Điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng liệu pháp tế bào gốc trên chuột

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM LÊ BỬU TRÚC

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH TIM
THIẾU MÁU CỤC BỘ BẰNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC
TRÊN CHUỘT
Chuyên ngành: Sinh lí học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

 
Tp. Hồ Chí Minh – 2015


Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
(ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM)
Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TP. HCM

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. PHẠM THÀNH HỔ

Phản biện 1: PGS.TS. Trương Quang Bình
Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Văn Thuận
Phản biện 3: PGS.TS. Lê Văn Đông
Phản biện độc lập 1: TS.BS. Hoàng Văn Sỹ
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Lê Xuân Trường

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM
Vào lúc ………giờ…….. ngày……tháng…….năm…….

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
-   Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
-   Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên


 

 

 


1.   Tính cần thiết của đề tài
Từ thuở ban sơ đến nay, loài người đã tiến hành cuộc chiến không ngừng
nghỉ chống lại các bệnh tật để kéo dài tuổi thọ của mình. Mặc dù sự bùng nổ
của hàng loạt công nghệ hiện đại làm cho đời sống văn minh nhân loại thay
đổi hằng ngày, nhưng con người vẫn đang phải đối mặt với một thách thức
then chốt lớn là suy giảm chất lượng sức khỏe và bệnh tật đe dọa mạng sống.
Trong các bệnh nguy hiểm gây chết người, bệnh tim mạch hiện được xếp ở
vị trí hàng đầu, cao hơn cả bệnh ung thư và AIDS. Theo Tổ chức Y tế Thế
giới, mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người trên hành tinh chết vì bệnh tim
mạch, con số này được dự đoán sẽ tăng lên 25 triệu vào năm 2020. Tại Việt
Nam, theo thống kê của Viện Tim mạch Việt Nam, hàng năm có đến hàng
triệu người bị bệnh mạch vành và khoảng 10% trong số bệnh nhân này tử
vong do nhồi máu cơ tim.
Bệnh tim mạch, đặc biệt là bệnh tim thiếu máu cục bộ là một loại bệnh
tim thường gặp nhất (chiếm tỉ lệ 42,3%). Nguyên nhân chính do động mạch

vành xơ vữa làm giảm lưu lượng máu đến nuôi cơ tim, về lâu dài dẫn đến
suy tim. Do lượng máu giảm nên tế bào bị thiếu oxy và dinh dưỡng, nếu tình
trạng kéo dài một phần tế bào sẽ bị chết. Các biện pháp điều trị thường quy
đã được sử dụng như điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch
vành qua da hay mổ bắc cầu nối động mạch vành. Tuy nhiên, cho đến nay, y
học vẫn chưa có biện pháp giúp hồi phục phần tế bào chết và đây là vấn đề
mà các nhà y học tái tạo hiện đang rất quan tâm.
Phương pháp trị liệu cấy ghép tế bào gốc trên các bệnh nhân bệnh tim
thiếu máu cục bộ nhằm cải thiện sức khoẻ đang được nhiều quốc gia trên thế
giới như Mỹ, Pháp, Áo, Đức, Hàn Quốc, Trung Quốc… tiến hành nghiên
cứu. Những kết quả ban đầu cho thấy nhiều triển vọng của phương pháp này
trong chữa bệnh tim do thiếu máu cục bộ. Lần đầu tiên ở Việt Nam, trường
Đại học Y Hà Nội phối hợp cùng Viện Tim mạch Quốc gia Việt Nam đã tiến


 

1
 


hành nghiên cứu và triển khai ứng dụng điều trị cấy ghép tế bào gốc để điều
trị cho các bệnh nhân suy tim sau nhồi máu.
Để việc điều trị bằng tế bào gốc được tiến hành có hệ thống và căn cơ,
các nghiên cứu cần phải tiến hành từ bước cơ bản trên mô hình chuột. Do đó,
đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng
liệu pháp tế bào gốc trên chuột” được đặt ra.
2.   Mục đích nghiên cứu
Thử nghiệm ghép tế bào gốc trên mô hình chuột tổn thương cơ tim do
thiếu máu cục bộ nhằm bước đầu đánh giá độ an toàn và hiệu quả của liệu

pháp làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. 1. Bệnh tim thiếu máu cục bộ
Bệnh tim thiếu máu cục bộ là trạng thái bệnh lý tim không được cung
cấp đủ oxy và chất dinh dưỡng so với nhu cầu bình thường dẫn đến tổn
thương cơ tim làm giảm hoạt động co bóp của tim, loạn nhịp tim và có thể
dẫn đến tử vong.
1. 2. Mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu máu cục bộ
Để hiểu sâu về cơ chế sinh bệnh và phát triển những liệu pháp hiệu
quả trong chữa trị, các mô hình động vật thiếu máu tim cục bộ được nghiên
cứu. Phần lớn mô hình thiếu máu tim cục bộ có thể được tạo dựa trên các
nguyên tắc: gây tắc hoàn toàn hoặc gây hẹp một phần động mạch vành bằng
các quy trình phẫu thuật hoặc bằng thuốc can thiệp, mô phỏng tiến trình bệnh
ở người bằng cách cảm ứng xơ vữa động mạch. Cho đến nay một số các
phương pháp tạo mô hình chuột bệnh tim mạch đã được nghiên cứu như sử
dụng hóa chất gây suy tim, đóng dòng chảy hoặc co khít mạch máu và thắt
mạch vành.
1.3. Nguồn tế bào gốc/ tế bào tiền thân được thử nghiệm biệt hoá thành
tế bào cơ tim

 

2
 


Hiện nay đã có một số nguồn tế bào gốc được thử nghiệm biệt hóa
thành tế bào cơ tim như tế bào gốc trung mô thu từ tủy xương, tế bào gốc
trung mô từ mô mỡ, tế bào gốc thu từ dịch màng ối, tế bào gốc phôi (ESCs)

hay tế bào cảm ứng đa tiềm năng (iPSCs). Tế bào gốc có nguồn gốc từ máu
cuống rốn (UCB-MSCs) với các đặc tính như trẻ, khỏe, dễ thu nhận, và có
khả năng điều biến miễn dịch được cho là nguồn tế bào tiềm năng để biệt hóa
thành tế bào cơ tim hướng đến ứng dụng điều trị các bệnh tim mạch.
1.4. Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào trong chữa trị bệnh tim thiếu
máu cục bộ trên thế giới
Đã hơn 20 năm kể từ ngày công trình đầu tiên về cấy ghép tế bào
điều trị tổn thương tim được công bố, đến nay liệu pháp tế bào trong điều trị
bệnh tim đã có những bước tiến đáng kể. Đầu tiên các công trình tập trung
vào việc sử dụng tế bào cơ xương và tế bào vệ tinh của nó vì khả năng thu
nhận từ nguồn tự thân cao, khả năng tăng sinh mạnh và khả năng chịu được
thiếu máu cục bộ tốt. Tuy nhiên, nguồn tế bào này sau đó được chứng minh
là không chuyển biệt hóa thành tế bào cơ tim và khả năng kết nối với tế bào
cơ tim trong cơ thể chủ sau khi cấy ghép rất thấp. Các nghiên cứu sau đó tiếp
tục tìm kiếm nguồn tế bào thích hợp và tế bào gốc trung mô tủy xương là một
trong số đó. ESCs có thể biệt hóa thành các loại tế bào trưởng thành và đã
được chứng minh là có khả năng tái tạo tế bào mô tim trên các mô hình động
vật. Tuy nhiên, vấn đề đạo đức sinh học, pháp lý và miễn dịch đã cản trở việc
sử dụng chúng trong các thử nghiệm trên người. ESCs được thay thế bằng
các tế bào gốc đa tiềm năng cảm ứng tái lập trình từ tế bào soma hay các tế
bào cơ tim được cảm ứng. Hiện nay, các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế
bào gốc trưởng thành, bao gồm cả tế bào đơn nhân từ tủy xương, các tế bào
gốc trung mô, tế bào gốc mô mỡ, và các tế bào gốc có nguồn gốc từ tim đang
được ưu tiên thử nghiệm và đánh giá lâm sàng.
Kết quả thử nghiệm lâm sàng gần đây ủng hộ quan điểm cho rằng
liệu pháp tế bào gốc là an toàn và có khả năng sửa chữa các cấu trúc tim cũng

 

3

 


như giúp phục hồi các chức năng tim. Các thử nghiệm lâm sàng sử dụng tế
bào gốc đồng loại cũng đang rất được quan tâm. Emerson C. Perin 2015 đã
công bố kết quả thử nghiệm ghép tế bào MSCs đồng loại ở 45 bệnh nhân suy
tim mãn do thiếu máu hay không do thiếu máu. Kết quả cho thấy không có
triệu chứng đáp ứng miễn dịch lâm sàng xảy ra, cấu trúc và chức năng tim
được cải thiện sau 3 năm cấy ghép. Piotr Musialek 2015 ghép tế bào MSCs
đồng loại từ màng Wharton’s Jelly cho 10 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp
tính. Kết quả cho thấy các bệnh nhân này không có dấu hiệu thiếu máu tim
khi đo ECG, không có tình trạng tim bị suy, lượng Troponin giảm sau 24 giờ
ghép, không có sự kiện bất lợi khác, có xảy ra loạn nhịp tim nhưng không
đáng kể.
1.5. Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào trong chữa trị bệnh tim thiếu
máu cục bộ ở việt nam
Riêng ở Việt Nam, từ năm 2010 đến nay, Phòng thí nghiệm Tế bào
gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM đã và đang triển khai hướng
nghiên cứu về sử dụng liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh tim mạch. Năm
2008, đề tài cấp nhà nước về Ghép tế bào gốc tự thân điều trị suy tim do GS.
TS. Nguyễn Lân Việt chủ nhiệm đã sử dụng tế bào gốc tự thân tủy xương để
ghép cho 6 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp. Cho đến nay, đã có 40 bệnh nhân
thử nghiệm phương pháp này với tỉ lệ an toàn, không biến chứng đạt 100%.
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng Mus musculus Var. Albino sạch bệnh, giống đực, 12 tuần
tuổi được mua từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu dọc có can thiệp và nhóm chứng.
- Phương pháp tạo mô hình chuột thiếu máu tim cục bộ: chuột được gây mê,
đặt nội khí quản trước khi sử dụng chỉ Prolene 7-0 để thắt động mạch vành

trước trái ở vị trí 1/3 từ cuống tim nhằm gây tắc nghẽn mạch vành, dẫn đến
tình trạng thiếu máu tim cục bộ.

 

4
 


- Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người: Tế
bào đơn nhân được huyền phù trong 3 môi trường khảo sát:
(1)-MT1 (M199 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4% ECGF/heparin
và 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 5 ng/ml bFGF, 5 ng/ml VEGF, 5 ng/ml
hIGF); (2)-MT2 (MCDB131 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4%
ECGF/heparin và 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 5 ng/ml bFGF, 5 ng/ml
VEGF, 5 ng/ml hIGF); (3)-MT3 (EGM + SingleQuots: 12 µg/ml BBE, 10
ng/ml hEGF, 1 µg/ml hydrocortison và antibiotics, 5% FBS (Sigma) + 50
ng/ml VEGF, 50 ng/ml hIGF, 50 ng/ml hEGF)
với 2 phương pháp:
(1)-PP1 (Thay mới môi trường sau 72 giờ nuôi cấy tế bào)
(2)-PP2 (Chuyển dịch nổi tế bào sau 24 giờ nuôi cấy)
Tế bào tiền thân nội mô ứng viên được đánh giá dựa vào hình thái, sự bám
dính và tăng sinh trong thời gian khảo sát 7, 14, 21 và 28 ngày.
Bảng 2.1. Tóm tắt cách bố trí các nghiệm thức thí nghiệm
STT
1

Tên nghiệm thức
Nghiệm thức A

Cách bố trí thí nghiệm
MT1 + PP1

2

Nghiệm thức B

MT1 + PP2

3

Nghiệm thức C

MT2 + PP1

4

Nghiệm thức D

MT2 + PP2

5

Nghiệm thức E

MT3 + PP1

6

Nghiệm thức F

MT3 + PP2

- Phương pháp biệt hoá tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (hUCBMSCs) thành tế bào tiền thân cơ tim (CPs): hUBC-MSCs nuôi trong môi
trường DMEM bổ sung 15% FBS và 1% Penicillin/Streptomycin được dùng
làm mẫu đối chứng. Xử lí với 5-AZC: Các tế bào được cảm ứng trong môi
trường DMEM bổ sung 10% FBS; 1% Penicillin/Streptomycin; 10 µM 5azacytidine; 50 ng/ml activin A; 0,1mM acid ascorbic trong 24 giờ. Sau đó,
các tế bào được rửa qua PBS 2 lần và nuôi trong môi trường DMEM bổ sung
15% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin; bổ sung 50 ng/ml activin A; 0,1mM

 

5
 


acid ascorbic không có 5-AZC để tránh gây chết tế bào do phơi nhiễm với 5AZC trong một thời gian dài. Môi trường được thay mỗi 3 ngày cho đến khi
thí nghiệm kết thúc sau 36 ngày. Xử lí 5-AZC + HE: các tế bào được cảm
ứng tương tự như phương pháp biệt hóa bằng 5-AZC thông thường nhưng
lượng 5-AZC được giảm còn 5µM và môi trường biệt hóa được bổ sung thêm
36 µg/ml dịch chiết tim thai chuột E.18.5.
- Phương pháp ghép tế bào: chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm chuột bình
thường, nhóm chuột mô hình được tiêm giả dược, nhóm chuột mô hình được
ghép EPCs, nhóm chuột mô hình được ghép CPs, và nhóm chuột mô hình
được ghép EPCs + CPs. Chuột được gây mê, trợ thở, mở lồng ngực, thắt
LAD và tiến hành tiêm tế bào hay giả dược. Sử dụng thiết bị vi tiêm
Ugobasile, số lượng tế bào được tiêm là 106 tế bào/30µl/con. Thể tích tiêm
là 30µl/con được chia làm 5 lần tiêm xung quanh vị trí nhồi máu (sau khi thắt
mạch vành từ 3-5 phút có thể dễ dàng quan sát vùng tim thiếu máu bị tái đi
so với vùng tim xung quanh). Tốc độ tiêm tế bào là 8,55ml/h. Hiệu quả ghép

được đánh giá theo các tiêu chí như sự biến động huyết áp chuột, mức độ tổn
thương cơ tim qua lượng protein Troponin I trong máu, sự tồn tại, di cư và
biến đổi của các tế bào ghép ảnh hưởng đến mô tim được ghép.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu tạo mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu
máu cục bộ
3.1.1. Tỷ lệ sống
Ở lô đối chứng, chuột không được thực hiện bất cứ thao tác thí nghiệm nào
đều sống và hoạt động sinh lý bình thường. Tỉ lệ sống được ghi nhận 100%
(n=10). Trong tổng số chuột sống sót qua quá trình giải phẫu thắt LAD
(n=22), có 2 con chuột chết ngày N3 và N4, 3 con chuột yếu dần và chết ngày
N7. Tỷ lệ sống ngay sau thắt mạch vành: 17/22 (77%). Tỷ lệ sống sau khi
thắt mạch vành 6 tuần: 17/17 (100%).
3.1.2. Sự thay đổi trọng lượng

 

6
 


Trọng lượng tăng ở nhóm đối chứng và nhóm giả dược trong khi giảm theo
thời gian ở nhóm thí nghiệm (hình 3.1).
3.1.3. Sự thay đổi huyết áp
Huyết áp ổn định ở nhóm đối chứng và nhóm giả dược trong khi giảm theo
thời gian ở nhóm thí nghiệm (hình 3.2).

Hình 3. 2. Biểu đồ sự thay đổi
huyết áp chuột (p<0,05)

Hình 3.1. Biểu đồ sự thay đổi
trọng lượng chuột (p<0,05)

3.1.4. Kết quả nhuộm H&E
Hình 3.3. Hình tim sau khi thắt
mạch vành 42 ngày. PBS được tiêm
vào tâm thất trái để rửa máu (A) và
sau khi rửa máu (B).


 
Hình 3. 4. Mô tim chuột mô hình
được cắt lát theo chiều ngang tại vị
trí thắt. Thành tâm thất trong vùng
nhồi máu (bên phải và phía trên hình
ảnh) là mỏng hơn so với thành tâm
thất vùng đối diện (bên phải và bên
dưới hình ảnh).


 

3.1.5. Sự hình thành mô sẹo và collagen vùng nhồi máu
Mô sẹo và collagen được hình thành ở mô tim chuột mô hình (Hình 3.6).

 

7
 

Hình 3. 5. Hình ảnh nhuộm H&E
mẫu mô tim vùng thất trái. (A)
chuột đối chứng (10x); (B) chuột mô
hình 6 tuần sau khi thắt LAD (10x);
(C), (D), (E), (F). Chuột mô hình 1
tuần, 3 tuần, 6 tuần và 10 tuần, tương
ứng sau khi phẫu thuật (40x); Các đầu
mũi tên màu đen cho thấy các tế bào
viêm, đầu mũi tên màu xanh cho thấy
các nguyên bào sợi.
Hình 3. 6. Kết quả nhuộm
Trichrome mẫu lát cắt tim chuột.
(A)

(A) Tim chuột đối chứng; (B) Tim

(B)

chuột mô hình ngày N70; (C) Phần
mô tim khỏe mạnh (40X); (D) Phần
(C )

mô tim được xác định nhồi máu

(D)

(40X); (E) Thành tim chuột ngày
N21(10X); (F) Thành tim chuột
ngày N70. Collagen bắt màu xanh.

(E )

(F )

Hình 4. 10. Kết qu ả nhu ộm Trichrome m ẫ u lát c ắ t tim chu ột. (A) Tim chuột ĐC; (B) Tim
chuột mô hình ngày N70; (C) Phần mô tim khỏe mạnh( 40X); (D) Phần mô tim được xác
định nhồi máu (40X); (E) Thành tim chuột ngày N21(10X); (F) Thành tim chuột ngày N70.
Tế bào chất được nhuộm đỏ, nhân được nhuộm xanh đen, Collagen được nhuộm xanh nhạt.

3.1.6. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang
Hình 3. 7. So sánh thành
tim chuột đối chứng (A)
và chuột mô hình sau 42
ngày thắt mạch vành (B).
Thành tim chuột mô hình ở vùng thiếu máu do mạch vành bị thắt mỏng hơn
rất nhiều so với thành tim chuột đối chứng (82,3%).

 

8
 


Hình 3. 8. Mô tim chuột được
nhuộm hóa mô miễn dịch
huỳnh quang.

Số tế bào chết khi xét trên tổng diện tích thành tim ở chuột mô hình là rất lớn
so với chuột đối chứng (37,86% so với 0,86%).
BÀN LUẬN

Chuột tắc nghẽn LAD đã được chứng minh là mô hình lý tưởng cho
nghiên cứu tình trạng thiếu máu cơ tim cục bộ. Theo một số nghiên cứu, việc
thắt LAD ở chuột thường hình thành vùng nhồi máu nhỏ (21% tâm thất) dẫn
đến sự bất thường trong huyết động học. Trong nghiên cứu này, sự thay đổi
huyết động ở các con vật mô hình biểu hiện khá rõ. Việc giảm huyết áp trung
bình MAP ở các con vật thuộc lô chuột bị thắt LAD có thể giải thích do mạch
vành bị thắt hẹp gây thiếu máu cấp cho tim dẫn đến thiếu oxy làm xuất hiện
các sản phẩm chuyển hóa yếm khí (acid) và các chất khác (histamine,
kinins…) ở nồng độ cao đầu độc tế bào tim, gây chết tế bào ở vùng thiếu
máu. Sự kết hợp đồng thời giữa suy giảm khả năng bơm máu và suy yếu cơ
tim sẽ dẫn đến sụt giảm huyết áp ở giai đoạn tim suy. Kết quả đánh giá cấu
trúc mô cho thấy: dù không có biểu hiện sinh lý rõ rệt nhưng những con chuột
sống sót đến ngày 42 đều có thành tim rất mỏng. Hình ảnh nhuộm H&E cho
thấy tình trạng viêm cơ tim bắt đầu biểu hiện vào ngày N7 và tăng cao ở ngày
N21. Sự xơ hoá được ghi nhận từ kết quả nhuộm trichrome mẫu tim chuột
mô hình của nghiên cứu này tương tự như các nghiên cứu của Shigeto Kanno
và cs. Hiện tượng cơ tim bị hoại tử cũng được quan sát thấy qua kết quả
nhuộm hoá mô miễn dịch huỳnh quang. Từ các kết quả ghi nhận được chúng
tôi đã tạo được mô hình chuột nhắt trắng tổn thương cơ tim bằng phương
pháp thắt LAD phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

 

9
 


3.2. Kết quả nghiên cứu thiết lập quy trình thu nhận tế bào tiền thân nội
mô máu cuống rốn người
3.2.1. Khảo sát nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô ứng viên

Nhằm tìm được môi trường và phương pháp thu nhận, nuôi cấy EPCs
thích hợp, thí nghiệm được bố trí thành 6 nghiệm thức như Bảng 2.1. Nghiệm
thức F cho kết quả tốt nhất so với các nghiệm thức còn lại. (hình 3.9, 3.10).

Hình 3. 9. Biểu đồ trung bình
số tế bào bám dính qua thời
gian khảo sát ở 6 nghiệm thức

Hình 3. 10. Biểu đồ so
sánh trung bình tế bào
bám dính ở 6 nghiệm thức

3.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên
Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên trong nghiệm thức F được
sử dụng để nuôi cấy tăng sinh, phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Tốc độ
tăng sinh của tế bào ứng viên trong nuôi cấy thứ cấp là tương đối giống nhau
giữa các lần cấy chuyền và nhanh hơn so với quá trình nuôi cấy sơ cấp (sau
6 – 12 giờ cấy chuyền, tế bào đã bám lại), đồng thời, tốc độ tăng trưởng của
tế bào cũng nhanh hơn (có thể cấy chuyền lần tiếp theo sau 5 – 7 ngày).
3.2.3. Xác định đặc tính tế bào tiền thân nội mô

 

10
 


Theo kết quả nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 3 lần
cấy chuyền biểu hiện âm tính với 2 marker CD45 (3,09%) và CD73 (6,47%),
âm tính hoàn toàn với 2 marker CD14 (1,06%) và CD90 (0,58%), đồng thời

biểu hiện dương tính với 3 marker CD34 (83,13%), CD44 (87,03%) và
CD133 (90,01%). Kết quả phân tích tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 5
lần cấy chuyền (bảng 3.4) cho thấy rằng, tế bào vẫn âm tính với 4 marker
CD14 (2,20%), CD45 (0,25%), CD73 (2,17%) và CD90 (3,00%) và đồng
thời tăng biểu hiện dương tính mạnh với 3 marker CD34 (97,66%), CD44
(97,89%) và CD133 (99,90%).
BÀN LUẬN
Ở nghiệm thức F, mặc dù số tế bào bám dính là không nhiều ở thời
điểm 7 ngày nhưng qua 3 thời điểm khảo sát, số lượng tế bào đã tăng lên
đáng kể. Điều này cho thấy môi trường nuôi cấy ở nghiệm thức F đã giúp tế
bào cảm ứng và thích nghi để tăng sinh tốt. Đồng thời, phương pháp chuyển
dịch nổi tế bào sau 24 giờ nuôi cấy là phù hợp với thời điểm bám dính của tế
bào tiền thân nội mô nên số tế bào bám dính ban đầu có thể được xem là các
tế bào nội mô ứng viên. Thêm vào đó, kết quả về hình ảnh cũng ủng hộ cho
quan điểm này khi các tế bào ở nghiệm thức này có dạng hình viên sỏi nhỏ,
khá đồng nhất và có biểu hiện của sự tăng sinh của các tế bào khi quan sát
dưới kính hiển vi. Kết quả phân tích dòng chảy tế bào cho thấy sau 5 lần cấy
chuyền, sự biểu hiện các marker dương tính ở dòng tế bào này rất mạnh (cả
3 marker CD34, CD44 và CD133 đều trên 95%), đồng thời, 4 marker âm tính
biểu hiện yếu (dưới 5%) và đặc biệt là CD45 (0,25%). Điều này chứng tỏ
tính đồng nhất trong quần thể tế bào tiền thân nội mô là rất cao vì sau các lần
cấy chuyền, quần thể các tế bào tạp nhiễm đã bị loại bỏ, đồng thời quần thể
tế bào tiền thân nội mô tăng sinh và biểu hiện mạnh các marker của chúng.
3.3. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành
các tế bào tiền thân cơ tim
3.3.1. Đặc tính của các tế bào hUCB-MSCs

 

11

 


Các tế bào hUCB-MSCs từ máu cuống rốn được thu nhận thành công
bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng, chọn lọc qua kiểu hình, sự biểu hiện
các marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô và khả năng biệt hóa thành các
tế bào mỡ (hình 3.11, hình 3.12, hình 3.13).


 

Hình 3. 11. Quần thể tế bào gốc trung

Hình 3.13. Tế bào đối chứng

mô ứng viên sau 21 ngày nuôi cấy (a)

(a) và tế bào tạo mỡ sau 21

và sau 3 lần cấy chuyền (b)

ngày cảm ứng (b)

Hình 3. 12. Kết quả phân tích

Hình 3.14. Sự thay đổi kiểu hình

sự biểu hiện một số marker

của hUCB-MSCs khi được cảm

của TBG trung mô ứng viên

ứng biệt hóa thành tế bào cơ tim

12
 


3.3.2. Sự thay đổi kiểu hình của tế bào được cảm ứng trong quá trình
biệt hóa
Nhằm đánh giá khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim của hUCBMSCs bằng các môi trường cảm ứng khác nhau, sự thay đổi kiểu hình của
các tế bào này được ghi nhận lại ở các thời điểm cảm ứng biệt hóa khác nhau
vào các ngày 0, 9, 18, 27 và 36 sau khi biệt hóa (hình 3.14).
3.3.3. Sự thay đổi biểu hiện gene ở các tế bào được biệt hóa
Để khảo sát sự biểu hiện các gene chuyên biệt cơ tim của các tế bào
được cảm ứng, chúng tôi thu nhận RNA tổng của các tế bào được cảm ứng
và tế bào không cảm ứng làm đối chứng ở các thời điểm khác nhau. Sau đó
chúng tôi tiến hành phân tích sự biểu gene bằng kỹ thuật RT-PCR với các
cặp mồi đặc hiệu cho các gene cần khảo sát.

Hình 3.15. Sự biểu hiện các gene đặc trưng cho tế bào cơ tim của hUCBMSCs được cảm ứng biệt hóa. Trong suốt quá trình biệt hóa từ ngày 0 đến
ngày 36, phân tích RT-PCR cho thấy sự điều hòa biểu hiện các gene đặc
trưng cho tế bào tiền thân cơ tim tăng ở các tế bào được cảm ứng. Gapdh
được sử dụng làm gene đối chứng nội.
3.3.4. Sự biểu hiện protein α-actin
Nhằm đánh giá hiệu quả biệt hóa ở mức protein, các tế bào nhóm đối
chứng, tế bào nhóm 5-AZC và tế bào nhóm 5-AZC+HE được nhuộm với

 

13
 


kháng thể kháng α-actin bằng kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch huỳnh quang
(Immunocytochemistry_ICC) ở các ngày 0, 9, 18, 27 và 36 sau khi cảm ứng
biệt hóa (hình 3.16).
3.3.5. Khả năng co đập của các tế bào được cảm ứng biệt hóa
Tuy các tế bào được biệt hóa biểu hiện các gen và protein chuyên
biệt cho tế bào cơ tim nhưng chúng không co đập một cách ngẫu nhiên.
Hình 3.16. Sự biểu hiện αactin theo thời gian cảm ứng
biệt hóa. Kết quả nhuộm miễn
dịch huỳnh quang các tế bào
cảm ứng biểu hiện marker cơ
tim đặc trưng α-actin, vào ngày
18 ở nhóm 5-AZC+HE và vào
ngày 27 ở nhóm 5-AZC (màu
đỏ). Nhân được nhuộm màu với
Hoechst 33342 (màu xanh).
Nhóm đối chứng không biểu
hiện α-actin. Thước đo 50 µm.
BÀN LUẬN
Kết quả cho thấy UCB-MSCs có thể được biệt hóa thành các tế bào
giống cơ tim bằng cách chỉ bổ sung 5-AZC hay kết hợp 5-AZC với dịch chiết
tim thai chuột (HE). Tuy nhiên, sự biệt hóa tế bào xảy ra sớm hơn ở nhóm 5AZC+HE. Cụ thể, sau khi cảm ứng chỉ bởi 5-AZC, các tế bào bắt đầu biểu
hiện gen và protein đặc hiệu cho cơ tim vào ngày 27 so với ngày 18 ở nhóm
5-AZC + HE. Như đã biết, các tế bào gốc trưởng thành được duy trì ở trạng
thái không hoạt động. Chúng tham gia vào quá trình tự làm mới và chỉ biệt
hóa khi được cảm ứng bởi các tác nhân thích hợp. Việc giảm quá trình acetyl

hóa histone dẫn đến các hiện tượng methyl hóa và nén chặt chromatin có thể

 
14
 


làm im lặng sự biểu hiện gen trong tế bào gốc. 5-AZC là một sản phẩm dược
phẩm tổng hợp có khả năng ức chế sự methyl hóa DNA. Vì vậy, 5-AZC đã
được sử dụng để cảm ứng biệt hóa tế bào gốc thành tế bào cơ tim. Nghiên
cứu của chúng tôi xác nhận rằng UCB-MSCs có thể được cảm ứng biệt hóa
thành tế bào cơ tim bằng 5-AZC. Việc quá trình biệt hoá diễn ra sớm hơn ở
nhóm có bổ sung dịch chiết tim thai chuột vào môi trường biệt hóa do một
số nguyên nhân. Trước hết, NO (nitric oxide) có ở tim của thai nhi và động
vật sơ sinh. Nó đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành các tế bào
cơ tim in vivo. NO thúc đẩy sự phát triển cơ tim ở trẻ sơ sinh bằng cách ức
chế sự biểu hiện của TIMP-3 thông qua S-nitrosylation của AP-1. Tín hiệu
NO qua trung gian cGMP cũng đóng một vai trò thiết yếu trong sự biệt hóa
của các tế bào ES thành tế bào cơ tim. Thứ hai, dịch chiết tim thai chuột chứa
RA (acid retinoic). RA được biết đến như là yếu tố giúp thúc đẩy sự biệt hóa
của các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi và tăng cường sự phát
triển của các tế bào cơ tim tâm thất. Việc thiếu hụt RA làm giảm tín hiệu Fgf
cảm ứng sự biệt hóa tế bào thành tế bào cơ tim. Trong một đường truyền tín
hiệu khác, RA cảm ứng EPO gan kích hoạt tín hiệu IGF2 dẫn đến sự tăng
sinh của các tế bào cơ tim. Cuối cùng, một số yếu tố phiên mã đã được chứng
minh có khả làm tăng hiệu quả cảm ứng biệt hóa tế bào cơ tim của GATA4,
TBX5, MEF2C như MYOCD, SRF, Mesp1 và SMARCD3.
3.4. Thử nghiệm cấy ghép tế bào lên mô hình chuột tổn thương cơ tim
do thiếu máu cục bộ
3.4.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tiền thân cơ tim

Các tế bào gốc trung mô được biệt hóa trong môi trường có chứa 5AZC theo phương pháp biệt hóa đã đề cập ở chương 2. Các tế bào cảm ứng
sau biệt hóa đều biểu hiện 2 marker đặc hiệu cho tế bào cơ tim như α-actin
và Troponin T (Hình 3.17).


 

15
 


Hình 3. 17. Kết quả nhuộm hóa
tế bào miễn dịch huỳnh quang
các tế bào được cảm ứng biệt
hóa
3.4.2. Tỉ lệ sống
Sau 14 ngày theo dõi, tất cả chuột ở các nhóm đều còn sống. Tỉ lệ
sống được ghi nhận 100%. Tuy nhiên, các con chuột ở nhóm tiêm PBS có
biểu hiện xù lông, gập người lại và suy yếu dần theo thời gian. Ngày 19 sau
ghép, 2 con ở nhóm PBS chết. Không có trường hợp chuột chết ở các nhóm
được ghép tế bào vào ngày 19. Các con chuột này biểu hiện linh hoạt như
chuột nhóm bình thường và không bị xù lông.
3.4.3. Huyết áp trung bình (MAP)
Bảng 3.5. Huyết áp trung bình (MAP) của các nhóm chuột
Nhóm
Bình thường
Tiêm PBS
Ghép EPCs
Ghép CPCs
Ghép EPCs + CPCs

N0
111,0667
111,0333
111,1333
111
111,0333

N7
110,9667
105,5333
109,2667
110,1
109,2333

N14
111,13333
103,5
108,53333
109,06667
109,03333

3.4.4. Kết quả phân tích lượng Troponin I bằng phương pháp Elisa
Lượng Troponin I ở các nhóm chuột ghép tế bào thấp hơn và không tăng
nhiều như nhóm chuột tiêm giả dược qua các thời điểm khảo sát (bảng 3.6
và bảng 3.7).


 

Nhóm

Tuần 0

Tuần 1

Tuần 2

Bình thường

0,0050

0,0057

0,0057

Tiêm PBS

0,0060

0,0077

0,0103

Ghép EPCs

0,0047

0,0057

0,0067

Ghép CPs

0,0053

0,0057

0,0063

Ghép EPCs + CPs

0,005

0,0057

0,006

16
 

Bảng 3.6. Kết quả
phân tích lượng
Troponin I trung
bình ở các lô
chuột


Bảng 3.7. Hiệu số lượng Troponin I trung bình ở các lô chuột
Nhóm

Bình thường
Tiêm PBS
Ghép EPCs
Ghép CPs
Ghép EPCs + CPs

1 tuần sau thời điểm ghép
(tuần 1 – tuần 0)
0,0007
0,0017
0,001
0,0004
0,0007

2 tuần sau thời điểm ghép
(tuần 2 – tuần 0)
0,0007
0,150043
0,002
0,001
0,001

3.4.4. Kết quả phân tích mô học
Kết quả nhuộm H&E và kết quả nhuộm Trichrome
Kết quả nhuộm H&E và Trichrome cho thấy mô cơ tim chuột bình thường
không bị viêm, không tổn thương đứt gãy và không có vùng nào bị xơ hóa
(Hình 3.19) trong khi mô cơ tim chuột tiêm PBS bị tổn thương đứt gãy, thành
tim mỏng hơn so với chuột bình thường và hình thành vùng xơ hóa rộng
(Hình 3.20). Sau 14 ngày ghép, mô tim chuột được ghép tế bào không có
hiện tượng bị đứt gãy, mức độ xơ hoá thấp hơn so với mô tim chuột tiêm

PBS. Phần mềm ImageJ được sử dụng để tính % xơ hoá. Kết quả cho thấy
mức độ xơ hoá mô cơ tim ở 3 nhóm chuột EPCs, CPCs và EPCs+CPCs được
ghép tế bào thấp hơn nhiều so với mô cơ tim nhóm giả dược lần lượt là
12,8%, 0%, và 5,1% so với 61,1% (Hình 3.21; 3.22; 3.23; 3.24).


 
Hình 3.18. Nhóm bình thường


 

Hình 3.19. Nhóm tiêm PBS

17
 


Hình 3.21. Nhóm ghép CPs

Hình 3.20. Nhóm ghép EPCs

Hình 3.22. Nhóm ghép EPCs+CPs
Hình 3.23. Độ xơ hoá mô tim
Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch huỳnh quang (IHC)
Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang cho thấy các tế bào cơ tim
chuột bình thường, chuột tiêm PBS không bắt các kháng thể cơ tim đặc hiệu
nhằm để nhận diện các tế bào người khi ghép lên mô hình chuột như human
Troponin T hay human alpha-actin (Hình 3.25; 3.26). Kết quả nhuộm mô học
cho thấy các tế bào EPCs được ghép có xu hướng tập trung lại ở vết thắt tạo

thành một vùng nhiều tế bào có thể quan sát thấy qua hình 3.27. Các tế bào
CPs sau khi tiêm tồn tại trong mô ghép và bắt màu với cả Troponin T (xanh
lá) và alpha-actinin (đỏ) khi chồng lớp có màu vàng (Hình 3.28; 3.29). Các
tế bào này không hình thành mô sẹo mà cùng với các tế bào cơ tim địa
phương ngăn ngừa các tổn thương và đứt gãy mô tim.

 

18
 


Hình 3.24. Nhóm bình thường

Hình 3.25. Nhóm tiêm PBS

Hình 3.26. Nhóm ghép EPCs

Hình 3.27. Nhóm ghép CPs

Hình 3.28. Nhóm ghép EPCs+CPs Hình 3.29. CPs không biểu hiện
gen sinh u trong in vitro và in vivo


 

19
 

BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá vai trò tiềm năng của
EPCs, CPs cho sửa chữa cơ tim. Một số kết quả chính của nghiên cứu là: sau
19 ngày tính từ thời điểm ghép tế bào, tỷ lệ chuột sống ở các nhóm được
ghép tế bào là 100%, tỷ lệ chuột sống ở nhóm giả dược là 80%; các con chuột
được ghép tế bào có biểu hiện bên ngoài bình thường nhưng các con chuột
nhóm giả dược có biểu hiện xù lông, gập người và suy yếu dần theo thời
gian; sau 14 ngày, 3 nhóm chuột EPCs, CPs và EPCs+CPs được ghép tế bào
lần lượt có mức độ giảm huyết áp thấp hơn so với chuột mô hình được tiêm
giả dược là 2,6 mmHg, 2,07 mmHg và 2,1 mmHg so với 7,6 mmHg; việc
ghép tế bào đã không dẫn đến việc tạo ra các u quái sau 14 ngày được ghép;
mức độ xơ hoá mô cơ tim ở 3 nhóm chuột EPCs, CPs và EPCs+CPs được
ghép tế bào thấp hơn nhiều so với mô cơ tim nhóm giả dược lần lượt là
12,8%, 0%, và 5,1% so với 61,1%; các tế bào CPs biểu hiện các marker đặc
trưng cho tế bào cơ tim người như human cTnT và human α-actin trong cơ
tim chuột được cấy ghép. Như đã đề cập bên trên, việc biến động huyết áp
dù nhỏ cũng cho thấy có sự ảnh hưởng nhất định lên hoạt động của tim. Do
đó, mức độ giảm huyết áp ở các nhóm được ghép tế bào thấp hơn so với
nhóm chuột mô hình được tiêm giả phần nào cho thấy tế bào được ghép đã
tham gia vào việc cải thiện chức năng tim thiếu máu cục bộ. Troponin I trong
máu của chuột bình thường rất ít và không biến động trong quá trình khảo
sát cho thấy được cơ tim của chuột bình thường khỏe mạnh và không bị tổn
thương. Trong quá trình khảo sát, lượng Troponin I trong máu của chuột
được ghép tế bào thấp hơn so với chuột tiêm PBS. Điều này cho thấy việc
ghép tế bào đã có tác động tích cực gíup ngăn ngừa các tổn thương cơ tim,
bảo vệ các tế bào cơ tim không bị chết nhiều hơn trong vùng tim thiếu máu
cục bộ do mạch vành bị tắc. Kết quả này tương tự như kết quả của Kanazawa
và cộng sự, 2015 khi ghép tế bào CDCs lên mô hình lợn nhồi máu cơ tim cấp
tính. Trong nghiên cứu của Kanazawa, sau 24 giờ cấy ghép, lượng Troponin
I ở nhóm động vật được ghép tế bào thấp hơn so với nhóm động vật được

tiêm giả dược cho thấy được CDCs có tác động ngăn ngừa sự huỷ hoại cơ
tim tiếp tục ở tim bị nhồi máu.
Kết quả lượng Troponin I thấp ở các nhóm chuột được ghép tế bào
so với nhóm tiêm giả dược phù hợp với kết quả nhuộm H&E và nhuộm
Trichrome. Kết quả thu nhận được cho thấy sau 14 ngày cấy ghép, mô tim

 

20
 


của chuột được ghép tế bào không bị mỏng đi do mất tế bào như ở mô tim
chuột nhóm PBS. Kết quả nhuộm Trichrome cũng không phát hiện thấy sự
hình thành sẹo ở mô tim nhóm ghép CPs, vùng sẹo rất nhỏ ở nhóm ghép
EPCs và nhóm ghép EPC + CPs trong khi một vùng sẹo lớn được hình thành
ở mô tim nhóm PBS. Kết quả này có thể do tác động của EPCs thông qua
con đường tín hiệu VEGF-PI3K/Akt-eNOS làm tăng mật độ mao mạch và
giảm sự hình thành xơ hay EPCs giúp giảm sự hình thành mạch bạch huyết
trong vùng nhồi máu dẫn đến giảm viêm, giảm tổn thương tế bào cơ tim và
EPCs được ghép có thể góp phần huy động EPCs nội sinh. Thêm vào đó, vai
trò của CPs cũng rất quan trọng trong việc phục hồi cấu trúc và chức năng
tim bị tổn thương do thiếu máu. Chúng có thể tiết ra các yếu tố tạo mạch như
VEGF, HGF, FGF và yếu tố huy động tế bào gốc nội sinh như SDF-1, SCF
[10], hay tiết các phân tử giảm sự hoạt hoá bạch cầu trung tính như JAM-A
(Junction Adhension Molecule-A), tiết Exosomes ức chế quá trình apoptosis,
thúc đẩy sự tạo mới các tế bào cơ tim, tăng cường sự hình thành mạch. Các
tế bào tiền thân cơ tim cũng có khả năng biệt hoá thành các tế bào cơ tim và
hình thành mối nối điện giữa tế bào ghép với tế bào địa phương tương tự như
nghiên cứu ghép tế bào cơ tim được biệt hoá từ tế bào gốc phôi người trên

mô hình khỉ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng các tế bào
CPs cấy ghép tồn tại trong mô ghép và các tế bào này đã không bị biến đổi
thành các tế bào xơ mà vẫn giữ chức năng của tế bào tim giúp tim được ghép
tế bào không bị suy giảm chức năng trầm trọng như ở nhóm PBS. Kết quả
này tương tự như các kết quả trước đây về khả năng tích hợp với mô tim vật
chủ của các tế bào cả in vitro và in vivo. Tác dụng tích cực của EPCs, CPs
lên mô hình chuột tương tự như tác dụng tích cực của việc ghép MMC
(menstrual blood-derived MSC), SVPs và CSCs sau 2 tuần thắt LAD giúp
cải thiện chức năng tim bị suy yếu trước đó; hay tương tự như kết quả của
việc ghép piPS (porcine induced progenitor cells ) lên mô hình lợn nhồi máu.
Tế bào CPs cấy ghép là những tế bào tiền thân cơ tim được biệt hoá từ tế bào
gốc trung mô máu cuống rốn người. Trong nghiên cứu trước đây của
Malliaras K. và cộng sự cho thấy các tế bào tiền thân cơ tim không biểu hiện
phân tử MHC II và phân tử B7, tương tự như profile miễn dịch thấp của
MSCs. Việc tế bào CPs được tìm thấy trong cơ tim chuột cấy ghép và chúng

 

21
 


biểu hiện các marker đặc trưng cho tế bào cơ tim cho thấy các tế bào CPs này
đã làm cách nào đó để vượt qua hàng rào miễn dịch, không bị thải loại mà
còn có khả năng biệt hoá thành tế bào cơ tim cùng hoạt động với tế bào cơ
tim địa phương. Đây thật sự là một kết quả thú vị và kết quả này cần được
nghiên cứu thêm về cơ chế cụ thể. Trong một số nghiên cứu khác khi ghép
tế bào ESCs không biệt hóa vào tim chuột nhồi máu cơ tim, các tế bào này
có xu hướng tạo các u quái chỉ sau 7 ngày được ghép. Trong nghiên cứu này
việc ghép tế bào CPs từ UCB-MSCs đã không tạo thành u quái trong mô

được ghép. Điều này có thể do sự biểu hiện gen của chúng đã bị biến đổi
trong quá trình biệt hóa theo hướng không sinh ung. Kết quả này tương tự
như kết quả trước đó của Huber và cộng sự khi ghép hESC-CMs vào mô tim
chuột nhồi máu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Huber việc ghép hESCCM vào tim bị tổn thương sau nhồi máu đã không dẫn đến việc tạo ra các u
quái, chứ không phải các tế bào ghép sống sót, tăng sinh, và tích hợp với mô
tim ghép trong khi việc ghép CPs cho thấy các tế bào này tồn tại và có xu
hướng tích hợp với các tế bào ở mô tim ghép. Điều này có thể do nguồn gốc
tế bào được biệt hóa khác nhau, thời gian theo dõi đánh giá khác nhau và quá
trình biệt hóa tế bào khác nhau. Qua đó có thể thấy các tế bào tiền thân cơ
tim sau khi được ghép không những tác động tích cực đến hiệu quả điều trị
thông qua việc tồn tại, cùng tích hợp với các tế bào cơ tim nội tại để hoạt
động mà chúng còn có thể thông qua các cơ chế khác như tiết ra các yếu tố
cận tiết, huy động các tế bào gốc nội tại hoạt động. Như vậy, việc ghép tế
bào EPCs, CPs cho thấy là một phương pháp tốt trong việc giảm khả năng
tạo sẹo và giúp cải thiện mô tim bị nhồi máu.
Hạn chế của đề tài nghiên cứu
Do điều kiện hiện tại của Phòng thí nghiệm chưa có thiết bị chuyên
dụng để đo điện tâm đồ, siêu âm tim chuột nên các kết quả đánh giá về mặt
chức năng tim bị hạn chế. Giới hạn về mặt thời gian khi thực hiện đề tài làm
cho việc đánh giá sau ghép tế bào chỉ được trong khoảng 14 ngày, thời gian
theo dõi này nên được kéo dài hơn để có thể quan sát rõ hơn tác động của tế
bào cấy ghép. Ngoài ra, các nghiên cứu sâu hơn về vai trò cũng như số phận
các tế bào sau cấy ghép do điều kiện khách quan nên cũng chưa được thực
hiện như khả năng hình thành mạch của EPCs, khả năng cận tiết của CPs,

 

22
 

hay khả năng huy động các tế bào gốc nội sinh tham gia vào quá sửa chữa
tim bị tổn thương. Tuy vẫn còn một số mặt hạn chế nhất định, nhưng nghiên
cứu này đã bước đầu hình thành một nền tảng khoa học cho các nghiên cứu
tiếp theo trong việc điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng liệu pháp tế bào.
KẾT LUẬN
1. Tạo được 60 con chuột mô hình thiếu máu tim cục bộ phục vụ cho nghiên
cứu bằng phương pháp vi phẫu thuật sử dụng chỉ Prolene 7-0 thắt động mạch
vành trước trái ở vị trí 1/3 từ cuống tim gây tắc nghẽn mạch vành, dẫn đến
tình trạng thiếu máu tim cục bộ. Tỷ lệ chuột sống sau khi vi phẫu thuật thắt
mạch vành trước trái là 77%.
2. Sau 19 ngày tính từ thời điểm ghép tế bào, tỷ lệ chuột sống ở các nhóm
được ghép tế bào là 100%, tỷ lệ chuột sống ở nhóm giả dược là 80%. Các
con chuột được ghép tế bào có biểu hiện bên ngoài bình thường nhưng các
con chuột nhóm giả dược có biểu hiện xù lông, gập người và suy yếu dần
theo thời gian.
3. Thu nhận được dòng EPCs bằng phương pháp chuyển dịch nổi tế bào sau
24 giờ nuôi cấy kết hợp với việc sử dụng môi trường nuôi EGM2 +
SingleQuots: 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 1 µg/ml hydrocortison &
antibiotics, 5% FBS (Sigma) + 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml hIGF, 50 ng/ml
hFGF.
4. Biệt hóa được UCB-MSC thành các tế bào tiền thân cơ tim bằng hai môi
trường cảm ứng: môi trường 5-AZC và môi trường 5-AZC kết hợp với dịch
chiết tim thai chuột. Trong đó, việc sử dụng 5-AZC kết hợp với dịch chiết
tim thai chuột giúp thúc đẩy quá trình biệt hóa diễn ra sớm hơn so với việc
chỉ sử dụng một mình 5-AZC. Các gen đặc trưng cho tế bào cơ tim như
Mef2c, Gata 4, Nkx2.5, HCN2, hBNP, cTnT, Desmin, alpha-cardiac actin,
beta-Mhc biểu hiện đầy đủ vào ngày 18 ở nhóm sử dụng 5-AZC kết hợp dịch
chiết và ngày 27 ở nhóm chỉ sử dụng 5-AZC. Protein α-actin đặc trưng cho
các tế bào cơ tim biểu hiện ở nhóm 5-AZC kết hợp dịch chiết vào ngày 18

và ở nhóm 5-AZC vào ngày 27. Các tế bào được biệt hoá không co đập một
cách tự phát.
5. Sau 14 ngày, 3 nhóm chuột EPCs, CPs và EPCs+CPs được ghép tế bào
lần lượt có mức độ giảm huyết áp thấp hơn so với chuột mô hình được tiêm
giả dược là 2,6 mmHg, 2,07 mmHg và 2,1 mmHg so với 7,6 mmHg.

 

23