
Gen m hoá P53 - chất áp chế ung th
Vai trò của P53: Ngời bảo vệ của genom (The guard of genome).
Khi kiểm tra thấy có sự sai hỏng DNA, p53 ngừng chu kỳ phân bào
tại các điểm/ trạm kiểm soát (checkpoint) và hoạt hóa các gen mã hóa các
enzym có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA. Nếu DNA đợc sửa chữa hoàn
chỉnh, tế bào tiếp tục chu kỳ tế bào. Còn nếu DNA không thể sửa chữa, tế bào
sẽ chết theo cơ chế chết theo chơng trình (apoptosis).
Nếu p53 bị sai hỏng, hoặc mất chức năng, thì các tế bào mang DNA sai
hỏng vẫn đợc nhân lên mang theo các đột biến có hại. Đây là cơ chế gây ra
ung th. Các nghiên cứu cho thấy hơn 50% trờng hợp ung th ở ngời là do
có sự sai hỏng của gen mã hóa p53. Và do đó p53 còn đợc gọi là chất áp chế
ung th (Tumor suppressor).
Định vị tại locut 17p13 ở genom ngời
Cấu trúc của Gen p53
Khung đọc mở: 393 aa
Vùng gắn DNA đặc hiệu
Vùng oligomer hóa
Vùng phosphoryl hóa
Cơ chế cảm ứng p53 khi có sự sai hỏng DNA

Loại đột biến DNA cảm ứng: gẫy DNA tạo đầu bằng hoặc đầu dính tại
đầu 5' hoặc 3'. Đột biến mất nucleotide ở một sợi không gây cảm ứng p53
Cơ chế tích luỹ p53 nội bào: 1) tăng hiệu quả dịch mã của mRNA p53
(theo cơ chế điều khiển sau phiên mã); 2) tăng độ bền (thời gian tồn tại)
protein p53. Vì rằng p53 có thời gian bán phân huỷ ngắn trong điều kiện bình

7


thờng (5-20 phút) và cơ chế phân huỷ p53 là 1 quá trình tiêu dùng năng
lợng theo con đờng phân huỷ protein phụ thuộc ubiquitin.
Cơ chế p53 ngăn cản chu kỳ tế bào tại các điểm/trạm kiểm soát
(checkpoint): thông qua điều khiển phiên mã tăng hoặc giảm các gen có liên
quan.
Điều khiển âm tính: p53 hạn chế quá trình phiên mã các gen thông
qua việc tơng tác với các nhân tố phiên mã tạo thành phức hệ. Phức hệ p53TBP (protein bám vùng TATA box promoter; là một tiểu đơn vị của nhân tố
phiên mã TFIID), phức hệ p53-SP1-CBF (nhân tố bám promoter CCAAT)
Điều khiển dơng tính: p53 tăng cờng phiên mã một số gen bằng
cách tơng tác trực tiếp với vùng DNA gắn đặc hiệu với p53. Ví dụ: gen
p21kip, GADD45 làm gián đoạn chu kỳ tế bào; gen Mdm2(Hdm2) khôi phục
chu kỳ tế bào và gây tác dụng phản hồi (feedback) ức chế p53.
Sự chết tế bào theo chong trình (apoptosis)
Đây là một quá trình phức tạp thông qua nhiều con đờng trao đổi kết
quả là gây chết một tế bào nhất định và loại bỏ nó mà không gây các thơng
tổn mô và viêm nhiễm. Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc điều
hòa mối cân bằng giữa sự sinh sản và sự chết của tế bào và đợc điều khiển
bởi nhiều cơ chế khác nhau.
Một trong các cơ chế gây chết tế bào là cơ chế phụ thuộc p53. Cơ chế
này có mặt ở nhiều loại mô và có tính phụ thuộc loại mô. Cơ chế giả định là
p53 ức chế phiên mã gen Bcl-2 (nhân tố quy định sự tồn tại của tế bào chống

lại apoptosis) và đồng thời tăng cờng phiên mã gen Bax (tác nhân ức chế Bcl2).
Protein p53 đợc tổng hợp ở tất cả các loại mô tế bào và có tính bảo thủ
cao trong quá trình tiến hóa. Mặc dù không phải là phân tử thiết yếu cho sự
tồn tại của tế bào nhng p53 đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc duy trì
sự ổn định tính di truyền ở mức độ tế bào. Điều này là vô cùng quan trọng vì
rằng những thơng tổn về di truyền sẽ gây ra sự phát triển của các khối u và
gây ung th. Vai trò quan trọng của p53 nh là một chất áp chế ung th đã
đợc khẳng định thông qua nghiên cứu thống kê cho thấy tỷ lệ trong 6 ngời
bị suy giảm chức năng p53 thì 1 ngời bị phát triển bệnh thành ung th.
Protein p53 đợc hoạt hóa khi có sự thơng tổn DNA và hoạt động nh
là nhân tố phiên mã, có thể gắn với vùng DNA đặc hiệu (vùng tơng tác p53)

8


và tăng cờng phiên mã của các gen đích. Trong trờng hợp này, p53 hoặc
gây gián đoạn chu kỳ tế bào hoặc cảm ứng sự apoptosis. Cả 2 chức năng này
đều bảo vệ tế bào chống lại việc nhân và khuyếch đại các đột biến DNA trong
quần thể tế bào.
Sự tổn thơng DNA và phản ứng của p53
Thông thờng, sự gẫy phân tử DNA mạch đôi có thể gây phản ứng p53.
Điều này đợc chứng minh bằng thí nghiệm vi tiêm một lợng nhất định phân
tử DNA vào nhân của các tế bào nuôi cấy bình thờng. Bằng việc sử dụng các
phân tử DNA mang những đột biến nhất định, ngời ta đã chứng minh rằng
các đứt gẫy phân tử DNA tạo đầu bằng hoặc đầu nhô 3 hoặc 5 đều có tác
dụng gây phản ứng p53 nh nhau. Ngợc lại, sự mất nucleotide trên một sợi
đơn thì không hoạt hóa và khởi phát phản ứng.
Nồng độ p53 nội bào tăng lên tơng ứng với thơng tổn DNA. Điều này
không phụ thuộc vào quá trình phiên mã của gen mã hóa p53 mà liên quan
đến cơ chế điều hòa sau phiên mã, làm tăng hiệu quả dịch mã của các phân tử

mRNA đã đợc tổng hợp. Cơ chế điều hòa sau phiên mã rất quan trọng trong
điều hòa tổng thể sự biểu hiện của gen và đặc biệt cho phép phản ứng nhanh
hơn so với điều hòa phiên mã. Quá trình này liên quan đến tơng tác proteinmRNA nội bào nhng cơ chế cụ thể làm tăng nồng độ protein p53 thì cha
đợc làm sáng tỏ.
Tính ổn định của protein cũng có thể góp phần làm tăng nồng độ p53
tơng ứng với các thơng tổn DNA. Phân tử p53 thông thờng có thời gian tồn
tại ngắn, với thời gian bán phân huỷ khoảng 5-20 phút tuỳ thuộc loại tế bào.
Sự phân huỷ protein là một quá trình tiêu dùng năng lợng và có thể liên quan
đến hệ thống phân huỷ protein thông qua ubiquitin. Điều này tơng đồng với
sự tăng đột ngột nồng đột và giải thích sự tích luỹ p53 trong các tế bào khi
thiếu hụt các thành phần của con đờng ubiquitin.
Cảm ứng sự gián đoạn chu kỳ phân bào
Việc tăng nồng độ protein p53 khởi phát hàng loạt phản ứng nội bào khi
có sự thơng tổn DNA. Sự biểu hiện của một gen đích đặc hiệu có thể đợc
tăng cờng hoặc áp chế phụ thuộc vào loại promoter điều khiển gen đó.
áp chế biểu hiện gen: Các gen đợc điều khiển bởi các nhân tố phiên
mã thì có thể bị áp chế sự biểu hiện. Trong một số trờng hợp, đó là kết quả

9


khi protein p53 tạo phức hợp với các nhân tố phiên mã này và làm bất hoạt
hoá chúng. Các gen bị áp chế bởi p53 bao gồm các gen bị điều khiển bởi
promoter TATA; sự áp chế là do p53 gắn với TBP-protein bám hộp TATA,
một tiểu đơn vị của nhân tố phiên mã TFIID. Các nghiên cứu in vitro cho thấy
tơng tác p53-TBP ngăn cản sự phiên mã của các promoter rất nhỏ. Các vùng
chức năng nằm phía hai đầu phân tử protein p53 có thể tơng tác với các vùng
chức năng của TBP. Protein E1A của adenovirus có thể phá vỡ mối tơng tác
p53-TBP qua đầu C của phân tử p53 và làm hạn chế quá trình ức chế phiên mã
của p53.

P53 cũng tơng tác với các nhân tố phiên mã khác nh nhân tố bám hộp
CCAAT (CBF) và SP-1. Điều này chứng tỏ p53 áp chế sự phiên mã của những
nhóm gen nhất định bằng việc phong toả các nhân tố phiên mã tơng ứng của
những gen này.
Vùng bám DNA đặc hiệu:
Việc bám DNA đặc hiệu và sự hoạt hóa phiên mã là vai trò cơ bản của
chất áp chế ung th - p53 bình thờng. Protein p53 là phân tử tạo thành bởi
các vùng chức năng (modular) và vùng gắn DNA đã đợc xác định là nằm với
domain trung tâm phân tử. Sự hoạt hóa phiên mã của p53 đợc điều khiển bởi
sự tơng tác với nhân tố hoạt hóa đồng thời TAF40 và TAF60 (nhân tố liên
kết TBP).
Vùng trình tự gắn đặc hiệu p53 đợc nghiên cứu kỹ nhất là đoạn DNA
chứa 2 lần lặp lại trình tự 5PuPuPu[A/T][T/A] GpyPyPy 3. Mỗi đoạn lặp
lại tiêu biểu cho 1 phần tơng tác in vivo, mỗi nửa tơng tác này có thể cách
nhau một chuỗi Nucleotide mà vẫn có thể gắn với p53. Phơng pháp xác định
khối lợng bằng kính hiển vi điện tử quét (STEM) đã cho thấy p53 tơng tác
với vùng DNA đặc trng thông qua tetramer, bằng cách tạo liên kết giữa 4
phân tử p53 đã tạo thành một vòng uốn DNA. Việc tetramer p53 gắn với DNA
đợc chứng minh lần đầu tiên bằng các nghiên cứu in vitro phân đoạn kích
thớc và phân tích sự xê dịch băng điện di trên gel (gel shilf). Tuy nhiên, các
diễn biến trong tế bào thực tế có thể phức tạp hơn nhiều vì mỗi monomer
p53 đều có chức năng tăng cờng phiên mã kiểu trans mặc dù không gắn
với DNA trong nghiên cứu in vitro.

10


Sự gắn với vùng DNA đặc hiệu của p53 phụ thuộc vào cấu hình protein.
Dạng 1620+ (phản ứng với kháng thể đơn dòng Pab1620 phụ thuộc cấu hình)
tơng ứng với chức năng áp chế ung th của p53, và đóng vai trò quyết định

đối với việc gắn với vùng DNA bảo thủ p53-CON in vitro. Các thí nghiệm đối
kháng cho thấy p53 chuột có thể thay thế cho p53 ngời (hp53) trong phức hệ
p53-DNA. Điều này tơng ứng với khả năng gắn của chuột p53 cao hơn hp53
trong phức hệ p53-DNA tại một nhiệt độ nhất định. Các oligomer giữa p53
ngời và chuột cũng có thể gắn với DNA trong in vitro, và ái lức liên kết đã
đợc xác định vào khoảng 5x10-10M tơng tự với ái lực của các oligomer của
p53 ngời và chuột riêng rẽ.
Đột biến mất chức năng của p53
Cho đến nay ngời ta đã biết đến 18584 đột biến khác nhau của gen
P53 ( Một đột biến điểm vô nghĩa
cũng có thể làm mất chức năng áp chế ung th của p53. Trong các tế bào của
ngời bị ung th, gen p53 dờng nh cực kỳ nhạy cảm với các đột biến điểm
nằm trong vùng lõi trung tâm (vùng gắn DNA). Thực tế, p53 đợc coi là gen
bị đột biến thờng xuyên nhất trong quần thể ngời bị ung th mà không phụ
thuộc loại ung th nào.
Trong các tế bào ung th, việc mất chức năng của một allen thờng liên
quan đến đột biến vô nghĩa trên allen kia. Mặc dù các đột biến thờng tập
trung chủ yếu trên 25% của vùng mang mã, nhng trong thực tế có rất nhiều
các vùng nóng đột biến. Các điểm nóng đột biến thì liên quan đến các loại ung
th đặc trng. Ví dụ, các codon 175, 248 và 273 là các điểm nóng đột biến
thông thờng tạo nên đột biến vô nghĩa, tuy nhiên bệnh ung th carcinoma
trên tế bào gan khi phơi nhiễm aflatoxin B thì thờng liên quan đến đột biến
tại codon 249. Các đột biến của gen p53 trên tế bào dòng tinh thờng liên
quan đến bệnh ung th bẩm sinh còn gọi là hội chứng Li-Fraumeni.
Ngoài các đột biến, protein p53 cũng có thể bị bất hoạt bởi các tơng
tác protein-protein đặc hiệu (ví dụ mdm-2) và các protein đợc mã hóa bởi
DNA của virus gây ung th biến nạp vào trong tế bào. Thực tế, hiện tợng này
gây ra khái niệm coi p53 là protein nội bào tạo phức hệ với kháng thể T lớn
của virus SV40 gây ung th ở ngời. Protein E1B của các adenovirus loại 5 và
E6 trong nhóm 16 và 18 của các virus gây ung th u nhú ở ngời (HPV-16 và

11


-18) cũng tơng tác với protein p53 kiểu dại. Các protein E1B và kháng thể T
lớn dờng nh tạo các phức hệ tơng đối bền với p53. Ngợc lại, HPV E6 làm
p53 bị thuỷ phân nhanh chóng vởi hệ thống phụ thuộc ubiquitin.
Chức năng của p53 thờng rất nhạy cảm với các đột biến vô nghĩa và
điều này đã đợc làm sáng tỏ khi vùng chức năng lõi trung tâm nơi đóng vai
trò liên kết với DNA đích đợc xây dựng mô hình cấu trúc bằng phơng pháp
tinh thể tia X. Ngời ta đã xác định rõ ràng các đột biến gây mất chức năng
bám DNA và các đột biến làm thay đôỉ cấu trúc không gian của protein p53.
Mô hình cấu trúc phân tử đã chỉ ra rằng vùng chức năng bám DNA của
p53 khác so với các protein bám DNA khác ở chỗ nó có cấu trúc tơng đối
mở, đòi hỏi tạo thành cấu trúc kẹp kiểu sandwich B để định vị và định hớng
các thành phần cấu trúc tơng tác với DNA. Cấu trúc kẹp B này tạo thành một
nếp gấp dạng vòng-tấm-xoắn và tạo 2 vòng loop L2 và L3. Cấu trúc này đợc
định hớng và ổn định nhờ các tơng tác của các chuỗi bên và sự tơng tác 4
tiểu phần dạng nguyên tố kẽm (Zn) (thông qua 3 Cys và 1 His). Sự định
hớng này có tính thiết yếu vì dạng vòng-tấm-xoắn và vòng loop L2, L3 tạo
thành bề mặt gắn DNA của p53. Việc nhận diện vùng DNA đặc hiệu liên quan
đến cả các rãnh lớn và rãnh nhỏ của vùng DNA đích.
Các đột biến vô nghĩa xảy ra trên khắp vùng liên kết với DNA với các
điểm nóng ở codon 175, 248 và 273 đều mã hóa arginine. Mô hình cấu trúc
tinh thể đã chỉ ra rằng các tơng tác chuỗi bên của Arg175 có vai trò quan
trọng trong việc duy trì cấu hình đúng (cấu trúc không gian cấp 4) cần thiết
cho việc gắn với DNA đặc hiệu. Đột biến ở vị trí này làm mất tính ổn định của
cấu trúc bậc 4 của p53 dẫn đến mất khả năng bám DNA và khả năng áp chế
ung th. Đột biến thay thế Arg248 và Arg273 cũng gây mất khả năng bám
DNA, nhng trong trờng hợp này không làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của p53

nên chứng tỏ rằng các vị trí này là nơi tơng tác trực tiếp với phân tử DNA.
Tóm lại, các đột biến cấu trúc làm sai hỏng cấu trúc bậc 4 của p53 nên mất
tính bám DNA; trong khi đó các đột biến liên kết DNA là các đột biến sai
hỏng tại các axit amin quan trọng liên kết trực tiếp với DNA nên không làm
sai hỏng cấu trúc không gian.
P53 là một protein đa chức năng
Tính đa chức năng của p53 đợc giải thích một phần thông qua lịch sử
nghiên cứu protein này. Đầu tiên, p53 đợc coi là tác nhân gây ung th nhng

12


cuối cùng lại là chất áp chế ung th. Trong thực tế, dạng p53 kiểu dại có 3
dạng cấu trúc không gian khác nhau (phân biệt bằng phép lai miễn dịch) mỗi
loại tơng ứng với một kiểu chức năng điều khiển sự phát triển của tế bào. Các
dạng cấu trúc khác nhau có thể là do kết quả của: 1) sự thay đổi cấu hình bổ
sung, 2) sửa đổi sau phiên mã, 3) tổ hợp khác nhau các exon trong mRNA
(alternative splicing).
Tính linh động cấu trúc không gian là các cơ chế phân tử cho phép một
protein có thể thực hiện các chức năng khác nhau. Đặc tính này có thể là do
các cơ chế điều hòa hoạt động p53 trong các phản ứng phát triển bình thờng
của tế bào và dờng nh đây là đặc tính cơ bản của p53 kiểu dại. Ngời ta
cũng cho rằng rất nhiều đột biến cấu trúc có thể giữ vững ổn định cấu hình của
p53 khi có phản ứng kích thích sinh trởng tế bào. Các nghiên cứu in vivo cho
thấy cấu trúc của p53 là đối tợng tấn công của các chất độc và của nguyên tố
Đồng, một kim loại độc. Ngời ta giả thuyết rằng các cơ chế này điều khiển
các cơ chế điều hòa nội bào cấu hình p53 để phản ứng tế bào với các tín hiệu
điều khiển sự sinh trởng của tế bào và cũng phản ứng với các thơng tổn
DNA.
Các sửa đổi sau phiên mã chủ yếu đối với protein p53 là sự phosphoryl

hóa, và có các vị trí khác nhau tơng ứng với các kinase đặc hiệu nằm ở đầu N
và đầu C của protein p53. Quá trình phosphoryl hóa có thể có hiệu quả quyết
định lên cấu hình protein. Mặt khác, cơ chế này có thể tác động lên p53 theo
các cách khác ví dụ nh sự hoạt hóa của các hoạt tính gắn DNA đặc hiệu.
Với các vị trí phosphoryl hóa phức nằm trên p53 và bản chất động lực
của phản ứng phosphoryl hóa/ dephosphoryl hóa, phân tử p53 có các cơ chế
thực hiện các chức năng là nhiệm vụ vô cùng quan trọng. Ngời ta đã thu
đợc các bằng chứng gián tiếp nh là quá trình phosphoryl hóa liên quan đến
phản ứng tế bào đối với sự thay đổi DNA, và p53 đợc biết là cơ chất của các
enzym kinase DNA-PK và JNK. Một thí nghiệm quan trọng là hoạt tính
DNA-PK liên quan đến quá trình sửa chữa những đứt gẫy của sợi kép DNA.
Tuy nhiên, vai trò của quá trình phosphoryl hóa phân tử p53 vẫn cha đợc
nghiên cứu rõ ràng.
Cơ chế cắt gắn luân phiên của p53 chuột đã đợc nghiên cứu và cho
thấy có sự thay thế 17 aa mới tại vị trí 26 aa nằm ở đầu C của phân tử p53
cha cắt gắn. Ngời ta đã xác định đợc 2 phân tử protein khác nhau trên tế

13


bào biểu mô của chuột và có thể đợc điều hòa khác nhau tuỳ thuộc thời điểm
trong chu kỳ tế bào. Sự khác biệt về chức năng giữa 2 biến dị của p53 do cắt
gắn là ở chỗ phân tử p53 bị cắt gắn luân phiên không thể bám tốt lên sợi đơn
ARN hoặc phân tử DNA.
Tổng kết
Phân tử p53 kiểu dại bằng cách nào đó đã nhạy cảm và phản ứng đối
với những sai hỏng DNA. Phản ứng này gây ra sự tích luỹ protein p53 theo cơ
chế điều khiển sau phiên mã. Phân tử p53 tác động đến quá trình phiên mã của
nhiều gen, hoặt bằng cách tơng tác với các protein liên quan đến quá trình
điều hòa phiên mã của gen đó, hoặc bằng cách bám trực tiếp với phân tử DNA

và hoạt hóa kiểu trans gen đó. Phân tử p53 hoặc gây ra sự gián đoạn chu kỳ tế
bào hoặc gây apoptosis tuỳ thuộc loại tế bào. Bằng cách ngăn chặn sự tăng
sinh của các tế bào bị sai hỏng DNA, phân tử p53 đóng vai trò cực kỳ quan
trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn của DNA và áp chế ung th.
Việc mất chức năng của p53 có liên quan đến sự phát triển của hơn nửa
bệnh ung th ở ngời, và p53 cũng là đối tợng nghiên cứu của các liệu pháp
chống ung th mới. Một hớng nghiên cứu là sử dụng liệu pháp gen để duy trì
cấu trúc kiểu dại của p53. Các lĩnh vực nghiên cứu trong tơng lai quan trọng
để phát triển các liệu pháp chống ung th liên quan p53 là việc xác định các
cơ chế p53 phản ứng đợc tự hoạt hóa nh thế nào khi có sự thơng tổn DNA,
và xác định các cơ chế quyết định khi nào thì p53 làm gián đoạn chu kỳ tế
bào, khi nào gây chết tế bào. Nhiều nghiên cứu cho thấy p53 có khả năng áp
chế ung th. Tuy nhiên, có bằng chứng cho thấy p53 là đa chức năng và thậm
chí có chức năng kích thích sự sinh trởng của tế bào. Các hiểu biết đầy đủ về
chức năng của p53 sẽ có ứng dụng đối với các bệnh liên quan đến ung th, tái
sinh và sửa chữa mô.
Gen Cyp1A1/ Cytochrome P450
Các protein Cytochrome P450 ở ngời là các enzym chuyển hóa thuốc
và các enzym này đợc sử dụng để tổng hợp các phân tử cholesterol, steroid
và phân tử lipid quan trọng khác nh prostacyclin và thromboxane A2. Hai
chất này là sản phẩm trung gian của quá trình tổng hợp arachidonic acid. Các
đột biến xảy ra trên các gen mã hóa cytochrome P450 hoặc sự thiếu hụt
protein này là tác nhân gây một số bệnh nghiêm trọng ở ngời. Ngoài ra, việc

14


cảm ứng một số gen P450 khác lại là nguyên nhân gây ra một số dạng ung th
vì các enzym này tham gia chuyển hóa các chất tiền gây ung th thành các
chất gây ung th.

Tên gọi cytochrome P450 là do các protein này đều chứa nhân Hem
và có một phổ hấp thụ đặc trng. Các protein cytochrome P450 ở động vật có
vú thờng là protein bám màng. Chúng đợc phát hiện lần đầu tiên tại thể
microsome ở gan chuột. Thể microsome là các thể tan đục đợc tạo thành khi
nghiền nhỏ các tế bào và phân lập các cấu trúc màng vẫn hòa tan trong khi
phần cặn tế bào và ty thể đợc lắng xuống. Hỗn hợp này rất đục khi quan sát
trên kính hiển vi quang học bởi vì chúng rất kém tán sắc. Cách duy nhất để
xác định phổ hấp thụ của các chất này là sử dụng thiết bị đặc biệt với phần
tiếp nhận ánh sáng rất gần với cuvette và sử dụng một nguồn sáng gián đoạn
trên các kính hiển vi khác nhau. Bằng cách này các tạp chất gây nhiễu xạ khác
có thể đợc phân tách. Trong hệ thống này, các thể tan có tính khử cao này
đợc phản ứng với khí CO trong cuvette sẽ cho một phổ hấp thụ tơng đối
mạnh ở bớc sóng 450nm (do đó đợc gọi là P450 với P nghĩa là sắc tố,
pigment). Đây đợc gọi là phổ biệt hóa CO khử. Các phân tử CO liên kết chặt
chẽ với nhân Hem chứa sắt sẽ cho 2 phổ hấp thụ khác nhau ở 2 cuvette khác
nhau. Phổ này đợc quan sát lần đầu tiên vào năm 1958.
Các protein chứa nhân Hem khác không có tính chất đặc biệt này.
Nguyên nhân cytochrome P450 lại hấp thụ tại phổ này là do sự hình thành liên
kết đặc biệt tại nhân Hem chứa ion sắt. Bốn liên kết của sắt đợc hình thành
với các nguyên tử N trong vòng Hem. Do đó, nguyên tử Fe còn có khả năng
tạo thêm 2 liên kết nữa phía trên và dới mặt phẳng liên kết. Trong các phân
tử cytochrome P450, liên kết thứ 5 tạo thành với anion lu huỳnh (S-). Nguyên
tố S là từ cysteine tại vị trí bảo thủ trong trung tâm hoạt động của enzym.
Cấu trúc tinh thể nhiễu xạ tia X của các phân tử P450 ở hơn mời loại vi
khuẩn đã đợc xác định (CYPs 51 [Mycobacterium], 55A1, 101A1, 102A1,
107A1 [eryF], 111A1, 119A1, 121A1 [P450Mt2], 152, 175A1). Các protein
này có tính tan cao trong khi các protein P450 ở sinh vật nhân chuẩn lại có
liên kết với màng. Cấu trúc này tơng tự nh các bào quan có cấu trúc màng
khác và có thể các protein này có các domain bám màng. Protein cytochrome
P450 đầu tiên đợc làm tinh thể là từ Pseudomonas putida, một loại vi khuẩn

có khả năng sử dụng long não làm nguồn carbon duy nhất. Chủng vi khuẩn

15


này đợc phát hiện trên đất dới các cây long não. Các protein này có hình
dạng kiểu tam giác với nhân Hem đợc ẩn sâu bên trong. Cấu trúc này cho
phép ngăn cản bất cứ phân tử cơ chất hoặc sản phẩm, kể cả các phân tử nớc
có thể tiếp xúc hoặc tách ra khỏi trung tâm hoạt động. Do đó, ngời ta giả
thuyết rằng có các cơ chế thay đổi cấu trúc các phân tử này để có thể mở một
số điểm tại các vị trí xúc tác. Phần lớn của enzym này có cấu trúc giàu xoắn
, phần còn lại là có cấu trúc nếp gấp và các cấu trúc không lặp lại khác.
Các phân tử P450 của động vật có vú cũng có cấu trúc bậc hai tơng tự nhng
ở đầu N có miền (domain) bám màng. Khi đầu N đợc loại bỏ khỏi phân tử
protein thì nó vẫn liên kết với màng. Protein CYP2C5 ở động vật có vú đã
đợc tinh thể hóa sau khi loại bỏ đoạn bám màng ở đầu N và thay thể trình tự
kỵ nớc bên trong bằng đoạn peptid có tính tan cao hơn. Cấu trúc nhiễu xạ tia
X của phân tử tinh thể này đã đợc xác định (Williams et. al. 2000). Bản mô
tả ngắn gọn các đặc điểm chính của phân tử này đã đợc công bố trớc đó.
Cấu trúc này tơng đồng với các cấu trúc enzym P450 tan của vi khuẩn nhng
có một số khác biệt rõ rệt.
Ngành công nghiệp dợc phẩm rất quan tâm đến các cấu trúc tinh thể
của P450 khi tạo phức với các dợc phẩm, dựa trên đó ngời ta có thể cải tiến
các dợc phẩm này. Ví dụ nh sự thoả thuận giữa công ty dợc hàng đầu thế
giới AstraZeneca với công nghệ Astex nhằm xác định cấu trúc tinh thể của
phức hợp các protein P450 ngời với các dợc phẩm của công ty. Việc ứng
dụng các công nghệ của Astex để xác định cấu trúc 3 chiều của các enzym
cytochrome P450 khi tạo phức với các hợp chất sẽ thúc đẩy nhanh quá trình
cải thiện các hợp chất có dợc tính và tăng cờng khả năng điều trị lâm sàng
của các dợc phẩm này.

Các protein cytochrome P450 xúc tác cho nhiều loại phản ứng nhng
quan trọng nhất là các phản ứng hydroxyl hóa. Các enzym này gọi là các
enzym oxy hóa đa chức năng hoặc các monooxygenase, bởi vì chúng phân
tách một nguyên tử oxygen ra khỏi cơ chất và giải phóng nớc. Chúng khác
với các dioxygenase có chức năng giải phóng phân tử oxygen.
Các chất hóa học hoặc dợc phẩm thờng đợc gọi là các chất ngoại
sinh. Các cytochrome P450 đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi
các chất ngoại sinh, đợc biệt là các dợc phẩm có tính kỵ nớc. Quá trình
trao đổi của các hợp chất này thờng tiến hành theo 2 phase. Trớc tiên, quá

16


trình gắn một gốc chức năng có tác dụng nh một vật nối với cơ chất. Phản
ứng này tạo ra các chất sửa đổi có tính tan tốt hơn do đó nó có thể chiết bằng
dung dịch ure. Rất nhiều P450 xúc tác phản ứng gắn gốc hydroxyl trong phase
I của phản ứng trao đổi thuốc. Sau đó, gốc hydroxyl sẽ đóng vai trò nh vị trí
xảy ra các phản ứng tiếp theo trong phase II.
Để có thể tiến hành các phản ứng xúc tác, các cytochrome P450 cần
một nguồn cung cấp electron. Việc bổ sung 2 electron (quá trình khử) vào
nhân Hem chứa sắt sẽ làm dễ dàng phá vỡ liên kết giữa O-O. Các electron
đợc cung cấp bởi một protein liên kết trực tiếp với P450 và truyền electron từ
nhóm ngoại của protein. Việc trao đổi electron giữa các protein này đợc gọi
là chuỗi truyền điện tử và nó tơng tự với chuỗi phản ứng của phức hệ I đến
IV trong ty thể.
Có hai kiểu chuỗi truyền điện tử trong các cytochrome P450. Quá
trình này phụ thuộc vị trí của enzym trong tế bào. Một số P450 đợc phát hiện
ở màng trong ty thể và một số ở mạng lới nội chất. Các 2 loại protein P450
này đều là các protein bám màng. Các protein cung cấp electron cho P450 ở
mạng lới nội chất gọi là NADPH cytochrome P450 reductase. Các enzym

này cũng có domain xuyên màng tại đầu N và phần xúc tác nằm ở phía tế bào
chất. Protein này có 2 domain mỗi cái chứa một phân tử flavin. Hai electron
cung cấp là từ NADPH và từ FAD & FMN sau đó truyền đến ion Fe của nhân
Hem P450.
Trong ty thể, chuỗi truyền điện tử dài hơn. Ferredoxin (còn gọi là
adrenodoxin của tuyến thợng thận, nhng 2 protein này đợc mã hóa bởi 2
gen khác nhau) là chất cho electron trực tiếp cho P450 ở ty thể (CYP11A1,
CYP11B1, CYP11B2, CYP24, CYP27A1, CYP27B1, CYP27C1). Ferredoxin
có nhóm sulfur sắt thay thể flavin. Tuy nhiên, ferredoxin bị khử bởi ferredoxin
reductase (còn gọi là adrenodoxin reductase) chứa nhân flavin. NADPH là
nguồn cung cấp electron sau đó truyền đến ferredoxin reductase, ferredoxin và
tới P450. Một số P450 cũng nhận electron từ cytochrome b5. Đây là một
protein nhỏ cũng chứa nhân Hem và vùng liên kết màng và cần một đơng
lợng khử từ NADH.

17


Hình 3: Sơ đồ cơ chế hoạt động của Cytochrome P450

Họ protein P450 ở ngời
Các protein P450 đợc sắp xếp thành các lớp và dới lớp dựa trên sự
tơng đồng về trình tự. Các trình tự amino acid thờng giống nhau khoảng
40% thì thuộc cùng một lớp. Các trình tự giống trên 55% thì thuộc cùng một
dới lớp. Hiện này, ngời ta đã xác định đợc trên 2500 trình tự cytochrome
P450.
Protein cytochrome P450 ở ngời chia làm 18 lớp và 43 dới lớp
CYP1 trao đổi dợc phẩm (3 dới lớp, 3 gen, 1 pseudogene)
CYP2 trao đổi dợc phẩm và steroid (13 dới lớp, 16 gen, 16 pseudogenes)
CYP3 trao đổi dợc phẩm (1 dới lớp, 4 gen, 2 pseudogenes)

CYP4 trao đổi arachidonic acid hoặc acid béo (5 dới lớp, 11 gen, 10
pseudogenes)
CYP5 Thromboxane A2 synthase (1 dới lớp, 1 gen)
CYP7A bile acid biosynthesis 7-alpha hydroxylase of steroid nucleus (1
thành viên dới lớp )
CYP7B 7-alpha hydroxylase dạng đặc hiệu não (1 dới lớp)
CYP8A prostacyclin synthase (1 thành viên dới lớp)
CYP8B bile acid biosynthesis (1 thành viên dới lớp)
CYP11 steroid biosynthesis (2 dới lớp, 3 gen)
CYP17 steroid biosynthesis (1 dới lớp, 1 gen) 17-alpha hydroxylase
CYP19 steroid biosynthesis (1 dới lớp, 1 gen) aromatase forms estrogen
CYP20 không rõ chức năng (1 dới lớp, 1 gen)

18


CYP21 steroid biosynthesis (1 dới lớp, 1 gen, 1 pseudogene)
CYP24 vitamin D degradation (1 dới lớp, 1 gen)
CYP26A retinoic acid hydroxylase important in development (1 dới lớp)
CYP26B probable retinoic acid hydroxylase (1 dới lớp)
CYP26C probabvle retinoic acid hydroxylase (1 dới lớp)
CYP27A bile acid biosynthesis (1 dới lớp)
CYP27B Vitamin D3 1-alpha hydroxylase activates vitamin D3 (1 dới lớp)
CYP27C không rõ chức năng (1 dới lớp)
CYP39 7 alpha hydroxylation of 24 hydroxy cholesterol (1 dới lớp)
CYP46 cholesterol 24-hydroxylase (1 dới lớp)
CYP51 cholesterol biosynthesis (1 dới lớp, 1 gen, 3 pseudogenes) lanosterol
14-alpha demethylase
Ngời ta đã xác định đợc trình tự của 57 gen CYP và 47

pseudogenes.
1A1, 1A2, 1B1, 1C1P, 2A6, 2A7, 2A7PT (telomeric),
2A7PC(centromeric), 2A13, 2A18P, 2B6, 2B7P1, 2B7P2, 2B7P3, 2C8, 2C9,
2C18, 2C19, 2D6, 2D7AP, 2D8P, 2E1, 2F1, 2F1P, 2G1P, 2G2P, 2J2, 2R1,
2S1, 2T2P, 2T3P, 2U1, 2W1, 3A4, 3A5, 3A5P1, 3A5P2, 3A7, 3A43, 4A11,
4A20, 4A21P, 4A22, 4B1, 4F2, 4F3, 4F8, 4F9P, 4F10P, 4F11, 4F12, 4F22,
4F23P, 4F24P, 4F25P, 4F26P, 4F27P, 4F28P, 4V2, 4X1, 5A1, 7A1, 7B1,
8A1, 8B1, 11A1, 11B1, 11B2, 17, 19, 20, 21A1P, 21A2, 24, 26A1, 26B1,
26C1, 27A1, 27B1, 27C1, 39, 46, 51, 51P1, 51P2, 51P3
P: pseudogene
Cảm ứng biểu hiện enzym P450
Các enzym P450 có các cơ chế điều hòa biểu hiện gen khác nhau. Một
số gen này có thể đợc cảm ứng phiên mã bởi một tín hiệu hóa học. Các
hormone steroid đợc điều chỉnh chặt chẽ bởi các tuyến nội tiết. Một trong
những hormon cảm ứng biểu hiện các gen P450 là hormone tuyến giáp trạng
ACTH. ACTH kích thích sự tạo thành cAMP, chất này đóng vai trò là chất
truyền tin thứ hai thông qua việc hoạt hóa các protein kinase, enzym xúc tác
cho quá trình phosphoryl hóa các protein khác làm tăng quá trình phiên mã
của gen.
Một dạng điều hòa gen P450 khác là thông qua các chất tăng sinh cấu
trúc peroxisome nh clofibrate. Các chất dợc phẩm này hoạt động thông qua
một protein liên kết là PPAR (peroxisome proliferator activated receptor). Khi
19


các chất dợc phẩm liên kết với các protein này thì nó sẽ di chuyển vào nhân,
tạo phức với thụ thể retinoid X (RXR) và liên kết với trình tự DNA đặc trng
trong vùng điều hòa của các gen cần thiết cho sự tạo thành peroxisome. Gen
CYP4A1 đợc điều hòa theo cơ chế này. Các peroxisome có tác dụng ôxy hóa
các axít béo và enzym này đợc coi là hydroxylase axít béo.

Các thành viên trong họ protein CYP1 đợc cảm ứng bởi các
hydrocarbon có vòng thơm. Sự hoạt hóa này liên quan đến một thụ thể đặc
hiệu đợc gọi là thụ thể hydrocarbon thơm (aryl hydrocarbon receptor).
Protein thụ thể này liên kết với các hydrocarbon thơm nhng nó không di
chuyển vào nhân để hoạt hóa quá trình phiên mã của gen nếu thiếu một
protein vận chuyển ARNT (Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator).
Cả hai protein này liên kết với nhau và tạo liên kết với phân tử DNA để hoạt
hóa quá trình phiên mã.
Một số hóa chất khác cũng cảm ứng P450. Ethanol cảm ứng các
enzym CYP2E. Phenobarbital cảm ứng các enzym CYP2B ở chuột lên 40-50
lần thông qua một thụ thể gọi là CAR. CAR cũng tạo dimer với RXR nh thụ
thể PPAR. Phức hệ này liên kết với trình tự phản ứng phenolbarbital trên phân
tử DNA để hoạt hóa các gen. Đặc điểm chung của quá trình cảm ứng các
enzym P450 này chứng tỏ chức năng của P450 trong việc giải độc cơ thể trớc
các hóa chất ngoại lai.
Chức năng của các nhóm cytochrome P450 ở ngời và các bệnh liên quan
khuyết gen
Lớp protein CYP1 của P450 có thể hydroxyl hóa estrogen (CYP1A2
và 1B1) và oxi hóa uroporphyrinogen thành uroporphyrin (CYP1A2) dới tác
dụng của nhân Hem, nhng chúng có thể tơng tác với một số cơ chất nội sinh
cha xác định. Các enzym này đợc cảm ứng bởi một số hydrocarbon đa vòng
có thể có trong khói thuốc lá hoặc thực phẩm cháy. Các enzym này tơng đối
đợc quan tâm nghiên cứu vì chúng có thể có chức năng hoạt hóa các chất
sinh ung th. Nồng độ cao CYP1A2 có thể liên quan đến bệnh ung th trực
tràng. Vì CYP1A2 đợc cảm ứng bởi khói thuốc lá nên có thể có mối liên
quan giữa khói thuốc là và bệnh ung th trực tràng.
Gen Cyp1B1 đã đợc phát hiện là liên quan đến bệnh tăng nhãn áp
bẩm sinh (Stoilov et al., 1997; Benjjani et al., 1998; Stoilov et al., 1998;
Plasilova et al., 1999). Cơ chất thông thờng của enzym này hiện cha xác

20


định nhng ngời ta cho rằng loại P450 này có thể đóng vai trò nhất định
trong việc loại bỏ các phân tử truyền tin. Khi thiếu hụt gen Cyp1B1, cơ thể sẽ
bị duy trì nồng độ cao các phân tử tín hiệu để dẫn đến bệnh tăng nhãn áp.
Phân tử tín hiệu có thể có bản chất là steroid.
Hai nhóm P450 này thuộc lớp lớn nhất của protein P450. Khoảng 1
phần 3 các protein P450 ở ngời là thuộc về lớp này. Nhiều protein này có khả
năng hydroxyl hóa steroid, một số lại hoạt động phụ thuộc giới tính do tơng
tác với một số hormone liên quan giới tính. Một số enzym khác thì tham gia
quá trình trao đổi dợc phẩm nên có thể có chức năng bảo vệ cơ thể khỏi các
chất độc từ thức ăn. Các loài thực vật thờng sản xuất các độc tố để tự bảo vệ.
Do đó, khi chúng ta tiêu hóa thức ăn thì cần một hệ thống giải độc đợc mã
hóa trong DNA. Đây là giả thuyết về cuộc đấu tranh giữa thực vật và động vật
ở mức độ hóa học.
Gen CYP2B đợc cảm ứng bởi các thuốc an thần ở chuột. Đây là
protein P450 đầu tiên đợc tinh sạch từ động vật có vú nhng chức năng của
nó vẫn cha đợc xác định.
Protein CYP2C8 có chức năng xúc tác quá trình 6--hydroxyl hóa
taxol. Đây là một loại thuốc đang đợc sử dụng để chống ung th.
Protein CYP2C19 tham gia trao đổi omerprazole, một loại dợc phẩm
thờng dùng để chữa các vết loét. Tính đa hình của gen này gây ra triệu chứng
kém chuyển hóa thuốc với tần số cao ở ngời châu á (23%) so với ngời
Caucasians (3-5%)
Tính đa hình của các gen P450 liên quan đến khả năng chuyển hóa dợc
phẩm
Các điểm nucleotide đa hình quần thể ngời chiếm khoảng 1%
genom. Các điểm khác biệt này có thể dẫn đến các phản ứng khác nhau đối
với thuốc và gen mã hóa cytochrome P450 là yếu tố quan trọng trong hệ

genom ngời. Tính đa hình của gen CYP2C19 làm thay đổi khả năng chuyển
hóa mephenytoin của enzym. ở ngời Caucasians, tính đa hình của các kiểu
hình kém chuyển hoá thuốc chỉ chiếm khoảng 3% trong khi ngời châu á
chiếm tới 23%.
CYP2D6 là protein P450 đợc nghiên cứu kỹ nhất về đa hình trao đổi
thuốc. Enyme này tham gia vào quá trình oxyhóa hơn 70 loại dợc phẩm khác
21